一种黑牛肝菌母种低温保藏方法.pdf

本发明涉及食用真菌栽培技术菌种保藏领域，特别涉及一种黑牛肝菌母种低温保藏方法，包括以下步骤：将黑牛肝菌子实体在固体培养基上培养菌丝，制得菌丝块；将菌丝块浸泡在含有无菌蒸馏水的无菌容器中，密封容器，在10-15℃条件下，放置10-30d；然后放置于3.5-4.5℃进行低温保藏。本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法，通过逐步冷却的方式保藏黑牛肝菌母种，经测试该方法保藏的黑牛肝菌母种，其菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同，保存黑牛肝菌母种活力及优良性状达3年，解决了黑牛肝菌母种中短期简便种保藏的问题，为规模化栽培提供了有力保障。

1.  一种黑牛肝菌母种低温保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、将黑牛肝菌子实体在固体培养基上培养菌丝，制得菌丝块；
(b)、将所述菌丝块浸泡在含有无菌蒸馏水的无菌容器中，密封容器，在10-15℃条件下，放置10-30d；然后放置于3.5-4.5℃进行低温保藏。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌丝块的大小为0.5㎝～1㎝×0.5㎝～1㎝。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述黑牛肝菌子实体培养前切块，得到组织块；
将所述组织块培养，至菌丝长满培养基，即得所述菌丝块。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为26-30℃，优选为28℃。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养采用平板培养基或斜面培养基进行。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养选用的容器包括玻璃试管、培养皿和塑料试管。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，容器中无菌蒸馏水的体积占所述容器体积的1/5-1/3。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述容器加入蒸馏水，于121℃灭菌20min，冷却待用。

9.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述容器为18mm×180mm规格的试管，每支试管装蒸馏水10ml～15ml，每支试管放置3块～5块黑牛肝菌母种，用硅胶塞塞紧试管口。

10.  根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述固体培养基，包括以下成分：

一种黑牛肝菌母种低温保藏方法
技术领域
本发明涉及食用真菌栽培技术菌种保藏领域，具体而言，涉及一种黑牛肝菌母种低温保藏方法。
背景技术
黑牛肝菌(Phlebopus portentosu)，是热带地区珍贵的、最受消费者喜爱的食用菌，分布于斯里兰卡、越南、印度尼西亚、泰国、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰及我国云南、广西和海南等地。黑牛肝菌品质鲜嫩、味道鲜美、营养价值丰富、高蛋白、低脂肪，富含17种人体必需氨基酸及丰富的磷、钾、钙、镁、铁、锌等人体必须的矿质元素，是较好的健康食品并具有很好的药用价值，深受消费者喜爱。目前已可用栽培腐生菌的方式进行人工栽培，以及接种凤凰木、咖啡、柚子、芒果寄主树等寄主树进行仿生栽培。
一般食用菌及微生物母种常将菌种转接于斜面培养，菌丝长满后于低温4℃条件保藏，或将菌种块放于试管装的无菌水中，然后保藏于低温4℃条件下的方法进行母种的中短期保藏。此方法的主要优点是方法简便、成本低，中短期可以很好的保持保藏母种的优良性状，是一般食用菌及微生物母种常用且较为有效的方法。但黑牛肝菌是一种高温食用菌，适宜菌丝生长的最适温度28℃～30℃。采用一般微生物及食用菌常用4℃低温保藏方法保藏黑牛肝菌母种，在保藏5天后菌丝即死亡。因此，迫切需要一种简便、有效、可利用常用设备进行保藏黑牛肝菌母种的方法。
申请号为201310546293.9的发，发明专利公开了一种黑牛肝菌母种保藏方法，该保藏方法包括在特定固体培养基上培养菌丝以及取菌丝块将其放入装有灭菌蒸馏水的容器中，密封容器，在10℃～15℃恒温保藏。但是，直接在10℃～15℃恒温保藏，菌体自身营养物质消耗严重，菌体保藏一年后活化，菌体活力显著降低，菌丝不够浓密和粗壮，生长缓慢，栽培得到的子实体重量轻，品质降低；并且该固体培养基成分较多，特别涉及到红壤土，而红壤土的成分变化较大，并且不易取得。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑牛肝菌母种低温保藏方法，该保藏方法简便、有效，并可利用常规设施低温保藏黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)母种，得到的黑牛肝菌母种活力及优良性状保持时间长久。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明还提供了一种黑牛肝菌母种低温保藏方法，包括以下步骤：
(a)、将黑牛肝菌子实体在固体培养基上培养菌丝，制得菌丝块；
(b)、将所述菌丝块浸泡在含有无菌蒸馏水的无菌容器中，密封容器，在10-15℃条件下，放置10-30d；然后放置于3.5-4.5℃进行低温保藏。
本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法，将黑牛肝菌子实体在固体培养基上培养后，制成菌丝块；将菌丝块浸泡在无菌的蒸馏水中，先放置于10-15℃条件下预冷处理，放置10-30d；然后再放 置于3.5-4.5℃进行低温保藏，通过逐步冷却的方式保藏黑牛肝菌母种。经测试，使用本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法保藏黑牛肝菌母种，其菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同，保存黑牛肝菌母种活力及优良性状达3年，解决了黑牛肝菌母种中短期简便种保藏的问题，为规模化栽培提供了有力保障。
为了保持菌丝活力及菌种栽培性状，且易于保藏，优选地，所述菌丝块的大小为0.5㎝～1㎝×0.5㎝～1㎝。即菌丝块的长宽为0.5㎝～1㎝×0.5㎝～1㎝。
为了便于黑牛肝菌子实体培养，得到更多的菌丝，优选地，在步骤(a)中，所述黑牛肝菌子实体培养前切块，得到组织块；
将所述组织块培养，至菌丝长满培养基，即得所述菌丝块。
优选地，所述培养的温度为26-30℃，优选为28℃。该温度条件下，培养22-28天菌丝即长满培养基。黑牛肝菌培养得到的菌丝健壮，保藏后，能很好的保持母种的活力及优良性状。
具体地，所述培养采用平板培养基或斜面培养基进行。即将黑牛肝菌的组织块接种于平板培养基或斜面培养基进行培养，得到菌丝块。
进一步地，所述培养选用的容器包括玻璃试管、培养皿和塑料试管。
为了使菌丝体保持更久的活力。优选地，在步骤(b)中，容器中无菌蒸馏水的体积占所述容器体积的1/5-1/3。
为了便于操作，得到无菌水的同时得到无菌的容器，优选地，在步骤(b)中，所述容器加入蒸馏水，于121℃灭菌20min，冷却待用。
具体地，在步骤(b)中，所述容器为18mm×180mm规格的试管，每支试管装蒸馏水10ml～15ml，每支试管放置3块～5块黑牛肝菌母种，用硅胶塞塞紧试管口。
优选地，所述固体培养基，包括以下成分：

该固体培养基用于培养黑牛肝菌，得到的菌丝体多，得到的菌丝块保存后，能够很好的保持黑牛肝菌母种活力及优良性状。
将黑牛肝菌母种分别于保藏30天、半年、1年、2年、3年后进行菌株转管活化，扩繁菌种，再培养成液体菌种，液体菌种接种袋装基质人工栽培黑牛肝菌，检验菌种活力及栽培性状的结果：a、菌种扩繁菌丝生长快，用活化菌丝体接种于试管装斜面培养基，接种后25天菌丝长满斜面；b、用“a”扩繁的菌丝体接种液体培养基培养液体菌种，接种第3天开始形成菌球，至第9天时菌球颜色金黄、色泽明亮，大小均匀、分布于液体培养基中，说明菌球旺盛生长期；c、将“b”培养的液体菌种接种固体基质人工栽培黑牛肝菌， 接种后第3天菌丝吃料，第50天菌子实体110g-115g，能实现黑牛肝菌规模化栽培。
本发明提供的保藏方法及培养基保藏黑牛肝菌母种，其菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同，可保存黑牛肝菌母种活力及优良性状达3年，解决了黑牛肝菌母种中短期简便种保藏的问题，为规模化栽培提供了有力保障。
本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法简便有效，设备简单，解决了高温食用菌菌种难于常规保藏的难题，可中长期(2-3年)保存黑牛肝菌菌株活力及优良性状，具有较高的应用价值、经济意义及社会意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法，通过逐步冷却的方式保藏黑牛肝菌母种，保藏后的菌丝块其菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同，保存黑牛肝菌母种活力及优良性状达3年，解决了黑牛肝菌母种中短期简便种保藏的问题，为规模化栽培提供了有力保障；
(2)为了将黑牛肝菌的菌丝块保藏后保持其活力及优良性状，本发明还在保藏容器中添加特定含量的无菌蒸馏水和特定数量的菌丝块；
(3)本发明提供的固体培养基培养黑牛肝菌，得到的菌丝块健壮，菌丝体多，利于后续的保藏，保藏后得到的菌丝块的菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
(1)黑牛肝菌母种培养：采集野生的黑牛肝菌子实体，用组织分离法取黑牛肝菌的组织块接种于固体培养基中，28℃恒温培养，25天菌丝长满培养基，得黑牛肝菌母种；
其中，固体培养基的配方如表1所示，同时将不同固体培养基培养得到的菌丝块直接进行栽培，得到黑牛肝菌子实体，并将黑牛肝菌子实体测量了重量，具体如表1所示。
表1 不同含量成分的固体培养基

从表1可以看出，不同成分含量的固体培养基培养得到的黑牛肝菌的菌丝块进行栽培，得到的黑牛肝菌的子实体重重，说明不同成分含量的固体培养基培养得到的菌丝块均具有很强的活力，并且黑牛肝菌的子实体之间无显著性差异。
(2)母种保藏存储管制作：用18×180mm规格的试管，每支试管装蒸馏水10ml，然后常规灭菌待用；将步骤(1)采用配方1培养获得的菌丝块，切取0.75㎝×0.75㎝的菌丝块放于已灭菌试管装的蒸馏水中，每支试管放入3块，用硅胶塞塞紧试管口，得母种存储管；
(3)预冷处理：步骤(2)得到的母种存储管放于10℃的恒温箱中预冷10d；
(4)低温保藏：将步骤(3)完成预冷的试管培养的斜面菌丝体及菌丝体蒸馏水保藏管放入4℃恒温箱进行低温保藏；
(5)菌丝活力检测及栽培检验
将保藏的黑牛肝菌母种，分别于保藏30天、半年、1年、2年、3年进行菌株转管活化，扩繁菌种，再培养成液体菌种，液体菌种接种袋装基质人工栽培黑牛肝菌，检验菌种活力及栽培性状的结果：
a、菌种扩繁菌丝生长快，用活化菌丝体接种于试管装斜面培养基，接种后25-26天菌丝长满斜面；
b、用“a”扩繁的菌丝体接种液体培养基培养液体菌种，接种第3天开始形成菌球，至第9-10天时菌球颜色金黄、色泽明亮，大小均匀、分布于液体培养基中，为菌球旺盛生长期；
c、将“b”培养的液体菌种接种固体基质人工栽培黑牛肝菌，接种后第3天菌丝吃料，第50天菌子实体110g-115g，能实现黑牛肝菌规模化栽培。
此外，还设置了对照组，具体为：直接将步骤(2)得到的母种存储管放于10℃的恒温箱中保藏1年。
将预冷后保藏半年、1年、3年后母种以及对照组保藏后的菌株进行活力及栽培性状检验，具体见表2。
表2 不同保藏时间得到的母种活力及栽培性状检验


从表2可以看出，本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法，保藏时间为3年内菌丝块均保持了很好的活力和优良性状；而对照组中，直接将菌丝块置于10℃保存，则明显地出现了菌丝块的退化以及污染状况。
此外，还设置了菌丝块置于10℃保存半年和3年的对照组，保存半年的菌丝块也比较明显地出现了菌丝块的退化以及污染状况；而保存3年的菌丝块严重地出现了菌丝块的退化以及污染状况。
实施例2
(1)黑牛肝菌母种培养：采集野生的黑牛肝菌子实体，用组织分离法取黑牛肝菌的组织块接种于固体培养基中，26℃恒温培养，28天菌丝长满培养基，得黑牛肝菌母种，其中，固体培养基采用实施例1中的配方1制成；
(2)母种保藏存储管制作：用18×180mm规格的试管，每支试管装蒸馏水15ml，然后常规灭菌待用；将步骤(1)得到的黑牛肝菌母种-菌丝块，切取0.5㎝×0.5㎝的菌丝块放于已 灭菌试管装的蒸馏水中，每支试管放入5块，用硅胶塞塞紧试管口，得母种存储管；
(3)预冷：步骤(2)得到的母种存储管放于15℃的恒温箱中预冷30d；
(4)低温保藏：将步骤(3)完成预冷的试管培养的斜面菌丝体及菌丝体蒸馏水保藏管放入4.5℃恒温箱进行低温保藏；
(5)菌丝活力检测及栽培检验
将保藏的黑牛肝菌母种，分别于保藏30天、半年、1年、2年、3年进行菌株转管活化，扩繁菌种，再培养成液体菌种，液体菌种接种袋装基质人工栽培黑牛肝菌，检验菌种活力及栽培性状的结果：
a、菌种扩繁菌丝生长快，用活化菌丝体接种于试管装斜面培养基，接种后25-26天菌丝长满斜面；
b、用“a”扩繁的菌丝体接种液体培养基培养液体菌种，接种第3天开始形成菌球，至第9-10天时菌球颜色金黄、色泽明亮，大小均匀、分布于液体培养基中，为菌球旺盛生长期；
c、将“b”培养的液体菌种接种固体基质人工栽培黑牛肝菌，接种后第3天菌丝吃料，第50天菌子实体115g-121g，能实现黑牛肝菌规模化栽培。
具体结果与实施例1一致；此外，还设置了对照组，具体为：直接将步骤(2)得到的母种存储管放于15℃的恒温箱中分别保藏半年、1年和3年，结果同实施例1中的对照组一致。
实施例3
(1)黑牛肝菌母种培养：采集野生的黑牛肝菌子实体，用组织分离法取黑牛肝菌的组织块接种于固体培养基中，30℃恒 温培养，22天菌丝长满培养基，得黑牛肝菌母种，其中，固体培养基采用实施例1中的配方1制成；
(2)母种保藏存储管制作：用18×180mm规格的试管，每支试管装蒸馏水12ml，然后常规灭菌待用；将步骤(1)得到的黑牛肝菌母种-菌丝块，切取1㎝×1㎝的菌丝块放于已灭菌试管装的蒸馏水中，每支试管放入3块，用硅胶塞塞紧试管口，得母种存储管；
(3)预冷：步骤(2)得到的母种存储管放于12℃的恒温箱中预冷20d；
(4)低温保藏：将步骤(3)完成预冷的试管培养的斜面菌丝体及菌丝体蒸馏水保藏管放入3.5℃恒温箱进行低温保藏；
(5)菌丝活力检测及栽培检验
将保藏的黑牛肝菌母种，分别于保藏30天、半年、1年、2年、3年进行菌株转管活化，扩繁菌种，再培养成液体菌种，液体菌种接种袋装基质人工栽培黑牛肝菌，检验菌种活力及栽培性状的结果：
a、菌种扩繁菌丝生长快，用活化菌丝体接种于试管装斜面培养基，接种后25-26天菌丝长满斜面；
b、用“a”扩繁的菌丝体接种液体培养基培养液体菌种，接种第3天开始形成菌球，至第9-10天时菌球颜色金黄、色泽明亮，大小均匀、分布于液体培养基中，为菌球旺盛生长期；
c、将“b”培养的液体菌种接种固体基质人工栽培黑牛肝菌，接种后第3天菌丝吃料，第50天菌子实体115g-121g，能实现黑牛肝菌规模化栽培。
具体结果与实施例1一致；此外，还设置了对照组，具体为：直接将步骤(2)得到的母种存储管放于12℃的恒温箱中分别保藏半年、1年和3年，结果同实施例1中的对照组一致。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。