末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410665513.4	申请日：	2014.11.20
公开号：	CN104448897A	公开日：	2015.03.25
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	专利权的转移IPC(主分类):C09B 57/00登记生效日:20171009变更事项:专利权人变更前权利人:河南师范大学变更后权利人:新乡市锦源化工有限公司变更事项:地址变更前权利人:453007 河南省新乡市牧野区建设东路46号变更后权利人:458300 河南省新乡市获嘉县楼村工业区\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C09B57/00申请日:20141120\|\|\|公开
IPC分类号：	C09B57/00; C09K11/06; G01N21/64	主分类号：	C09B57/00
申请人：	河南师范大学
发明人：	仉华; 聂亚敏; 蒋涛; 王魁; 陈粤华; 蒋凯
地址：	453007河南省新乡市牧野区建设东路46号
优先权：
专利代理机构：	大连智慧专利事务所21215	代理人：	周志舰
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内容摘要

一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构，如附图1。该类双光子荧光染料在活细胞可对多细胞器进行成像，尤其是线粒体和溶酶体，在目标成像的细胞器以外区域具有较低的荧光背景，仅在活细胞中目标多细胞器区域内具有较强的荧光信号，且对目标多细胞器具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。

权利要求书

权利要求书
1.  末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构：

通式I中：
R1选自：-H、卤素、C1-8烷基、-(CH2)nO(CH2)mCH3、-(CH2)nS(CH2)mCH3和-(CH2)nNH(CH2)mCH3；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数；
R2选自卤素、H和C1-8烷基；
L1和L2各自独立地选自：-(CH2)p-、-S(CH2)p-、-(CH2)pS-、-S(CH2)pS-、-O(CH2)p-、-(CH2)pO-、-O(CH2)pO-、-NH(CH2)p-、-(CH2)pNH-、-NH(CH2)pNH-、-N(CH3)(CH2)p-、-(CH2)pN(CH3)-和-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-；其中p是1-8的整数。

2.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R1选自：-H、卤素、C1-8烷基、-(CH2)nO(CH2)mCH3或-(CH2)nNH(CH2)mCH3。

3.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R2为-Cl、-Br、-I、-H、或C1-4烷基。

4.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的L1选自-(CH2)p-、-NH(CH2)p-、-(CH2)pNH-、-NH(CH2)pNH-、-N(CH3)(CH2)p-、-(CH2)pN(CH3)-或-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-。

5.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的L2选自-(CH2)p-、-(CH2)pS-或-(CH2)pO-。

6.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，选自化合物A1-A4：

7.  权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1)化合物B1与R1-I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C1：

反应温度为20-80℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物；
2)在DMAP催化下，化合物C1、化合物B2与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-180℃，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)在DMAP催化下，化合物C2、H-L1-H与EDCl按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C3：

反应温度25-120℃，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
4)在DMAP催化下，化合物C3、R2-L2-COOH与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C4：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,
5)化合物C4水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。

8.  权利要求1-6中任一权利要求所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料在生物同时检测与标记中的应用。

9.  权利要求8所述的应用，其特征在于所述的生物同时检测与标记目标物为活细胞中的线粒体和溶酶体。

说明书

说明书末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料
技术领域
本发明涉及一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料对活细胞中多种细胞器同时的识别及成像。
背景技术
细胞是一切生物结构和功能的基本组成单位，生物有机体的新陈代谢、生长发育、繁殖、遗传、变异、应激性和对环境的适应性等各种生命现象，都是依靠细胞来表现和完成的。换言之，疾病就是人体局部组织结构当中的细胞发生病变的结果，如发炎、癌变、肥大等病症就根源于细胞的病变发育。例如：内质网在病理条件下、受到损伤或受到某些因素的作用时，会发生肿胀、肥大和某些物质累积，从而导致诸如：代谢性疾病——糖尿病、肥胖症等的发生；溶酶体异常，会引发很多疾病，如痛风、矽肺等。而这些病变过程，往往都伴随有某一种或者多种细胞器在数量、大小、形状、结果的变化。因此，只要找到能实时监测这些病变细胞及其活动的方法，就能够在一定程度上对疾病诊断与治疗起到很大帮助(Virchow R.L.K.Die Cellularpathologie.Nabu Press:USA,2010:112-119)。
现有识别及检测细胞器的方法种类很多，其中荧光显微成像成为研究细胞器的一种无可替代的视觉工具。随着显微成像技术的发展，荧光染料在显微成像研究中已经成为最重要的依附工具。目前，Hoechst、DAPI、SYTO类荧光染料都已经应用到细胞器相关研究中。但应用荧光小分子的荧光显微成像方法在实际多细胞同时成像应用中存在以下缺陷：染料细胞膜的通透性差、多细胞同时成像时对细胞器的非内源性损伤等等(Invitrogen:USA,2010:499,516,525；Journal of materials chemistry B,2013,1:438-442；Journal of the American Chemical Society,2010,132:12237-12239)。此外，他们在近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等方面(Nature,1999,2:989-996.；Science,1997,275:530.；Angewandte Chemie International Edition,2001,40:2098.)具有一定的缺陷。因此设计开发一类双光子探针分子，利用其实现对多个细胞器同时实时成像的工作势必对疾病早期诊断及病因学的研究具有重大潜在意义。
发明内容
本发明的目的，首先在于提供一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，所述染料具有通式I的结构(附图1)：

通式I中：
R1选自：-H、卤素、C1-8烷基、-(CH2)nO(CH2)mCH3、-(CH2)nS(CH2)mCH3和-(CH2)nNH(CH2)mCH3；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数；
R2选自卤素、H和C1-8烷基；
L1和L2各自独立地选自：-(CH2)p-、-S(CH2)p-、-(CH2)pS-、-S(CH2)pS-、-O(CH2)p-、-(CH2)pO-、-O(CH2)pO-、-NH(CH2)p-、-(CH2)pNH-、-NH(CH2)pNH-、-N(CH3)(CH2)p-、-(CH2)pN(CH3)-和-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-；其中p是1-8的整数。
上述基团的结构式中，“---”用以表示该基团与化合物其它部分连接的游离键。
本发明另一方面的目的，在于提供上述本发明的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)化合物B1与R1-I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C1：

反应温度为20-80℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物；
2)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C1、化合物B2与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-180℃，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
3)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C2、H-L1-H与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C3：

反应温度25-120℃，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
4)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C3、R2-L2-COOH与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C4：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,
5)化合物C4水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。
上述对本发明的一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R1、R2、L1、和L2的定义，与上述对化合物的描述中的定义相同。
本发明所提供的末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料可以双光子激发、在活细胞对目标细胞器，尤其是线粒体和溶酶体，有较强的荧光信号。并且该类荧光染料具有一定水平的水溶性，以及良好的细胞膜通透性，并具有较大的有效的双光子吸收截面，同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
因此，本发明再一方面的目的在于提供上述末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料在生物同时检测与标记中的应用。尤其优选应用于目标物为活细胞中的线粒体和溶酶体的检测与标记。
附图说明
本发明附图9幅：
图1是本发明的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的结构通式I。
图2是实施例1中本发明的荧光染料化合物A1的溶剂化效应表征结果。将化合物A1分别加入到的不同溶剂中。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)
图3是实施例1中本发明的荧光染料化合物A1在DMSO溶剂中的双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：DMSO溶剂。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH11)作为参比，所用A1溶液浓度为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图4是实施例4合成的化合物A2，以终浓度为2.0μM的A2孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网的有强荧光信号。图4的荧光采集波段为490-550nm。
图5是实施例4中本发明的荧光染料化合物A2的水溶解性表征结果。使用不同浓度的化合物A2的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。
图6是实施例7合成的化合物A3，以终浓度为2.0μM的A3孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中高尔基体的有强荧光信号。图6的荧光采集波段为490-550nm。
图7是实施例7中本发明的荧光染料化合物A3在DMSO中的双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：DMSO。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A3溶液浓度为1×10-4M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。
图8是使用实施例10合成的化合物A4，以终浓度为2.0μM的A4孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网上有强荧光信号。图8的荧光采集波段为490-550nm。
图9是实施例10中本发明的荧光探针化合物A4的水溶解性表征结果。使用化合物A4不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名称，如“丙基”、“异丙基”或“环丙基”，特指具体碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。如概括形式的描述，如“C1-6烷基”，则包括碳原子数满足要求的所有基团，“C1-6烷基”包括但不限于C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明公开一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构：

所述通式I中，L1，L2为连接臂；R1，R2为不同取代基团。
通式I中，所述R1选自：-H、卤素、C1-8烷基、-(CH2)nO(CH2)mCH3、-(CH2)nS(CH2)mCH3和-(CH2)nNH(CH2)mCH3；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数；
更为优选地，所述的R1选自：-H、卤素、C1-8烷基、-(CH2)nO(CH2)mCH3或-(CH2)nNH(CH2)mCH3。尤其优选R1是-H或C1-8烷基。
具体实施方式之一，所述的R1是-H。
具体实施方式之一，所述的R1选自C1-8烷基，包括碳原子数为1-8的所有直连烷基、支链烷基和环烷基，举例但不限于如下结构的基团：-(CH2)n-、-(CHCH3)1-4-、-(CH3CCH3)1-2-或它们任意组合后所得基团。优选C1-4烷基，包括但不限于-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)CH3。最优选-CH3。
通式I中，所述的R2选自卤素、H和C1-8烷基。
具体实施方式之一，所述R2是H。
具体实施方式之一，所述R2选自卤素，包括F，Cl，Br，I；优选-Cl、-Br和-I，最优选-Cl。
具体实施方式之一，所述的R2为C1-8烷基，包括碳原子数为1-8的所有直连烷基、支链烷基和环烷基，举例但不限于如下结构的基团：-(CH2)n-、-(CHCH3)1-4-、-(CH3CCH3)1-2-或它们任意组合后所得基团。优选C1-4烷基，包括但不限于-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH(CH3)CH3。
通式I中，所述的L1和L2各自独立地选自：-(CH2)p-、-S(CH2)p-、-(CH2)pS-、-S(CH2)pS-、-O(CH2)p-、-(CH2)pO-、-O(CH2)pO-、-NH(CH2)p-、-(CH2)pNH-、-NH(CH2)pNH-、-N(CH3)(CH2)p-、-(CH2)pN(CH3)-和-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-；其中p是1-8的整数。
作为优选的实施方式，所述的L1选自：-(CH2)p-、-NH(CH2)p-、-(CH2)pNH-、-NH(CH2)pNH-、-N(CH3)(CH2)p-、-(CH2)pN(CH3)-或-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-；L1进一步优选：-NH(CH2)pNH-或-N(CH3)(CH2)pN(CH3)-；最优选-NH(CH2)pNH-。任意具体实施方式中，p是1-8的整数，优选p是1-4的整数，尤其优选p为2或3。
作为优选的实施方式，所述的L2选自：-(CH2)p-、-(CH2)pS-或-(CH2)pO-；L2进一步优选：-(CH2)p-。任意具体实施方式中，p是1-8的整数，优选p是1-4的整数，尤其优选p是1-3的整数。
以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发明所述及的范围。
优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，选自化合物A1-A4：

另一方面，本发明提供了上述本发明一类末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1)化合物B1与R1-I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C1：

反应温度为20-80℃，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤1)的反应温度优选20-70℃，更优选20-60℃，最优选20-50℃；所述的反应时间优选1-9小时，更优选1-8小时，最优选2-8小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、甲醇、丙酮或其混合物，更优选二氯甲烷、丙酮或其混合物，最优选二氯甲烷；化合物B1与R1-I进行反应摩尔比优选1:1.1-1:2，更优选1:1.2-1:2，最优选1:1.25-1:2。
2)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C1、化合物B2与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C2：

反应温度30-180℃，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤2)的反应温度优选30-170℃，更优选30-160℃，最优选30-150℃；所述的反应时间优选1-19小时，更优选1-18小时，最优选1-16小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、醋酸或其混合物；化合物C1、化合物B2与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]进行反应摩尔比优选1:5:1-1:19:5，更优选1:5:1-1:18:5，最优选1:5:1-1:17:5。
3)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C2、H-L1-H与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C3：

反应温度25-120℃，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤3)的反应温度优选30-120℃，更优选30-110℃，最优选30-100℃；所述的反应时间优选1-15小时，更优选5-15小时，最优选5-14小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；化合物C2、H-L1-H与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]进行反应摩尔比优选1:1.1:1-1:5:5，更优选1:1.2:1-1:5:5，最优选1:1.5:1-1:5:5。
4)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C3、R2-L2-COOH与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C4：

反应温度25-100℃，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤4)的反应温度优选30-100℃，更优选30-90℃，最优选30-80℃；所述的反应时间优选1-9小时，更优选5-9小时，最优选6-9小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；化合物C3、R2-L2-COOH与EDCl[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]进行反应摩尔比优选1:5:1-1:19:5，更优选1:5:1-1:18:5，最优选1:5:1-1:17:5。
5)化合物C4水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；
反应温度为25-50℃，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。
具体实施方式中，所述步骤5)的反应温度优选25-45℃，更优选25-40℃，最优选25-35℃；所述的反应时间优选1-5小时，更优选1.5-5小时，最优选2-5小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、水或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、水或其混合物，最优选二氯甲烷、水或其混合物；化合物C4与三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠进行反应摩尔比优选1:1-1:9.5，更优选1:1-1:9，最优选1:1-1:8。
对本发明采用上述方法合成的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。
本发明所述的荧光染料具备以下优点：
所述荧光染料化合物引入了与不同细胞器特异性结合位点，提高了染料对活细胞不同细胞器的检测和识别专一性、特异性；
所述荧光染料化合物具有优异的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性；
所述荧光染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化；
鉴于此，本发明所述的双光子荧光染料可用于活细胞多种细胞器的同时标记。除了以本文中所述的形式直接用于活细胞多种细胞器的同时标记，含有本发明的双光子荧光染料化合物的组合物也可以用于活细胞多种细胞器的同时标记。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明还提供使用上述本发明的双光子荧光染料针化合物活细胞多种细胞器同时标记的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
制备荧光染料化合物A1，采用下述合成路线：

(1)化合物1-1的合成
将20mmol B1和100mmol B2加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，为化合物1-1，收率76％。

(2)化合物1-2的合成
将20mmol化合物1-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品化合物1-2，收率89％。
(3)化合物1-3的合成
将20mmol化合物1-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物1-3，收率65％。
(4)化合物1-4的合成
将20mmol化合物1-3和100mmol丁酸加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物1-4，收率65％。
(5)荧光染料化合物A1的合成
将化合物1-4在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A1，产率21％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.11(s,1H),7.97-7.93(m,2H),7.63(d,2H),6.74(d，2H),6.43(s,2H),4.31(dd,2H),3.48(m,5H),2.78(s,3H),2.23-2.16(m,6H),1.01-0.97(dd,5H).
实施例2
荧光染料化合物A1的溶剂化效应检测试验
使用上述实施例1合成的荧光染料化合物A1分别加入到不同溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图2(a)为探针A1在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图2(b)为荧光染料化合物A1在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计。
实施例3
荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面检测试验：
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例1合成的荧光染料化合物A1分别加入到的二甲基亚砜溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式如下所示：
δs=δrCrCsnrnsFsFrΦrΦs]]>
公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。
测定在DMSO溶剂中的双光子有效吸收截面(Φδ，图3)。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。由实验结果(图3)所示，荧光染料化合物A1的双光子有效吸收截面在770nm可以达到238GM。
实施例4
制备荧光染料化合物A2：

(1)化合物2-1的合成
将20mmol B1和100mmol B2加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物2-1，收率76％。
(2)化合物2-2的合成
将20mmol化合物2-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物2-2，收率89％。
(3)化合物2-3的合成
将20mmol化合物2-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物2-3，收率65％。
(4)化合物2-4的合成
将20mmol化合物2-3和100mmol氯代丁酸加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物2-4，收率61％。
(5)荧光染料化合物A2的合成
将上步化合物2-4在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A2，产率19％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.17(s,1H),7.98-7.94(m,2H),7.63-7.60(d,2H),6.74-6.70(d，2H),6.33(s,2H),4.31(dd,2H),3.48(m,7H),2.78(s,3H),2.23-2.16(m,6H),1.91-0.97(m,2H).
实施例5
荧光染料化合物A2对肿瘤活细胞中内质网的识别与标记
使用实施例4合成的荧光染料化合物A2，以终浓度为2.0μM的A2分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网的有强荧光信号。图4的荧光采集波段为490-550nm。测试结果(图4)显示荧光染料化合物A2在肿瘤细胞的内质网处有明显的荧光信号。
实施例6
荧光染料化合物A2的水溶解性检测试验
使用上述实施例4合成的荧光染料化合物A2加入到水中，测定在不同浓度A2水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果(图5)显示当化合物A2浓度为6.0μM时，吸光度值未发生偏移，即荧光染料化合物A2在水中的溶解度为6.0μM。图5为不同探针A2浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例7
制备荧光染料化合物A3

(1)化合物3-1的合成
将20mmol B1和100mmol B2加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物3-1，收率76％。
(2)化合物3-2的合成
将上步20mmol化合物3-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物3-2，收率89％。
(3)化合物3-3的合成
将上步20mmol化合物3-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物3-3，收率65％。
(4)化合物3-4的合成
将上步20mmol化合物3-3和100mmol乙酸加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物3-4，收率55％。
(5)荧光染料化合物A3的合成
将上步化合物3-4在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A3，产率19％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.17(s,1H),7.97-7.94(m,2H),7.63-7.61(d,2H),6.74-6.71(d，2H),6.33(s,3H),4.31(dd,2H),3.48(m,5H),2.23-2.16(m,7H).
实施例8
荧光染料化合物A3对活细胞中高尔基体的标记
使用实施例7合成的荧光染料化合物A3，以终浓度为2.0μM的A3分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。测试结果(图6)显示荧光染料化合物A3在Hela细胞中高尔基体的有强荧光信号。图6的荧光采集波段为490-550nm。
实施例9
荧光染料化合物A3的双光子有效吸收截面检测试验：
采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例7合成的荧光染料化合物A3分别加入到的二甲基亚砜溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为1×10-4M，用计算公式如下所示：
δs=δrCrCsnrnsFsFrΦrΦs]]>
公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。δ是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。
测定在DMSO中双光子有效吸收截面(Φδ，图7)。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700～980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。由实验结果(图7)所示，荧光染料化合物A3的双光子有效吸收截面在770nm可以达到263GM。
实施例10
制备荧光染料化合物A4

(1)化合物4-1的合成
将20mmol B1和100mmol B2加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物4-1，收率76％。
(2)化合物4-2的合成
将20mmol化合物4-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物4-2，收率89％。
(3)化合物4-3的合成
将20mmol化合物4-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物4-3，收率65％。
(4)化合物4-4的合成
将20mmol化合物4-3和100mmol氯乙酸加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物4-4，收率53％。
(5)荧光染料化合物A4的合成
将化合物4-4在反应温度为25℃，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1％三氟乙酸)：乙腈＝10:1-1:10为洗脱剂制备液相荧光染料化合物A4，产率15％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),7.96-7.89(m,2H),7.65-7.60(d,2H),6.75-6.71(d，2H),6.33(s,3H),4.31(dd,2H),4.22(m,2H),3.48(m,5H),2.23-2.16(m,4H).
实施例11
荧光染料化合物A4对活细胞中内质网的标记
使用实施例10合成的荧光染料化合物A4，以终浓度为2.0μM的A4分别孵育Hela细胞，在37℃，5％CO2孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100×)观察，重复三次。测试结果显示(图8)荧光染料化合物A4在Hela细胞中内质网上有强荧光信号。图8的荧光采集波段为490-550nm。
实施例12
荧光染料化合物A4的水溶解性检测试验
使用上述实施例10合成的荧光染料化合物A4加入到水中，测定在不同浓度A4水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果显示当荧光染料化合物A2浓度为7.0μM时，吸光度值未发生偏移，即测试结果显示：荧光染料化合物A4在水中的溶解度为7.0μM。图9为不同探针A4浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

资源描述

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410665513.4 (22)申请日 2014.11.20 C09B 57/00(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人河南师范大学地址 453007 河南省新乡市牧野区建设东路 46号 (72)发明人仉华聂亚敏蒋涛王魁陈粤华蒋凯 (74)专利代理机构大连智慧专利事务所 21215 代理人周志舰 (54) 发明名称末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料 (57) 摘要一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构，如附图1。该。

2、类双光子荧光染料在活细胞可对多细胞器进行成像，尤其是线粒体和溶酶体，在目标成像的细胞器以外区域具有较低的荧光背景，仅在活细胞中目标多细胞器区域内具有较强的荧光信号，且对目标多细胞器具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书3页说明书13页附图3页 (10)申请公布号 CN 104448897 。

3、A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104448897 A 1/3页 2 1.末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构：通式I中： R 1 选自：-H、卤素、C 1-8 烷基、-(CH 2 ) n O(CH 2 ) m CH 3 、-(CH 2 ) n S(CH 2 ) m CH 3 和-(CH 2 ) n NH(CH 2 ) m CH 3 ；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数； R 2 选自卤素、H和C 1-8 烷基； L 1 和L 2 各自独立地选自：-(CH 2 ) p -、-S(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p S-、-S(CH 2 )。

4、 p S-、-O(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p O-、-O(CH 2 ) p O-、-NH(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p NH-、-NH(CH 2 ) p NH-、-N(CH 3 )(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p N(CH 3 )-和-N(CH 3 )(CH 2 ) p N(CH 3 )-；其中p是1-8的整数。 2.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R 1 选自：-H、卤素、C 1-8 烷基、-(CH 2 ) n O(CH 2 ) m CH 3 或-(CH 2 ) n NH(CH 2 ) m CH 3 。 3。

5、.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的R 2 为-Cl、-Br、-I、-H、或C 1-4 烷基。 4.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的L 1 选自-(CH 2 ) p -、-NH(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p NH-、-NH(CH 2 ) p NH-、-N(CH 3 )(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p N(CH 3 )-或-N(CH 3 )(CH 2 ) p N(CH 3 )-。 5.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述的L 2 选自-(CH 2 。

6、) p -、-(CH 2 ) p S-或-(CH 2 ) p O-。 6.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，选自化合物A 1 -A 4 ： 7.权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤： 1)化合物B 1 与R 1 -I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C 1 ：权利要求书CN 104448897 A 2/3页 3 反应温度为20-80，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物； 2)在DMAP催化下，化合物C 1 、化合物B 2 与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备。

7、化合物C 2 ：反应温度30-180，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 3)在DMAP催化下，化合物C 2 、H-L 1 -H与EDCl按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C 3 ：反应温度25-120，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 4)在DMAP催化下，化合物C 3 、R 2 -L 2 -COOH与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C 4 ：反应温度25-100，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇。

8、、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物, 5)化合物C 4 水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C 4 摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠；反应温度为25-50，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。权利要求书CN 104448897 A 3/3页 4 8.权利要求1-6中任一权利要求所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料在生物同时检测与标记中的应用。 9.权利要求8所述的应用，其特征在于所述的生物同时检测与标记目标物为活细胞中的线粒体和溶酶体。权利要求书CN 104448897 A 1/13。

9、页 5 末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料技术领域 0001 本发明涉及一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料对活细胞中多种细胞器同时的识别及成像。背景技术 0002 细胞是一切生物结构和功能的基本组成单位，生物有机体的新陈代谢、生长发育、繁殖、遗传、变异、应激性和对环境的适应性等各种生命现象，都是依靠细胞来表现和完成的。换言之，疾病就是人体局部组织结构当中的细胞发生病变的结果，如发炎、癌变、肥大等病症就根源于细胞的病变发育。例如：内质网在病理条件下、受到损伤或受到某些因素的作用时，会发生肿胀、肥大和某些物质累积，从而导致诸如：代谢性疾病。

10、糖尿病、肥胖症等的发生；溶酶体异常，会引发很多疾病，如痛风、矽肺等。而这些病变过程，往往都伴随有某一种或者多种细胞器在数量、大小、形状、结果的变化。因此，只要找到能实时监测这些病变细胞及其活动的方法，就能够在一定程度上对疾病诊断与治疗起到很大帮助(Virchow R.L.K.Die Cellularpathologie.Nabu Press:USA,2010:112-119)。 0003 现有识别及检测细胞器的方法种类很多，其中荧光显微成像成为研究细胞器的一种无可替代的视觉工具。随着显微成像技术的发展，荧光染料在显微成像研究中已经成为最重要的依附工具。目前，Hoechst、DAPI、。

11、SYTO类荧光染料都已经应用到细胞器相关研究中。但应用荧光小分子的荧光显微成像方法在实际多细胞同时成像应用中存在以下缺陷：染料细胞膜的通透性差、多细胞同时成像时对细胞器的非内源性损伤等等(Invi trogen:USA,2010:499,516,525；Journal of materials chemistry B,2013,1:438-442； Journal of the American Chemical Society,2010,132:12237-12239)。此外，他们在近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及。

12、降低组织自发荧光干扰等方面(Nature,1999,2:989-996.； Science,1997,275:530.；Angewandte Chemie International Edition,2001,40:2098.) 具有一定的缺陷。因此设计开发一类双光子探针分子，利用其实现对多个细胞器同时实时成像的工作势必对疾病早期诊断及病因学的研究具有重大潜在意义。发明内容 0004 本发明的目的，首先在于提供一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，所述染料具有通式I的结构(附图1)： 0005 0006 通式I中：说明书CN 104448897 A 2/13页 6 0007 。

13、R 1 选自：-H、卤素、C 1-8 烷基、-(CH 2 ) n O(CH 2 ) m CH 3 、-(CH 2 ) n S(CH 2 ) m CH 3 和-(CH 2 ) n NH(CH 2 ) m CH 3 ；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数； 0008 R 2 选自卤素、H和C 1-8 烷基； 0009 L 1 和L 2 各自独立地选自：-(CH 2 ) p -、-S(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p S-、-S(CH 2 ) p S-、-O(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p O-、-O(CH 2 ) p O-、-NH(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p。

14、 NH-、-NH(CH 2 ) p NH-、-N(CH 3 )(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p N(CH 3 )-和-N(CH 3 )(CH 2 ) p N(CH 3 )-；其中p是1-8的整数。 0010 上述基团的结构式中，“-”用以表示该基团与化合物其它部分连接的游离键。 0011 本发明另一方面的目的，在于提供上述本发明的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，所述方法包括如下步骤： 0012 1)化合物B 1 与R 1 -I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C 1 ： 0013 0014 反应温度为20-80，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、。

15、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物； 0015 2)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 1 、化合物B 2 与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C 2 ： 0016 0017 反应温度30-180，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 0018 3)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 2 、H-L 1 -H与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C 3 ： 0019 0020。

16、反应温度25-120，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 0021 4)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 3 、R 2 -L 2 -COOH与EDCl1-(3-二甲说明书CN 104448897 A 3/13页 7 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C 4 ： 0022 0023 反应温度25-100，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物, 0024 5)化合物C 4 水解反应制备化合物I，反应体系加。

17、入1-10倍于化合物C 4 摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠； 0025 反应温度为25-50，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。 0026 上述对本发明的一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R 1 、R 2 、L 1 、和L 2 的定义，与上述对化合物的描述中的定义相同。 0027 本发明所提供的末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料可以双光子激发、在活细胞对目标细胞器，尤其是线粒体和溶酶体，有较强的荧光信号。并且该类荧光染料具有一定水平的水溶性，以及良好的细胞膜通透性，并具有较大的有效的双。

18、光子吸收截面，同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。 0028 因此，本发明再一方面的目的在于提供上述末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料在生物同时检测与标记中的应用。尤其优选应用于目标物为活细胞中的线粒体和溶酶体的检测与标记。附图说明 0029 本发明附图9幅： 0030 图1是本发明的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的结构通式I。 0031 图2是实施例1中本发明的荧光染料化合物A 1 的溶剂化效应表征结果。将化合物 A 1 分别加入到的不同溶剂中。测定不同溶剂中的紫外吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b) 0032 图3是实。

19、施例1中本发明的荧光染料化合物A 1 在DMSO溶剂中的双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：DMSO溶剂。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH11)作为参比，所用A 1 溶液浓度为110 -4 M，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。 0033 图4是实施例4合成的化合物A 2 ，以终浓度为2.0M的A 2 孵育Hela细胞，在37， 5CO 2 孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选。

20、取代表性区域，用油镜(100)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网的说明书CN 104448897 A 4/13页 8 有强荧光信号。图4的荧光采集波段为490-550nm。 0034 图5是实施例4中本发明的荧光染料化合物A 2 的水溶解性表征结果。使用不同浓度的化合物A 2 的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。 0035 图6是实施例7合成的化合物A 3 ，以终浓度为2.0M的A 3 孵育Hela细胞，在37， 5CO 2 孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100)观察，重复三次。成。

21、像显示Hela细胞中高尔基体的有强荧光信号。图6的荧光采集波段为490-550nm。 0036 图7是实施例7中本发明的荧光染料化合物A 3 在DMSO中的双光子吸收截面的测定结果。测定溶剂为：DMSO。测定方法为：采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，所用A 3 溶液浓度为110 -4 M，激光脉冲宽70fs，重复频率 80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。 0037 图8是使用实施例10合成的化合物A 4 ，以终浓度为2.0M的A 4 孵育Hela细胞，在3。

22、7，5CO 2 孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网上有强荧光信号。图8的荧光采集波段为490-550nm。 0038 图9是实施例10中本发明的荧光探针化合物A 4 的水溶解性表征结果。使用化合物A 4 不同浓度的水溶液，测定其在最大吸收波长下吸光度。重复三次。具体实施方式 0039 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。 0040 本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名称，如“丙基”、“异丙基”或“环丙基”，特指具体。

23、碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。如概括形式的描述，如“C 1-6 烷基”，则包括碳原子数满足要求的所有基团，“C 1-6 烷基”包括但不限于C 1-4 烷基、C 1-3 烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。 0041 本发明公开一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构： 0042 0043 所述通式I中，L 1 ，L 2 为连接臂；R 1 ，R 2 为不同取代基团。 0044 通式I中，所述R 1 选自：-H、卤素、C 1-8 烷基、-(CH 2 ) n O(CH 2 ) m C。

24、H 3 、-(CH 2 ) n S(CH 2 ) m CH 3 和-(CH 2 ) n NH(CH 2 ) m CH 3 ；其中，n和m各自独立地选自1-8的整数； 0045 更为优选地，所述的R 1 选自：-H、卤素、C 1-8 烷基、-(CH 2 ) n O(CH 2 ) m CH 3 或-(CH 2 ) n NH(CH 2 ) m CH 3 。尤其优选R 1 是-H或C 1-8 烷基。说明书CN 104448897 A 5/13页 9 0046 具体实施方式之一，所述的R 1 是-H。 0047 具体实施方式之一，所述的R 1 选自C 1-8 烷基，包括碳原子数为1-8的所有直连。

25、烷基、支链烷基和环烷基，举例但不限于如下结构的基团：-(CH 2 ) n -、-(CHCH 3 ) 1-4 -、-(CH 3 CCH 3 ) 1-2 -或它们任意组合后所得基团。优选C 1-4 烷基，包括但不限于 -CH 3 ，-CH 2 CH 3 ，-CH 2 CH 2 CH 3 ，-CH(CH 3 )CH 3 。最优选-CH 3 。 0048 通式I中，所述的R 2 选自卤素、H和C 1-8 烷基。 0049 具体实施方式之一，所述R 2 是H。 0050 具体实施方式之一，所述R 2 选自卤素，包括F，Cl，Br，I；优选-Cl、-Br和-I，最优选-Cl。 0051 具体实施方式之一。

26、，所述的R 2 为C 1-8 烷基，包括碳原子数为1-8的所有直连烷基、支链烷基和环烷基，举例但不限于如下结构的基团：-(CH 2 ) n -、-(CHCH 3 ) 1-4 -、-(CH 3 CCH 3 ) 1-2 -或它们任意组合后所得基团。优选C 1-4 烷基，包括但不限于 -CH 3 ，-CH 2 CH 3 ，-CH 2 CH 2 CH 3 ，-CH(CH 3 )CH 3 。 0052 通式I中，所述的L 1 和L 2 各自独立地选自：-(CH 2 ) p -、-S(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p S-、-S(CH 2 ) p S-、-O(CH 2 ) p -、-(CH 2。

27、 ) p O-、-O(CH 2 ) p O-、-NH(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p NH-、-NH(CH 2 ) p NH-、-N(CH 3 )(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p N(CH 3 )-和-N(CH 3 )(CH 2 ) p N(CH 3 )-；其中p是1-8的整数。 0053 作为优选的实施方式，所述的L 1 选自：-(CH 2 ) p -、-NH(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p NH-、-NH(CH 2 ) p NH-、-N(CH 3 )(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p N(CH 3 )-或-N(CH 3 )(CH 2 ) p N。

28、(CH 3 )-；L 1 进一步优选：-NH(CH 2 ) p NH-或-N(CH 3 )(CH 2 ) p N(CH 3 )-；最优选-NH(CH 2 ) p NH-。任意具体实施方式中，p是1-8的整数，优选p是1-4的整数，尤其优选p为2或3。 0054 作为优选的实施方式，所述的L 2 选自：-(CH 2 ) p -、-(CH 2 ) p S-或-(CH 2 ) p O-；L 2 进一步优选：-(CH 2 ) p -。任意具体实施方式中，p是1-8的整数，优选p是1-4的整数，尤其优选p 是1-3的整数。 0055 以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于。

29、本发明所述及的范围。 0056 优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，选自化合物A 1 -A 4 ： 0057 说明书CN 104448897 A 6/13页 10 0058 另一方面，本发明提供了上述本发明一类末端官能化的萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如下步骤： 0059 1)化合物B 1 与R 1 -I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C 1 ： 0060 0061 反应温度为20-80，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮或其混合物； 0062 具体实施方式中，所述步骤1)。

30、的反应温度优选20-70，更优选20-60，最优选20-50；所述的反应时间优选1-9小时，更优选1-8小时，最优选2-8小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、甲醇、丙酮或其混合物，更优选二氯甲烷、丙酮或其混合物，最优选二氯甲烷；化合物B 1 与R 1 -I进行反应摩尔比优选1:1.1-1:2，更优选1:1.2-1:2，最优选 1:1.25-1:2。 0063 2)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 1 、化合物B 2 与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C 2 ： 0064 0065 反应温度30-180。

31、，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 0066 具体实施方式中，所述步骤2)的反应温度优选30-170，更优选30-160，最优选30-150；所述的反应时间优选1-19小时，更优选1-18小时，最优选1-16小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、醋酸或其混合物；化合物C 1 、化合物B 2 与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行反应摩尔比优选1:5:1-1:19:5，更优选。

32、1:5:1-1:18:5，最优选1:5:1-1:17:5。 0067 3)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 2 、H-L 1 -H与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合物C 3 ： 0068 说明书CN 104448897 A 10 7/13页 11 0069 反应温度25-120，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 0070 具体实施方式中，所述步骤3)的反应温度优选30-120，更优选30-110，最优选30-100；所述的反应时间优选1-。

33、15小时，更优选5-15小时，最优选5-14小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；化合物C 2 、H-L 1 -H与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行反应摩尔比优选1:1.1:1-1:5:5，更优选1:1.2:1-1:5:5，最优选1:1.5:1-1:5:5。 0071 4)在DMAP(4-二甲氨基吡啶)催化下，化合物C 3 、R 2 -L 2 -COOH与EDCl1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按照摩。

34、尔比1:5:1-1:20:5反应，制备化合物C 4 ： 0072 0073 反应温度25-100，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 0074 具体实施方式中，所述步骤4)的反应温度优选30-100，更优选30-90，最优选30-80；所述的反应时间优选1-9小时，更优选5-9小时，最优选6-9小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选二氯甲烷、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；化合物C 3 、 R 2 -L 2 -COOH与EDCl1-。

35、(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行反应摩尔比优选 1:5:1-1:19:5，更优选1:5:1-1:18:5，最优选1:5:1-1:17:5。 0075 5)化合物C 4 水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C 4 摩尔当量的三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠； 0076 反应温度为25-50，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、水或其混合物。 0077 具体实施方式中，所述步骤5)的反应温度优选25-45，更优选25-40，最优选 25-35；所述的反应时间优选1-5小时，更优选1.5-5小时，最优选2-5小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、。

36、乙醇、甲醇、水或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、水或其混合物，最优选二氯甲烷、水或其混合物；化合物C 4 与三氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠进行反应摩尔比优选 1:1-1:9.5，更优选1:1-1:9，最优选1:1-1:8。说明书CN 104448897 A 11 8/13页 12 0078 对本发明采用上述方法合成的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。 0079 本发明所述的荧光染料具备以下优点： 0080 所述荧光染料化合物引入了与不同细胞器特异性结合位点，提高了染料对活细胞不同细胞器的检测和识别专一性、特异性； 0081 所述荧光染料化合物具。

37、有优异的双光子性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性； 0082 所述荧光染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化； 0083 鉴于此，本发明所述的双光子荧光染料可用于活细胞多种细胞器的同时标记。除了以本文中所述的形式直接用于活细胞多种细胞器的同时标记，含有本发明的双光子荧光染料化合物的组合物也可以用于活细胞多种细胞器的同时标记。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的双光子荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前。

38、用水配制为溶液的其它合适形式存在。 0084 本发明还提供使用上述本发明的双光子荧光染料针化合物活细胞多种细胞器同时标记的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。 0085 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 0086 实施例1 0087 制备荧光染料化合物A 1 ，采用下述合成路线： 0088 0089 (1)化合物1-1的合成 0090 将20mmol B 1 和100mmol B 2 加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加 20mmol EDCl以及少量DM。

39、AP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，为化合物1-1，收率76。 0091 0092 (2)化合物1-2的合成说明书CN 104448897 A 12 9/13页 13 0093 将20mmol化合物1-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品化合物1-2，收率89。 0094 (3)化合物1-3的合成 0095 将20mmol化合物1-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml 二氯甲烷溶液。

40、的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物1-3，收率65。 0096 (4)化合物1-4的合成 0097 将20mmol化合物1-3和100mmol丁酸加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml 二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物1-4，收率65。 0098 (5)荧光染料化合物A 1 的合成 0099 将化合物1-4在反应温度为25，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1三氟乙酸)：乙腈10:1-1:10为洗脱剂制。

41、备液相的荧光染料化合物A 1 ，产率21。 1 H NMR(400MHz,DMSO)10.11(s,1H),7.97- 7.93(m,2H),7.63(d,2H),6.74(d，2H),6.43(s,2H),4.31(dd,2H),3.48(m,5H),2.78(s,3H) ,2.23-2.16(m,6H),1.01-0.97(dd,5H). 0100 实施例2 0101 荧光染料化合物A 1 的溶剂化效应检测试验 0102 使用上述实施例1合成的荧光染料化合物A 1 分别加入到不同溶剂中，测定不同溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。测试结果显示，随着溶剂极性的改变，紫外吸收光谱中的最大吸。

42、收波长有相应的移动，荧光发射光谱也同样存在着最大发射波长的移动。图 2(a)为探针A 1 在不同溶剂中的紫外吸收光谱，图2(b)为荧光染料化合物A 1 在不同溶剂中的荧光发射光谱。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计和Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计。 0103 实施例3 0104 荧光染料化合物A 1 的双光子有效吸收截面检测试验： 0105 采用飞秒双光子诱导荧光方法，利用荧光素的NaOH溶液(pH 11)作为参比，将实施例1合成的荧光染料化合物A 1 分别加入到的二甲基亚砜溶剂中双光子吸收截面的测试，所用溶液浓度都为110 -4 M，用计算公。

43、式如下所示： 0106 0107 公式中的C为溶液的浓度，n是溶剂的折射率，可查表得到。F是上转换荧光强度，由实验测得。是双光子吸收截面。参比溶液的物理量均用下标r表示。 0108 测定在DMSO溶剂中的双光子有效吸收截面(，图3)。双光子激发荧光光谱的激发源是一台锁模飞秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽70fs，重复频率80MHz，激光器的平均输出功率1.5W(780nm)，可调波长范围700980nm,在实验中飞秒激光波长调至所需测试波长。由实验结果(图3)所示，荧光染料化合物A 1 的双光子有效吸收截面在770nm可以说明书CN 104448897 A 13 10/13页 14 。

44、达到238GM。 0109 实施例4 0110 制备荧光染料化合物A 2 ： 0111 0112 (1)化合物2-1的合成 0113 将20mmol B 1 和100mmol B 2 加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加 20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物2-1，收率76。 0114 (2)化合物2-2的合成 0115 将20mmol化合物2-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末。

45、产品，化合物2-2，收率89。 0116 (3)化合物2-3的合成 0117 将20mmol化合物2-2和80mmol乙二胺加入到含有20mmol EDCl及少量DMAP 20ml 二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应5h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物2-3，收率65。 0118 (4)化合物2-4的合成 0119 将20mmol化合物2-3和100mmol氯代丁酸加入到含有20mmol EDCl及少量 DMAP20ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应7h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得黄色固体粉末化合物2-4，收率61。 0120 (5)荧光染料化合物。

46、A 2 的合成 0121 将上步化合物2-4在反应温度为25，反应时间为5小时，反应溶剂选自二氯甲烷，添加1.5倍当量的三氟乙酸，反应结束后，以水(含1三氟乙酸)：乙腈10:1-1:10 为洗脱剂制备液相的荧光染料化合物A 2 ，产率19。 1 H NMR(400MHz,DMSO)10.17(s,1H) ,7.98-7.94(m,2H),7.63-7.60(d,2H),6.74-6.70(d，2H),6.33(s,2H),4.31(dd,2H),3.48( m,7H),2.78(s,3H),2.23-2.16(m,6H),1.91-0.97(m,2H). 0122 实施例5 0123 荧光染。

47、料化合物A 2 对肿瘤活细胞中内质网的识别与标记 0124 使用实施例4合成的荧光染料化合物A 2 ，以终浓度为2.0M的A 2 分别孵育Hela 细胞，在37，5CO 2 孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min3，再加入细胞培养基，双光子激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(100)观察，重复三次。成像显示Hela细胞中内质网的有强荧光信号。图4的荧光采集波段为490-550nm。测试结果(图4)显示荧说明书CN 104448897 A 14 11/13页 15 光染料化合物A 2 在肿瘤细胞的内质网处有明显的荧光信号。 0125 实施例6 0126 荧光染料化合物A 2 的。

48、水溶解性检测试验 0127 使用上述实施例4合成的荧光染料化合物A 2 加入到水中，测定在不同浓度A 2 水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果(图5)显示当化合物A 2 浓度为6.0M时，吸光度值未发生偏移，即荧光染料化合物A 2 在水中的溶解度为6.0M。图5为不同探针A 2 浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。 0128 实施例7 0129 制备荧光染料化合物A 3 0130 0131 (1)化合物3-1的合成 0132 将20mmol B 1 和100mmol B 2 加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，添加 20mmol EDCl以及少量DMAP，氮气保护，室温下反应。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物3-1，收率76。 0133 (2)化合物3-2的合成 0134 将上步20mmol化合物3-1和40mmol碘甲烷加入到含有10ml二氯甲烷溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。室温反应8h后停止。反应结束后，旋除溶剂，柱层析分离，得淡黄色固体粉末产品，化合物3-2，收率89。 0135 (3)化合物3-3的合成 0136 将上。

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