体外转录生成短双链干扰RNA的方法 【技术领域】
本发明涉及的是一种体外转录生成短双链干扰RNA的方法，特别是一种以T7RNA聚合酶催化体外转录合成小干扰RNA的方法，用于生物、基因工程技术领域。
背景技术
在早期的转基因试验中，人们试图通过增加某个功能基因的拷贝而提高它的表达，然而一些结果显示该基因表达不但没有提高反而降低，这种现象在植物上被称作共抑制，在真菌上被称作压制。Su等1995年在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他们对这个结果很不理解。直到Fire等1998年在线虫上的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是在体外转录正义RNA时产生的双链RNA，他们称这种双链RNA对基因表达的阻断作用为RNA干扰。
目前RNAi的作用机理已被基本阐明，即当生物体内由于RNA病毒感染、转座子的转录产物以及外源导入基因产生双链RNA时，会诱发细胞产生免疫反应，激活机体RNA聚合酶III，并将双链RNA切割成若干个短双链干扰RNA。这种短双链干扰RNA同RNA聚合酶III、RNA解旋酶等结合形成复合物，在短双链干扰RNA的指导下复合物同mRNA中地同源部分结合，在RNA聚合酶III的作用下将长链RNA切断，结果是病毒被清除，转座子或外源导入基因表达被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
RNA干扰现象自从在线虫中被揭示以来，由于能特异、高效地阻断基因的表达，而引起生物研究领域的广泛关注和浓厚兴趣。目前已在真菌、拟南芥、水螅、锥虫、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等生物中发现了这种基因沉默现象。在线虫中由于双链RNA的导入方式极为方便(浸泡或喂食即可)，故RNA干扰已用于高通量的基因功能研究。在果蝇、斑马鱼、小鼠等生物中也已开展了胚胎发育方面的研究。但受dsRNA导入方式和胚胎发育特点的影响，脊椎动物中的RNAi研究目前更多地集中在细胞水平上。RNAi具有操作简单、适用范围广、特异性强、可在不同时相并同时失活多个目标基因等优点，因此是利用反向遗传学了解基因功能较为理想的工具。
实施RNA干扰技术主要有合成干扰用双链RNA、双链RNA导入细胞或体内、RNA干扰效应的检测和观察三部分内容，而获得双链RNA是进行RNA干扰研究的首要步骤。尤其对哺乳动物而言，长的双链RNA由于激活机体病毒防御机制而引起多种基因非特异性限制，只有21～23个核苷酸对的短双链RNA才能特异性阻断基因的表达，这对干扰用双链RNA合成增加了一定的难度。
近两年，国外学者对体外和体内转录生成双链干扰RNA方法的研究报道不断增多，一些已经迅速转化成商品进入了市场，同化学合成法相比较大大降低了实验成本。目前获得双链干扰RNA主要有三种办法，即化学合成法、体外转录法和体内转录法。由于化学合成法的造价太高一般不被采用；体内转录法的基本思路是先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内由细胞自发转录生成双链RNA，这样在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。虽然体内转录法有明显的优势，但仍局限于少数物种和细胞系，载体表达效率及其作用规律还在研究之中。体外转录法有多种形式，但基本作法是以目标基因mRNA上的一段同源DNA序列为模板，并将其同T7启动子引物褪火结合，然后在T7RNA聚合酶的作用下转录成RNA，两个互补的RNA褪火结合成双链RNA。经对现有技术文献的检索，发现：Olivier Donzé and Didier Picard.RNA interference inmammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase.Nucl.Acids.Res.2002，30：e46[作者：Olivier Donzé and Didier Picard，文章题目：用T7 RNA聚合酶合成的短双链干扰RNA在哺乳动物细胞中的RNA干扰研究；杂志：核酸研究(英国)，2002，30：e46]。该文献在38个碱基的寡核苷酸转录模板设计上，其5’端开始的2个碱基是随机选取的，其结果转录出的RNA 3’端末尾2个碱基也是随机的。本发明则在38个碱基的寡核苷酸转录模板设计上有很大改动，既5’端开始的2个碱基选取2个腺嘌呤，其结果转录出的RNA 3’端末尾2个碱基是尿嘧啶。当转录出的正、负两条单链RNA退火形成双链RNA时，两端各垂悬的尿嘧啶。许多RNA干扰研究认为，这种结构的双链RNA及其同RNA聚合酶III、RNA解旋酶等结合形成复合物更容易同目标基因的mRAN结合并切断它，从而更有效地敲低目标基因的表达。另外，文献对合成的短双链RNA直接用乙醇沉淀后溶解，未进行任何的提纯。本发明则采用酚-氯仿抽提法，祛出了大部分反应体系中的蛋白质等杂质，得到高纯度的短双链RNA，确保了进行RNA干扰研究时细胞或机体对导入短双链RNA的质量要求。
【发明内容】
本发明的目的在于在于克服现有技术中的不足，提供一种体外转录生成短双链干扰RNA的方法，特别是以T7RNA聚合酶催化体外转录合成短双链干扰RNA的方法。使其将是一套操作简单、成本低、效率高短双链干扰RNA合成方法，为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供短双链干扰RNA合成方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先设计合成T7启动子18bp及含目标基因20bp和T7启动子反向互补序列18bpDNA寡核苷酸链，两者退火后形成双链DNA，合成T7启动子18bp及含目标基因反向互补序列20bp和T7启动子反向互补序列18bpDNA寡核苷酸链，两者退火后还形成另一条双链DNA，T7 RNA聚合酶在T7启动子引导下，以两条含T7启动子的目标基因和目标基因反向互补序列的双链DNA链为模板分别转录生成正链RNA和反链RNA，将两条转录后的产物用DNase-I降解反应体系中的DNA，获得正单链RNA和反单链RNA，将两个反应体系中生成的正、负单链RNA退火并纯化后便获得短双链RNA。
方法流程如下：
1、目标基因干扰位置的选择
在互联网生物数据库GenBank上查询要干扰基因的mRNA序列，在启始密码子(ATG)75个碱基后寻找AAG开始的20个碱基序列作为目标基因序列。要求该段序列中G、C含量在30％-45％，并将所选的序列在GenBank等大型生物数据库上进行同源性比较(BLAST)，要求该段序列与其它基因无高度同源，否则不能确定为RNA干扰目标序列。
2、DNA寡核苷酸链的设计与合成
设计合成一条T7启动子DNA寡核苷酸链(18bp)，一条含AAG开始的目标基因正向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bp)的DNA寡核苷酸链(38bp)，一条含AAG开始的目标基因反向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bp)的DNA寡核苷酸链(38bp)。
这样设计的目的：首先18个碱基的T7启动子DNA寡核苷酸同38个碱基的DNA寡核苷酸(含目标基因同源序列和T7启动子寡核苷酸互补序列)退火形成双链DNA，由于T7RNA聚合酶只有在T7启动子为双链时才能转录模板DNA，因此上面形成的双链DNA模板在T7RNA聚合酶作用下转录生成RNA。
其更重要的原因是，在转录时，T7启动子DNA寡核苷酸链5′→3′的最后一个碱基G，在转录时被T7RNA聚合酶纳入RNA序列，即转录生成的RNA的第一个碱基是G。另由于把38个碱基DNA寡核苷酸链5′端前3个碱基设计为AAG，转录生成的RNA第19、20、21个碱基为CUU。因此，转录的结果是转录生成的正向、负向RNA单链5′端均以G开始，3′端均以CUU结尾，其它碱基序列互补。当正向、负向RNA单链混合退火时形成碱基互补、两端各有2个悬垂UU的短双链RNA。这种结构是进行RNA干扰所希望的。
3、双链DNA模板形成和体外转录
将合成的T7启动子DNA寡核苷酸链分别同含目标基因正、反向序列和T7启动子反向互补序列的DNA寡核苷酸链，先在95℃下变性5分钟，然后缓慢降温便得到T7启动子互补的双链DNA，其中目标基因序列为单链。
在转录反应体系中，分别以两条含双链T7启动子和单链目标基因正、反向序列的DNA链为模板，T7 RNA聚合酶在双链T7启动子引导下，以三磷酸核苷混合物(rNTP)为原料，分别转录合成正向单链RNA和反向单链RNA，此时的转录产物为DNA和RNA杂合物。为了获得单链RNA，实验用DNA I酶降解反应体系中的DNA，分别获得了正向单链RNA和反向单链RNA。将获得的正向单链RNA和反向单链RNA混合后在95℃下变性5分钟，37℃孵育1小时后便获得短双链RNA。
4、短双链干扰RNA的分离、提纯
首先在短双链干扰RNA的分离、提纯过程中增加了酚/氯仿抽提步骤，采用了酚/氯仿法对合成产物进行了提纯，然后采用无水冷乙醇沉淀RNA，用70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl PBS溶解，在反应体系每次可获得20～40μg短双链干扰RNA。由于反应体系中含有蛋白质等多种化学成分，如T7RNA聚合酶、DNAI酶、三磷酸核苷混合物等，因此本发明明显优于现有技术每次可获得1～5μg短双链干扰RNA。
本发明获得的短双链干扰RNA能够有效地敲低外源报告基因-绿荧光蛋白表达载体的表达，而且导入细胞的短双链干扰RNA没有非特异性免疫反应。本发明操作简单、成本低、效率高，为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供了短双链干扰RNA合成方法。
【附图说明】
图1体外转录生成短双链干扰RNA示意图
图1中，当可供选择的范围是整个基因的全长mRNA时，一般情况下容易在启始密码后75个碱基寻找AAG开始的20个碱基序列。
图2体外转录合成短双链干扰RNA的电泳检测
在图2(a)中，1、2泳道为未进行转录的T7同目标基因的寡核苷酸序列退火形成的正、负双链DNA的酶切产物。3、4泳道为以T7同目标基因的寡核苷酸序列退火形成的正、负双链DNA为模板转录生成RNA的酶切产物。由电泳结果可知，DNase-I彻底降解了DNA链(泳道1、2)；以T7同目标基因的寡核苷酸序列退火形成的正、负双链DNA为模板的转录产物确为RNA(泳道3、4)。
在图2(b)中，1、2泳道为转录后DNase-I酶切产物。3、4泳道为转录后未经DNase-I酶切产物。5泳道为转录合成的siRNA。由图2(b)可以看出，转录后经DNase-I酶切和未经酶切产物的迁移率不同，1、2泳道条带的迁移率略大于3、4泳道条带，可能是由于DNase-I降解了转录模板DNA，产物长度有38bp下降到21nt所致。
图3短双链干扰RNA对鸡成纤维细胞绿色荧光蛋白表达影响的荧光检测
在图3中，(a)表示用绿荧光蛋白表达载体转染的细胞(b)表示用绿荧光蛋白表达载体和siGFP共转染的细胞(c)表示用绿荧光蛋白表达载体和siGAPDH共转染的细胞。观察结果显示，单独用绿荧光蛋白表达载体转染组中绿荧光蛋白正常表达；用绿荧光蛋白表达载体和siGFP共转染组中绿荧光蛋白微弱表达；用绿荧光蛋白表达载体和siGAPDH共转染组绿荧光蛋白正常表达。结果证明了获得短双链干扰RNA的方法是正确有效的；另一方面也证明了鸡成纤维细胞存在RNA干扰机制，并且这种对基因表达干扰是特异性的。
【具体实施方式】
以下结合发明内容及其附图对本发明实施方式进一步具体描述：
实施例1
体外转录合成短双链干扰RNA
1.转录Buffer和转录反应液
10×T7转录Buffer：Tris-HCl PH7.9 400mmol/L，MgCL2 60mmol/L，DTT 100mmol/L，NaCl 100mmol/L，Spermidine 20mmol/L)。
转录反应液：10×T7转录Buffer 5μl，1mmol/L rNTP Mixture，40U RNaseInhibitor，100U T7 RNA polymerase，200pmol dsDNA，0.1U YeastPyrophosphatase，加DEPC处理水至50μl。
2.DNA寡核苷酸链合成和双链DNA获得
设计合成T7寡核苷酸和目标寡核苷酸(见图1)。在50μl TE Buffer中(10mMTris-HCI pH8.0，1mmol/L EDTA)，每条各加入1nmol，95℃孵育2分钟，关掉热槽，缓慢降温形成双链DNA
3.转录反应和短双链干扰RNA生成
将转录反应液(各50μl)于37℃孵育2h。加入5U RNase-Free DNase-I，37℃孵育15min。将两管混合(100μl)，95℃孵育5min。37℃孵育1hr。
4.短双链干扰RNA分离提纯
加入100μl(等量)的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混合后12000g离心10min，取上层水相于另一离心管中。加入100μl(等量)的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混合后12000g离心10min，取上层水相于另一离心管中。加入10μl的3M NaOCA(pH5.2)。加入2.5倍量的冷无水乙醇，-20℃放置30min，12000g离心10min，回收沉淀，70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl PBS溶解。
5.体外转录合成短双链干扰RNA的电泳检测
由于siRNA片段较小，单链RNA和siRNA间电泳迁移率差异不大，因此用琼脂糖凝胶电泳不容易区分，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳操作相对麻烦，另外，单链RNA极容易降解，使依靠电泳检测siRNA合成情况不容易做到。本发明用琼脂糖凝胶电泳检测转录前和转录后经DNA I酶消化的产物(图2a)，结果1，2泳道未见有任何条带，3，4泳道在DNA酶消化后马上检测可见清晰条带，但该转录、酶切后产物极不稳定，在室温下放置30min以上，便检测不到电泳条带。检测结果证明转录反应成功地转录出单链RNA。对转录后产物酶切及退火结果显示(图2b)，1、2泳道转录后DNase-I酶切产物与3、4泳道转录后未经DNase-I酶切产物的电泳条带的迁移率不同，既1、2泳道条带的迁移率略大于3、4泳道条带，其原因可能是由于DNase-I降解了转录模板DNA，产物长度有38bp下降到21nt所致。另外，5泳道为两条单链RNA退火后产物，其电泳条带迁移率同1、2泳道转录后DNase-I酶切产物-单链RNA有所不同，可能的原因是双链RNA和单链RNA在结构上的差异所致。电泳检测结果说明本发明成功地转录出RNA，经DNase-I酶切后得到的单链RNA经退火后确实生成了短双链干扰RNA。
实施例2
体外转录合成短双链干扰RNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白表达
1.体外转录合成短双链干扰RNA
按体外转录合成短双链干扰RNA方法要求合成的DNA寡核苷酸序列，T7promoter：5’-taatacgactcactatag-3’；siGFP：Sense 5’-aagaacggcatcaaggtgaactatagtgagtcgtatta-3’，Antisense 5’-aagttcaccttgatgccgttctatagtgagtcgtatta-3’(Accession No：U55763)；siGAPDH：Sense 5’-aagcgtgttatcatctcagcctatagtgagtcgtatta-3’，Antisense 5’-aaggctgagatgataacacgctatagtgagtcgtatta-3’(Accession No：K01458)。具体操作和反应体系组成见实施例1。
2.鸡成纤维细胞培养
取孵化8-10天的受精蛋，用碘酒或75％酒精擦洗蛋表面，小心取出鸡胚放于无菌培养皿中，去除头部和内脏。胚体用D-Hanks液或PBS液清洗3次，切成1~2mm的小块，转移到容积适中的三角瓶中。加入适量消化液(0.25％胰蛋白酶，0.3mg/ml胶原酶，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素)，一般每10个鸡胚加20ml消化液，密封瓶口。在磁力搅拌器上室温慢速搅拌1小时。加入少量胎牛血清钝化胰蛋白酶。然后通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液。将细胞悬液转移到离心管中。800r/min离心10分钟。弃上清液。将细胞沉淀用D-Hanks液或PBS液清洗2次。加入培养液，用吸管吹打制成细胞悬液。记数细胞。以1×106个/ml的密度接种细胞。在37℃，5％CO2条件下于CO2培养箱中培养。
3.绿荧光蛋白表达载体和短双链干扰RNA转染细胞
细胞转染试剂为Lipofectamine TM2000(Invitrogen)。根据转染试剂说明按如下比例进行转染：在250μl细胞培养液中稀释4μg核酸，轻轻混合后备用。在250μl细胞培养液中稀释10μl细胞转染试剂，轻轻混合后在室温下孵育5min。将上两种稀释液轻轻混合后在室温下孵育20min形成复合体(500μl)。将复合体加入细胞50％以上汇集的6孔培养皿中，轻轻摇动混合。37℃ 5％CO2条件下于CO2培养箱中培养12h后可观察转染效果。绿荧光蛋白表达载体为pEGFP-C1Vector(Clontech)。
4.细胞转染转染核酸24h后，分别在荧光显微镜(Nikon E600)白光和激发光波长为488nm下观察、记数、拍照。
5.短双链干扰RNA对绿荧光蛋白表达的影响
转染细胞24h后在荧光显微镜下观察，转染和干扰效果见附图3。在附图3中，(a)表示用绿荧光蛋白表达载体转染的细胞(b)表示用绿荧光蛋白表达载体和siGFP共转染的细胞(c)表示用绿荧光蛋白表达载体和siGAPDH共转染的细胞。
观察结果显示，单独用绿荧光蛋白表达载体转染组中绿荧光蛋白正常表达；用绿荧光蛋白表达载体和siGFP共转染组中绿荧光蛋白微弱表达；用绿荧光蛋白表达载体和siGAPDH共转染组绿荧光蛋白正常表达。结果证明了本发明获得短双链干扰RNA的方法是正确、有效的；另一方面也证明了鸡成纤维细胞存在RNA干扰机制，并且这种对基因表达干扰是特异性的。