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用于纯化白蛋白结合物的方法
发明背景
(a)发明领域
本发明涉及用于从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离白蛋白结合物的纯化方法。
(b)已有技术的描述
WO 95/10302和WO 99/24074描述了白蛋白结合物的形成，其中所考虑的分子具有偶联于其上的适合与白蛋白共价结合因此形成结合物的活性官能团。这些结合物可以体内形成，但也可以在体外生成。体外结合物的形成包括将偶联到活性官能团的分子添加到白蛋白溶液中。该反应最初的终产物是非结合的白蛋白，白蛋白结合物和偶联到活性官能团的未反应的分子。
提供的用于从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中纯化白蛋白结合物的纯化方法非常合乎需要。
发明概述
根据本发明，提供了一种用于从含有白蛋白结合物和非结合的白蛋白的溶液中将白蛋白结合物从非结合的白蛋白中分离出来的方法。该方法包括：
a)将溶液加到用高含盐量的水性缓冲液平衡的疏水性固体支持物支持物上；
b)对支持物支持物施加坡度降低的含盐量；和
c)收集洗脱的白蛋白结合物。
在本发明优选的具体实施方式中，白蛋白结合物由具有与白蛋白共价偶联的Michael受体的分子组成，而更优选是在Michael受体与白蛋白半胱氨酸34之间的偶联。
在本发明更优选的具体实施方式中，Michael受体是马来酰亚胺基团，而更优选的是马来酰亚胺基团是马来酰亚胺(maleimid)-丙酸(MPA)。可选择Michael受体通过接头与该分子结合在一起。该接头优选选自以羟乙基基序组成的基团，例如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，乙二胺(EDA)，2-[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，氨基乙氧基乙基氨基琥珀酸(AEEAS)；一种或多种以烷基链基序例如甘氨酸，3-丙氨酸(APA)，8-氨基辛酸(AOA)，辛酸(OA)，4-氨基苯甲酸(APhA)。优选的接头是OA，ADE，AEA，AEEA和AEEAS。也可以利用两个接头的组合例如，AEEA-EDA，AEEA-AEEA，AEEAS-AEEAS，和AEA-AEEA。
在本发明的优选的具体实施方式中，白蛋白选自血清清蛋白，重组白蛋白和基因组来源的白蛋白。
在本发明的优选的具体实施方式中，白蛋白选自人白蛋白，大鼠白蛋白，小鼠白蛋白，猪白蛋白，牛白蛋白，狗白蛋白和兔子白蛋白，更优选人血清白蛋白。
在优选的具体实施方式中，白蛋白是用选自脂肪酸，金属离子，与白蛋白有高亲合性的小分子，和糖类，例如，但不限于，葡萄糖，乳糖和甘露糖修饰的白蛋白。
在本发明的优选的具体实施方式中，分子选自肽，DNA，RNA，小的有机分子及其组合。肽分子量优先至少57道尔顿。所用的肽包括，但不限于，GLP-1，GLP-2，ANP，K5，强啡肽，GRF，胰岛素，钠尿肽，T-20，T-1249，C-34和PYY。所用的小分子包括，但不限于，长春瑞宾(vinorelbine)，吉西他滨(gemcitabine)和紫杉醇。在本发明更优选的具体实施方式中，当分子是DNA，RNA或者小的有机分子时，它是通过酸敏感的共价键或者对溶解蛋白裂解敏感的肽序列与白蛋白共价结合的，由此可以使该分子与白蛋白分离并使分子进入细胞。
在本发明的优选的具体实施方式中，疏水性固体支持物是包含疏水性树脂例如，但不限于，辛基sepharose(sepharose)，苯基sepharose和丁基sepharose，而更优选为丁基sepharose的柱子。
在本发明另一具体实施方式中，疏水性固体支持物含有与支持物例如聚苯乙烯/二乙烯基苯基质相连的疏水性配体例如CibacronBlueF3G-A，醚或者异丙基。
根据物质与固定在不带电的基质上的疏水性配体间疏水相互作用的不同强度而将其分离开来。通常实施这些技术时，初始缓冲液中的盐为中高浓度(1M)(盐促进的吸附)。通过线形的或者逐渐降低盐浓度来进行洗脱。
在吸附阶段使用的配体类型，取代程度，pH和盐的种类和浓度对HIC基质(疏水作用层析基质)的总体性能(例如选择性和载量)会有很大的影响。
溶剂是一个最重要的参数，它会影响HIC(疏水作用层析)的载量和选择性。一般说来，吸附过程比脱附过程要有更高的选择性。因此，对于起始缓冲液的pH，溶剂种类，盐的种类和盐的浓度的优化是很重要的。在样品中添加各种“盐析”盐可以促进HIC中配体-蛋白质的相互作用。随着盐浓度的加大，结合蛋白的量会增加到该蛋白的沉淀点。每种盐促进疏水性相互作用的能力是不同的。不同盐对疏水性相互作用的影响遵循以下已建立的公认的感胶离子序(hofmeister series)：
感胶离子序
盐析效应
阴离子：PO4^3-＞SO4^2-＞CH₃COO^-＞Cl^-＞Br^-＞NO3^-＞ClO^4-＞I^-＞SCN^-
离液序列高的效应
阳离子：NH4⁺＜Rb⁺＜K⁺＜Na⁺＜Cs⁺＜Li⁺＜Mg²⁺＜Ba²⁺
增加盐析效应可以增强疏水性相互作用，而增加离液序列高的效应则使之减弱。因此，硫酸铵比氯化钠能显示出更强的盐析效应。对于HIC最经常使用的盐是硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，硫酸钠((Na)₂SO₄))，硫酸镁(MgSO₄)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，和乙酸铵(CH₃COONH₄)。
通过中到高浓度的“盐析”盐来促进蛋白与HIC吸附剂的结合，由于这些盐其优先从天然的球状蛋白中排除即，盐与蛋白质表面的相互作用是热力学不利的，因此这些盐的大部分对蛋白的结构还有稳定化影响。盐浓度应该足够高(例如500-1000mM)以促进配体-蛋白相互作用，而低于会引起样品中蛋白沉淀的浓度。对于白蛋白的情况，盐浓度应该低于3M(摩尔每升)。盐析的本质机理包括盐导致的水表面张力的加大(Melander和Horvath 1977)。因此，致密的结构更加有利，因为该结构对应的是较小的蛋白溶解的界面面积。
有意思的是，我们发现在同样的条件下(即由SO₄^2-，PO₄^2-或CH₃COO^-与任何相反离子组成的缓冲液)，基本上对所有的在此描述的结合结合的白蛋白这些盐都显示出具有盐析效应，而有点与非结合的白蛋白不同(即巯基白蛋白和加有半胱氨酸帽子的白蛋白)，因此相对于非结合的白蛋白，可以达到结合的白蛋白稳定的层析分离。也就是说，我们注意到，促进配体与结合白蛋白的相互作用所需要的盐浓度要低于配体和非结合白蛋白的相互作用所要求的盐浓度。层析分离基本上不依赖于(a)白蛋白的序列(例如人类，小鼠，鼠，等等)(b)白蛋白的来源(即血浆来源或重组的)(c)结合分子的分子量，(d)分子结构中Michael受体(或者马来酰亚胺基团)的位置，(e)肽的序列或者分子的化学结构，和(f)结合分子的三维结构，例如线形的对比环状的结构。
在本发明的优选的具体实施方式中，水溶液的盐足以产生盐析效应。为了提供足够的盐析效应，盐优选为，但不限于，磷酸盐，硫酸盐和醋酸盐。更优选的盐是磷酸盐或者硫酸盐。缓冲液中阳离子的选择不那么严，因此阳离子可无限制地选自NH4⁺，Rb⁺，K⁺，Na⁺，Cs⁺，Li⁺，Mg²⁺和Ba²⁺。
缓冲液优选磷酸铵，硫酸铵和磷酸镁，等等，更优选是硫酸铵。
在本发明的优选的具体实施方式中，缓冲液的pH在3.0-9.0；更优选6.0-8.0，而更优选pH7.0。
在本发明优选的具体实施方式中，缓冲液和疏水性固体支持物的温度是在室温(大约25℃)或在4℃或在两者之间。
表1显示的是利用丁基-sepharose树脂，从HSA溶液中纯化预先形成的HSA：第一种GLP-1类似物的结合物时，改变盐类所产生的效果(第一种GLP-1类似物的结构描述在下面的实施例1中)。
表1

  盐的类型 750mM的起始盐浓度   1,750mM的起始盐浓  度  磷酸铵 是   是   硫酸铵 是   是   氯化铵否  否  碘化铵否  否  硫氰酸铵否  否  硫酸镁否  是  磷酸镁*-  -  硫酸钡*-  -
*意思是在20mM磷酸钠(pH7)，5mM辛酸盐中，该盐在1750mM或者750mM的浓度是不可溶的
是意思是在HSA：第一种GLP-1类似物结合物和非结合的HSA之间能很好地分解
否意思是在HSA：第一种GLP-1类似物结合物和非结合的HSA之间无法实现分离
术语“肽”指的是分子量至少为57道尔顿的氨基酸序列。肽序列可以是环形的(环状结构)例如ANP，可以包含一个以上的氨基酸链例如胰岛素，或者可以是线形的例如K5，强啡肽A，C-34和GLP-1。
所有在此引用的参考文献此处都一并引用。
附图简要说明
图1举例说明通过本发明方法的优选具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图2举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)；
图3举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化非结合的HSA；
图4举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物rHSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图5举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化HAScortex；
图6举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：K5类似物(SEQ ID NO：3)；
图7举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：4)；
图8举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：5)；
图9举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种C34类似物(SEQ ID NO：6)；
图10举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种C34类似物(SEQ ID NO：7)；
图11举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种C34类似物(SEQ ID NO：8)；
图12举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化L-半胱氨酸；
图13举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化L-半胱氨酸：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图14举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种GLP-1类似物(SEQ ID NO：9)；
图15举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种GLP-1类似物(SEQ ID NO：10)；
图16举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第四种GLP-1类似物(SEQ ID NO：11)；
图17举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第五种GLP-1类似物(SEQ ID NO：12)；
图18举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：13)；
图19举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：14)；
图20举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化HSA：MPA；
图21举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化HSA；
图22举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种C34类似物(SEQ ID NO：3)；
图23举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种强啡肽类似物(SEQ ID NO：15)；
图24举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种ANP似物(SEQ ID NO：16)；
图25举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种强啡肽类似物(SEQ ID NO：17)；
图26举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：ACE抑制剂(SEQ ID NO：18)；
图27举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第六种GLP-1类似物(SEQ ID NO：19)；
图28举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第七种GLP-1类似物(SEQ ID NO：20)；
图29举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第八种GLP-1类似物(SEQ ID NO：21)；
图30举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第九种GLP-1类似物(SEQ ID NO：22)；
图31举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第十种GLP-1类似物(SEQ ID NO：23)；
图32举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第十一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：24)；
图33举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：25)；
图34举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第十二种GLP-1类似物(SEQ ID NO：26)；
图35举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一胰岛素衍生物(SEQ ID NO：4)；
图36举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：27)；
图37举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：5)；
图38举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第四种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：28)；
图39举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)；
图40举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种GRF类似物(SEQ ID NO：29)；
图41举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种GRF类似物(SEQ ID NO：30)；
图42举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第四种GRF类似物(SEQ ID NO：31)；
图43举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第十三种GLP-1类似物CJC 1365(SEQ ID NO：32)；
图44举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA乳糖：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图45举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种T20类似物(SEQ ID NO：33)；
图46举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种T1249类似物(SEQ ID NO：34)；
图47举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化复合的HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图48举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化复合的HSA：第一C34类似物(SEQ ID NO：6)；
图49举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化复合物HSA：第二种GRF类似物(SEQ ID NO：29)；
图50举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：长春瑞宾类似物结合物(SEQ ID NO：35)；
图51举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化L-半胱氨酸；
图52举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物L-半胱氨酸：长春瑞宾类似物(SEQ ID NO：35)；
图53举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物RSA：第三种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：25)；
图54举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第四种C34类似物(SEQ ID NO：36)；
图55举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第五种C34类似物(SEQ ID NO：37)；
图56举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第六种C34类似物(SEQ ID NO：38)；
图57举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第七种C34类似物(SEQ ID NO：39)；
图58举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第八种C34类似物(SEQ ID NO：40)；
图59举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种PYY类似物(SEQ ID NO：41)；
图60举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二种PYY类似物(SEQ ID NO：42)；
图61举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第五种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：43)；
图62举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第六种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：44)；
图63举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第七种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：45)；
图64举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种PYY类似物(SEQ ID NO：46)；
图65举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第四种PYY类似物(SEQ ID NO：47)；
图66举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第五种PYY类似物(SEQ ID NO：48)；
图67举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第六种PYY类似物(SEQ ID NO：49)；
图68举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第二ANP类似物(SEQ ID NO：50)；
图69A-B举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第三种ANP类似物CJC 1681(SEQ ID NO：51)；
图70举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图71举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图72举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图73举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图74举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)；
图75举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物HSA：第一种GLP-2类似物(SEQ ID NO：52)；和
图76举例说明通过本发明方法的优选的具体实施方式纯化结合物RSA：第一种GLP-2类似物(SEQ ID NO：52)。
本发明优选具体实施方式的详细说明
根据本发明，提供了一种用于从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中纯化白蛋白结合物的方法。
方法
对照(非结合的)人血清白蛋白(HSA)和预先形成的白蛋白结合物的制备
将每种具有Michael受体的化合物以10mM的浓度溶解到纳米纯(nanopure)的水中(或者如果化合物难以溶解则溶解在二甲亚砜中)，然后在HSA溶液(25％，250mg/ml，Cortex-Biochem，San Leandro，CA)中稀释到1mM。样品然后在37℃温育30min。纯化之前，将每种结合物在由5mM腈辛酸钠组成的20mM磷酸钠缓冲液(pH7)中释到5％ 50mg/ml HSA。用于洗脱梯度中的盐可以以起始浓度添加到缓冲液中以稀释该混合溶液。盐的起始浓度优选大约750到大约1700mM(NH₄)₂SO₄。
根据优选的具体实施方式用于纯化的方法
利用AKTA净化器(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，以2.5ml/min的流速将结合物加样到50ml的丁基sepharose4速流树脂(Amershan Biosciences，Uppsala，Sweden)上，该树脂用由5mM辛酸钠和750mM到1.7M(NH₄)₂SO₄组成的20mM磷酸钠缓冲液(pH7)平衡。在这些条件下，相对于非结合的HAS，增加了2kDa以上分子量的HSA结合物被吸附到疏水性树脂上，而所有非结合的HSA基本上都在柱子的无效体积中被洗脱掉。对于分子量增加小于2kDa的结合物，最初的含盐量可以更高，随后分级梯度降低盐的浓度。通过施加多于4倍柱体积的连续的或者不连续降低的盐梯度(750到0mM(NH₄)₂SO₄)溶液进一步将每种结合物从与所有游离的非结合的物质中纯化出来。在优选的具体实施方式中，每种纯化的结合物随后通过透滤法，例如Amicon^超速离心机(30kDa)过滤装置(MilliporeCorporation，Bedford，MA)脱盐和浓缩。最后，为了长期保存，每种结合溶液最好浸入到液氮中，利用Labconco冻干系统(FreeZone^4.5)冻干，并于-20℃保藏。
LC/EMS分析实施例
纯化后，最好将每种结合物1μl注入到LC/EMS系统中。HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)的结合物通过检测总质量70 160Da的最高丰度的部分而证实，这与巯基白蛋白的质量(66448Da)，其中半胱氨酸34是游离的巯基形式，再加上一个分子的第一种GLP-1类似物(3 719.9Da)部分相对应。第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)的结构在下面的实施例1中有所描述。在表2中举例说明。
表2  组分  分子量  绝对量  相对量  A  70160.58  321970  100.00  B  65862.95  70008  21.74  C  64545.45  62888  19.53  D  70320.04  41167  12.79  E  61287.67  16842  5.23  F  60623.81  16522  5.13  G  58090.04  12473  3.87
HSA：第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)的结合物通过检测总质量是70 086Da的最高丰度的部分而证实，这与巯基白蛋白(66448Da)的质量相对应，其中半胱氨酸34是游离巯基形式，再加上一个分子的第一种GRF类似物(3648.2Da)部分。第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)的结构在下面的实施例2中有所描述。在表3中举例说明。
表3  组分  分子量  绝对量  相对量  A  70086.06  279413  100.00  B  63214.84  53333  19.09  C  62148.17  38582  13.81  D  70247.98  34870  12.48  E  56795.96  10523  3.77  F  62695.49  9813  3.51
以下实施例举例说明了几种具有马来酰亚胺基团作为Michael受体的化合物，该化合物已经与白蛋白结合并且根据本发明的方法进行了纯化。
以下实施例是用来举例说明本发明而不是限制其范围。
在下面的实施例中，梯度编码指的是以下梯度详细内容，其中CV指的是50ml的柱体积。
梯度#1：超过4CV的线性750-0mM(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#2：阶段梯度，超过0.5CV的1.75M-1.2M的(NH₄)₂SO₄，随后是超过5CV的1.2M-875mM的(NH₄)₂SO₄，最后是超过0.5CV的875mM-0mM的(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#3：超过4CV的线性900-0mM(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#4：阶段梯度，过0.5CV的1.5M-1.1M的(NH₄)₂SO₄，随后是超过6CV的1.1M-375mM的(NH₄)₂SO₄，最后是超过0.5CV的375mM-0mM的(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#5：超过2CV的线性750-0mM(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#6：超过6CV的阶段梯度1.75M-0mM(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
梯度#7：超过6CV的线性750-0mM(NH₄)₂SO₄，流速2.5ml/min。
实施例1
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其具有以下序列：  H(dA)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(AEEA-MPA)- CONH₂
将1ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的共轭物的稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图1中，纯化的结合物级分在(NH₄)₂SO₄浓度降低的梯度过程中洗脱，作为级分B(F8-F9)，而非结合的白蛋白在柱子的无效体积中(级分A)被洗脱。用Ultrafree^TM过滤器30kDa浓缩结合物级分并利用LC-EMS进行分析。
实施例2
HSA：第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)结合物的纯化
第一种GRF类似物是GRF(1-29)dAla² Gln⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Lys³⁰(ε-MPA)CONH₂，具有以下序列：  YaDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILSRK(MPA)-CONH₂
将1ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GRF类似物作用生成的共轭物的稀释到9ml用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM辛酸钠和750mM(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图2中，纯化的结合物级分存在于级分B(F6-F7)中，而非结合的白蛋白柱子的无效体积中(级分A)洗脱。用Ultrafree^TM过滤器30kDa浓缩结合物级分并利用LC-EMS进行分析。
实施例3
非结合的HSA 1ml的纯化
将1ml 25％的250mg/ml非结合的HSA(Cortex-Biochem，SanLeandro，CA)稀释到9ml的用20mM磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中(pH7.0)，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。基本上所有的白蛋白分子在无效体积中洗脱，在(NH₄)₂SO₄梯度中280nm下没有检测到蛋白。图3举例说明了获得的分离曲线。
实施例4
rHSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列显示在实施例1中。
5ml，5％的rHSA(重组HSA新世纪培养等级)与200μM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到5ml的用20mM的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图4中，纯化的结合物级分存在于级分B(F7-F8-F9)中。
实施例5
HSA 10ml的纯化
将10ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)稀释到40ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中(pH7.0)，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。基本上所有的白蛋白分子都洗脱到无效体积中，在(NH₄)₂SO₄梯度中280nm下没有检测到蛋白。图5举例说明了获得的分离曲线。
实施例6
HSA：K5类似物(SEQ ID NO：3)结合物的纯化
K5类似物是Ac-K5Lys⁸(ε-MPA)-NH₂，具有如下序列：

将4ml 25％的250/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的k5类似物作用生成的结合物的稀释到16ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH4)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图6中，纯化的结合物级分存在于带有白蛋白的级分A和存在于级分B(F7-F8-F9)中。
实施例7
HSA：第一种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：4)结合物的纯化
第一种胰岛素衍生物是在B1位置带有MPA的人类胰岛素，如下面的图1所示。
图1

将1ml 25％的250mg/ml HSA (Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到9ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图7中，纯化的结合物级分存在于级分B(F6-F7-F8)中。
实施例8
HSA：第二种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：5)结合物的纯化
第二种胰岛素衍生物是在A1位置带有MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将1ml 25％的250mg/ml HSA (Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到9ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。在图8中，纯化的结合物级分存在于级分B(F6-F8-F8)中。
实施例9
HSA：第一种C34类似物(SEQ ID NO：6)结合物的纯化
第一种C34类似物是MPA-AEEA-C34-CONH₂，具有如下序列：

将5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种C34类似物作用生成的结合物稀释到20ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图9中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例10
HSA：第二种C34类似物(SEQ ID NO：7)结合物的纯化
第二种C34类似物是C34(1-34)Lys³⁵(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下结构：

将5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种C34类似物作用生成的结合物稀释到20ml的用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图10中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例11
HSA：第三种C34类似物(SEQ ID NO：8)结合物的纯化
第三种C34类似物是C34(1-34)Lys¹³(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下结构：

将5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第三种C34类似物作用生成的结合物的稀释到20ml的20mM，的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图11中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例12
I-半胱氨酸的纯化
在2ml用20mM磷酸钠，5mM辛酸钠和750mM(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中121mg的I-半胱氨酸在丁基sepharose柱上利用如上所述的梯度#5进行纯化。图12举例说明了获得的分离曲线，其中L-半胱氨酸洗脱到了柱子的无效体积中(F3)。
实施例13
L-半胱氨酸：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
将121mg L-半胱氨酸与36.36mg的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到2ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图13举例说明了获得的分离曲线，其中过量的L-半胱氨酸洗脱到F3(柱无效体积)中，L-半胱氨酸：第一种GLP-1类似物的结合物洗脱到了0mM的(NH₄)₂SO₄中。
实施例14
HSA：第二种GLP-1类似物(SEQ ID NO：9)结合物的纯化
第二种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys³⁷(ε-MPA)-NH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(ε-MPA)
将2.5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到10ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图14中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例15
HSA：第三种GLP-1类似物(SEQ ID NO：10)结合物的纯化
第三种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-M PA)-N H₂，具有如下序列：  H(dA)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(MPA)-CONH₂
将2.5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第三种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到10ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图15中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例16
HSA：第四种GLP-1类似物(SEQ ID NO：11)结合物的纯化
第四种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys²⁶(ε-AEEA-AE EA-MPA)，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(ε-AEEA-AEEA-MPA)EFIAWLVKGR
将2.5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第四种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到10ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图16中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例17
HSA：第五种GLP-1类似物(SEQ ID NO：12)结合物的纯化
第五种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys³⁴(ε-AEEA-AEEA-MPA)，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ε-AEEA-AEEA-MPA)GR
将2.5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第五种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到10ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图17中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例18
HSA：第一种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：13)结合物的纯化
第一种exendin-4类似物是Exendin-4-(1-39)Lys⁴⁰(ε-MPA)-NH₂，具有如下序列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(ε-MPA)-CONH₂
将1ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种exendin-4类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图18中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例19
HSA：第二种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：14)结合物的纯化
第二种Exendin-4类似物是Exendin-4(9-39)Lys⁴⁰(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(AEEA-MPA)-CONH₂
将3.5ml，25％ HSA cortex与1mM的第二种Exendin-4类似物作用生成的结合物的稀释到21.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图19中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例20
HSA：MPA的纯化
将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与2mM的MPA作用生成的结合物稀释到9ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图20中，纯化的巯基白蛋白存在于级分A(F5)中，而加帽的白蛋白存在于级分B(F7-F8)中。用Amicon^TM过滤器30kDa浓缩结合物级分。
实施例21
HSA的纯化
将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)稀释到9ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。当利用梯度#2时，不像梯度#1和#5，在加样过程中，结合的白蛋白和非结合的白蛋白都吸附到了疏水性树脂上。图21举例说明了获得的分离曲线，其中F4和F5富集了巯基白蛋白，而F6，F7和F8富集了加帽的白蛋白。
实施例22
HSA：第二种C34类似物(SEQ ID NO：3)结合物的纯化
第二种C34类似物是C34(1-34)Lys³⁵(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其结构如实施例10所示。
将1ml 25％的250mg/ml HSA (Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种C34类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图20中，巯基白蛋白存在于级分A(F5)中，而加帽的白蛋白和纯化的结合物存在于级分B(F7-F8)中。
实施例23
HSA：第一种强啡肽A类似物(SEQ ID NO：15)结合物的纯化
第一种强啡肽A类似物是Dyn A(1-13)(MPA)-NH₂，具有如下序列：YGGFLRRIRPKLK(MPA)-CONH₂。
将1ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种强啡肽A类似物作用生成的结合物稀释到9ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图23中，纯化的结合物级分存在于级分A(F11-F12)中。
实施例24
HSA：第一种ANP类似物(SEQ ID NO：16)结合物的纯化
第一种ANP类似物是MPA-AEEA-ANP(99-126)-CONH₂，具有如下结构：

将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种ANP类似物作用生成的结合物稀释到9ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图24中，纯化的结合物级分存在于级分A(F14)中。
实施例25
HSA：第二种强啡肽A类似物(SEQ ID NO：17)结合物的纯化
第二种强啡A类似物是Dyn A(7-13)Lys¹³(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
将1ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种强啡肽A类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图25中，纯化的结合物级分存在于级分A(F9)中。
实施例26
HSA：ACE抑制剂(SEQ ID NO：18)结合物的纯化
本实施例所用的ACE抑制剂是乙酰-Phe-His-环己基苄氧喹甲酯-Ile-Lys(ε-AEEA-MPA)-CONH2，具有如下序列：

将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的ACE抑制剂作用生成的结合物稀释到9ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#2在丁基sepharose柱上进行纯化。在图26中，纯化的结合物级分存在于级分A(F14)中。
实施例27
HSA：第六种GLP-1类似物(SEQ ID NO：19)结合物的纯化
第六种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys²³(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGK(AEEA-MPA)AAKEFIAWLVKGR-CONH₂
将3ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第六种GLP 1类似物作用生成的结合物的稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和1750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图27中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例28
HSA：第七种GLP-1类似物(SEQ ID NO：20)结合物的纯化
第七种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys¹⁸(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSK(AEEA-MPA)YLEGQAAKEFIAWLVKGR-CONH₂
将3ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第七种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图28中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例29
HSA：第八种GLP-1类似物(SEQ ID NO：21)结合物的纯化
第八种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys²⁶(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(AEEA-MPA)EFIAWLVKGR-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第八种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图29中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例30
HSA：第九种GLP-1类似物(SEQ ID NO：22)结合物的纯化
第九种GLP-1类似物是GLP-1(7-37)Lys²⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKK(AEEA-MPA)FIAWLVKGR-CONH₂
将3ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第九种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1丁基sepharose柱上进行纯化。图30中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例31
HSA：第十种GLP-1类似物(SEQ ID NO：23)结合物的纯化
第十种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys³⁷(ε-AEEA-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK-AEEA-AEEA-MPA-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第十种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图31中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例32
HSA：第十一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：24)结合物的纯化
第十一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(AEEA-MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第十一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图32中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例33
HSA：第三种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：25)结合物的纯化
第三种Exendin-4类似物是Exendin-4-(1-39)Lys⁴⁰(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(ε-AEEA-MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA (Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与4mM的第三种Exendin-4类似物作用生成的结合物的稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图33中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例34
HSA：第十二种GLP-1类似物(SEQ ID NO：26)结合物的纯化
第十二种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)Lys³⁴(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ε-AEEA-MPA)GR-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第十二种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图34中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例35
HSA：第一种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：4)结合物的纯化
第一种胰岛素衍生物是在B1位置带有MPA的人类胰岛素，其结构在实施例7中有详述。
将2.5ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图35中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例36
HSA：第三胰岛素衍生物(SEQ ID NO：27)轭物的纯化
第三种胰岛素衍生物是在B1位置带有OA-MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将4ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第三种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到21ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图36中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例37
HSA：第二种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：5)结合物的纯化
第二种胰岛素衍生物是在A1位置带有MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将3ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图37中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例38
HSA：第四胰岛素衍生物(SEQ ID NO：28)轭物的纯化
第四种胰岛素衍生物是在B29位置带有MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将3ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第四种胰岛素衍生物作用生成的结合物稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图38中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例39
HSA：第一种GRF类似物(SEQ ID NO：2)结合物的纯化
第一种GRF类似物是GRF(1-29)dAla² Gln⁸ Ala¹⁵ Leu²⁷ Lys³⁰(ε-MPA)CONH₂，其序列如实施例2所示。
将3.7ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GRF类似物作用生成的结合物稀释到22ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图39中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例40
HSA：第二种GRF类似物(SEQ ID NO：29)结合物的纯化
第二种GRF类似物是GRF(1-29)Lys³⁰(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：  YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRK(MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第二种GRF类似物作用生成的结合物稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和900mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上进行纯化。图40中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例41
HSA：第三GRF类似物(SEQ ID NO：30)结合物的纯化
第三种GRF类似物是GRF(1-29)dAla² Gln⁸ dArg¹¹ Ala¹⁵ Leu²⁷Lys³⁰(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：  YaDAIFTQSYrKVLAQLSARKLLQDILSRK(MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第三GRF类似物作用生成的结合物稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上进行纯化。图41中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例42
HSA：第四种GRF类似物(SEQ ID NO：31)结合物的纯化
第四种GRF类似物是GRF(1-29)dAla² Lys³⁰(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：  YaDAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRK(MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第四种GRF类似物作用生成的结合物稀释到22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和900mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上在行纯化。图42中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例43
HSA：第十三种GLP-1类似物CJC 1365(SEQ ID NO：32)结合物的纯化
第十三种GLP-1类似物是GLP-1(9-36)Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(ε-AEEA-MPA)-CONH₂
将3.5ml，25％的HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第十三GLP-1类似物作用生成的结合物稀释到21.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上纯化。图43中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例44
HSA乳糖：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
将4ml，25％的乳糖胺化的白蛋白(与过量的乳糖在37℃，pH7.0预培养的HSA)与200μm的第一种GLP-4类似物作用生成的结合物，在4ml的用20mM的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图44中，纯化的乳糖胺化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例45
HSA：第一种T20类似物(SEQ ID NO：33)结合物的纯化
第一种T20类似物是Ac-T20(1-36)Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFK(AEEA-MPA)-CONH₂
将2.5ml，25％ HSA与1mM的第一种T20类似物作用生成的结合物，在10ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图45中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例46
HSA：第一种T1249类似物(SEQ ID NO：34)结合物的纯化
第一种T1249类似物是Ac-T1249(1-39)Lys⁴⁰(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：

将2ml，25％ HSA与1mM的第一种T1249类似物作用生成的结合物，在10.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图46中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例47
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
114.45mg的预先形成的第一种GLP-1类似物在12.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图47举例说明了由在级分F2中发现的结合物而得到的分离曲线。
实施例48
HSA：第一种C34类似物(SEQ ID NO：6)结合物的纯化
第一种C34类似物是MPA-AEEA-C34-CONH₂，其序列如实施例9所示。
114.45mg的预先形成的第一种C34类似物在12.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图48举例说明了分离曲线，而结合物在级分F2中发现。
实施例49
HSA：第二种GRF类似物(SEQ ID NO：29)结合物的纯化
第二种GRF类似物是GRF(1-29)Lys³⁰(ε-MPA)-CONH₂，其序列如实施例40所示。
125.53mg的预先形成的第二种GRF类似物在12.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄，pH7.0的缓冲液中，利用如上所述的梯度#5在丁基sepharose柱上进行纯化。图49举例说明了得到的分离曲线，而结合物在级分F2中发现。
实施例50
HSA：长春瑞宾类似物(SEQ ID NO：35)结合物的纯化
长春瑞宾类似物是一种长春瑞宾与AEEA-MPA偶联的分子，以下为其图示结构：

将2.5ml，25％ HSA与1mM的长春瑞宾类似物作用生成的结合物，在22.5ml用20mM的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄ pH7.0制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#4在丁基sepharose柱上进行纯化。在图50中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。用Amicon^TM过滤器30kDa浓缩结合物级分。
实施例51
L-半胱氨酸的纯化
2.5ml 40mM的L-半胱氨酸在22.5ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM辛酸钠和1500mM(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，在丁基sepharose柱上利用如上所述的梯度#4进行纯化。图51举例说明了获得的分离曲线，其中L-半胱氨酸洗脱到了柱子的无效体积中(级分F3)。
实施例52
L-半胱氨酸：长春瑞宾类似物(SEQ ID NO：35)的结合物的纯化
长春瑞宾类似物是一种长春瑞宾与AEEA-MPA偶联的分子，图示的结构如实施例50所示。
将2.5ml，40mM的L-半胱氨酸与1mM的长春瑞宾类似物作用生成的结合物，在22.5ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#4在丁基sepharose柱上进行纯化。图52举例说明了获得的分离曲线，L-半胱氨酸结合物洗脱到了级分F8，F9和F10中。
实施例53
RSA：第三种Exendin-4类似物(SEQ ID NO：25)结合物的纯化
第三种Exendin-4类似物是Exendin-4-(1-39)Lys⁴⁰(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例33所示。
将11ml，5％的RSA(大鼠血清白蛋白)与200μM第三种Exendin-4类似物作用生成的结合物，在11ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上纯化。图53中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例54
HSA：第四种C34类似物(SEQ ID NO：36)结合物的纯化
第四种C34类似物是C34(1-34)Lys¹³(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列： WMEWDREINNYTK(MPA)LIHSLIEESQNQQEKNEQELL-CONH₂
将2ml，25％ HSA与1mM的第四种C34类似物作用生成的结合物，在13ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图54中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例55
HSA：第五种C34类似物(SEQ ID NO：37)结合物的纯化
[00215]第五种C34类似物是C34(1-34)Lys³⁵(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：

将2ml，25％ HSA与1mM的第五种C34类似物作用生成的结合物，在13ml用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图55中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例56
HSA：第六种C34类似物(SEQ ID NO：38)结合物的纯化
第六种C34类似物是MPA-C34(1-34)-CONH₂，具有如下序列：  MPA-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-CONH₂
将2ml，25％ HSA与1mM的第六种C34类似物作用生成的结合物，在13ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图56中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例57
HSA：第七种C34类似物(SEQ ID NO：39)结合物的纯化
第七种C34类似物是Ac-C34(1-34)Glu² Lys⁶ Lys⁷ Glu⁹ Glu¹⁰Lys¹³ Lys¹⁴ Glu¹⁶ Glu¹⁷ Lys²⁰ Lys²¹ Glu²³ Glu²⁴ Lys²⁷ Glu³¹ Lys³⁴ Lys³⁵Lys³⁶(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，具有如下序列：
AC-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKKK(AEEA-MPA)-CONH₂
将2ml，25％的HSA与1mM的第七种C34类似物作用生成的结合物，在13ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图57中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例58
HSA：第八种C34类似物(SEQ ID NO：40)结合物的纯化
第八种C34类似物是MPA-AEEA-C34(1-34)Glu² Lys⁶ Lys⁷ Glu⁹Glu¹⁰ Lys¹³ Lys¹⁴ Glu¹⁶ Glu¹⁷ Lys²⁰ Lys²¹ Glu²³ Glu²⁴ Lys²⁷ Glu³¹ Lys³⁴Lys³⁵-CONH₂，具有如下序列： WPA-AEEA-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-CO  NH₂
将2ml，25％的HSA与1mM的第八种C34类似物作用生成的结合物，在13ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图58中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例59
HSA：第一种PYY类似物(SEQ ID NO：41)结合物的纯化
第一种PYY类似物是PYY(3-36)Lys⁴(ε-OA-MPA)-CON H₂，具有如下结构：

将1.5ml，25％的HSA与1mM的第一种PYY类似物作用生成的结合物，在6ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图59中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例60
HSA：第二种PYY类似物(SEQ ID NO：42)结合物的纯化
第二种PYY类似物是MPA-OA-PYY(3-36)-CONH₂，具有如下序列：

将1.5ml，25％的HSA与1mM的第二种PYY类似物作用生成的结合物，在6ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图60中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例61
HSA：第五种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：43)结合物的纯化
第五种胰岛素衍生物是在B29位置带有AEEAS-AEEAS-MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将2ml，25％的HSA与1mM的第五种胰岛素衍生物作用生成的结合物，在15ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图61中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例62
HSA：第六种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：44)结合物的纯化
第六种胰岛素衍生物是在B1位置带有AEEAS-AEEAS-MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将2.5ml，25％的HSA与1mM的第六种胰岛素衍生物作用生成的结合物，在15ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图62中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例63
HSA：第七种胰岛素衍生物(SEQ ID NO：45)结合物的纯化
第七种胰岛素衍生物是在B29位置带有OA-MPA的人类胰岛素，如实施例7中的图1所示。
将2ml，25％的HSA与1mM的第七种胰岛素衍生物作用生成的结合物，在15ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图63中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例64
HSA：第三种PYY类似物(SEQ ID NO：46)结合物的纯化
第三种PYY类似物是MPA-PYY(3-36)-CONH₂，具有如下序列： MPA-NH-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-CONH₂
将3ml，25％ HSA与1mM的第三种PYY类似物作用生成的结合物，在18ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图64中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例65
HSA：第四种PYY类似物(SEQ ID NO：47)结合物的纯化
第四种PYY类似物是PYY(3-36)Lys³⁷(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：  IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYK(MPA)-CONH₂
将3ml，25％的HSA与1mM的第四种PYY类似物作用生成的结合物，在18ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图65中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例66
HSA：第五种PYY类似物(SEQ ID NO：48)结合物的纯化
第五种PYY类似物是MPA-PYY(22-36)-CONH₂，具有如下序列：(MPA)-ASLRHYLNLVTRQRY-CONH₂。
将6ml，25％的HSA与1mM的第五种PYY类似物作用生成的结合物，在36ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与900mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上进行纯化。图66中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例67
HSA：第六种PYY类似物(SEQ ID NO：49)结合物的纯化
第六种PYY类似物是乙酰基-PYY(22-36)Lys37(ε-MPA)-CONH₂，具有如下序列：AC-ASLRHYLNLVTRQRYK(MPA)-CONH₂。
将6ml，25％的HSA与1mM的第六种PYY类似物作用生成的结合物，在36ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.00)，5mM的辛酸钠与900mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上进行纯化。图67中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例68
HSA：第二种ANP类似物(SEQ ID NO：50)结合物的纯化
第二种ANP类似物是MPA-ANP(99-126)-CONH₂，具有如下序列：

将1ml，25％的HSA与1mM的第二种ANP类似物作用生成的结合物，在14ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与750mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3mm在丁基sepharose柱上进行纯化。图68中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例69
HSA：第三种ANP类似物(SEQ ID NO：51)结合物的纯化
第三种ANP类似物是与MAL-dPEG4(Quanta Biodesign，Powell，OH，USA)在Ser⁹⁹偶联的ANP(99-126)。产生的ANP类似物是MPA-EEEEP-ANP(99-126)，其中EEEEP是乙氧基乙氧基乙氧基乙氧基丙酸；其序列如下：

将1ml，25％的HSA与1mM的CJC 1681作用生成的结合物，在14ml的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，5mM的辛酸钠与900mM的(NH₄)₂SO₄的缓冲液中，利用如上所述的梯度#3在丁基sepharose柱上进行纯化。在图69A和69B中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例70
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和1.75M的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#6在丁基sepharose柱上进行纯化。图70中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例71
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和1.75M的硫酸镁制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#6在丁基sepharose柱上进行纯化。图71中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例72
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
样品含750mM的硫酸铵，将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图72中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例73
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
样品含1.75M的磷酸铵，将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物的稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和1.75M的磷酸铵制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#6在丁基sepharose柱上进行纯化。图73中，纯化的结合物级分存在于级分B中。
实施例74
HSA：第一种GLP-1类似物(SEQ ID NO：1)结合物的纯化
第一种GLP-1类似物是GLP-1(7-36)dAla⁸ Lys³⁷(ε-AEEA-MPA)-CONH₂，其序列如实施例1所示。
样品含750mM的磷酸铵，将1ml，25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-1类似物作用生成的结合物稀释到9ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的磷酸铵制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图74中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例75
HSA：第一种GLP-2类似物(SEQ ID NO：52)结合物的纯化
第一种GLP-2类似物是GLP-2(1-33)Gly² Lys³⁴(ε-M PA)-CONH₂，具有如下序列：  HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDK(MPA)-CONH₂
将2ml 25％的250mg/ml HSA(Cortex-Biochem，San Leandro，CA)与1mM的第一种GLP-2类似物作用生成的结合物的稀释到14ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图75中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
实施例76
RSA：第一种GLP-2类似物(SEQ ID NO：52)结合物的纯化
第一种GLP-2类似物是GLP-2(1-33)Gly² Lys³⁴(ε-MPA)-CONH₂，其序列如实施例75所示。
将9ml，25％的250mg/ml RSA(大鼠血清白蛋白)与1mM的第一种GLP-2类似物作用生成的结合物的稀释到14ml的用20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液，5mM的辛酸钠和750mM的(NH₄)₂SO₄制成的缓冲液中，利用如上所述的梯度#1在丁基sepharose柱上进行纯化。图76中，纯化的结合物级分存在于级分F2中。
尽管在相关的特殊的具体实施方式中描述了本发明，但是很清楚可以进一步地进行修改，而本申请也意图包括任何大体上遵循本发明的变动，运用，或者修改，并包括从属于本发明的、可以应用于以上阐述的基本特征的、在本领域已知的或者惯例范围内和在以下附加的权利要求范围内的对给出的公开内容进行的改变。