酶复合物 本发明涉及利用预处理过的黑麦稀釜馏物作为木聚糖酶形成的诱导物而制备富含木聚糖酶的酶复合物的发酵方法。
我们知道，木聚糖酶是一种酶的术语，它指半纤维素酶，能将木聚糖(或“树胶”)水解成木糖和其它糖。该酶还称为内切-1,4-β-D-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶，它属于EC3.2.1.8酶类。木聚糖本身是得自1,4-β-葡糖苷键连的D-吡喃木糖的多糖，它们具有不同组成的短侧链，在其分子中还包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和/或葡糖醛酸以及乙酰基和甲基；木聚糖是多种落叶性树木和针叶树以及谷物、糠、果胶、黄蓍胶、植物胶等的成分。因为它们存在于木材中，所以木聚糖属于存在最广的天然原料。鉴于它们的结构多样性，完全降解支化的、部分乙酰化的木聚糖需要多种木聚糖酶的作用，通过木聚糖酶的作用使木聚糖水解成木糖和其它糖。木聚糖酶的作用方式复杂且通常是与其它(在某种程度上协同作用)酶结合而实现其作用的。
木聚糖酶是通过真菌如木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、Talaromyces和侧孢霉属(Sporotrichum)以及细菌如梭菌属(Clostridium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、高温单孢菌属(Thermononspora)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)形成地。它们在纤维素工业中主要用作漂白剂和改进剂，而近来被用于制备动物饲料。关于后一种应用领域，有关外源酶如木聚糖酶在含黑麦、大麦或黑小麦的饲料中应用的研究表明：各种制剂对于减小非淀粉多糖的抗营养作用可产生有益影响，并能改善动物肠内的消化性和营养物吸收作用。现在尤其用于供煎烤雏鸡的饲养方面最重要的一组酶就是能水解存在于谷物如大麦、小麦和黑麦中的非淀粉多糖的那些酶。市场上已有含这类酶的数种制剂，例如RoxazymeG(Roche)，它含有纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶作为主要酶。将这类制剂与动物饲料混合，是因为它们在动物饲料中的上述优点；按本发明制备的富含木聚糖酶的酶复合物用作生产这类制剂的很有用的原料。木聚糖酶作为家禽营养物中饲料添加剂的应用代表了一个重要的应用领域，与没有这种饲料添加剂的低能量谷物如大麦、燕麦、黑麦和黑小麦所能达到的营养价值相比，它可大为提高用它生产的供煎烤雏鸡饲料的营养价值〔参见兽医药物月刊(Mh.Vet.-Med.)48,213-217(1993)以及其中引用的文献〕。
如上所述，本发明涉及制备所述酶复合物的方法，即通过在基本上含碳源、氮源和特定盐的营养培养基中培养木霉属产木聚糖酶的微生物，然后从营养培养基分离形成的富含木聚糖酶(同时纤维素酶和β-葡聚糖酶减少了)的酶复合物。特别是，木霉属微生物是多糖分解活性的有效形成物，它优先使纤维素分解(即它的活性优选针对纤维素的降解)。人们进行了很多试验旨在改变该活性范围，尤其是想选择性地增大木聚糖分解活性。为此将含木聚糖的物质加到营养培养基(发酵培养基)中以实现诱导形成木聚糖酶。这些物质的实例有：纯化的木聚糖、小麦麸、大麦颖片(barley glume)、磨碎的玉米棒子(玉米芯子粉)、秸杆和黑麦稀釜馏物。通过该方法可以使活性范围转向更高的木聚糖酶活性〔参见下列文献的技术背景：德国专利说明书DD278359和DD291673；欧洲专利公开(EP)0455928A1；应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)40,224-229(1993)；以及酶&微生物技术(Enzyme & Microb.Technol.)18,495-501(1996)〕。特别是，该诱导物效果可应用黑麦稀釜馏物以成本效益的方式实现；然而，黑麦稀釜馏物随着浓度的增大对各微生物的生长和酶形成产生抑制效果。
意外地，现已发现对用作诱导物的黑麦稀釜馏物的一种特别的预处理，即通过蒸发水和其它挥发性组分，可消除上述天然黑麦稀釜馏物活性的不利抑制作用并且同时增大诱导物活性，所以这样处理过的黑麦稀釜馏物的浓缩形式有利于应用。由于这种处理诱导的、在微生物(于发酵罐中)培养期间实现的酶的形成使酶范围产生显著变化：木聚糖分解活性超过其它酶的活性(即纤维素分解活性和葡聚糖分解活性)几百个百分数：实现了有利于木聚糖酶的木聚糖酶/纤维素酶之比惊人的转变。
本发明的目的是，通过在特定的营养培养基中培养木霉属产木聚糖酶的微生物而制备富含木聚糖酶(同时纤维素酶和β-葡聚糖酶减少了)的酶复合物。
该目的按本发明得以实现：在培养时应用预处理过的黑麦稀釜馏物作为木聚糖酶形成的诱导剂(下文称为“木聚糖酶诱导物”)且同时作为碳源，该预处理包括除去黑麦稀釜馏物中的固体组分，通过蒸发水和其它挥发性物质浓缩非挥发性组分，接着高压灭菌由此得到的黑麦稀釜馏物。
作为可用于本发明方法中以制备富含木聚糖酶的酶复合物的、木霉属产木聚糖酶的微生物，尤其可考虑的有得自野生菌株QM6a的Trichoderma(T.)reesei突变体，例如QM9123、QM9414、M18.2、M18.2-y、Rut M-7和Rut NG-14(参见Bland S.Montenecourt,“Trichoderma reesei纤维素酶”，生物技术进展(“Trichoderma reeseicellulases”,Trends in Biotechnology),Vol.1,No.5,pp 156-160,1983及其中引用的文献)。
上述微生物菌株有些已被保藏，即QM6a： ATCC 13631,CCM F-560,CMI 45548,DSM 768；QM9123： ATCC 24449；QM9414： ATCC 26921,CCM F-522,DSM 769；M18.2： DSM 10683；以及M18.2-y DSM 7537.
微生物菌株T.reesei QM6a、QM9123和QM9414都被列入国际保藏机构的目录中，例如德国微生物保藏中心(DSM)和/或美国典型培养物保藏中心(ATCC)，所以它们可从这些机构或其它途径商购。微生物菌株M18.2已于1996.5.14由BiopractGmbH,Rudower Chaussee 5,D-12489 Berlin保藏在DSM，属于长期保藏，给予保藏号为DSM 10683；1988.6.12 DSM收到Biopract GamH的要求，即要求将该保藏物转变成按布达佩斯条约下保藏的保藏物。最后，微生物菌株M18.2-y原先按布达佩斯条约下于1989.8.31保藏在耶拿的the Zentralinstitut rür mikrobielleund experimentelle Therapie(ZIMET)，给予保藏号为IMET43915。于1993.3.4该菌株被转到Braunschweig的DSM并获新保藏号为DSM 7537。由于所有权的变化使微生物菌株T.reeseiM18.2-y最终成为F.Hoffmann-La Roche AG的财产。
在本发明方法中用作木聚糖酶诱导物且同时作为碳源的、预处理过的黑麦稀釜馏物来自稀釜馏物(酒槽或造酒厂的“蒸馏废液”)，它可得自谷物制酒残液，人们常常认为这是一种废产物。(未处理过的)黑麦稀釜馏物以如下方式导致从黑麦生产酒精：基于黑麦、水和酶(外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶)，在约30℃下通过酵母的作用使黑麦淀粉发酵3天而得酒精。蒸馏出酒精后，大致不含黑麦淀粉的混合物以黑麦稀釜馏物的形式残留。
不同批的黑麦稀釜馏物组分各不相同，对于天然产品来说这是正常的；这些组分主要包括：糖类(纤维类、半纤维素、戊聚糖)、少量的白蛋白、矿物质，脂肪以及残留量的乙醇，还有酵母发酵的其它产物。
黑麦稀釜馏物的预处理基本上包括：除去固体物质，浓缩非挥发性组分和高压灭菌所得浓缩物。这些预处理步骤具有下列优选的特点：
-通过倾析和运用板式分离器(例如SA1型，WestfaliaSeparator AG,Oelde,Germany)分离而除去黑麦稀釜馏物中的固体组分。待弃去的含固体部分的体积占黑麦稀釜馏物体积的约30％～约50％。
-运用旋转式真空蒸发器(例如VUV20-I型，Schott & Gen,Jena,Germany)在约40℃～约50℃的沸腾温度、相应于该温度的无固体黑麦稀釜馏物的蒸汽压下浓缩无固体黑麦稀釜馏物的非挥发性组分。在这些条件下约1小时后可实现所希望的无固体黑麦稀釜馏物体积减少约80％～约90％。相应地非挥发性组分的浓缩达到约1∶5-约1∶10(约5～约10倍)。
-在约121℃(适当地121±1℃)下高压灭菌已浓缩的无固体黑麦稀釜馏物至少达约30分钟。
不但预处理过的黑麦稀釜馏物，而且可考虑用其它碳源作为本发明方法中的营养培养基，其它碳源尤其是乳糖、纤维素、大聚糖、小麦麸、葡萄糖浆和喷雾干燥的玉米浸泡液浓缩液。
特别优选的其它碳源有乳糖、纤维素和燕麦颖片木聚糖。
作为营养培养基的氮源，尤其可考虑硫酸铵〔(NH4)2SO4〕、氨水〔NH3·H2O〕和脱油的大豆粉(作为有机氮源)。氮源含量一般占基于碳源计的至少20％。
可考虑例如应用磷酸二氢钾〔KH2PO4〕作为营养培养基的磷源。磷源含量一般占基于碳源计的至少2.5％。
营养培养基一般含有其它盐，因此尤其可考虑镁、铁、锰和锌的硫酸盐以及钙和钴的氯化物。
作为营养物的其它组分，例如可应用消泡剂，如M-30(ServaFeinbiochemica,Heidelberg,Germany)、Glanapon DG 102(Bussetti,Vienna,Austria)或MAZU8005(Quest International,Cork,Ireland)。
在本发明方法中，一般应用基于培养基总体积计约35～约45g/l、优选约40g/l、浓缩10倍的预处理过的黑麦稀釜馏物。Trichoderma reesei种菌的体积一般占培养基总体积的约10％。
培养时的pH值一般在约5.5～约6.5的范围内，优选约为6.0。培养基中pH值一般是用浓度约12.5％～约25％(基于NH3)的氨水来进行调节的。
至于培养温度，一般约28℃～约34℃，优选约31℃。
应用的发酵装置可以是完全常规的培养器(发酵罐)，必须对发酵装置采取预防措施以排除外源侵染。这类培养器通常尤其是具有搅拌装置和充气装置以提供空气，因为按本发明进行的培养过程是需氧深层微生物培养。将搅拌速度和空气供应量适当地调节到使培养基中的氧含量不低于氧饱和值的约10％。
特别适于实施本发明方法的操作技术是所谓的“分批进料技术”，其中第一步(分批阶段)包括分批发酵，接着是底物引入步骤(分批进料阶段)。
分批阶段的作用是在营养培养基中培养菌丝体，注射(接种)发酵罐可方便地分(ⅰ)～(ⅲ)三步实施：(ⅰ)用无菌自来水从微生物储备库冲洗斜面琼脂培养物的分生孢子。该水一般含有乳化剂，如Tween80(此情况下优选约1g/l的浓度)。分生孢子悬浮液被适当地调节到至少5×108个分生孢子/l，特别是5×108～1×109个/l。
(ⅱ)将步骤(ⅰ)中生产的分生孢子悬浮液注射入摇瓶，这些摇瓶中适当地含有基于葡萄糖或纤维素作C源的、Trichoderma reesei属微生物的已知营养培养基，磷酸盐，硝酸盐，脲，胨和痕量元素〔例如参见R.Haapala,E.Parkkinen,P.Suominen和S.Linko,“通过固定化Trichoderma reesei于摇瓶培养物中生产胞外酶”，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)43,815-821(1995)〕。分生孢子悬浮液与营养培养基的体积比一般在约1∶25到约1∶50。在这些摇瓶中，分生孢子在约31℃±1℃(30-32℃)下培养，最好是约为31℃，摇动频率为约200～约300rpm，优选约250rpm，直到培养基中形成良好分枝的菌丝体。不应看出形成孢子。
(ⅲ)将步骤(ⅱ)中生产的培养基注射入发酵罐，使发酵罐内培养基与营养培养基的体积比一般为约1∶5～约1∶10，优选约1∶5。
酶的形成主要是在后续的分批进料阶段发生的。底物溶液的添加(引入底物)，优选为作为诱导物的预处理过的黑麦稀釜馏物，作为有机氮源的脱油的大豆粉或大豆粉母液，以及作为碳源的乳糖的添加是适当地通过控制装置或运用分析方法对菌丝体中特定的二氧化碳释放进行过程控制而调节的。底物的引入例如可通过发酵废气中的二氧化碳浓度来控制或者按经验确定的时间方案进行控制。
按本发明的进一步方面，将另外的脱油大豆粉或大豆粉母液用作(另外的)氮源。已证实通过将脱油的大豆粉或大豆粉母液加入预处理过的黑麦稀釜馏物中可进一步增大木聚糖酶产量。因此推测脱油的大豆粉或大豆粉母液具有木聚糖酶诱导物的作用。
脱油的大豆粉一般是大豆磨粉的商品。培养基中脱油大豆粉的浓度在分批阶段一般为约20～30g/l营养培养基而在分批进料阶段一般约为15～25g/l底物溶液，优选分别为约25g/l和约20g/l。
替换应用的大豆粉母液是脱油大豆粉组分的水溶液。大豆粉母液是通过将脱油的大豆粉悬浮于水(约35g/l)而制备的。将此悬浮液煮沸约10分钟，冷却至室温后滤去固体组分。无固体滤液(大豆粉母液)的体积占过滤前大豆粉悬浮液体积的约80％。优选在分批进料阶段将大豆粉母液用作脱油大豆粉的替代物，大豆粉粉母液的体积相当于脱油大豆粉的重量(weighed amount)。
按本发明方法生产的酶复合物的分离及其纯化和浓缩可按本来已知的方法进行。这类方法的基本要求是低的介质温度(约5℃～约15℃)和低pH值(约4～约4.5)以及无菌条件。这类方法一般包括：
一通过离心或过滤或微量过滤从发酵培养基中分离生物量；
-通过超滤浓缩酶复合物；
-生产固体酶制剂时，酶复合物浓缩后可进行喷雾干燥。
按本发明方法获得的酶复合物的主要应用领域是它作为动物饲料生产中饲料添加剂的应用。该酶复合物可用作非加工(non-worked up)的发酵培养基、培养滤液、酶浓缩物或作为固体制剂。
本发明通过如下实施例而得以阐述。
实施例
在分批进料发酵中应用Trichoderma reesei M18.2-y(DSM7537)制备富含木聚糖酶的酶复合物。
制备黑麦稀釜馏物的浓缩物，在真空、约50℃下将黑麦稀釜馏物的无固体部分浓缩7.5倍，再在121℃下高压灭菌约30分钟。
制备分批阶段的营养培养基，将含有20.8g/l乳糖、8.3g/l微晶纤维素、25g/l脱油的大豆粉、33.3ml/l黑麦稀釜馏物的浓缩物、3.75g/l KH2PO4、6.0g/l(NH4)2SO4、0.5g/lMgSO4·7H2O、0.5g/l CaCl2·2H2O、6.25mg/lFeSO4·7H2O、2.0mg/l MnSO4·H2O、1.75mg/lZnSO4·7H2O和2.5mg/l CoCl2·6H2O的1800ml营养培养基在121℃、5l发酵罐中高压灭菌20分钟，再用12.5％氨水将pH调节至6.0。
制备分批进料阶段的底物溶液，将含有300g/l乳糖、10g/l纤维素、500ml/l大豆粉母液和107ml/l黑麦稀釜馏物的浓缩物的1000ml底物和诱导物溶液在121℃下高压灭菌20分钟。(500ml大豆粉母液的制备：将20g大豆粉悬浮于600ml水；将悬浮液煮沸10分钟再滤去固体成分。)
在分批阶段，用300ml摇瓶预培养物接种发酵罐。为了制备合适的接种物，各将3ml含1g/l TWEEN80(聚氧乙烯山梨聚糖油酸酯)的无菌自来水引入两个得自储备库的斜面琼脂管，摇掉两个琼脂表面的分生孢子。在下列步骤中将等体积的分生孢子悬浮液注射入各含100ml营养培养基的三个摇瓶中。该营养培养基包括：20g/l葡萄糖、15.0g/lKH2PO4、4.8g/l(NH4)2SO4、0.3g/lCaCl2·2H2O、0.3g/lMgSO4·7H2O、5.0mg/lFeSO4·7H2O、1.6mg/l MnSO4·H2O、1.4mg/l ZnSO4·7H2O和2.0mg/l CoCl2·6H2O。然后在31℃和约250rpm的摇动频率下培养这些摇瓶预培养物。不调节培养基的pH值。开始培养时pH值约为5，结束时约为3.5。培养约28小时后将这些摇瓶预培养物注射入发酵罐。然后用12％氨水将pH值调节至6.0。应用搅拌器级联调节将氧含量保持在31℃下氧饱和值的约10％。培养21小时后，发酵罐废气中超过了首次CO2最大值，于是分批阶段结束。
在分批进料阶段，当废气中CO2含量降到首次最大值的80％之后，开始不连续添加底物。每次添加导致又一次的CO2最大值。当废气中CO2含量降到前次最大值的80％之后就自动进行分批的添加。加入的底物溶液体积相当于在每升培养其中加入1.5g乳糖以及从发酵50小时起每升培养基中加入2.0g乳糖。
72小时后冷却到10℃并将pH值调节到4.5而终止发酵。滤掉菌丝体，将残余的发酵液进行分析。发酵培养基中的酶活性为：木聚糖酶： 2625U/mlβ-葡聚糖酶： 555U/ml羧甲基纤维素酶(CMC酶)： 330U/ml
发酵培养基中溶解的蛋白质浓度达 17.0g/l。
酶和蛋白质测定：
木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶)的活性是通过与0.5％木聚糖(木聚糖来自燕麦颖片，Roth)在40mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)中的悬浮液在50℃下保温20分钟而测定的。一个单位(U)木聚糖酶每分钟释出1mol木糖。
β-葡聚糖酶(内切-1,3-1,4-β-葡聚糖酶)的活性是通过与0.5％地衣淀粉(地衣淀粉，Carl Roth GmbH,Karlsruhe,Germany)在40mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)中的悬浮液在50℃下保温20分钟而测定的。
CMC酶(内切-1,4-β-葡聚糖酶)的活性是通过与2.0％羧甲基纤维素钠盐(Carl Roth GmbH)在40mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)中的溶液在50℃下保温20分钟而测定的。一个单位(U)β-葡聚糖酶或CMC酶每分钟释出1mol葡萄糖。
当蛋白质沉淀(加入三氯乙酸)后进行蛋白质测定，应用基于二辛可酸：Sigma Procedure No.TPRO-562(Sigma Chemical Co.,St.Louis,USA)的Lowry的改进方法进行测定。