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1、(10)申请公布号 CN 104294370 A (43)申请公布日 2015.01.21 C N 1 0 4 2 9 4 3 7 0 A (21)申请号 201410474304.1 (22)申请日 2014.09.18 C40B 50/06(2006.01) (71)申请人北京众科生物科技服务有限公司 地址 102300 北京市门头沟区石龙经济开发 区永安路20号3号楼A-1618室 (72)发明人刘艳磊 (54) 发明名称 一种用单条染色体构建文库方法 (57) 摘要 本发明提供一种用单条染色体构建文库方 法，本发明采用分轮扩增的办法，消除了PCR随机 偏向性问题；内切酶可选余地大，灵活。
2、，粘性末端 连接效率高；使用人为设计的接头作特异引物， 可用较高的退火温度，消除了非特异性扩增问题， 采用超声随机打断后，通过加A反映，然后加接头 的做法，属于本发明的扩展，与高通量测序技术相 结合进行物种的基因组从头测序，将消除基因组 测序中多染色体高杂合度不能正确组装和染色间 组装错误问题，为基因组测序开辟广阔的前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104294370 A CN 104294370 A 1/2页 2 1.一种用单条染色体。
3、构建文库方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)对单染色体中的蛋白酶K灭活，加入酶切体系，酶切。 (2)加入等量的正反向单链接头，制作通用接头。加入适量的接头到酶切产物中，使接 头与酶切片段连接。 (3)向连接产物中加入PCR扩增体系，利用小循环多次扩增的方式进行扩增，期间对每 轮的产物合管混合后再分管以降低PCR偏好。 2.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，蛋白酶K的灭活条件为9510-20min。 3.根据权利要求2所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，采用的限制性内切酶为同尾酶，方便接头的设计。 4.根据权利要。
4、求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，利用T4DNA连接酶缓冲液替换原限制性内切酶的缓冲液。 5.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，酶切的体系为 6.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，酶切的条件为373小时处理，并6510min灭活限制性内切酶。 7.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(2) 中，接头的序列为 正向接头5-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3 反向接头5-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3 。 8。
5、.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(2) 中，接头的制作条件为945-10min，5220-30min处理之后在室温下放置2-3h。 9.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤(2) 中，连接的体系为 。 权 利 要 求 书CN 104294370 A 2/2页 3 10.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤 (2)中，连接的条件为16-20恒温连接10小时。 11.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步骤 (3)中，采用小循环多次扩增的方式进行扩增，产物合管混。
6、合后再分管以降低PCR偏向。 12.根据权利要求1所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于：所述步 骤(3)中，PCR扩增的程序为943min，1cycle；9430S，5240S，7250S，10cycle； 7210min4，1cycle。 13.根据权利要求1-12中任一所述的一种用单条染色体构建文库方法，其特征在于： 所述实验材料为单条染色体。 。 权 利 要 求 书CN 104294370 A 1/7页 4 一种用单条染色体构建文库方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用单条染色体构建基因组文库的方法，尤其涉及一种用单条染色 体构建文库方法。 背景技术 0002 基因组序列信。
7、息是了解物种遗传信息的最基本、最全面、最重要的途径。随着新一 代测序技术或称为高通量测序技术的出现，不少物种的全基因组测序已经完成，为这些物 种基因资源的开发利用提供了便利，也为其他物种的基因组测序提供了有益的参照。如今， 高通量测序技术成本不断下降，越来越多的物种可望用高通量测序技术实现全基因组从头 测序。然而，由于目前常用的高通量测序技术的读长短，基因组的正确组装仍是巨大的挑 战，尤其是杂合度高的植物只能得到基因组框架图而非精细图。解决基因组测序杂合度问 题的最佳途径是单染色体测序。如果能解决单染色体建库的技术问题，那么任何物种的全 基因组测序就有了希望。因此，本发明以已经分离出的牡丹第5。
8、号染色体为例，探索用单条 染色体构建全染色体文库的技术途径，为单染色体测序提供技术准备。 0003 本发明采用内切酶消化后引入接头而后通过基因组无偏PCR扩增的建库方法。首 先用识别四个碱基的II型限制性内切酶对单条染色体进行消化，使其成为带有粘性末端 的小片段，用连接酶向片段的两端加上预先设计好的接头，然后利用接头做引物进行多轮 PCR扩增，实现单染色体片段的倍增，从而达到高通量测序的要求。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的不足，而提供一种用单条染色体 构建文库方法。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种用单条染色体构建文库方 法，酶切时采。
9、用了来自NEW England Biolabs的Acil限制性内切酶；HinPll限制性内切酶； HpyCH4IV限制性内切酶；Mspl限制性内切酶，浓度均为10unit/L。这四种酶为同尾酶， 即识别序列不同，但是所切出的粘性末端相同。使用同尾酶的好处是可以设计通用的接头 和引物，即方便又经济。为了使内切酶消化后的DNA片段适合高通量测序的读长，本发明采 用双酶切体系。 0006 在连接实验中，选用了T4DNA连接酶，这种酶在16-20的条件下活性较大，连接 效率较好。 0007 在PCR过程中，采用了保真性较好KOD-plus，浓度为1unit/L，这种聚合酶产自 Toyobo，其保真性是。
10、普通聚合酶的几百倍。 0008 在接头的选择上以广泛使用的Sau3Al接头为基础，进行了适当的改良，使其与粘 性末端匹配更好。接头的序列如下： 0009 正向接头5-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3 0010 反向接头5-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3 说 明 书CN 104294370 A 2/7页 5 0011 正向接头的相对分子质量5868.8，每OD的质量为27.9微克，长度为19个碱基， 每OD的摩尔数为4.7nmol。反向接头的相对分子质量6367.3，OD的质量为28.5微克，长 度为21个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。双链接头的相对分子质量为1。
11、2236.1，在制作 接头时加入等摩尔数的正反向寡核苷酸片段，先在94的条件下充分变性，然后再自然降 温至室温，降低错配的可能性。 0012 本发明的实验步骤如下。 0013 (1)双内切酶消化 0014 酶切的体系如下： 0015 0016 在前期对单染色体进行去蛋白处理时加入了蛋白酶K，所以在进行酶切实验之 前要在9510min的条件下灭活。然后进行酶切，酶切操作的程序为：373小时处理， 6510min灭活限制性内切酶。 0017 因为在本次发明中，关键的环节就在于接头能否与酶切片段高效连接，只有连接 了接头的酶切片段才能在所加引物的引导下得到扩增。II型限制性内切酶对缓冲液的要求 比较。
12、低，为了保证T4DNA连接酶的活性，选择用T4DNA连接酶的缓冲液作为限制性内切酶切 时的缓冲液。 0018 (2)连接 0019 连接体系的如下： 0020 0021 采用的程序16恒温连接10小时。 0022 (3)多轮PCR扩增 0023 第一轮 0024 PCR体系为连接产物15L；KOD-plus高保真酶0.5L；KOD-plus dNTP 2.5L； 说 明 书CN 104294370 A 3/7页 6 KOD-plus buffer 2.5L；KOD-plus镁离子2.0L；引物2.5L。扩增程序为943min； 9430s，5240s，7250s，10个循环；7210min，4。
13、保存。 0025 第二轮 0026 将第一轮PCR产物均分为5管进行第二轮PCR扩增。 0027 PCR体系为第一轮PCR产物5L；KOD-plus高保真酶0.2L；KOD-plus dNTP 1L；KOD-plus buffer 1L；KOD-plus镁离子0.8L；引物2L。运行程序与第一轮扩 增相同。 0028 第三轮 0029 将第二轮PCR产物合管，然后均分为10管进行第三轮PCR。 0030 PCR体系为第二轮PCR产物5L；KOD-plus高保真酶0.2L；KOD-plus dNTP 1L；KOD-plus buffer 1L；KOD-plus镁离子0.8L；引物2L。运行程序与。
14、第一轮扩 增相同。 0031 第四轮 0032 将第三轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第四轮PCR扩增。 0033 PCR体系为第三轮PCR产物10L；KOD-plus高保真酶0.4L；KOD-plus dNTP 2L；KOD-plus buffer 2L；KOD-plus镁离子1.6L；引物4L。运行程序与第一轮扩 增相同。 0034 第五轮 0035 将第四轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第五轮PCR扩增。 0036 PCR体系为第四轮PCR产物20L；KOD-plus高保真酶0.8L；KOD-plus dNTP 4L；KOD-plus bu。
15、ffer 4L；KOD-plus镁离子3.2L；引物2L；无菌水6L。运行程 序与第一轮扩增相同。 0037 第六轮 0038 将第五轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第六轮PCR扩增。 0039 与前几轮PCR扩增不同，这轮的PCR只将第五轮的PCR产物混合后再均分为10管， 不添加任何试剂，使存在于产物中的酶和引物继续反应，尽可能地消耗残存的引物。运行程 序与第一轮扩增相同。 0040 第七轮 0041 将第六轮的PCR扩增产物混合充分，向其中补加同以上比例的酶，引物，缓冲液， 镁离子等40L，然后均分为10管，进行PCR扩增。运行程序与第一轮扩增相同。 0042 以。
16、上七轮PCR扩增共进行了总和70个循环的PCR，扩增产物达到高通量测序要求。 0043 这种方法在实验时底物只需一条染色体，不存在杂合度问题。我们采用分轮扩增 的办法，消除了PCR随机偏向性问题。内切酶可选余地大，灵活，粘性末端连接效率高。使 用人为设计的接头作特异引物，可用较高的退火温度，消除了非特异性扩增问题。采用超声 随机打断后，通过加A反映，然后加接头的做法，属于本发明的扩展。 0044 这项技术的发明为微量DNA构建基因组文库提供了参考的途径。本发明与高通量 测序技术相结合进行物种的基因组从头测序，将消除基因组测序中多染色体高杂合度不能 正确组装和染色间组装错误问题，为基因组测序开辟。
17、广阔的前景。 说 明 书CN 104294370 A 4/7页 7 附图说明 0045 图1为牡丹五号单染色体的扩增结果。 0046 图2为酶Acil，Mspl组合的PCR产物；酶Acil，HinPll组合的PCR产物；酶 HpyCH4IV，Mspl组合的PCR产物；酶HinPll，Mspl组合的PCR产物的浓度和A260/280的比 值。 0047 图1中：01为Trans2k plus DNA Marker；02-06依次为引物；酶Acil，Mspl组合的 PCR产物酶Acil，HinPll组合的PCR产物；酶HpyCH4IV，Mspl组合的PCR产物；酶HinPll， Mspl组合的PC。
18、R产物。 具体实施方式 0048 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。 0049 一种用单条染色体构建文库方法，酶切时采用了来自NEW England Biolabs的 Acil限制性内切酶；HinPll限制性内切酶；HpyCH4IV限制性内切酶；Mspl限制性内切酶， 浓度均为10unit/L。这四种酶为同尾酶，即识别序列不同，但是所切出的粘性末端相同。 使用同尾酶的好处是可以设计通用的接头和引物，即方便又经济。为了使内切酶消化后的 DNA片段适合高通量测。
19、序的读长，本发明采用双酶切体系。 0050 在连接实验中，选用了T4DNA连接酶，这种酶在16-20的条件下活性较大，连接 效率较好。 0051 在PCR过程中，采用了保真性较好KOD-plus，浓度为1unit/L，这种聚合酶产自 Toyobo，其保真性是普通聚合酶的几百倍。 0052 在接头的选择上以广泛使用的Sau3Al接头为基础，进行了适当的改良，使其与粘 性末端匹配更好。接头的序列如下： 0053 正向接头5-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3 0054 反向接头5-CGCTGAGCTCGAATTCGACCC-3 0055 正向接头的相对分子质量5868.8，每OD的质量为2。
20、7.9微克，长度为19个碱基， 每OD的摩尔数为4.7nmol。反向接头的相对分子质量6367.3，OD的质量为28.5微克，长 度为21个碱基，每OD的摩尔数为4.7nmol。双链接头的相对分子质量为12236.1，在制作 接头时加入等摩尔数的正反向寡核苷酸片段，先在94的条件下充分变性，然后再自然降 温至室温，降低错配的可能性。 0056 本发明的实验步骤如下。 0057 (1)双内切酶消化 0058 酶切的体系如下： 0059 说 明 书CN 104294370 A 5/7页 8 0060 在前期对单染色体进行去蛋白处理时加入了蛋白酶K，所以在进行酶切实验之 前要在9510min的条件下。
21、灭活。然后进行酶切，酶切操作的程序为：373小时处理， 6510min灭活限制性内切酶。 0061 因为在本次发明中，关键的环节就在于接头能否与酶切片段高效连接，只有连接 了接头的酶切片段才能在所加引物的引导下得到扩增。II型限制性内切酶对缓冲液的要求 比较低，为了保证T4DNA连接酶的活性，选择用T4DNA连接酶的缓冲液作为限制性内切酶切 时的缓冲液。 0062 (2)连接 0063 连接体系的如下： 0064 0065 采用的程序16恒温连接10小时。 0066 (3)多轮PCR扩增 0067 第一轮 0068 PCR体系为连接产物15L；KOD-plus高保真酶0.5L；KOD-plus。
22、 dNTP 2.5L； KOD-plus buffer 2.5L；KOD-plus镁离子2.0L；引物2.5L。扩增程序为943min； 9430s，5240s，7250s，10个循环；7210min，4保存。 0069 第二轮 0070 将第一轮PCR产物均分为5管进行第二轮PCR扩增。 0071 PCR体系为第一轮PCR产物5L；KOD-plus高保真酶0.2L；KOD-plus dNTP 1L；KOD-plus buffer 1L；KOD-plus镁离子0.8L；引物2L。运行程序与第一轮扩 增相同。 0072 第三轮 0073 将第二轮PCR产物合管，然后均分为10管进行第三轮PCR。。
23、 说 明 书CN 104294370 A 6/7页 9 0074 PCR体系为第二轮PCR产物5L；KOD-plus高保真酶0.2L；KOD-plus dNTP 1L；KOD-plus buffer 1L；KOD-plus镁离子0.8L；引物2L。运行程序与第一轮扩 增相同。 0075 第四轮 0076 将第三轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第四轮PCR扩增。 0077 PCR体系为第三轮PCR产物10L；KOD-plus高保真酶0.4L；KOD-plus dNTP 2L；KOD-plus buffer 2L；KOD-plus镁离子1.6L；引物4L。运行程序与第一轮扩。
24、 增相同。 0078 第五轮 0079 将第四轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第五轮PCR扩增。 0080 PCR体系为第四轮PCR产物20L；KOD-plus高保真酶0.8L；KOD-plus dNTP 4L；KOD-plus buffer 4L；KOD-plus镁离子3.2L；引物2L；无菌水6L。运行程 序与第一轮扩增相同。 0081 第六轮 0082 将第五轮的10管PCR产物混合充分，然后将其均分为10管，进行第六轮PCR扩增。 0083 与前几轮PCR扩增不同，这轮的PCR只将第五轮的PCR产物混合后再均分为10管， 不添加任何试剂，使存在于产物中的酶和引物。
25、继续反应，尽可能地消耗残存的引物。运行程 序与第一轮扩增相同。 0084 第七轮 0085 将第六轮的PCR扩增产物混合充分，向其中补加同以上比例的酶，引物，缓冲液， 镁离子等40L，然后均分为10管，进行PCR扩增。运行程序与第一轮扩增相同。 0086 以上七轮PCR扩增共进行了总和70个循环的PCR，扩增产物达到高通量测序要求。 0087 实施例一：下述实施例中对DNA的产率和质量的检测方法如下： 0088 (1)电泳检测 0089 通过1琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物的情况和浓度。取1L PCR扩增产 物，加9L电泳缓冲液，混匀后点入1琼脂糖凝胶，在150V的电压下电泳15min，紫外。
26、凝 胶成像仪上观察并拍照。 0090 (2)分光光度计检测 0091 取1L DNA原液，用美国NanoDrop 2000微量分光光度计测定五种DNA提取方法 提取的DNA的OD值及A260/280比值。根据分光光度计测定的DNA的OD值计算DNA的产 率。 0092 实施例 0093 结果如下：牡丹五号染色体的扩增 0094 在切割出牡丹五号单染色体的基础上，利用前文的实验步骤进行实验，实验结果 如下： 0095 1、胶检结果 0096 图1为单染色体扩增实验的结果，从图中可以看出，PCR扩增产物的大小在 100bp-1000bp之间，大部分集中在250bp-100bp之间，这个实验结果和我。
27、们预想中的结果 符合，这说明实验获得了初步的成功。 说 明 书CN 104294370 A 7/7页 10 0097 2、DNA的质量 0098 现有技术中，一般认为，用紫外分光光度计检测，高纯度DNA的A260/280比值应在 1.82.0之间。当A260/280小于1.8时，说明DNA样品中存在蛋白质的污染，当A260/280 大于2.0时，说明DNA样品中RNA含量较高。如图2为实验产物的检测结果。 0099 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。 说 明 书CN 104294370 A 10 1/1页 11 图1 图2 说 明 书 附 图CN 104294370 A 11 。