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多基因转染的细胞株及其构建方法
    本发明涉及生命科学领域，特别是一种多基因转染的细胞株及其构建方法。

    基因治疗是近年兴起的一种生物高技术治疗方案，被认为是治愈恶性肿瘤最有希望的方案之一，世界各国均投入相当大的科研力量及科研基金进行研究。尽管基因治疗已在动物体内取得较大成功，但目前对肿瘤治疗103个临床方案中，其效果并不理想，主要原因是目前的基因治疗多采用单基因治疗方案，而单基因治疗存在以下问题：(1)单基因治疗若采用直接抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细胞的基因，则要求基因转染的载体系统能高效且特异性地将基因转染肿瘤细胞，而目前的基因转染系统不可能达到上述要求，具最高转染率的腺病毒载体也只能部分转染肿瘤细胞，因此难以起明显临床疗效；(2)单基因治疗若采用免疫基因治疗，即加强肿瘤细胞的免疫原性或机体免疫效应细胞的反应性，虽可避免上述载体系统的局限性，但在免疫基因治疗的设计思路方面，或是着眼于肿瘤免疫原性缺陷，或是仅考虑增强免疫效应细胞(如T细胞)的反应性，这种方案在动物实验中取得很大成功，而在临床试验中并不理想，其原因是人体肿瘤在病毒或化学致癌物作用下，经过癌变到肿瘤演进多阶段的过程，不仅在肿瘤抗原性方面发生复杂变化，同时在机体免疫反应机制方面也产生缺陷，因此单用一种基因难以起明显疗效。近年来有研究表明，对恶性肿瘤的治疗，多基因协同配合明显优于单基因治疗，如细胞凋亡基因HSV-TK和共刺激因子B7联合优于单个基因的治疗。因此研制高效多基因转染技术至关重要。但目前的多基因转染技术仍有很多技术缺陷，通常采用逆转录病毒载体、腺病毒载体及疱疹病毒载体三种方法：(1)采用逆转录病毒载体，由于细胞只能单次被逆转录病毒颗粒转染，因此只能在载体方面进行改建。目前逆转录病毒载体通常采用进入核糖体结合位点(IRES)，这种方法可转染两个目的基因及一个筛选基因，因此单用逆转录病毒载体最多只能转染三个基因(其中包括一个筛选基因)：(2)应用腺病毒载体，可采用多种腺病毒载体混合注射，但三个以上腺病毒载体混合注射可导致明显的免疫反应，而使基因无法表达：(3)应用疱疹病毒载体，疱疹病毒载体是目前较为常用的多基因表达载体，目前该载体可克隆多个基因，但由于该载体存在着明显毒性以及强烈的抗原性，此载体尚存在很多问题，因此目前未见临床应用的报告。总而言之，高效多基因转染技术目前仍存在很多问题，故至今未见有4个或4个以上基因转染的细胞株。

    本发明的目地在于提供一种多基因转染的细胞株及其构建方法。

    本发明的目的通过如下技术方案达到：建立一种多基因转染技术，即应用多基因真核表达载体及逆转录病毒载体先后按常规转染方法转染同一逆转录病毒载体包装细胞株(如PA317)，使该细胞株包含有多种基因，其既能表达真核表达载体携带的基因，又能分泌高滴度逆转录病毒颗粒。若将该细胞株接种于机体局部，则可利用该细胞株分泌真核表达载体携带基因的高水平表达产物，使该局部形成高浓度；同时该细胞株分泌的高滴度逆转录病毒颗粒，可转染机体细胞，使机体细胞表达逆转录病毒颗粒携带的基因，从而达到多基因协同作用的目的。这种方法可以使足够多的基因转染同一细胞株。

    例一、按常规(见分子生物学常用实验方法，1996年2月人民军医出版社出版，下同)构建真核表达载体PED携带含P35及P40两个基因片段的白介素12(IL-12)基因，然后应用磷酸钙沉淀法(参见分子克隆第二版，1992年10月科学出版社出版)将其转染逆转录病毒载体包装细胞株PA317。载体PED中含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，应用氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05μM渐增至10.0μM，隔两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前次的两倍，具体视细胞生长情况而定，约需筛选三个月时间。细胞培养按常规进行，培养液为：15％胎牛血清(GIBCO公司)+RPMI1640/DMEM，置3 7℃5％CO2培养箱培养。然后按通常的极度稀释法进行单克隆化，应用ELISA法分别检测其活性，可得到高水平分泌白介素12的PA317细胞株，命名为PA317-IL-12。按常规构建逆转录病毒多基因载体GCPXSN携带白介素2(IL-2)基因及共刺激因子B7得重组逆转录病毒多基因载体GCXPNSN IL-2 and B7。将该载体转染PA317-IL-12细胞株，其转染方法为磷酸钙沉淀法，因该逆转录病毒载体携带新霉素耐药基因(neo)，故应用含氨基甙类抗生素G418的培养基进行筛选，G418浓度为1000μg/ml，培养四周，所用培养基及培养条件同上，然后应用小鼠成纤维细胞NIH3T3按常规筛选出可分泌高滴度病毒颗粒的细胞株，命名为PA317-IL-12，IL-2and B7，它既能分泌高水平白介素12，又能分泌携带IL-2基因及共刺激因子B7的逆转录病毒颗粒。若将该细胞株直接注射在肿瘤部位，其可产生高浓度白介素12，其分泌的携带IL-2及B7的逆转录病毒颗粒可转染肿瘤细胞，使肿瘤细胞表达共刺激因子B7及白介素2，T细胞受到肿瘤抗原及共刺激因子刺激，在IL-12及IL-2作用下，大量T细胞被激活并增殖，对肿瘤细胞产生强大攻击作用，因而能杀灭肿瘤细胞。在该细胞株中，由于含IL-12基因的2个基因片段，加上IL-2、B7，共有4个目的基因，再加上两个筛选基因DFHR及neo，因此共转染6个基因片段。

    例二、按常规构建真核表达载体PEG携带IL-12基因即PEG-IL-12，构建真核表达载体PMT携带IL-2基因即PMT-IL-2；应用逆转录病毒多基因载体GCPXSN携带凋亡基因HSV-TK及B7基因，得重组逆转录病毒载体GCPXSN-HSV-TK and B7。其中PEG筛选标记基因为DHFR，筛选药物为MTX，筛选方法同例一：PMT筛选标记基因为hygr，筛选药物为潮霉素(hyg)，其浓度为300μg/ml，培养条件为15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM，置37℃5％CO2培养箱，共培养3周，而逆转录病毒载体筛选标记基因为neo，筛选药物为G418，筛选方法同例一。先将PEG-IL-12及PMT-IL-2混合，应用磷酸钙沉淀法将其共转染PA317，再用MTX及hyg进行共筛选，具体筛选方法为：在培养基(15％胎牛血清+RPMI1640/DMEM)中，同时加入hyg和MTX，至37℃5％CO2培养箱中按细胞培养常规培养。hyg的浓度为300μg/ml，筛选3周后停加，MTX的浓度从0.05μM渐增至10.0μM，每两周增加一次浓度，用量约为前次的2倍，具体视细胞生长情况而定，约培养3个月。筛选到的细胞株命名为PA317-IL-12，IL-2，然后将重组逆转录病毒载体GCPXSN-HSV-TK and B7转染该细胞株，应用G418筛选，G418浓度为1000μM/ml，共筛选四周(方法同前)，所得到的细胞株命名为PA317-IL-12，IL-2，HSV-TK and B7。该细胞株既能高水平地分泌IL-12和IL-2、又能高滴度地分泌携带HSV-TK及B7的病毒颗粒。若将该细胞株局部注射肿瘤部位，可使肿瘤局部产生高浓度的白介素2及白介素12，其分泌的病毒颗粒可转染肿瘤细胞，使肿瘤细胞表达HSV-TK及共刺激因子B7。该细胞株含有目的基因片段5个，筛选标记基因3个，共转染8个基因片段。本发明具有如下有益效果：

    1.利用多基因转染的细胞株含有的逆转录病毒载体具有较高的转染率及真核表达载体具有较高表达水平的特点，可根据不同情况，构建含相应目的基因的多基因细胞株，以杀灭肿瘤细胞。

    2.本发明可将4个或4个以上基因片段先后转染到同一细胞中，为肿瘤的多基因治疗开辟了新的途径。