与糖类结合的生物活性化合物 1.发明领域
本发明的领域是生物活性物质的输送和击靶，特别包括增加的生物利用率和细胞摄入在影响所述输送和击靶方面的应用。
2.发明背景
临床药理学的一个显著的问题是将特定的生物活性化合物选择性地输送到生物体的靶细胞中。在许多情况下，所需化合物仅是被动地而且部分地扩散到靶细胞中，由于毒性以及被肝、肾和其他机体器官或体液清除或降解，需要达到显著细胞内水平的原生质浓度将难以达到。对于中枢神经系统，由于存在血脑屏障(BBB)，这个问题通常将更加严重；在肿瘤中，由于血管化不足或低效，这个问题可进一步加重。其他困难可能来自生物活性物质在消化道中的消化或降解，和/或许多这类化合物跨肠壁运输不足。进一步的困难来自于生物活性化合物被错误地输送到非靶细胞中。
许多生物活性化合物已涉及与特异性输送有关的问题，这些化合物包括强毒性的抗肿瘤药物，例如阿霉素和氨甲喋呤；抗病毒药物，例如阿拉伯糖酰基胞嘧啶和阿拉伯糖酰基腺嘌呤；抗寄生物药物，例如氯喹和乙胺嘧啶，其中位点特异性是特别重要的。从技术上说不是药物的物质也会遇到输送问题，如放射性标记和造影物质，它们被设计成可被认为是生物活性化合物，因为它们可以在活的生物体上或活的生物体中起作用。
已知糖蛋白的糖基元在体内吸收、运输和随后地组织分配中起重要作用，一些研究者已通过施用与生物活性物质结合的糖类而研究了输送问题。在这个领域已取得了显著的成果。一项研究表明，通过用糖对药物进行糖基化，可以明显地增加吸收性差的药物的肠吸收。Mizuma，T.等，通过葡萄糖传输系统进行的与糖结合的化合物的肠活性吸收：吸收性差的药物的改进的实质，Biochem.Pharma.，43(9)2037-2039(1992)。另一项研究确定了不同糖-多聚L赖氨酸结合物的不同靶向，报告说半乳糖结合物优选地靶向肝，甘露糖和墨角藻糖结合物优选地靶向网状内皮系统，木糖结合物优选地靶向肝和肺。Gonsho，A.等，糖-多聚L赖氨酸结合物的组织靶向能力，Biol.Pharm.Bull.，17(2)275-282(1994)。
这一领域的研究分为三个一般性的类别：(1)治疗方法，其中糖不以任何方式与生物活性化合物结合；(2)组合物，其中糖直接或间接地通过糖苷键(利用糖的C1原子)与生物活性化合物共价结合；(3)组合物，其中药物与两亲分子相连，例如封于糖包被的脂质体中。
第一类别的进展与利用甘露醇来克服血脑屏障有密切的关系。例如，甘露醇的浓缩液被输注到颈动脉，以在足够长的时间内破坏血脑屏障，使得氨甲喋呤和其他有效的化学治疗药剂进入脑肿瘤中。Angier，N.，Discover，May 199，67-72。虽然已报道此途径获得了明显的效果，但它还有一些缺点。具体地说，血脑屏障的开放显然是非特异性的，使得大量的有害化合物与所需化合物一起进入大脑。此外，此技术主要靶向中枢神经系统，几乎不可应用于其他系统。
对于第二类别的进展，糖与药物之间直接或间接的糖苷键是非常重要的。因此，细胞毒药物-氨甲喋呤(MTC)-与甘露糖基化的牛血清白蛋白(BSA)结合，所得的化合物被巨噬细胞表面上的甘露糖受体识别(Chakraborty，P.等，在实验性内脏利什曼病的治疗中，由糖受体介导的向巨噬细胞的药物输送，Biochem.Biophys.Res.Comm，166(1)404-410(1990))。胰岛素已被糖基化，以有利于葡萄糖与糖基化胰岛素之间的竞争性结合(Seminoff，L.A.等，一种自调节胰岛素输送系统I合成的糖基化胰岛素衍生物的表征，Int’l J，Pharm.，54(1989)241-249)。抗HIV药剂，3′-迭氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)也已通过糖苷键与人血清白蛋白(HSA)和不同的糖基元偶联以产生甘露糖、墨角藻糖、半乳糖和葡萄糖新糖蛋白(Molema，G，抗病毒药物对T4淋巴细胞的靶向，BiochemPharm.，40(12)2603-2610(1990))。抗炎症药剂-naproxin-也通过糖苷键与糖末端的HSA(Franssen，E.J.F.，带有作为载体分子的人血清白蛋白和新糖蛋白的抗炎症药剂的肝和肝内靶向，Biochem.Pharm.，45(6)12151226(1993))。在后两种情况中，糖苷键是与HSA形成的，因此仅与药物(AZT或naproxin)间接地形成糖苷键。在1994年，一个日本小组报道用糖苷放射性碘化地高辛的方法(Takemuru，Y.等，糖苷结合的放射性药物的进展：地高辛的新的放射性碘化方法，Biol.Pharm.Bull.，17(1)97-101(1974))。也通过糖苷键将糖与多聚L赖氨酸共价连接(Monsigny，M.等，药物的糖类特异性输送，寡核苷酸和基因，Targeting of Drugs，431-50(GGregoriadis等编，Putnam Press，N.Y，1994))。
除了这些合成的糖类结合物外，自然界中还有许多糖与生物活性基元共价结合的实例。例如，糖苷是糖与不同种类的有机羟基(有时是氨基或巯基)化合物的缩合产物，其中糖的半缩醛部分的OH参与了缩合(Remington，The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.386-387(Mack Publ.Co.，Easton，PA，1995))。实际上，许多众所周知的生物活性化合物是糖苷，包括苦杏仁苷、磁麻苷、毛地黄毒苷、乌本苷、芸香苷和水杨苷。还有内源性的糖苷，包括神经节苷脂，糖核苷酸和神经细胞粘附分子。其他实际上在其结构中含有糖苷连接的天然化合物通常不被列为糖苷。例如抗生素，庆大霉素、氨基羟丁基卡那霉素、乙基紫苏霉素、妥布拉霉素、新生霉素和链霉素；糖生物碱，如茄碱以及核苷，核苷由与D-2-脱氧核糖的D-核糖连接的嘌呤或嘧啶碱基组成。
如天然和合成化合物的效用所表明的，糖与药物的共价直接或间接糖苷结合是输送药物的成功策略。尽管与糖偶联的生物活性化合物广泛存在并且人们对其有丰富的知识，但可通过应用标准的糖苷键而开发的化合物是有限的。例如，在有些情况下，这样的连接是完全不适合的，因为所得的结合化合物的体积和位阻不再被相应的细胞传输体识别或正确传输。在其他情况中，糖苷键太不稳定，容易被糖苷酶水解。
对于第三类别，已知带有糖苷的脂质体可体内用于特异性地向巨噬细胞输送药物(Medda，S.等，糖包被的脂质体：一种提高药物效力并减少药物毒性的新的输送系统，Biotechnol.Appl.Biochem，1737-47(1993))。已合成阴离子两亲分子，它在亲氟-亲脂尾和基于糖的亲水头之间有磷酯连接(Guillod，F.等，用于氧和药物输送系统的带有单或双全氟烷基化疏水链的两亲糖磷酸酯，Art.Cells，Blood Subs.，and Immob Biotech，22(4)1273-1279(1994))。在1995年，出版了脂质体对表面糖脂的作用的深入分析(Jones，M.，磷脂脂质体系统的表面特性和它们的表征，Advances in Colliod andInterface Science，5493-128(1995))。但是，这第三类化合物尽管看来有前途，但与上述的糖苷和新糖蛋白有同样的缺点。产生这些化合物的标准的糖苷连接是十分有限的。此外，在产生立体化学纯的α或β糖苷键时，总是存在合成和/或纯化问题。
在给出了目前采用的，用于增加细胞摄入和靶向(例如被特异性组织摄入)的方法和组合物之后，提供结合糖和生物活性化合物的新的方法和组合物是令人感兴趣的。
3.发明概述
本发明提供增加细胞摄入生物活性物质的方法和组合物，细胞摄入的增加是由化合物与糖类基元通过利用非糖苷键的化学连接物进行共价结合而实现的。大量的糖类、连接物和生物活性物质可用这种方式连接以形成新的组合物，这些组合物在本文中被一般地称作糖连苷(glinkoside)。优选的糖连苷优选地被葡萄糖受体和/或其他细胞受体摄取，并且一旦进入细胞，糖连苷就会被切割成糖，连接物或连接物片段，以及生物活性化合物。本发明的不同方面包括合成糖连苷的方法，糖连苷组合物，用糖连苷治疗疾病的方法。
4.附图简述
图1显示衍生连接物的示例性合成。
图2显示3-O-和6-O-D-半乳糖连接物中间体的示例性合成。
图3显示3-O-和6-O-D-半乳糖连接物活性中间体的示例性合成。
图4显示通过酯键带有LG-5的胸苷结合物的示例性合成。
图5显示通过酯键带有LG-5的示例性病毒唑(virazole)TM结合物。
图6显示通过酯键带有LG-6的示例性病毒唑TM结合物。
图7显示6-O-D-半乳糖连接物中间体的示例性合成。
图8显示4-O-和6-O-D-甘露糖连接物中间体的示例性合成。
图9显示3-O-、4-O-和5-O-D-果糖连接物中间体的示例性合成。
图10显示用于自动寡脱氧核苷酸合成的葡萄糖连接物氨基磷酸酯中间体的示例性合成。
图11显示用于自动寡脱氧核苷酸合成的衍生连接物氨基磷酸酯的示例性合成。
图12显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6’-羟基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-3)的可选合成。
图13显示在3’和5’位置修饰(ICN 16967)的寡脱氧核苷酸(ODN)的示例性合成。
图14包含修饰的(14a，c)(ICN 16967)和未修饰的(14b，d)寡核苷酸的TM’和UV吸收曲线。
5.发明详述
根据本文所用的新术语，糖连苷的一般结构是MS-LINK-BAM，其中MS是单糖，LINK是连接物，BAM是生物活性物质，MS与LINK共价结合，结合位点不是MSC1，LINK与BAM共价连接。有大量糖连苷变换可以存在。例如，在糖连苷中可以利用任何单糖，包括具有3到8个或更多碳原子的单糖。糖连苷的LINK部分也有大量变异形式，可以是直链或支链烷基，取代的烷基，芳烷基，取代的芳烷基，芳基和取代的芳基。BAM部分可由任意生物活性分子组成，所述生物活性分子包括：
胃肠和肝脏药物
血液药物
心血管药物
呼吸系统药物
拟交感神经药物
拟胆碱药物
肾上腺素能和肾上腺素能神经元阻断药物
抗蕈毒和抗痉挛药物
骨骼肌松弛药
子宫和抗migrane药物
激素
全身或局部麻醉药物
镇静和安眠药物
抗癫痫药物
精神药理学药剂
消炎药
CNS兴奋药剂
合适的MS-LINK和LINK-BAM键也有很大的不同，作为示例，它们可独立地由醚、酯、酰胺、二硫化物、半缩醛、半缩酮、缩醛和缩酮键组成。
目前优选的糖连苷利用天然存在的核糖(5碳)或己糖(6碳)，4到16碳的直链连接物，双功能α、ω连接物例如己烷，以及已知的生物活性药物。MS-LINK和LINK-BAM键各自优选地可在生理条件下切割，由此，糖连苷可作为前药，向靶细胞上或靶细胞内的靶位置输送活性或可活化药物。目前优选的实施方案涉及这样的糖连苷，其中LINK-BAM键强于MS-LINK键。
与糖苷相比，糖连苷有许多优点，包括：
(1)单糖可在其不同的OH取代基(除了C1)中的任何一个，通过特别设计的α，ω双功能连接物与BAM化学结合。
(2)应用连接物可消除合成物的立体化学问题。
(3)相对于糖苷，特别是其中BAM直接连接单糖的糖苷，位阻现象被大部分或完全消除。这有助于糖连苷通过特异的膜蛋白传输体，例如通过葡萄糖传输体系统之一，例如谷氨酰胺传输体系统(GLUT-1)。
(4)单糖-连接物和连接物-BAM键的相对强度可以改变，使得BAM可以在传输中的适当点释放。
(5)糖连苷也可促进对血脑屏障的透过。
糖连苷的合成
为了将糖与生物活性化合物化学连接，两个化学实体中的选定官能团可用于通过特定的化学连接物将其共价结合。糖和生物活性物质中常用的官能团包括：羟基、氨基、巯基、羰基、羧基和酰氨基官能团，而化学连接物在大多数情况下包括α，ω双功能烷基链。显然有更多的官能团和化学键可用于此目的。
一般地说，糖连苷可用下述步骤制备：(1)制备合适的连接物。对于双功能α，ω连接物，α末端应是反应性的，ω末端应是被保护的；(2)选择一种单糖，将其一个非C1-OH基团与连接物化学结合；(3)将连接物与生物活性物质化学结合。示例性的合成方法和糖连苷化合物在下面实施例中公开。当然，应理解给出的实施例仅是阐述性的，并没有对本发明的范围构成限制。
实施例1-3.衍生连接物的合成
在图1中，第一行显示了1-O-对甲苯磺酰-1，6-已二醇(L-1)的示例性合成，利用如下试剂：1，6-己二醇＝1，6-HD；对甲苯磺酰氯＝TsCl；吡啶＝Py；二氯甲烷＝CH2Cl2。在该方法中，将6-HD(44克，0.382摩尔)溶解于Py/CH2Cl2(1∶1)混合物中(80毫升)。所得的溶液冷却至0℃，并加入TsCl(20克，0.105摩尔)。得到的反应混合物保持在4℃5个小时。然后用10％HCl水溶液将反应溶液中和，产物用CH2Cl2(3×100毫升)萃取。将有机层用盐水洗，干燥并蒸发。粗产物用硅胶柱上的急骤层析纯化(用TLC溶剂系统)，L-1(油)；产率：20.6g(72％)。TLC：乙酸乙酯/己烷(1∶1)；Rf：0.56。用1H-NMR谱检测L-1的结构和纯度。
第二行显示1-O-对甲苯磺酰-6-O-(2′-四氢吡喃基)-1，6-己二醇(L-2)，利用下述试剂：L-1；二氢吡喃＝DHP；对甲苯磺酰吡啶鎓＝PpTs(制备自Py和对甲苯磺酸＝TsOH)；和CH2Cl2。在此方法中，向无水CH2Cl2(40毫升)中逐一加入L-1(10g，36.7mM)，DHP(3.4g，40.3mM)和PPTS(1.0g，3.7mM)。在室温下搅拌反应混合物，直至反应完成(6-8小时)。将反应混合物用盐水洗(3×20毫升)，干燥并蒸发。粗产物用硅胶柱层析纯化(用TLC溶剂系统)。(L-2(油)；产率：9.42g(72％)。TLC：15％乙酸乙酯，溶于己烷的1％三乙胺；Rf＝0.9；用1H-NMR谱检测L-2的结构和纯度。
第三行显示1-O-(2′-四氢吡喃基)-6-碘-1-己醇(L-3)，利用下述试剂：L-2；NaI；丙酮。在此方法中，将L-2(9.0g，25.2mM)，NaI(11.3g，75mM)和无水丙酮(100毫升)在50℃下搅拌，直至反应完成(8-12小时)。蒸发掉丙酮，用水(100毫升)处理残余物。用CH2Cl2(3×50毫升)萃取产物。将有机层用盐水(3×50毫升)洗，干燥并蒸发。用硅胶柱层析收集产物(TLC溶剂系统)。L-3(油)；产率：5.0g(63％)。TLC：己烷中的5％三乙胺；Rf：0.50；用1H-NMR谱(CDCl3)确定L-3的结构和纯度。
实施例4.3-O-和6-O-D-葡萄糖-连接物中间体的合成
图2显示1，2-O-异亚丙基-3-O-(6′四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-1a)和1，2-O-异亚丙基-6-O(6′-四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-1b)，利用下述试剂：L-3；1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃葡萄糖＝IPGF；NaH；和二甲基亚砜＝DMSO。在此方法中，IPGF(20g，9.08mM)溶于无水DMSO(7毫升)中，在室温下将NaH(总共545毫克，13.6mM)分成几小份加入。反应混合物在40℃下保持0.5小时，加入L-3(2.27g，7.26mM)。所得混合物在室温下保持过夜，然后倒在乙酸乙酯(200毫升)上。将有机层用盐水(3×50毫升)洗，干燥(无水Na2SO4)并蒸发。纯化粗产物混合物，用硅胶柱上的急骤层析分离异构体(TLC溶剂系统)。LG-1a(油)；产率：1.06g(36％)，LG-1b(油)；产率：0.94g(32％)。TLC：50％乙酸乙酯，2.5％三乙胺，47.5％己烷；Rf(LG-1a)：0.34；Rf(LG-1b)：0.47。两种异构体在CDCl3中的1H-NMR谱与预计的结构一致(样品是化学纯的)。
实施例5. 1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-2)
图2也显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-2)的示例性合成，利用下述试剂：LG-2；丙酮；和PPTS(由TsOH和Py制备)。在此方法中，在室温下将LG-1a(500mg，1.233mM)，PPTS(67mg，0.247mM)和丙酮的混合物搅拌直至反应完成(6小时)。将丙酮蒸发，将残余物层析。LG-2(油)，产率：490毫克(91％)。
TLC：15％乙酸乙酯，5％三乙胺，己烷80％
Rf：0.66。用1H-NMR谱(CDCl3)确定LG-2的结构和纯度。
实施例6. 1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖的可选合成法
LG-2的一种可选的直接合成法可用下述试剂完成：1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃葡萄糖＝DIPGF L-3；NaH；和DMSO。在此方法中，将DIPGF(2.5g，9.6mM)溶于无水DMSO(7毫升)中，在室温下将NaH(576mg，14.40mM)分成小份加入。反应混合物在40℃下保持30分钟，加入L-3(3.6g，11.52mM)。反应混合物在室温下保持过夜，然后倒入乙酸乙酯(200毫升)中。将有机层用盐水(3×50毫升)洗，干燥(Na2SO4)并蒸发。用硅胶柱层析纯化产物，LG-2(油)；产率：2.42g(58％)。TLC：15％乙酸乙酯，5％三乙胺，80％己烷；Rf：0.66。
实施例7. 3-O-D-葡萄糖连接物活性中间体的合成
图3显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-羟基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-3)的示例性合成，利用下述试剂：LG-2；乙醇(96％)；PPTS和丙酮。在此方法中，将LG-2(2.0g，4.49mM)和PPTS(245mg，0.90mM)溶于乙醇(100毫升)，反应混合物在55℃下加热5小时。然后蒸发掉乙醇。将残余物溶于丙酮(100毫升)，在室温下再搅拌4小时。真空除去丙酮之后，将残余物溶于乙酸乙酯(50毫升)，用盐水.(3×50毫升)洗，干燥(Na2SO4)并蒸发。最终用硅胶急骤层析纯化产物。LG-3(油)；产率：1.52g(94％)。TLC：乙酸乙酯/己烷(1∶1)；Rf：0.48；用1H-NMR谱确定LG-3的纯度和结构。
实施例8. 1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(5′-羟基羰基)-戊基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-5)
图3也显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(5′-羟基羰基)-戊基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-5)的示例性合成，利用下述试剂：LG-3；Py2H2Cr2O7(重铬酸吡啶鎓)＝PDCh；KMnO4和丙酮。在此方法中，将LG-3(1.0g，2.77mM)，PDCh(2.13g，5.65mM)，KMnO4(0.89g，5.65mM)和丙酮(50毫升)的混合物在50℃下搅拌，直至反应完成(7-8小时)。通过用TLC监测反应，仅在5分钟之后即观察到起始LG-3几乎完全转化成醛(LG-4)中间体(在另一实验中分离了LG-4，并用相应的1H-NMR谱提供了它的纯度和结构)。在氧化成酸LG-5完成之后，过滤反应混合物，蒸发滤过物。用急骤层析纯化产物(TLC溶剂系统)。LG-5(油)；产率：700mg(67％)；TLC：乙酸乙酯/己烷(1∶1)；Rf：0.23；用1H-NMR(CDCl3)谱确定LG-5的纯度和结构。
实施例9. 1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-对甲苯磺酰基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-6)
图3也显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6′-对甲苯磺酰基氧基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-6)的示例性合成，利用下述试剂：LG-3；TsCl；Py和CH2Cl2。在此方法中，将LG-3(1.40g，3.884mM)溶于吡啶(5毫升)和CH2Cl2(10毫升)的混合物中。将反应混合物冷却至0℃，加入TsCl(0.89g，4.668mM)。反应混合物在4℃下保持5小时，然后用10％盐酸水溶液中和。将有机层用盐水洗，干燥并蒸发。用柱层析纯化产物(TLC溶剂系统)。LG-6(油)；产率：1.8g(90％)；TLC：33％乙酸乙酯，67％己烷；用1H-NMR(CDCl3)谱确定LG-6的纯度和结构。
实施例10.带有LG-5(通过酯键)的胸苷结合物
图4显示带有LG-5的胸苷3′-O-和5′-O-酯的示例性合成，利用下述试剂：胸苷；LG-5；二环己基碳化二亚胺＝DCC；二甲基氨基吡啶＝DMAP。在此方法中，将胸苷(100mg，0.413mM)，LG-5(233mg，0.620mM)，DCC(128mg，0.620mM)，DMAP(15.1mg，0.124mM)和Py(3毫升)的混合物在60℃下保持过夜，这样足以使反应完成。在真空下蒸发掉Py，将残余物在硅胶柱上层析(TLC溶剂系统)。5′-O-和3′-O-胸苷酯(油)；产率：68.7mg(28％)和59.0mg(24％)；TLC：25％己烷，75％乙酸乙酯；Rf(5)：0.40；Rf(3)：0.25。两种异构体的1H-NMR(CDCl3)谱与预计的结构一致。
实施例11.分离的胸苷酯的去异亚丙基反应(去保护)
图4也显示分离的胸苷酯的去异亚丙基反应(去保护)，利用了三氟乙酸＝TFA。在此方法中，在室温下将分离的(单一的)胸苷酯(来自前面的实验，30mg，0.05mM)用TFA/水(9/1，v/v)处理5分钟。然后在真空中将反应混合物蒸发，重溶于1毫升水中，过滤并再次蒸发。去保护的酯(油)；产率：81-89％；TLC：10％甲醇，2％乙酸，88％乙酸乙酯；Rf：0.17(无5′-OH)和0.20(无3′-OH)。1H-NMR谱与预计的结构一致。
实施例12.带有LG-5(通过酯键)的病毒唑结合物
图5显示2，3-O-异亚丙基-病毒唑(V-1)的示例性合成，利用下述试剂：病毒唑TM(ICN商标名为病毒唑(Ribavirin)USP)；丙酮；2，2-二甲氧基丙烷＝DMP；和高氯酸(70％)。在此方法中，将病毒唑TM(3.0g，12.28mM)悬于丙酮(40毫升)和DMP(20毫升)的混合物中。将混合物在冰浴中冷却，加入高氯酸(600微升)。混合物在室温下保持3小时，然后在5℃下保持过夜。用2M的KOH水溶液中和所得的橙色溶液，过滤并蒸发至干。用甲醇(5毫升)处理固体残余物，通过过滤除去不可溶产物。将甲醇处理过的滤过物蒸发至干，从丙酮中重结晶固体残余物。产率：2.95g(81％)；TLC：15％甲醇，85％乙酸乙酯；Rf：0.54。用1H-NMR谱(丙酮-d6)确定V-1的纯度和结构。
实施例13. 2′，3′-O-异亚丙基-病毒唑-5′-O-酯
图5显示带有LG-5的2′，3′-O-异亚丙基-病毒唑-5′-O-酯(V-1-5′-O-LG-5)的示例性合成，利用下述试剂：V-1；LG-5；DCC；DMAP；吡啶。在此方法中，将V-1(236mg，0.796mM)，LG-5(200mg，0.531mM)，DCC(108mg，0.531mM)，DMAP(13mg，0.106mM)和Py(5毫升)在60℃下保持过夜。在真空中除去吡啶，用硅胶柱层析纯化残余物。产率：160mg(46％)；TLC：25％己烷，75％乙酸乙酯；Rf：0.21。用1H-NMR谱(丙酮-d6)确定V-1-50-O-LG-5的纯度和结构。
实施例14.V-1-5′-O-LG-5的去保护和V-5′-O-LG-7的合成
图5也显示V-1-5′-O-LG-5的示例性去保护和V-5′-O-LG-7的合成，利用被保护的病毒唑TM酯，它来自前面实验(V-1-酯)TFA。在此方法中，将V-1酯(50mg，0.076mM)用TFA/水(9/1，v/v)在室温下处理5分钟。将反应混合物蒸发至干，重溶于1毫升水，过滤并再次蒸发。产率：35mg(87％)；TLC：10％甲醇，2％乙酸，88％乙酸乙酯；Rf：0.19。用1H-NMR谱(D2O)确定V-5′-O-LG-7的纯度和结构。
实施例15.带有LG-6(通过酯键)的病毒唑TM结合物
图6显示V-1-ETH-5′-O-：LG-8和LG-9的示例性合成，利用下述试剂：V-1；LG-6；NaH；和DMSO。在此方法中，V-1(250mg，0.843mM)溶于无水DMSO(5毫升)中，在30分钟内以小份加入NaH(118mg，2.95mM)。将反应混合物在40℃下再加热30分钟，然后加入LG-6。混合物在室温下保持过夜。然后用100毫升乙酸乙酯稀释。将溶液用盐水(3×30毫升)洗，干燥(Na2SO4)，蒸发并用硅胶柱层析纯化。产率：220mg(49％)；TLC：10％己烷，90％乙酸乙酯；Rf：0.53；1H-NMR谱(丙酮-d6)支持预计的结构。
实施例16.带有LG-6(通过酯键)的病毒唑TM结合物
在另一示例性合成中，用TFA/水(9/1，v/v)在室温下处理前述化合物(50mg，0.078mM)5分钟。将反应混合物蒸发至干，重溶于1毫升水中，过滤并再次蒸发。V-ETH-5′-O-LG-9：36mg(88％)；TLC：10％甲醇，2％乙酸，88％乙酸乙酯。
实施例17. 6-O-D-半乳糖-连接物中间体
图7显示1，2：3，4-二-O-异亚丙基-6-O-(6′四氢吡喃基氧基)-己基-α-D-吡喃半乳糖(Lga-2)，利用下述试剂：L-3；1，2：3，4-二-O-异亚丙基-α-D-吡喃半乳糖＝DIPGap；NaH；和DMSO。在此方法中，DIPGap(500mg，1.92mM)溶于无水DMSO(5毫升)中，在室温下将NaH(96mg，2.40mM)以小份加入。将反应混合物在40℃下加热0.5小时，在室温下加入L-3(600mg，2.11mM)。将混合物在室温下保持过夜，然后倒入100毫升乙酸乙酯中。将有机层用盐水(3×25毫升)洗，干燥(Na2SO4)，蒸发。用急骤硅胶层析纯化产物(溶剂：10％乙酸乙酯，2.5％三乙胺，87.5％己烷)。产率：500mg(62％)；TLC：15％乙酸乙酯，2.5％三乙胺，82.5％己烷；Rf：0.44；用1H-NMR谱(CDCl3)确定Lga-2的纯度和结构。以类似于LG-3的方法(见图3)得到LGa-1。
实施例18. 4-O-和6-O-D-甘露糖连接物中间体的合成
图8显示4-O-和6-O-D-甘露糖连接物中间体的合成。合成是用类似于前面半乳糖和葡萄糖的方法进行的。
实施例19. 3-O-、4-O-和5-O-D-果糖-连接物中间体的合成
图9显示4-O-和6-O-D-甘露糖连接物中间体的合成。合成是用类似于前面半乳糖和葡萄糖的方法进行的。
实施例20用于自动寡脱氧核苷酸合成的葡萄糖氨基磷酸酯中间体
图10显示LG-3 Bnf的示例性合成，利用下述试剂：LG-3；苄基溴＝BnBr；氢化钠＝NaH；和四氢呋喃＝THF。在此方法中，将溶于THF(10毫升)的LG-3(1.00g，2.77mM)和NaH(150mg，3.75mM)的混合物在40℃下搅拌，直至反应完成(6小时)。然后加入乙酸乙酯(100毫升)，用盐水(3×50毫升)洗得到的溶液。干燥(Na2SO4)有机层并蒸发。用硅胶急骤层析纯化产物(TLC溶剂系统)。产率：1.25g(94％)；TLC：15％乙酸乙酯，85％己烷；Rf：0.45。1H-NMR谱(丙酮-d6)与预计的结构一致。
实施例21.LG-3BnpTA
图10也显示LG-3BnpTA的示例性合成，利用下述试剂：LG-3Bnf；三氟乙酸＝TFA；乙酸酐＝Ac2O；和吡啶＝Py。在此方法中，在室温下用4毫升TFA/水(9∶1，v/v)处理LG-3Bnf(1.00g，2.22rnM)7分钟。将反应混合物在真空下蒸发至干，溶于Ac2O/Py混合物(10毫升，1∶1，v/v)，在室温下放置过夜。在中和(5％HCl水溶液，50毫升)之后，用乙酸乙酯(3×50毫升)萃取产物。将有机层用盐水(3×25毫升)洗，干燥(Na2SO4)，蒸发。最后用急骤硅胶柱层析纯化产物(TLC溶剂系统溶剂)。产率：1.15g(96％)；TLC：33％乙酸乙酯，67％己烷；Rf：0.44；用1H-NMR谱(丙酮-d6)确定LG-3BnpTA的纯度和结构。
实施例22.LG-3pTA
图10也显示LG-3pTA的示例性合成，利用下述试剂：LG-3BnpTA；10％Pd/C；和甲醇。在此方法中，将LG-3BnpTA(100g，1.86mM)溶于甲醇(50毫升)，然后加入催化剂(Pd/C，200mg)。在氢气氛中摇动反应混合物直至反应完成(18-24小时)。然后通过过滤除去催化剂，蒸发甲醇溶液至干。用急骤硅胶层析纯化产物。产率：815mg(98.1％)；TLC：乙酸乙酯/己烷(1/1)Rf：0.21；1H-NMR谱(CDCl3)与预计的结构一致。
实施例23.LG-3pTAPA
图10也显示氨基磷酸酯中间体(LG-3pTAPA)的示例性合成，利用下述试剂：LG-3pTA；；氯代-氰基乙氧基-二异丙基氨基膦＝PAP(氨基磷酸酯前体)；二异丙基乙胺＝DIPEA；和CH2Cl2。在此方法中，在氩气下将LG-3pTA(300mg，0.669mM)溶于CH2Cl2(3毫升)。所得溶液冷却至0℃，加入DIPEA(450μl，2.62mM)。15分钟后，再加入PAP(315μl，1.408mM，0℃)。将得到的反应混合物在室温下再保持2小时，然后冷却(0℃)，用冷的CH2Cl2(100毫升)稀释，用冷的5％NaHCO3水溶液洗，干燥(Na2SO4)并真空蒸发。用硅胶急骤层析纯化粗产物。纯产物在用于自动寡脱氧核苷酸合成之前保持在氩气下。为进行自动ODN合成，利用了LG-3pTAPA的0.1M无水乙腈溶液。产率：257mg(62.2％)；TLC：32％乙酸乙酯，5％三乙胺，63％己烷；Rf：0.53。32P-NMR谱与预计的结构一致。
实施例24.用于自动寡脱氧核苷酸合成的衍生连接物氨基磷酸酯
图11显示L-4的示例性合成，利用下述试剂：1，6-己二醇＝HD；和二甲氧基三苯甲基＝DMT-Cl。在此方法中，将HD(4.00g，29.52mM)溶于Py/CH2Cl2(1∶1，v/v)混合物(8.0毫升)。所得溶液冷却至0℃，加入DMT-Cl(2.50g，7.38mM)。所得反应混合物在4℃下保持6小时。然后小心地用5％HCl水溶液将反应溶液中和(pH8.0)，用CH2Cl2(3×50毫升)萃取产物。将有机层用盐水(3×30毫升)洗，干燥(Na2SO4)，蒸发。用急骤硅胶柱层析纯化粗产物。产率：2.53g(81.5％)；TLC：32％乙酸乙酯，3％三乙胺，65％己烷；Rf：0.38；1H-NMR谱与预计的结构一致。
实施例25.L-5
图11也显示L-5的示例性合成，利用下述试剂：L-4；PAP；和DIPEA。在此方法中，在氩气下将L-4(500mg，1.19mM)溶于CH2Cl2(5毫升)。所得溶液冷却至0℃，加入DIPEA(800μl，4.65mM)。15分钟后再加入PAP(550μl，2.46mM)。所得反应混合物再在室温下保持2小时，然后冷却(0℃)，用冷的CH2Cl2(100毫升)稀释，用冷的5％NaHCO3水溶液洗，干燥(Na2SO4)并真空蒸发。用硅胶急骤层析纯化粗产物。纯产物(无色油)在使用前在-18℃下保持在氩气中。所用的氨基磷酸酯L-5是溶于无水乙腈的0.1M溶液。产率：430mg(58.3％)；TLC：16％乙酸乙酯，4％三乙胺，80％己烷；Rf：0.37。1H和31P-NMR谱与预计的结构一致。
实施例26.L-6
在图12中，第一行显示1，6-O-对二(甲苯)磺酰基-1，6-己二醇(L-6)，利用下述试剂：1，6-己二醇＝1，6-HD；对甲苯磺酰氯＝TsCl；吡啶＝Py；和二氯甲烷＝CH2Cl2。在此方法中，6-HD(70.9g，0.60mol)溶于150毫升Py和250毫升CH2Cl2。所得的反应冷却至0℃，加入TsCl(251.65g，1.32mol)。得到的反应混合物在4℃下保持5小时。然后用10％HCl水溶液中和反应溶液，用CH2Cl2(3×250毫升)萃取产物。将有机层用盐水洗，干燥并蒸发。将粗产物悬于乙醇(300毫升)，过滤并用冷的乙醇洗。L-6(白色晶体)；产率：219.1g(85.6％)。TLC：乙酸乙酯/己烷(1∶2)；Rf：0.48。用1H-NMR谱和FAB高分辨质谱检查并确定L-6的结构和纯度。
实施例27和28.Lg-6和LG-3的可选合成方法
图12在第二行也显示了LG-6的可选直接合成方法，它可用下述试剂进行：1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃葡萄糖＝DIPGF，L-6；NaH；和DMSO。在此方法中，将DIPGF(11.68g，44.88mM)溶于无水DMSO(50毫升)中，在室温下以小份加入NaH(2.334g，58.34mM)。反应混合物在40℃下保持30分钟，加入溶于150毫升温(40℃)DMSO中的L-6(60.7g，157.0mM)。30分钟后将反应混合物倒入乙酸乙酯(800毫升)。将有机层用盐水洗(3×30毫升)，干燥(Na2SO4)并蒸发。将产物用硅胶柱层析纯化(TLC溶剂系统)。LG-6(无色油)；产率：16.0g(69.0％)。TLC：33％乙酸乙酯，67％己烷；Rf：0.53。用1H-NMR谱和FAB高分辨质谱检查并确定LG-6的结构和纯度。
此外，图12显示1，2：5，6-二-O-异亚丙基-3-O-(6’-羟基)-己基-α-D-呋喃葡萄糖(LG-3)，利用下述试剂：LG-6；DMF；K2CO3；H2O。在此方法中，将LG-6(16.0g，31.03mM)和K2CO3溶于DMF(200毫升)和水(20毫升)，反应在90℃加热5小时。除去溶剂后(在高真空下蒸发)，将残余物溶于乙酸乙酯(600毫升)，用盐水洗(3×200毫升)，干燥(Na2SO4)并蒸发。最终将产物用硅胶急骤层析纯化。LG-3(无色油)；产率：7.85g(70.2％)；TLC：乙酸乙酯/己烷；Rf：o48；用1H-NMR谱和FAB高分辨质谱检查并确定LG-3的结构和纯度。
实施例29.在3’和5’位置修饰的寡脱氧核苷酸(ODN)的合成及它们的生物物理特性
图13修饰在3’和5’位置修饰的寡脱氧核苷酸(ODN)(ICN 16967)的示例性合成，利用自动DNA合成仪(Applied Biosystems，394型)，和标准的氨基磷酸酯化学；β-氰基乙基氨基磷酸酯，合成试剂和CPG聚苯乙烯柱(1μM和10μMT，500孔径，ABI)。合成之后，在55℃下用浓氢氧化铵将寡核苷酸去保护8小时。粗和最终分析用分析型C8 HPLC柱(Beckman；ultrasphere octyl)进行。
在反相半制备型C8 HPLC柱(Beckman C8 ultrasphere ODS 5μM，10mm×25cm)上进行纯化，流速3ml/min，利用0.1M TEAA和5％乙腈。纯化和调理之后，用2-丙醇沉淀纯产物，将其溶于水并冻干。产率：2.23mg，(36％，对于1μmol合成)。用HPLC分析，毛细电泳和电喷质谱检测并确定ICN 16967的结构和纯度。
ICN 16967的生物物理特性
用热力熔化(Tm)实验研究这些3’，5’-修饰的寡核苷酸的杂交特性。(见Fuglisi，3.D；Tinoco，I.Jr酶学方法1989，180，304中的方法)。这些实验是在Varian紫外光度计上进行的，该光度计配备了电子温度控制器和Cary杂交软件。如图14(a)所示，与未修饰的序列(b)相比，该修饰序列与互补RNA的杂交几乎是相同的。
Tm测量的样品含有溶于缓冲液(100mM硫酸钠，0.1mM EDTA和0.1M氯化钠，pH＝7.0)中的2μM修饰的寡聚物和2.0μM互补RNA。
用类似于Wengel和其合作者描述的方法，在37℃下用蛇毒磷酸二酯酶降解寡核苷酸样品，通过紫外吸收曲线计算修饰的(图14，c)和未修饰的(d)寡核苷酸的稳定性和半衰期。(见Svendsen，M.L；Wengel，3.；Dahl，0.，Kirpekar，F.；Roepstorff，P.Tetrahedron 1993，49，11341.中的方法)在Varian紫外光度计小池中，在25℃下将寡核苷酸(0.75OD)与蛇毒磷酸二酯酶(1.2单位)在1.5毫升缓冲液(0.1M Tris Hcl，pH7.5；0.1M NaCl；14mM MgCl2)中温育，记录降解过程中260nm处吸收值随时间的增加。由这些吸收曲线计算寡核苷酸的半衰期。在这些条件下，ICN 16976(糖连苷)寡核苷酸比相应的未修饰的寡核苷酸大约稳定20倍。
生物利用率增加的证据
我们检测了示例糖连苷，5′-O葡萄糖氚化胸苷(D-G-L-Thy)的生物利用率，方法是在一个简单的体外测试中比较游离胸苷的掺入和D-G-L-Thy的掺入。在此测试中，我们利用了生长于10％胎牛补充培养基(SSM)和无血清培养基(SFM)中的肺癌细胞系177(人非小肺肿瘤)。用游离胸苷和结合的胸苷(D-G-L-Thy)处理这些细胞4和24小时。D-G-L-*Thy是用同位素稀释技术合成的(1份Hot Thy：100份Cold Thy)。制备具有平均值cpm：Thy：481，660和5′-O-结合物467，242(CORR因子：1.03)的贮液。得到下列结果(平均值)：培养基Thy5′-O-结合物5′-O-结合物/ThySSM(4小时)2,945.04,089.41.39SFM(4小时)1,119.62,022.41.39SSM(24小时)12,395.716,063.91.34SFM(24小时)5,869.88,230.71.34
在所有的情况中，从化合物D-G-L-Thy中释放的胸苷的掺入比对照要高。这些数据表明，胸苷可以由于磷酸二酯酶的存在而在细胞中从D-G-L-Thy复合物中释放出来，释放的胸苷可随后掺入DNA。胸苷在细胞外从复合物中酶促释放是不太可能的，因为培养基中没有磷酸二酯酶。
因此，我们的数据表明糖连苷化合物D-G-L-Thy是作为前药被细胞摄入的，该化合物在细胞内转变成游离胸苷和游离葡萄糖。由于伴随同时和随后(细胞外和内)前药水解的吸收过程在动力学上是复杂的，在此阶段的实验可以被简单地解释如下：
·糖连苷的吸收量很大，很可能极大地高于胸苷自身的吸收；
·前药的细胞内水解足够地快，使得在细胞内释放出足量的前药；
·这为糖连苷通过GLUT系统的可能的吸收提供了良好的指标。
生物利用率提高的证据
在补充了10％牛血清的DMEM(培养基)中培养人黑素瘤细胞ATTCHTB140(HS294T)。为进行该实验，这些细胞被胰酶消化，悬于培养基中。在以大约10000细胞/孔/200μl培养基的密度铺96孔平板之后，用0.5μM寡核苷酸处理细胞72小时。之后，用血细胞测量仪对胰酶消化后的细胞计数。在每个实验中对每个计数重复3次。下表是以相对于未处理的细胞(对照)的细胞生长平均抑制计算的，它们基于三个独立的实验。 寡核苷酸 对照生长的$ 标准差 未修饰的 64.59 18.80 修饰的 54.32 11.10
这些实验显示未修饰的寡核苷酸在细胞生长的72小时中，在0.5μM浓度下是有效的；修饰的寡核苷酸在同样浓度和实验条件下比未修饰的寡核苷酸更有效。
用糖连苷处理
糖连苷可用于增强现有的和即将开发出来的药剂的吸收、分配和细胞摄入。例如，糖连苷可在体外、体内和间接体内控制和处理正常的、衰老的和病态的细胞生长，诱导/防止细胞凋亡，诱导/抑制细胞分化，控制细胞代谢和行为，病毒增殖和在被感染的细胞中的活性，功能化病毒感染的细胞，以及治疗神经退化性疾病。
本发明特别涉及不同单糖的传输，特别是在不同组织和细胞中表达的葡萄糖传输体的功能。葡萄糖传输体与不同单糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)向细胞传输有直接的关系。一些葡萄糖传输体以某些组织(例如)或细胞类型(例如\0或生物功能(例如GLUT-1离子快速生长正常和癌细胞)为特征。不同的葡萄糖传输体在不同的细胞中被不同地表达，这一事实提供了生物活性化合物的细胞特异性摄入或输送的可能性，所述化合物与本文描述的单糖治疗性地结合。
1.快速生长细胞中的葡萄糖。被生长因子激活的非生长(静息)正常细胞进入细胞循环，最终分裂。生长因子引起基因、mRNA、蛋白表达和细胞结构组织水平上的事件依次出现。例如，在生长因子激活的细胞中观察到了GLUT-1mRNA和蛋白表达的短时(0.5-1小时)增加(Endocrinology，1990，127，2025)。已知为非特异性生长刺激剂的钒酸钠可诱导GLUT-1在正常3T3成纤维细胞中表达，此外，它可延长GLUT-1mRNA的半衰期2-3倍(Endocrinology，1990，126，2778)。
癌细胞失控增殖的自分泌机制已被充分建立。癌细胞生长快速并大量表达GLUT-1。以这种方式，癌细胞比正常细胞摄入更多的葡萄糖，并将它用于糖酵解。也已证明高水平的功能性GLUT-1蛋白表达对于癌生长也是需要的。任何通过结合GLUT-1抗体或结合苏拉明引起的GLUT-1在癌细胞中的功能抑制，显著地限制了葡萄糖摄入和被处理的细胞的生长速率。这些数据表明高葡萄糖摄入水平对维持癌细胞的高增殖速率(特别是由生长因子依赖型GLUT介导的)是必需的。因此，乳腺、前列腺、肺、神经胶质瘤和其他癌细胞显示出显著增加的GLUT水平。
2.血脑屏障中的葡萄糖传输体。为了跨越血脑屏障(BBB)，药物必须透过内皮细胞的腔膜和基底膜。这可通过受体介导的摄入而成为可能，例如抗帕金森药物L-多巴的情况。多巴胺自身不能透过血脑屏障，但是，它的天然前体L-多巴可通过氨基酸载体系统穿过血脑屏障。
反义寡核苷酸是高度带电的分子，很难穿过脑毛细管壁。通过将寡核苷酸掺入本文描述的糖连苷，由构成BBB的内皮细胞的葡萄糖传输体摄取，这些潜在的有效反义药物的传输应被极大地促进。
葡萄糖从血液到神经和胶质细胞的传输是由两种特异性传输体介导的，所述传输体位于构成BBB的脑毛细管内皮中(M.W.Brightman 1977，“血脑界面的形态学”Exp.Eye Res 25，1-25)。这两种葡萄糖传输体被确定为钠依赖型葡萄糖传输体超基因家族的两个不同成员。葡萄糖传输体3型同种型(GLUT-3)位于神经细胞膜中(S.Nagamatsu等，JBiol.Chem.267，467-472)，葡萄糖传输体1型同种型(GLUT-1)位于BBB中(R.J.Boado和W.M.Partridge，Biochem Biophys.Res.Commun，166，174-179(1990)。由于GLUT-1传输体系统的丰富性，糖连苷应能透过BBB。这将极大地促进反义寡核苷酸在治疗中枢神经系统神经退化性疾病方面的潜在应用，例如治疗帕金森氏病和阿尔兹海默氏病。药物可口服或静脉注射，然后通过血液循环分布到脑中，或可选地，它可被注射到颈动脉中，以改善局部脑部输送。
3.由于存在特异性葡萄糖传输体而特别适于应用糖连苷的其他靶包括神经细胞、肝、肠、脂肪组织、肌肉和衰老细胞。
应用糖连苷的药物制剂
对于其他药物制剂，可使糖连苷以适于特定施用方法的不同方式施用到体内，包括口服、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射、局部施用等。除了包含一种或多种糖连苷外，主题药物制剂可包含一种或多种非生物活性化合物，即赋形剂，例如稳定剂(以有助于长期贮存)、乳化剂、结合剂、增稠剂、盐、保鲜剂等。
糖连苷的剂量和数量可依生物活性化合物的常规值而定，但要进行调整以更有效地吸收、传输和细胞摄入。因此，对于口服剂量可为1200毫克/天的病毒唑，相应糖连苷的剂量应包括大约600毫克/天的病毒唑或更少。该剂量可一次全部施用，或者可分为一些较小的剂量以不同的时间间隔施用。
所采用的剂量方案应提供最佳的治疗效果。例如，最优选的剂量应随所选择的具体药剂而变，在施用过程中，剂量可根据治疗情况按比例地增加或减少。
可以以任意适宜的方式施用糖连苷，例如口服、静脉注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射或其他途径。对于口服施用，糖连苷可与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起施用，或者可将糖连苷直接掺入食物中。口服施用的糖连苷可掺入赋形剂，以可咽片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮糖浆、糯米纸囊剂等形式应用。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含：结合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；香味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃香。当剂量单位是胶囊时，除上述类型物质外，它可含有液体载体。不同的载体物质也可作为包衣或用于改变剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶和/或糖包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可包含作为甜味剂的蔗糖，作为保鲜剂的甲基或对羟苯甲酸丙酯，着色剂和香味剂，例如樱桃或range香。这些添加剂在所用量之下应基本上无毒。而且，糖连苷可掺入到缓释制备物和制剂中。
胃肠外施用的制剂可包括无菌水溶液或分散体，和无菌粉末，用于临时制备无菌的，可注射的溶液或分散体。该溶液或分散体也可含有缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂，可被设计为有助于组合物中糖连苷的细胞摄入，例如，糖连苷可被封装于适当的脂质体中。优选地，用于胃肠外施用的溶液和分散体是适于正确施用的无菌的，足量的液体，对制造和应用都足够稳定，可以抗微生物(如细菌和真菌)污染。载体可以是溶剂或分散体介质，含有例如水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们的适当的混合物，以及植物油。可通过例如用卵磷脂包被，或通过维持分散体的所需颗粒大小，以及应用表面活性剂来维持正常的流动性。
无菌的注射液可如下制备：将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，所述溶剂含有一种或多种其他上述成分，然后灭菌。分散体可一般性地通过将不同的无菌活性成分掺入无菌赋形剂中而制备，所述赋形剂含有基本的分散介质和所需的上面列出的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，得到活性成分粉末和任意附加的来自前述过滤除菌溶液的所需成分。
局部施用的药物制剂对于用于局部治疗的某些生物活性化合物是特别有用的。用于局部治疗的制剂包括软膏剂、喷雾剂、凝胶剂、悬液剂、洗剂、霜剂等。用于局部施用的制剂除糖连苷外可包含已知的载体物质，例如异丙醇、甘油、石蜡、十八烷醇、聚乙二醇等。药用载体也可包含化学吸收促进剂。吸收促进剂的实例例如二甲基乙酰胺(美国专利3,472,931号)，三氯乙醇或三氟乙醇(美国专利3,891,757号)，某些醇和其混合物(英国专利1,001,949号)，和英国专利说明书1,464,975号。
糖连苷溶液可以以游离碱或药用盐形式贮存和/或施用，可有利地在水中制备并适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物，以及油中制备。这些组合物和制剂可有利地含有保鲜剂，以防止微生物生长。
可用不同的抗细菌和抗真菌药剂防止微生物的作用，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thmerosal等。在许多情况下，包含等渗剂如氯化钠是有利的。可注射的组合物的延长可利用延缓吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)进行。
所描述的组合物和制剂优选地含有至少0.1％的活性糖连苷。组合物和制剂的百分比当然可以不同，可包含2％-60％(重量)的施用量。在该治疗用组合物和制剂中的活性化合物的量是可以得到合适剂量的量。
如本文中所用，“药用载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌药剂、等渗和吸收延缓剂等。这些用于药物活性物质的介质和药剂的应用是本领域内众所周知的。除了任意常规介质或药剂与治疗性活性成分相容外，它在治疗组合物和制剂中的应用是本发明要求的。补充的活性成分也可被掺入到组合物和制剂中。
本发明的糖连苷除了治疗性应用外，也可被用作实验室工具，用于研究吸收、分配、细胞摄入和效能。
等同物
上面所写的说明书对于本领域技术人员实现本发明应当是充分的。实际上，对于有机化学或相关领域的技术人员来说是显而易见的，为实现本发明而进行的上述各种修改，应被包括在本发明的范围内。