一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料及其制备和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104275167 A (43)申请公布日 2015.01.14 C N 1 0 4 2 7 5 1 6 7 A (21)申请号 201310274854.4 (22)申请日 2013.07.01 B01J 20/286(2006.01) B01J 20/30(2006.01) B01D 15/08(2006.01) C07K 1/14(2006.01) G01N 1/34(2006.01) (71)申请人中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路457号 (72)发明人邹汉法 黄光 欧俊杰 (74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限 公司。

2、 21002 代理人马驰 (54) 发明名称 一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料及其 制备和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种刷型肼聚合物功能化磁性 纳米材料制备及其在糖肽或糖蛋白富集中的应 用。在纳米材料表面引入可逆加成断裂链转移 (RAFT)试剂后，加入有机聚合反应功能单体和有 机聚合反应引发剂，有机功能单体在可逆加成断 裂链转移试剂的调控下进行可控自由基聚合反 应，制备出含刷型聚合物的有机-无机杂化纳米 材料。该有机-无机杂化纳米材料的制备过程简 单、反应条件温和，并可以应用于复杂生物样品中 糖肽或糖蛋白的富集。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (19)中。

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104275167 A CN 104275167 A 1/2页 2 1.一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米微球，其特征在于：磁性纳米微球是于四氧化化 三铁表面包裹硅胶后，通过硅胶上的硅烷化反应，于硅胶上键合刷型肼聚合物，其结构示意 图如下， 2.一种权利要求1所述功能化磁性纳米微球的制备方法，其特征在于：在四氧化三铁 表面包裹二氧化硅的磁性纳米微球表面原位生成RAFT试剂，加入有机聚合反应功能单体 和有机聚合反应引发剂，在RAFT试剂的调控下将功能单体接枝到纳米材料表面形成刷型 聚合物。

4、功能化磁性纳米微球。 3.根据权利要求2所述的制备，其特征在于：可按如下步骤操作， (1)磁性纳米微球表面包覆一层二氧化硅：取0.15-0.30g四氧化三铁纳米微球在超声 作用下分散在60-260mL的无水乙醇中，加入15-52mL水，0.5-3mL质量浓度25-28%的浓氨 水，超声10-60min，再加入1-5mL正硅酸乙酯(TEOS)，在25-55水浴中搅拌1-15h，取出磁 球依次用水和无水乙醇洗涤； (2)包覆上二氧化硅的磁球进行4-氯甲基苯基功能化反应：将步骤(1)制备的包覆 二氧化硅的磁球置于40-100的真空干燥箱中干燥2-24h后，将干燥的磁球加入10-50mL 甲苯，超声分。

5、散10-40min，在氮气保护下滴加50-300L4-氯甲基苯基三氯硅烷，然后超声 1-10min，再滴加120-720L三乙胺，最终的混合物在氮气保护下回流6-36h，取出磁球依 次用甲苯、水、乙醇洗涤，然后置于40-80的真空干燥箱中干燥2-24h； (3)磁球表面原位生成RAFT试剂：在氮气保护下，将6.9-41.5mg镁粉和22.0-46.0mg 碘粒加入到反应瓶中，并向其中加入1-2mL四氢呋喃（内含溴苯1.4-8.7L），吹风机加热 引发后，滴入10-20mL四氢呋喃（内含溴苯28.9-173.6L），在40-60时反应0.5-3.0h， 然后冷却至0，再向其中滴入5-10mL四氢。

6、呋喃（内含二硫化碳23.7-118.4L），0.5-4.0h 后，向所得红色溶液中加入步骤(2)所得磁球，超声5-30min后，该反应液置于40-60的油 浴中反应12-48h，依次用水、乙醇、丙酮洗涤后，置于40-80的真空干燥箱中干燥2-24h； (4)甲基丙烯酸缩水甘油酯以RAFT方式聚合得到刷型聚合物磁球：在希莱克试管中， 加入步骤(3)所得磁球，10-30mL四氢呋喃，超声分散5-30min后，再加入0.5-2.0mL甲基丙 烯酸缩水甘油酯(GMA)，2.0-8.0mg偶氮二异丁腈(AIBN)，冷冻(-60至-80)-脱空气-溶 解循环2-5次，在氮气保护下置于50-65的油浴中反应。

7、12-36h，产物依次用四氢呋喃、乙 醇洗涤后，置于50的真空干燥箱中干燥2-24h； (5)刷型聚合物磁球进行肼功能化：将步骤(4)所得磁球分散到20-50mL无水乙醇中， 超声5-60min后，加入0.5-3.0mL水合肼，在室温下搅拌6-36h，最终的产品用乙醇充分洗涤 后，置于40-70的真空干燥箱中干燥2-24h，制备成刷型肼聚合物功能化磁性纳米微球。 权 利 要 求 书CN 104275167 A 2/2页 3 4.一种权利要求1所述刷型肼聚合物功能化磁性纳米微球的应用，其特征在于：刷型 肼聚合物功能化磁性纳米微球作为吸附剂或填料用于糖肽或糖蛋白的富集和/或纯化。 权 利 要 求 。

8、书CN 104275167 A 1/5页 4 一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及糖基化肽的分离富集，具体地说是一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米 材料及其制备，以及其在糖肽或糖蛋白的选择性分离富集中的应用。 背景技术 0002 蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰，在蛋白质折叠、构象稳定和活性等方 面具有重要影响。糖基化蛋白质参与了蛋白质相互作用、免疫应答、细胞通讯、细胞凋亡等 生命过程。糖基化蛋白质的异常变化可以作为肿瘤发生和发展的一种重要标志。 0003 在糖基化蛋白质组分析中，高效液相色谱质谱联用是分析糖蛋白或者糖肽的一种 有效工具。当样品直接进。

9、质谱分析时，由于糖肽或糖蛋白的含量相对于非糖肽或非糖蛋白 的含量很低，糖肽或糖蛋白的离子信号强度往往会被非糖肽或糖蛋白的离子信号所抑制， 因而在进行蛋白质糖基化分析时，对糖肽或糖蛋白进行预分离和富集是很有必要的。从复 杂的体系中分离富集糖肽或糖蛋白较为有效的方法是酰肼化学法，该方法的主要原理是高 碘酸钠将糖基上的顺式邻二醇氧化成醛，然后与固定在材料上的肼共价结合，从而达到了 分离富集糖肽或糖蛋白的效果。 0004 近年来，尽管有一些商品化的肼材料被广泛应用于细胞表面糖蛋白的提取，但材 料的分离耗时，因而不适合高通量分析。将肼引入到磁性材料表面可以有效地克服这一 缺陷(文献1.Zhiqing Z。

10、ou et.al“Synthesis and Evaluation of Superparamagnetic Silica Particles for Extraction of Glycopeptides in the Microtiter Plate Format”Analytical Chemistry,2008,80,1228-1234.文献2.Shisheng Sun et.al“Isolation of N-linked glycopeptides by hydrazine-functionalized magnetic particles”Analytical and bioan。

11、alytical chemistry,2010,396,3071-3078.)，然 而这些文献中键合到磁球表面的化合物只含有单个肼基团，这样材料表面的肼含量相对较 低，因此富集到糖肽的量是很有限的。在无机纳米粒子表面键合刷型聚合物日益引起广泛 关注，聚合物单体的多样性决定了聚合物类型的多样性，而且刷型聚合物容易后修饰，这样 使得表面键合了聚合物的纳米材料特异性强，灵敏度高，捕捉量大。在磁核上以RAFT方式 制备了刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料并应用于糖肽或糖蛋白的分离富集得方法未见 报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料制备及应用，其可 在磁铁作用下。

12、简单快速地完成糖肽或糖蛋白从复杂生物样品中高效高选择性地分离富集。 0006 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 0007 一种刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料，刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的结 构示意如下， 0008 说 明 书CN 104275167 A 2/5页 5 0009 所述刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的磁性微球平均粒径为300nm。可按如下 步骤操作， 0010 (1)四氧化三铁磁性纳米微球表面包覆一层二氧化硅； 0011 具体为：取0.15-0.30g四氧化三铁纳米微球在超声作用下分散在60-260mL的无 水乙醇中，加入15-52mL水，0.5-3mL浓氨水，超声1。

13、0-60min，再加入1-5mL正硅酸乙酯，在 25-55水浴中搅拌1-15h，取出磁球依次用水和无水乙醇洗涤； 0012 (2)包覆上二氧化硅的磁球进行4-氯甲基苯基功能化反应； 0013 具体为：将制备的包覆二氧化硅的磁球置于40-100的真空干燥箱中干燥 2-24h后，将干燥的磁球加入10-50mL干燥甲苯，超声分散10-40min，在氮气保护下滴加 50-300L4-氯甲基苯基三氯硅烷，然后超声1-10min，再滴加120-720L三乙胺，最终的 混合物在氮气保护下回流6-36h，取出磁球依次用甲苯、水、乙醇洗涤，然后置于40-80的 真空干燥箱中干燥2-24h； 0014 (3)磁球。

14、表面原位生成RAFT试剂； 0015 具体为：在氮气保护下，将6.9-41.5mg镁粉和22.0-46.0mg碘粒加入到反应瓶中， 并向其中加入1-2mL四氢呋喃（内含溴苯1.4-8.7L），吹风机加热引发后，滴入10-20mL四 氢呋喃（内含溴苯28.9-173.6L），在40-60时反应0.5-3.0h，然后冷却至0，再向其中 滴入5-10mL四氢呋喃（内含二硫化碳23.7-118.4L），0.5-4.0h后，向所得红色溶液中加 入步骤(2)所得磁球，超声5-30min后，该反应液置于40-60的油浴中反应12-48h，依次 用水、乙醇、丙酮洗涤后，置于40-80的真空干燥箱中干燥2-24。

15、h； 0016 (4)甲基丙烯酸缩水甘油酯以RAFT方式聚合得到刷型聚合物磁球； 0017 具体为：在希莱克试管中，加入步骤(3)所得磁球，10-30mL干燥四氢呋喃，超声分 散5-30min后，再加入0.5-2.0mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，2.0-8.0mg偶氮二异丁腈， 冷冻(-60至-80)-脱空气-溶解循环2-5次，在氮气保护下置于50-65的油浴中反应 12-36h，产物依次用四氢呋喃、乙醇洗涤后，置于50的真空干燥箱中干燥2-24h； 0018 (5)刷型聚合物磁球进行肼功能化； 0019 具体为：将步骤(4)所得磁球分散到20-50mL无水乙醇中，超声5-60min后，。

16、加入 0.5-3.0mL水合肼，在室温下搅拌6-36h，最终的产品用乙醇充分洗涤后，置于40-70的真 空干燥箱中干燥2-24h，得刷型肼聚合物功能化磁性纳米微球。 0020 所述刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料可用于糖肽或糖蛋白的富集和纯化。蛋白 酶解物在高碘酸钠氧化后刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料与样品中的糖肽或糖蛋白共 价结合，通过洗涤除去非糖肽或非糖蛋白，所富集到的糖肽经PNGase F酶切去糖链后释放 出的肽段或蛋白可直接用质谱进行分析。 说 明 书CN 104275167 A 3/5页 6 0021 本发明具有如下优点： 0022 1.磁核上包覆的二氧化硅可有效地防止四氧化三铁磁球被。

17、酸、碱腐蚀，提高材料 的生物相容性，而且在二氧化硅层上可以进行有效的衍生化，减少了四氧化三铁磁球的非 特异性吸附。 0023 2.纳米磁球的超顺磁性使得材料在磁场作用下容易从溶液中分离出来，磁场撤销 后容易分散开，因而操作简单，而且可以减少离心等前处理步骤带来的样品损失。 0024 3.纳米磁核大的比表面积使得单位质量的材料上具有更多的功能基团，因而具备 了高效的富集能力。 0025 4.刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料具有较好的亲水性和间隔臂，在生理条件下 有很好的生物相容性和稳定性，在空间上可以与糖肽进行很好的相互作用。 0026 5.刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料具有较多的肼基团，因而具有。

18、特异性强，灵 敏度高，捕捉量大等优势。 附图说明 0027 图1为刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的制备示意图。 0028 图2为刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的红外光谱图。 0029 (a)Fe 3 O 4 SiO 2 -GMA,(b)Fe 3 O 4 SiO 2 -RAFT。 0030 图3为刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的透射电镜图。 0031 (a)Fe 3 O 4 SiO 2 -RAFT,(b)Fe 3 O 4 SiO 2 -GMA。 具体实施方式 0032 实施例利用刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料富集糖肽 0033 刷型肼聚合物功能化磁性纳米材料的制备： 0034 1）300g Fe。

19、 3 O 4 颗粒分散到200mL乙醇、50mL水和1.4mL的浓氨水中，超声处理 15min，然后加入1mL TEOS，在室温下搅拌10h，产物用30mL水和乙醇各洗5次，置于50的 真空干燥箱中干燥24h，得Fe 3 O 4 SiO 2 颗粒； 0035 2）将200g Fe 3 O 4 SiO 2 颗粒分散到40mL干燥甲苯中，超声15min后，滴入含4-氯 甲基三氯硅烷(90L)的甲苯溶液8mL，再超声5min后，缓慢滴入含三乙胺(216L)的 甲苯溶液8mL，最终的反应液在氮气保护下回流24h，产物用30mL水和乙醇各洗5次，置于 50的真空干燥箱中干燥24h，得Fe 3 O 4 S。

20、iO 2 -Cl颗粒； 0036 3）将60g镁粉和1粒碘粒加入到反应瓶中，吹风机加热引发后，滴入含溴苯 (238L)的干燥四氢呋喃溶液5mL，在60时反应1.5h，然后冷却至0，再向其中滴入 含二硫化碳(206L)的干燥四氢呋喃溶液5mL，1.5h后，向所得红色溶液中加入200g Fe 3 O 4 SiO 2 -Cl颗粒，超声5min后，在氮气保护下，该反应液置于50的油浴中反应48h，用 30mL水、乙醇、丙酮各洗4次后，置于50的真空干燥箱中干燥24h，得Fe 3 O 4 SiO 2 -RAFT颗 粒； 0037 4）在希莱克试管中，加入100g F e 3 O 4 SiO 2 -RAF。

21、T颗粒，17mL干燥四氢呋喃，超声 分散15min后，再加入1mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，40g AIBN，冷冻(-80)-脱空 气-溶解循环三次，在氩气保护下置于60的油浴中反应24h，产物用20mL四氢呋喃洗6 说 明 书CN 104275167 A 4/5页 7 次，乙醇洗2次后，置于50的真空干燥箱中干燥24h，得Fe 3 O 4 SiO 2 -GMA颗粒； 0038 5）100g Fe 3 O 4 SiO 2 -GMA颗粒分散到30mL无水乙醇中，超声15min后，加入1mL 水合肼，在室温下搅拌24h，最终的产品用乙醇充分洗涤后，置于50的真空干燥箱中干燥 24h，得Fe 。

22、3 O 4 SiO 2 -GMA-NHNH 2 颗粒。 0039 6）纳米材料中肼含量测试，1.16mg Fe 3 O 4 SiO 2 -GMA-NHNH 2 置于1.5mL离心管中， 先用去离子水洗3次，然后再用冰醋酸甲醇溶液(0.8%，V/V)洗4次，再向其中加入过量的 对硝基苯甲醛，1mL冰醋酸甲醇溶液(0.8%，V/V)，所得悬浮液室温反应4h。磁核分离后，用 0.3mL冰醋酸甲醇溶液(0.8%，V/V)洗3次，所得的上清液合并到一起，根据对硝基苯甲醛 的标准曲线计算出该纳米材料中的肼含量为1442nmol/mg。 0040 产物表征 0041 在Fe 3 O 4 SiO2-RAFT(。

23、图2(b)的FT-IR谱中，442，575，1078cm -1 的吸收峰分别属 于Fe-O-Si,Fe-O-Fe和Si-O-Si的振动吸收峰。Fe 3 O 4 SiO 2 GMA(图2(a)的FT-IR谱中， 新出现的2950，2875cm-1的吸收峰属于C-H振动吸收峰，1730cm -1 属于C=O的振动吸收峰， 这些特征峰的出现说明GMA成功接枝到磁核表面。 0042 透射电镜图(图3)中清晰地看见，在图3(a)中，可以清晰地看到核壳结构的磁 核，磁核外面包裹了一层二氧化硅；在图3(b)中，可以清晰地看到三明治结构的磁核，磁核 粒径240nm，中间的二氧化硅层9nm，外层的PGMA为6n。

24、m，这说明GMA成功接枝到磁核表面。 0043 样品溶液的制备：鸡蛋清卵清蛋白(Albumin from chicken egg white)、胎牛血 清胎球蛋白(fetuin from fetal calf serum)、人血浆转铁蛋白(transferrin from human blood plasma)、人血浆 1 -酸性糖蛋白( 1 -acid glycoprotein from human plasma)各 1mg混合溶解在含8M尿素的100mM的碳酸氢铵溶液中(pH=8.2)，加入80mol二硫苏糖 醇，在60恒温1h，再加入160mol碘代乙酰胺，避光40min，用100mM的。

25、碳酸氢铵溶液将 尿素浓度稀释成1M，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37的水浴中反 应时间为16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-30的冰箱中备用。糖基化肽的富集及 Triple TOF5600质谱分析： 0044 1mg四种标准糖肽的混合物酶解物溶解于800L氧化溶液中(100mM醋酸 钠,150mM氯化钠，pH=5.5)，加入200L50mM高点酸钠(NaIO4)，室温下避光反应1h，然后 加入200L100mM Na 2 S 2 O 3 ，室温反应10min，再将反应液加入到5mg的刷型肼聚合物功能化 磁球中，25下振荡过夜反应。反应完全成后，依次用1.5M氯化钠、无。

26、水甲醇、100mM碳酸 氢铵洗去非特异吸附的非糖基化肽段。最终加入1L PNGase F酶，于10mM碳酸氢铵中 37孵育过夜，在外磁场作用下收集上清，冷冻干燥后0.1%FA复溶，再将样品进行Triple TOF5600质谱分析。 0045 分析结果：来自于四个标准糖蛋白酶解的糖肽容易被刷型肼聚合物功能化磁球所 捕获，非糖肽容易被洗脱，说明刷型肼聚合物功能化磁球能特异性地分离富集糖基化肽。 0046 表1.在四种标准糖蛋白酶解液中检测到的糖基化肽 0047 说 明 书CN 104275167 A 5/5页 8 0048 0049 该有机-无机杂化纳米材料的制备过程简单、反应条件温和，并可以应用于复杂 生物样品中糖肽或糖蛋白的富集。 说 明 书CN 104275167 A 1/2页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 104275167 A 2/2页 10 图3 说 明 书 附 图CN 104275167 A 10 。