大豆β-淀粉酶的制备工艺 本发明涉及一种植物中的β-淀粉酶生产工艺，具体地涉及一种高酶活力大豆β-淀粉酶的制备工艺。
β-淀粉酶是外切型糖化酶，它作用于淀粉时，从α-1,4糖甘键的非还原性末端依次切下麦芽糖单位，水解道谢产物有麦芽糖、麦芽三糖和β-界限糊精。β-淀粉酶主要用于食品工业，如高麦牙糖浆及超高麦芽糖浆的生产。目前，已有技术中，用微生物发酵法生产的商品β-淀粉酶耐热性差，而且成本较高。植物中的β-淀粉酶活力高、耐热性好，作用pH范围广，但现有技术中曾经生产过的甘薯β-淀粉酶酶活力极低，品质粗糙，已经淘汰。据谷海先、郭庆文报道的大豆β-淀粉酶制备方法(见谷海先、郭庆文，1997，大豆β-淀粉酶的制备及酶学性质的研究，仪器与发酵工业23(6)45-49)，包括糊精吸附并酒精沉淀，该方法的酶活力虽然较甘薯β-淀粉酶高，但制备过程耗用大量酒精，必须配套建立酒精回收装置，从而使操作复杂，成本高。迄今为止，由于缺乏相关的工艺技术，高酶活力植物β-淀粉酶仍未实现工业规模生产。
本发明的目的是克服已有技术的上述缺点，提供一种耗能较低、生产效率高、更适合工业生产的高酶活力大豆β-淀粉酶制备工艺。进一步提供依据该工艺生产的产品性能好的大豆β-淀粉酶。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
大豆β-淀粉酶的制备工艺，包括脱脂豆粉浸提液地超滤浓缩，二次沉淀及沉淀的冻融处理步骤，具体地，脱脂豆粉经缓冲液在30-40℃浸提后，过滤，加入0.2-1.0％的硫酸钠，超滤浓缩，调整浓缩液的pH为3.6-5.0，加入硫酸纳至浓度为24％-31％，过滤或离心收集沉淀，将沉淀置于-10℃至-1℃速冻至冻结态或置于1℃至5℃冷藏10小时以上，取出沉淀，加蒸馏水溶解，过滤或离心收集清液，将上述滤液调至pH为3.6-5.0，加入15％-20％硫酸钠，过滤或离心收集沉淀，烘干，粉碎过筛。
上述工艺中，超滤浓缩可优选用排阻分子量20K-30K道尔顿的中空纤维柱。
上述工艺中，烘干可优选温度35-40℃。
同时，本发明还提供了依据上述工艺生产出的大豆β-淀粉酶。其特性为：最适作用温度为60℃，作用温度范围45-65℃，最适作用pH5.0-6.0，作用pH范围4.0-7.0，不含α-淀粉酶。
本发明的优异效果足基于下述原理得出的：脱脂豆粉经缓冲液浸提后，过滤，向滤液加入0.2-1.0％的硫酸钠，作为蛋白保护剂，用排阻分子量20K道尔顿的中空纤维柱进行超滤浓缩，调整浓缩液的pH为3.6-5.5，进行第一次沉淀，加入硫酸纳至浓度为24％-31％，过滤或离心收集沉淀。此时酶活回收率为85％。将沉淀置于-10℃至-1℃速冻至冻结态或置于1℃至5℃冷藏10小时以上，取出沉淀，加适量蒸馏水解溶，过滤或离心收集清液，弃不溶物。分析不溶物为杂蛋白和淀粉等多糖类物质，因为这些物质具冷沉性，经过深度冷却甚至冷冻后，不再溶解于冷水中，而作为沉淀被去除；经检测，沉淀中仪有极微量的β-淀粉酶活力残留，而这部分沉淀的干重占干酶粉的五分之一到四分之一；因此，经过该纯化步骤，酶的比活力提高25％-33％。此时，滤液中β-淀粉酶的比活力已达30Ku/ml(1u即1个酶活力单位，它是指在适宜反应条件下，每小时产生1毫克麦芽糖的酶量)，加入一定的保存剂，可作为液体酶直接使用。若要制得酶的干粉，可对溶解清液进行第二次沉淀，即将上述滤液调至pH为3.6-5.0，加入15％-20％硫酸钠，过滤或离心收集沉淀，于35-40℃烘干后粉碎过筛，得高酶活力大豆β-淀粉酶，色泽浅黄，酶活力高达430Ku/g，总酶活回收率为70％。这些指标均优于用现有技术得到的制品。可见本发明克服了已有技术的上述缺点，提供了一种耗能较低、生产效率高、更适合工业生产的高酶活力大豆β-淀粉酶制备工艺。同时还提供了依据本发明工艺生产的产品性能好的大豆β-淀粉酶。其特性为：最适作用温度为60℃，作用温度范围45-65℃，最适作用pH5.0-6.0，作用pH范围4.0-7.0，不含α-淀粉酶。
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：称取1公斤脱脂豆粉，加入9公斤缓冲液，40℃提取30分钟后，过滤，滤渣加入蒸馏水1公斤，搅拌后过滤，合并滤液，向滤液加入硫酸钠45克，溶解完全后，用排阻分子量20K道尔顿的中空纤维柱进行超滤浓缩，调整浓缩液的pH为4.5，加入硫酸纳560克，待硫酸钠晶体完全溶解后，6000rpm离心20分钟，收集沉淀并置于-8℃速冻。向冻结之沉淀加入蒸馏水450ml，溶解后6000rpm离心25分钟，上清液调至pH4.5，加入硫酸钠104克，待硫酸钠晶体完全溶解后，离心收集沉淀，将沉淀分散在不锈钢筛网上，40℃热烘20小时，粉碎后过120目筛网，得酶粉39克，测定β-淀粉酶活力为432Ku/g。
实施例2：称取2公斤脱脂豆粉，加入17公斤缓冲液，30℃提取40分钟后，过滤，滤渣加入蒸馏水2公斤，搅拌后过滤，合并滤液，向滤液加入硫酸钠88克，溶解完全后，用排阻分子量30K道尔顿的中空纤维柱进行超滤浓缩，调整浓缩液的pH为3.8，加入硫酸纳990克，待硫酸钠晶体完全溶解后，6000rpm离心20分钟，收集沉淀置冰箱内冷藏过夜。向冷藏之沉淀加入蒸馏水900ml，溶解后6000rpm离心25分钟，上清液调至pH3.8，加入硫酸钠200克，待硫酸钠晶体完全溶解后，离心收集沉淀，将沉淀分散在不锈钢筛网上，38℃热烘24小时，粉碎后过120目筛网，得酶粉80克，测定β-淀粉酶活力为424Ku/g。
实施例3：称取5公斤脱脂豆粉，加入45公斤缓冲液，35℃提取40分钟后，过滤，滤渣加入蒸馏水5公斤，搅拌后过滤，合并滤液，向滤液加入硫酸钠225克，溶解完全后，用排阻分子量30K道尔顿的中空纤维柱进行超滤浓缩，调整浓缩液的pH为4.2，加入硫酸钠2600克，待硫酸钠晶体完全溶解后，6000rpm离心20分钟，收集沉淀置冰箱内冷藏过夜。向冷藏之沉淀加入蒸馏水2250ml，溶解后6000rpm离心25分钟，上清液调至pH4.2，加入硫酸钠500克，待硫酸钠晶体完全溶解后，离心收集沉淀，将沉淀分散在不锈钢筛网上，40℃热烘20小时，粉碎后过120目筛网，得酶粉197克，测定β-淀粉酶活力为430Ku/g。
上述实施例1-3制备出的大豆β-淀粉酶。其特性为：最适作用温度为60℃，作用温度范围45-65℃，最适作用pH5.0-6.0，作用pH范围4.0-7.0，不含α-淀粉酶。