一种水稻苗期耐盐基因QST2及其分子标记方法.pdf

本发明涉及一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法，属于水稻抗逆育种和分子遗传学领域，其特征在于利用中广香1号与IR75862构建的BC1F10导入系群体及导入系互交衍生的F2群体，通过单标记分析，定位在水稻基因组第2染色体存在一个与水稻苗期耐盐相关的一个基因位点qST2，并获得与之紧密连锁的基于PCR扩增的实用经济型标记RM110。将本发明应用于水稻苗期耐盐性的辅助选择育种和聚合育种，能够有效地弥补以往缺乏耐盐基因的不足，可以在苗期对低世代的育种群体进行基因型选择，获得耐盐个体，便于及时地杂交转育，降低耐盐鉴定过程中表型鉴定的误差，提高育种效率，加快育种进程。

1.  一种水稻苗期耐盐基因qST2，其特征在于：在水稻基因组第2染色体存在一个与水稻苗期耐盐相关的一个基因位点qST2，籼稻品种中广香1号在该位点上的等位基因能够显著提高水稻苗期耐盐性。

2.  如权利要求1所述的一种水稻苗期耐盐基因qST2的分子标记方法，其特征在于：用一对特异的PCR引物对RM110，其中正向引物序列为：TCGAAGCCATCCACCAACGAAG，反向引物序列为：TCCGTACGCCGACGAGGTCGAG，PCR扩增带有中广香1号基因组DNA，如果引物对RM110能够扩增出与中广香1号类似的135bp左右大小的片段，则该育种材料带有中广香1号的耐盐等位基因。

3.  根据权利要求1、2所述的一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法，其特征在于在水稻耐盐分子标记辅助选择育种中的应用。

一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法，属于水稻抗逆育种和分子遗传学领域。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，对盐害敏感，在水稻苗期对盐害尤为敏感。仅在亚洲就有2.9×10⁷公顷盐害耕地，对水稻生产造成了很大的损失。选育耐盐水稻品种是提高水稻耐盐性最直接有效的方法。
分子遗传学研究表明，水稻耐盐表现为受多基因控制的数量性状。迄今为止，已有多个影响水稻耐盐性的主效QTL被鉴定出来，其中Saltol等基因已被精细定位，SKC1已被克隆。另外，研究者通过反向遗传学的方法还克隆了OsNAP、OsSIK1、SNAC1、OsNAC10、OsNAC045、OsISAP1等多个影响水稻耐盐基因。同时，研究者还发现，SNAC家族成员能通过调节盐胁迫相关基因的表达来提高水稻苗期的耐盐性。上述影响水稻耐盐性的基因主要是通过转基因的方法克隆的，这些基因的定位和克隆有助于我们了解水稻耐盐性的遗传及分子基础，但其真正在育种实践中成功应用的实例仍然十分有限。
拓宽遗传变异进而鉴定和挖掘有利基因是开展突破性育种的先决条件。种质资源是人们在长期生产实践中培育和保留的自然群体材料，它们携带有多种有利变异的基因，是进行遗传改良的宝库。实践证明，通过对核心种质的鉴定和遗传改良是获得农作物主栽品种有利变异的有效途径。前人从种质资源中 挖掘了许多耐盐有利基因，但是由于不利基因的连锁累赘，从种质资源中转育耐盐等位基因受到很大局限，很少有成功的报道。近年来植物分子数量遗传学的研究表明，育成的许多推广品种中也携带耐盐、高产、抗旱等有利等位基因，因此从推广品种中挖掘耐盐有利基因，在优良品种的背景下将其聚合，可以有效克服种质资源不利性状与耐盐基因连锁的负面影响，比单纯从种植资源中转育耐盐有利基因更容易改良推广品种的耐盐性。
本发明人在国内较早开展回交育种研究，选用中广香1号作为受体材料，与来源于国际水稻研究所的糯稻品种IR75862构建了一套回交导入系群体(BC₁F₁₀)，该导入系群体于2011年构建完成。2012年将该套导入系进行苗期耐盐实验，发现虽然亲本中广香1号和IR75862均中等感盐，但部分导入系表现为较强的苗期耐盐特征。通过分子标记技术定位发现一个位于第2染色体上的主效位点qST2，该位点来源于中广香1号的等位基因能降低苗期盐害级别和延长盐胁迫下幼苗存活天数，增加幼苗的耐盐性，在导入系群体中解释13.4％盐害级别和21.6％存活天数的表型变异，获得了与该耐盐位点紧密连锁的分子标记RM110。经比较作图发现，这个位点上尚未有控制耐盐相关性状的基因报道，因此qST2可能是一个控制水稻苗期耐盐新基因。该耐盐新基因qST2及其紧密连锁的分子标记RM110有望应用于水稻耐盐标记辅助选择育种。
发明内容：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法，利用IR75862为供体亲本与中广香1号为轮回亲本杂交和回交，配制的导入系群体，通过连锁分析，定位第2染色体上的苗期耐盐基因qST2，获得与之紧密连锁的基于PCR的实用经济型标记RM110，该标记可以有效的进行水稻苗期耐盐性的辅助选择，应用于水稻抗逆育种。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的一种水稻苗期耐盐基因qST2，是在水稻基因组第2染色体存在一个与水稻苗期耐盐相关的一个基因位点qST2，籼稻品种中广香1号在该位点上的等位基因能够显著提高水稻苗期耐盐性；
对基因qST2的分子标记方法，是用一对特异的PCR引物对RM110，其中正向引物序列为：TCGAAGCCATCCACCAACGAAG，反向引物序列为：TCCGTACGCCGACGAGGTCGAG，PCR扩增带有中广香1号基因组DNA，如果引物对RM110能够扩增出与中广香1号类似的135bp左右大小的片段，则该育种材料带有中广香1号的耐盐等位基因。
水稻耐盐基因qST2及其分子标记方法可以应用于水稻耐盐分子标记辅助选择育种。
本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：
1、与目前报道的影响耐盐基因SKC1、Saltol、OsNAP、OsSIK1、SNAC1、OsNAC10、OsNAC045、OsISAP1等不同，qST2是来源于感盐推广品种中广香1号的一个控制水稻苗期耐盐性的新基因位点，为分子标记辅助选择提高水稻耐盐性提供了耐盐新基因。
2、通过新基因标记的筛选，能够获得苗期耐盐性提高的抗逆育种材料。本发明的分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效地鉴别带有该基因的耐盐个体，便于及时的杂交转育，加快育种进程。
附图说明
图1为耐盐导入系与感盐导入系杂交F₂群体苗期耐盐性表现与RM110标记基因型图谱。
中广香1号/IR75862的BC₁F₁₀回交后代耐盐导入系CV204(仅带有qST21个耐盐基因)与感盐导入系CV55(不带有任何耐盐等位基因)杂交的F₂群体，经SSR标记RM110的PCR扩增产物在5％聚丙烯酰胺凝胶电泳的带型图谱及其对应的表型(1-30为随机选取的F₂代单株；M为DNA Ladder；CV204为耐盐导入系；CV55为感盐导入系；a为135bp，b为150bp)。
图2为来源于中广香1号/IR75862导入系后代不同株系杂交的F₂群体基于RM110标记鉴定的两种纯合基因型单株的苗期耐盐表现。
A：两种纯合基因型个体的平均盐害级别；B：两种纯合基因型个体的平均存活天数。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，其中所用的方法如无特别说明均为常规方法。
一、耐盐新基因的单标记法定位
1、供试材料
利用引自国际水稻所的糯稻品种IR75862为供体，与我国高产优质籼型常规稻中广香1号为受体杂交和回交，构建200个BC₁F₁₀家系的回交导入系群体。
2、DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。以各个单株的基因组DNA为模板对RM110标记进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。
3、单标记分析
根据导入系的扩增条带所表示的基因型，将其对应的苗期盐胁迫下的盐害 级别和存活天数考查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMapping V3.0，免费软件)，进行表型与标记的单向方差分析，定位到影响盐害级别和存活天数的QTL区间及相关标记。
筛选效应较大的主效基因位点。共获得了2个影响盐害级别的主效QTL，4个影响存活天数的主效QTL，其中在第2染色体1,000,000-1,500,000bp区间定位到1个同时影响盐害级别和存活天数的qST2位点，该位点来自中广香1号的等位基因降低盐害级别0.65和提高存活天数1.30天，分别解释导入系群体中盐害级别和存活天数的13.4％和21.6％。
表1：利用中广香1号/IR75862导入系群体检测到影响苗期盐害级别和存活天数的主效QTL

表1中：a表示加性效应，指中广香1号等位基因被IR75862等位基因替代后的效应，R²(％)表示QTL解释群体中该性状变异的百分比。
二、导入系衍生的F₂群体qST2及标记验证分析
1、供试材料
从中广香1号/IR75862导入系群体中，选择仅带有一个qST2纯合耐盐基因的耐盐导入系CV204，与不带任何耐盐基因的另一个感盐导入系CV55配制F₂分离群体，该群体计390株，用于qST2及连锁标记的验证。
2、DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。以各个单株的基因组DNA为模板对RM110标记进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代单株的带型进行判别记录。
3、t测验分析
根据后代单株的RM110标记扩增条带所表示的基因型，将F₂群体中的个体分成两组，其中一组是qST2位点基因型为中广香1号纯合基因型的个体(称为ZGX组)，共计95株；另一组是qST2位点基因型为IR75862纯合基因型的个体(称为IR组)，共计90株。将两组个体考察所得的平均盐害级别和存活天数进行t测验(表2)，结果表明，两组个体间的盐害级别和存活天数均达到极显著差异水平，表明RM110标记附近确实存在一个影响盐害级别和存活天数的主效基因qST2，而且与RM110标记紧密连锁。
表2：导入系杂交F₂群体在RM110标记位点双亲纯合个体盐害级别和存活天数的表现

表2中：***表示差异达到0.001水平显著。