大肠杆菌表达制备具诱骨活性的人骨形成蛋白-3 本发明涉及基因工程领域中采用大肠杆菌表达制备具诱骨活性的入骨形成蛋白-3。
骨形成蛋白(BMP)最早是从骨组织中提取的一类蛋白质，将其放人组织(肌肉、皮下结缔组织及其他组织)中能诱导异位骨组织的形成。实验证明BMP是正常胚胎时期骨、牙组织发生和成年骨修复中最重要的诱骨分化因子。国内外大量的动物实验和临床试用表明BMP能治疗骨缺损、促进骨折愈合，促使牙齿再生，有很好的临床应用前景。从动物提取的BMP也曾成功用于入骨缺损的治疗，但从牛、猪、羊等动物骨组织所得异种BMP同时也总对人有免疫反应，不如人BMP好，但新鲜人骨来源不易，而且从骨组织提取BMP手续繁杂，收获量少，且难以得到纯品，诱骨活性往往不高，批间差别大。因此研究用基因工程大量生产具有良好诱骨活性的人BMP (hBMP)，具有很好的临床应用价值。
1988年美国Wozney等首先克隆得BMP-1，-2，-3的cDNA。继而又不断发现hBMP的新成员，到1996年已经获得hBMP1-10的cDNA。90年代在hBMP基因工程研究上又取得了进展。美国用CHO和COS细胞表达纯化hBMP-2获得成功，已进入临床试验阶段，但hBMP在真核细胞中表达水平不高，收获量少，培养CHO和COS等真核细胞作生产成本昂贵。按Wozney 1988年的报告，认为hBMP-2和hBMP-3 cDNA的大肠杆菌表达产物没有诱骨活性。迄今国外一直没有大肠杆菌表达hBMP-2，和-3有诱骨活性的报道。
本发明的目的是应用繁殖快、操作容易、表达水平高的大肠杆菌来大量生产成本低廉的具有诱骨活性的hBMP-3，供基础研究和临床应用。
本发明地目的是通过以下途径来实现的。1.构建了新型原核双顺反子表达载体pEC和pGC；2.利用PCR方法获取所需的hBMP-3基因全序列或部分序列，系统研究了各部分基因序列表达产物的诱骨活性；3.在大肠杆菌表达系统中高表达了hBMP-3不同长短的碳端肽；4.通过包涵体的纯化、变性、复性获取有活性的骨形成蛋白-3；5骨形成蛋白-3单独或通过与复合材料复合后进行离体或整体动物实验测定其诱骨活性。
发明技术方案：
第一，构建双顺反子表达载体pEC和pGC.此表达载体分别以era和gst基因为第一顺反子，分别以PL和Ptac为启动子，同时引入”原核翻译增强子”序列构建而成。
第二，编码hBMP-3碳端肽的基因的获得：根据已发表的hBMP-3基因全序列，设计扩增不同碳端肽段长度的PCR引物，扩增编码hBMP-3碳端270、215、18 3和127氨基酸等不同长度的基因片段。
第三，编码hBMP-3碳端肽段的基因的表达：将目的基因克隆入表达载体pEC和pGC，分别进行温度(42℃)和IPTG诱导，SDS-PAGE观察表达情况，证明hBMP-3各肽段高表达。
第四，hBMP-3碳端肽段的纯化、变性、复性和活性测定：表达的蛋白质以包涵体形式存在时，采用以下纯化工艺流程获取目的蛋白。首先洗涤菌体，加入裂解液(STE，Triton X-100，NaCl等)裂菌，用Triton X-100、脲等包涵体洗涤液洗涤粗制包涵体，得纯化的包涵体。将纯化的包涵体用变性液(脲，Tris.Cl，等)进行变性，除去不溶物，对复性液进行透析，最后冷冻真空干燥。单独或与复合材料复合后，植入小鼠肌肉中，进行活性测定，证明其诱骨活性。
本发明的优点：
1 大肠杆菌表达系统操作简单、周期短、成本低；
2 纯化复性方法简单、可靠、效果好、成本低；
3 可提供大量具诱骨活性的骨形成蛋白-3纯品供基础研究和临床应用；
3 此重组蛋白为非融合蛋白，非常有利于作为基因工程产品应用于临床。
实施例
1 hBMP-3碳端肽段利用pEC34在大肠杆菌中的高表达
设计用PCR方法获得编码hBMP-3C端127个氨基酸的cDNA段落，插入双顺反子表达载体pEC，转化宿主菌TAP106，经42℃诱导表达，裂菌后PAGE检测，光密度扫描，14kD目的蛋白表达量占细菌总蛋白量50％。
温度诱导表达后，菌体用溶菌酶-脱氧胆酸法裂菌，DNaseI-MgCl2降解DNA，离心后高表达的14kD蛋白主要在不溶性沉淀中，用裂菌液及洗涤液除去沉淀中大多数杂蛋白，再以浓变性液溶解沉淀，除不溶物，上清对复性液透析，除去变性剂，取其上清液。Lowry法蛋白定量，计算复性后可溶性蛋白收得率。对5％甘油透析后，冷冻干燥，用PAGE及FPLC检测，纯度应达98％以上。
将冻干的产物溶解，定量，与脱蛋白脱脂牛松质骨复合，植入小鼠后腿肌内中。另直接定量植人冻于的产物，并同时植入牛松骨质作对照。21日后取植入局部组织作切片，HE染色，镜下观察。结果：rhBMP-3C端肽植入21日后，肌肉中可见典型的骨组织形成，骨小梁较成熟，骨陷窝中骨细胞核小而深染，骨小梁间有成熟的骨髓造血组织。单纯松骨质植入未见有任何软骨或骨组织的形成。这研究表明：大肠杆菌表达的rhBMP-3C端肽具有良好的诱骨活性，且与脱蛋白脱脂松质骨复合后，诱骨活性又明显增强，为用大肠杆菌系统生产rhBMP-3C端肽供实际应用奠定了基础。
2 hBMP-3碳端肽段利用pGC34在大肠杆菌中的高表达
设计用PCR方法获得编码hBMP-3C端270个氨基酸的cDNA段落，插入双顺反子表达载体pGC，转化宿主菌JM109，经IPTG诱导表达，裂菌后PAGE检测，光密度扫描，31kD目的蛋白表达量占细菌总蛋白量28.5％。
诱导表达后，菌体用溶菌酶-脱氧胆酸法裂菌，DNaseI-MgCl2降解DNA，离心后高表达的31kD蛋白主要在不溶性沉淀中，用裂菌液及洗涤液除去沉淀中大多数杂蛋白，再以浓变性液溶解沉淀，除不溶物，上清对复性液透析，除去变性剂，取其上清液。Lowry法蛋白定量，计算复性后可溶性蛋白收得率。对5％甘油透析后，冷冻干燥，用PAGE及FPLC检测，纯度应达98％以上。
将冻干的产物溶解，定量，与脱蛋白脱脂牛松质骨复合，植入小鼠后腿肌内中。另直接定量植入冻干的产物，并同时植入牛松骨质作对照。21日后取植入局部组织作切片，HE染色，镜下观察。结果：rhBMP-3 C端肽植入21日后，肌肉中可见典型的骨组织形成，骨小梁较成熟，骨陷窝中骨细胞核小而深染，骨小梁间有成熟的骨髓造血组织。单纯松骨质植入未见有任何软骨或骨组织的形成。这研究表明：大肠杆菌表达的rhBMP-3 C端肽具有良好的诱骨活性，且与脱蛋白脱脂松质骨复合后，诱骨活性又明显增强，为用大肠杆菌系统生产rhBMP-3 C端肽供实际应用奠定了基础。