激活变性蛋白的方法 本发明涉及增溶和复性变性蛋白，特别是重组生产的变性蛋白的简化方法。
当原核细胞如大肠杆菌中产生蛋白质时，经常形成几乎不溶失活蛋白质聚集体(内含体)。为了将这些蛋白转化成活化形式，需要增溶和复性这些蛋白质。这些方法是已知的，例如在EP-A0361475,EP-A0114506,EP-A0093619,EP-A0253823,WO87/02673,EP-A0364926和EP-A0241022中有叙述。激活过程中的一个限制了复性蛋白的产量的重要因素是变性蛋白转换成准确折叠的中间产物和几个蛋白质分子的聚集之间的竞争反应。由于这一原因，复性溶液中复性蛋白质的浓度是复性过程的产量的重要参数。复性蛋白的浓度增加有利于聚集，而具有天然蛋白构型的复性蛋白的相对产量下降(临界浓度)。
在大规模的重组蛋白的生产中，待复性的蛋白质的量通常比临界浓度高得多。由于通常蛋白质在使用的激活缓冲液中的溶解度低，所以，产生的值得重视的缺点是产量低，需要时间长，和缓冲液体积大。
从WO87/02673了解的一个方法，其中将失活的可溶蛋白用变性剂和还原剂增溶，随后分离还原剂，然后从增溶地蛋白中制备蛋白质和例如谷胱甘肽之间的异源混合的二硫化物。这样混合的二硫化物有利于进一步纯化和复性，因为在硫醇基团(thiolgruppen)修饰后，保护了蛋白质不受空气中氧的氧化，因而在较大的pH范围中是稳定的。净电荷的变化也简化了纯化过程，因为这种变化使非修饰蛋白质可以通过离子交换层析分离。
为了形成混合二硫化物，将从还原剂中纯化的，增溶的，透析的，还原蛋白与含有变性剂和用于衍生的二硫化物成分(如，GSSG，胱氨酸，胱胺)的溶液一起温育。在分离二硫化物成分后，以常规方法进行复性。虽然这个过程是有效的，这需要许多个别方法的步骤，特别是在衍生之前除去还原剂。
从WO93/19084可以知道一种折叠和纯化胰岛素样生长因子I的方法。根据这一方法，在还原条件下增溶内含体，随后，不经除去还原剂而加入过量的氧化试剂。复性是从随后的稀释(不经透析)和新加入还原剂(为了构建氧化还原系统)开始的。WO91/08762叙述了制备起源于生物活性血小板生长因子的过程。在这一过程中，首先在pH3时，没有还原剂时进行增溶，随后在变性条件下纯化。在这之后，加入氧化剂产生衍生物。根据EP-A0450386，加入增溶缓冲液，随后离心制备内含体(变性的增溶NGF蛋白)提取物。然后用还原剂处理提取物，温育，不经预先透析加入氧化剂氧化。随后，稀释并加入其它成分用于变性。所以，在这一过程中，作为一独立的步骤首先进行增溶不加入氧化还原活性物质。根据US专利号4,933,434，这些方法中，没有一个适于脉冲复性。
已知的其它方法使增溶过程可能进行衍生作用。亚硫酸盐裂解法(Sulficolyse)已经长期为人所知(如，Bailey,J.L.,Cole,R.D.,1967，酶学方法，11,206-208；EP0114507)。在这一方法中，用亚硫酸盐处理蛋白质中的二硫桥，作为反应产物，形成50％硫-磺酸盐(RS-SO3-)和50％游离(RS-)蛋白质-SH基团的混合物。然后将游离SH基团经再氧化还原(如用铜离子，iodosobenzoate或优选地连四硫酸盐)转换成二硫化物，通过重复循环这一过程二硫化物可以完全转换成硫代硫酸盐。这一过程相当简单，可以在温和环境条件(如中性pH值)下进行。正如生物化学杂志234,1733已经阐述的，缺点是形成的硫代硫酸盐是化学不稳定的，不可能检测转换的完全程度，并且最主要的是色氨酸残基被再氧化剂部分地破坏了。另一个缺点是难以完全分离含有硫代硫酸盐蛋白质-SH基团和氧化剂如所述的iodosobenzoate的副产物。用分析方法检测这一点是非常费力的。然而为排除已经以非生理方式化学修饰的治疗试剂的可能的副作用，这对于打算用于治疗的蛋白质是绝对需要的。
WO95/30686也叙述了用于复性NGF/BDNF家族的神经营养因子的亚硫酸盐裂解法。R.Wetzel等人，基因16(1981)63-71以及W.F.Heath等人，生物化学杂志267(1992)419-425叙述了同样的人胰岛素原的复性过程。
已知一类似的方法，该方法避免使用破坏侧链的再氧化条件(Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Scheraga,H.A.,1984，分析生物化学138,181-188；Thannhauser,T.W.,Scheragea,H.A.,1985，生物化学24,7681-7688)：在这种代替再氧化的情况下，当将二硫键还原而得到的半胱氨酸直接通过与2-硝基-5-(磺基硫代)-苯甲酸盐反应进行衍生，在这一过程中释放了2-硝基-5-硫代苯甲酸盐，这可以用分光光度计测量，因此，能够以定量测定转换的SH基团。这一方法的缺点是导入了复杂的化学物质，从最后的产物中完全分离它是非常耗时的，并且难于检测。另外，作者(生物化学24,7681)观察到得到的硫代硫酸盐只有在完全缺乏硫醇基团时是稳定的。另外，在这种情况下(精氨酸脱胺)，也观察到侧链的修饰。
本发明的目的是为了简化和改进这些方法，和提供稳定的，可储藏的蛋白质，这些蛋白质在其SH基团上被衍生化，并且能够高产量地复性。
令人吃惊的是，本发明的方法允许在单个步骤中进行增溶和衍生而不必预前还原。特别惊人的是衍生作用也可以发生在酸性条件下(pH值小于7.0，优选地pH3-6.5)，优选地是对神经营养蛋白如NGF，并且，与通常在pH范围7-10与硫醇基团成分的反应比较，该反应基本没有影响反应的动力学和完成程度而进行。通常假设，这样的反应只在存在游离硫酸盐阴离子时进行，这只发生在约7以上的pH值的有效浓度中，因为硫醇盐阴离子的高pK值约为9。
所以本发明涉及生产由蛋白质和二硫化物成分组成的混合二硫化物的方法，它的特征是在存在二硫化物成分(摩尔比，蛋白质∶二硫化物成分1∶1到1∶10000，优选地1∶1000)时，将失活的几乎不溶形式的蛋白质(内含体)与变性浓度的变性剂的溶液一起温育，增溶和衍生，并且随后除去或不除去二硫化物成分。通过随后如US专利号4,933,434所述进行脉冲复性可以方便地除去二硫化物成分。本发明衍生的蛋白质是稳定的，在进一步加工之前可以储藏。这是特别有利的，因为通过本发明的方法可以不经过复性产生衍生蛋白。所以，衍生蛋白可以作为分离的中间产物用于多种复性和纯化过程和/或制备。
可选择地，在存在还原剂(如，DTT,DTE,GSH，半胱氨酸，胱胺，亚硫酸盐)时进行温育以便衍生蛋白质。这可以提高衍生物产量。在这种情况下，根据实际选择还原剂浓度使二硫化物成分不受限制或只稍微限制是有利的；还原剂浓度高达二硫化物成分的浓度的20摩尔百分比，优选地产生高达10％浓度是有利的。
可以加入其它试剂保护游离的SH基团，这是通过重金属，自由基和活化氧种类部分地或完全地防止封阻或破坏这些SH基团。这一类保护剂例如包括EDTA,0.1到100毫摩尔/升浓度或甘露醇，1到1000毫摩尔/升。
二硫化物成分被理解为来自二硫化物类的物质如，GSSG，胱胺或半胱氨酸。二硫化物成分在切开二硫键后，能够衍生蛋白质中的SH基团。二硫化物的优选使用浓度是至少1毫摩尔/升或更高，优选地1-1000毫摩尔/升，特别优选地是10-200毫摩尔/升。
用变性剂是有利的，变性剂通常用于在氧化条件下如变性剂时增溶变性蛋白。优选地使用盐酸胍或其它胍盐如，硫酸盐，磷酸盐或硫氰酸盐以及脲或其衍生物。使用这些变性剂的混合物也是可能的。
变性剂的浓度取决于变性剂的类型，本领域技术人员可以容易地确定该浓度。如果可以达到变性的几乎不溶蛋白的完全增溶，这时变性剂的浓度是适当的。在盐酸胍的情况中，这些浓度通常是3-8摩尔/升，优选地6-8摩尔/升。在脲的情况中，该浓度通常是6-10摩尔/升。
“失活的几乎不溶形式的蛋白质”是例如通过在原核细胞中重组生产形成的蛋白质。这些蛋白质通常是在原核细胞中过度表达真核细胞蛋白时形成的，该蛋白不是以活化形式运输到周质或细胞上清液(Zelluber-stand)中的。在这种情况中，重组产生的蛋白质以不溶和聚集的形式保留在细胞质或周质中。这样的聚集体，它们的分离和纯化如Marston F.A.O.，生物化学杂志，214(1986)1-12所述。在发酵后裂解原核细胞以便分离内含体。
根据常用方法如，通过超声，高压分离或溶菌酶进行细胞裂解。优选地在缓冲液中进行，将该溶液pH值调节中性到弱酸性是适当的，可作为悬浮介质如0.1摩尔/升Tris-HCl。在细胞溶胞后，以任何需要的方式，优选地通过在用试剂洗涤后，离心或过滤分离不溶的成分(内含体)，这些试剂不干扰蛋白质，但尽可能完全地溶解外源细胞蛋白质，如水或磷酸缓冲液，可选择地加入温和的去垢剂如Brij。随后将沉淀进行本发明的过程，用于增溶和衍生。
在中性到碱性pH范围，优选地在pH6和10之间，特别优选地在7和8的pH范围之间进行本发明的方法。所有常用的缓冲液适于作为缓冲液；当利用盐酸胍作为变性剂时，不必要加入缓冲液，因为它具有缓冲作用。本领域技术人员已知的优选使用的缓冲液如Tris或磷酸。惊人的是，本发明的方法也可以特别有利地用于神经营养蛋白，甚至在酸性条件下(pH3-6.5)。
加入二硫化物进行本发明的方法。优选的二硫化物成分是GSSG，胱胺和半胱氨酸。因为衍生反应是硫醇形式的蛋白质和二硫化物成分之间的平衡反应，或者是，混合的二硫化物和游离的硫醇成分(Thiolkomponente)之间的平衡反应，前者由蛋白质和二硫化物成分组成，后者是残存的蛋白质硫醇基团，和由二氧化硫成分通过与硫醇形式的蛋白质反应而释放出的硫醇成分。因此需要的衍生反应必须施加高度过量的二硫化物成分。这一反应需要的条件在蛋白质之间是非常不同的。优选地使用10毫摩尔/升到饱和限度浓度范围的二硫化物成分(如在GSSG，取决于制备的pH值，为ca.200-300毫摩尔/升，对于胱胺，ca.700毫摩尔/升)，二硫化物成分饱和浓度的50-100％是特别优选的浓度范围。
在本发明的方法中，加入还原剂也是优选的。来自硫醇基团的还原剂是特别优选的如还原谷胱甘肽(GSH)或2-巯基乙醇，二硫赤藓糖醇(DTE)或二硫苏糖醇(DTT)，浓度范围为0.01-50毫摩尔/升，优选地0.1-10毫摩尔/升。另外优选的还原剂如亚硫酸盐，如亚硫酸钠。虽然加入这些还原剂中的一种不是成功地进行反应的先决条件，但是，当蛋白质的再激活取决于处理的蛋白质时，加入还原剂导致产量的提高。
在0.1-100小时，优选地1-24小时，特别优选地2-4小时，在室温下优选地进行本发明的方法。但是，其它条件如加热到约60℃或冷却到约0℃的方法也是适当的。为了防止空气氧对还原剂的氧化，和保护游离SH基团，加入EDTA是有利的，优选的量是1-100摩尔/升，特别优选地是约10毫摩尔/升。为了抑制自由基副反应，这种反应可以发生在含有硫醇的溶液中，特别是相当高的pH值时，在蛋白质的复性和/或加工过程中，加入自由基interceptors(淬灭剂)如甘露醇是有利的，浓度为1到1000毫摩尔/升，优选地浓度为20到200毫摩尔/升，特别优选地浓度为50毫摩尔/升。
在增溶/衍生后，优选地在含有变性浓度的变性剂中透析，为了除去二硫化物成分和可加入可不加入的还原剂。透析溶液有利地含有变性剂，浓度与变性/衍生溶液中相同。同样优选的是对其它同样摩尔浓度的变性剂透析，如对ca.1毫摩尔/升HCl或稀释的乙酸。另外，不完全分离二硫化物也是有利的；因为已经解释了衍生反应是游离硫醇成分和(可混合可不混合的)二硫化物成分之间的平衡反应。如果所有的蛋白质硫醇基团还没有完全衍生，在分离二硫化物成分后，存在的危险是储藏衍生蛋白质的过程中残留的游离硫醇成分将对存在的混合二硫化物具有还原作用，并且衍生产量将随后下降。出于衍生作用保护蛋白质硫醇基团不氧化和不发生同样破坏性的副反应的目的，处理蛋白的衍生程度必须尽可能地高和稳定。这可以通过在二硫化物成分的浓度下降到适当浓度以下之前早期终止透析，或在透析液中对含有需要浓度的二硫化物成分的透析缓冲液透析来达到。在储藏衍生蛋白过程中维持衍生程度需要的浓度取决于相关的处理蛋白质和特别是取决于处理蛋白质的半胱氨酸含量，这一浓度可以是范围为0-100毫摩尔/升的浓度。考虑到进一步使用衍生蛋白用于再激活反应，必须注意在再激活过程中加入二硫化物成分对用于这种情况的分子间或分子内的二硫化物桥需要的氧化键没有或只有可忽略的作用。由于这一原因，已经证明在衍生蛋白中约1-10毫摩尔/升的二硫化物成分的残留浓度是有利的。
本发明的另一个主题是在原核生物中重组生产后得到的它的失活的几乎不溶形式中生产复性蛋白的过程，它的特征是将失活几乎不溶形式的蛋白质与变性浓度的和存在二硫化物成分的变性剂一起温育，增溶和衍生(摩尔比例蛋白质∶二硫化物成分1∶1到1∶10000，优选地1∶1000)，增溶蛋白采取了生物学活性构型，方法是将强烈的变性溶液改变成弱的或非变性溶液，其中加入氧化还原系统打开与二硫化物成分的二硫键，以这种方式在蛋白质中分子内新形成二硫键，在这种方式中，蛋白质采取了其特征性的生物学活性的构型。
在存在还原剂时稀释或优选地透析可以达到这样的微弱变性条件。与强烈变性条件相反，微弱变性条件是在这样的条件：在这些条件下，蛋白质采取活性构型，并且能够在这一构型中稳定。在强烈变性条件下，这种形式的蛋白质不稳定，趋向于变性，即，失去它的稳定的三维结构和能量上有利的二硫键。强烈变性的条件存在于例如4-9摩尔/升盐酸胍溶液中。微弱变性条件存在于例如0.1-2摩尔/升盐酸胍。在复性过程中加入浓度在0.1和1摩尔/升的精氨酸也是有利的。
蛋白质的活性是蛋白质的生物学活性。如果是天然存在的蛋白质或天然蛋白质的衍生物，可以通过蛋白质的免疫学，细胞生物学或催化特性确定它的生物学活性。
在GSH浓度为0.1-20毫摩尔/升，GSSG浓度为0.01-10毫摩尔/升没有变性剂或在变性剂的非变性浓度时优选地进行激活(复性)，优选地在1-300小时的时期进行再激活。在这种情况下，GSH浓度优选地是0.5-10毫摩尔/升和/或GSSG浓度优选地0.1-10毫摩尔/升。
本发明的方法适用于复性大量的变性蛋白，特别是重组地生产的变性蛋白。这样的蛋白质例如是蛋白酶，生长因子，蛋白质激素，细胞因子，纤溶酶原激活物，Xa因子，特别是神经营养蛋白。神经营养蛋白是特别在神经细胞中发现的蛋白质，它支持神经细胞的分化和生存。所以神经营养蛋白(如NGF，起源于脑的神经生长因子(BDNF)，神经营养因子3,4/5,6)是有价值的细胞治疗试剂，可用于治疗神经变性疾病，如多神经病(polyneuropathy),Alzheimer病或脑和脊髓损伤。
人神经生长因子(NGF)是两个亚基组成的蛋白质。已经发现β亚基具有影响感觉神经元和交感神经元的生长能力。成熟的NGF由118个氨基酸组成，含有三个二硫桥，是非糖基化的。生物学活性NGF是二聚体。EP-B0121338(USP5,169,762)中叙述了NGF的DNA和氨基酸序列。但是，通过这一方法得到它的活性蛋白质是不可能的。活性重组NGF的生产如EP-A0329175,EP-A0370171,Biochem.Biophys.Res.Commun.171(1990)116-122,EP-A0414151,基因70(1988)57-65,EP-A0450386和基因(1989),109-114所述。
Leibrock等人，自然341(1989)149-152已经叙述了起源于脑的神经营养因子(BDNF)。BDNF在中心神经系统中支持感觉神经元的生存，并且似乎是成功地治疗了帕金森病。重组BDNF可以根据WO91/03568在CHO细胞中和根据WO92/22665在原核细胞中产生。
下面的实施例，公开物和序列方案进一步阐述了本发明，由专利的权利要求产生的本发明的保护范围。已叙述的方法应理解为例证，甚至在修饰之后仍然叙述本发明的主题。
实施例1
在大肠杆菌中表达NGF
a)表达质粒
在Ullrich等人(自然303:821,1983)公开的序列的基础上并通过特别是在5’部分掺入一些修饰合成了编码成熟的部分的NGF基因。将Beattie和Fowle的方法(1991，自然352:548-549)用于上述过程。为了简化克隆，在5’末端插入限制性酶EcoRⅠ的切割位点，在3’末端插入限制性酶HindⅢ的切割位点。用酶EcoRⅠ和HindⅢ切割合成的核酸，并与表达载体pA27fd(EP-A-0382174)连接，该载体已经预先用EcoRⅠ消化，和用HindⅢ部分地消化。将连接的制备物与辅助质粒pUBS520一起转化进大肠杆菌(Brinkmann等人，基因85(1989),109-114)。
通过质粒传递的氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择克隆。得到的质粒含有比起始质粒pA27fd更小的EcoRⅠ/HindⅢ片断，大小约为400bp。
b)大肠杆菌中表达
为了检测表达产量，在存在氨苄青霉素和卡那霉素(最后浓度各50微克/毫升)时，在LB培养基中培养用质粒pNGF23fd和pUBS520转化的大肠杆菌，达到一个550纳米的OD值。加入5毫摩尔/升的IPTG开始表达。再温育培养物4小时。随后，通过离心收集大肠杆菌和在缓冲液中再悬浮；(50毫摩尔/升Tris-HCl,pH8,50毫摩尔/升EDTA)声波处理溶胞大肠杆菌。通过再次离心收集不溶蛋白质部分，并通过声波处理，在前面提到的缓冲液中再悬浮。在悬浮液中加入四分之一应用缓冲液(250毫摩尔/升Tris-HCl pH6.8,0.01摩尔/升EDTA,5％SDS,5％巯基乙醇，50％甘油和0.005％溴酚兰)，在12.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶的辅助下分析。没有加入IPTG的大肠杆菌的培养物(pNGF23fd,pUBS520)的同样的制备物作为对照，加到聚丙烯酰胺凝胶上。在用0.2％考马斯蓝R250(溶解于30％乙醇和10％乙酸)染色凝胶后，看到IPTG诱导的培养物的制备物中分子量约为14千道尔顿的清晰的带(与Biorad“H+L”的标准蛋白质混合物相比)。在非诱导大肠杆菌细胞中没有发现这一带。
实施例2
制备内含体(=IBs)
为了制备含有重组NGF的IBs，在10升的发酵罐中发酵实施例1所述的大肠杆菌表达菌株8小时。在开始发酵后，在对数生长期中加入IPTG诱导NGF的表达。通过在发酵8小时后离心收获690克生物量。将该生物量在加入0.7溶菌酶，7毫克DNase和0.4毫摩尔/升MgSO4后悬浮于3.5升0.1摩尔/升Tris-HClpH7中，在0℃温育20分钟。通过在1000巴高压分离随后进行完全的细胞溶胞。将DNase再一次加入溶胞溶液直到最后浓度为0.1毫克/毫升，MgSO4最后浓度为2毫摩尔/升，将溶液在20℃温育30分钟。在DNase处理之后，用一半体积的6％Brij35,1.5摩尔/升NaCl,60毫摩尔/升EDTA,pH7.0稀释，并在冰浴中温育20分钟。随后离心分离不溶成分(IBs)。将沉淀悬浮于3倍体积的0.1摩尔/升Tris-HCl,20毫摩尔/升EDTA,pH6.5(TE缓冲液)中，在20℃温育30分钟后，再次通过离心收集IBs。随后将沉淀在3倍体积的TE缓冲液中进行再悬浮。在20℃温育30分钟后，通过再次离心在沉淀中得到IBs。
为了确定IBs中rh-NGF的量，用7.5摩尔/升盐酸胍(GdmHCl)和10毫摩尔/升EDTA,pH6.0将500毫克IBs(湿重)构成10毫升的体积，悬浮2小时。通过Biuret蛋白质测定(Boehringer Mannheim，顺序号.124281)确定溶液中蛋白质的含量。在通过SDS毛细管电泳分离增溶在IBs中用SDS变性和用DTE还原的蛋白质后，在SDS凝胶电泳分离蛋白质后，通过将峰区域与标准的NGF的比较或对样品道的光密度测量确定相对于总蛋白质含量的rh-NGF的量(如，BoeringerMannheim顺序号1457616)。从10升发酵肉汤中分离的IBs含有ca.6克rh-NGF。
实施例3
增溶和衍生rh-NGF
a)制备增溶产物
将IBs悬浮于7.5摩尔/升GdmHCl,0.1摩尔/升Tris-HCl,10毫摩尔/升EDTA和0.1摩尔/升DTT,pH8.5中直到浓度为20到200克IBs/升，在20-25℃，搅拌2小时。随后用25％HCl将溶液pH调节到3，冷却到4℃。将以这种方式得到的增溶产物在交叉流动过滤仅器中在超滤膜上渗滤，排出极限是10千道尔顿对6-10体积的7.5摩尔/升GdmHCl,10毫摩尔/升EDTA,pH3或者在透析管中对同样的缓冲液透析几次。
b)从增溶产物中制备衍生物(本领域状态)
将实施例3a中得到的无DTT透析增溶产物与20毫摩尔/升GSSG混合，通过用1摩尔/升Tris滴定调节到pH7.5。将得到的混合物在20-25℃温育2小时，然后用25％HCl调节到pH6，冷却到4℃。将以这种方式得到的衍生物在4℃，在交叉过滤器中，通过超滤膜渗滤，排出极限是10千道尔顿对6-10体积的7.5摩尔/升GdmHCl,10毫摩尔/升EDTA,pH6，或在透析管中对同样的缓冲液透析几次。
c)直接从IBs制备衍生物(根据本发明的方法)
将IBs悬浮于7.5摩尔/升GdmHCl,0.1摩尔/升Tris-HCl,10-200毫摩尔/升GSSG,10毫摩尔/升EDTA,pH6的溶液中，IBs的浓度为20到200克/升，在20到25℃搅拌3小时。随后将以这种方式得到的衍生物在4℃，在交流过滤器中，通过超滤膜(截断阂为10千道尔顿)渗滤，对6-10体积的7.5摩尔/升GdmHCl,10毫摩尔/升EDTA,pH6,或者在透析管中对同样的缓冲液透析几次。
以类似的方法，在衍生过程中，在pH值3-10和在渗滤过程中在pH6进行IBs的直接衍生，用NaOH或HCl在透析之前将pH值调节到6。在pH值低于6的情况下，GSSG浓度增加到300毫摩尔/升。在开始衍生之前通过离心除去可能存在的不增溶的GSSG。
通过SDS凝胶电泳和质谱(MALDI-MS)检测完全的衍生作用。显示实施例3c得到的衍生程度比与衍生过程中的pH值无关的前面的技术(实施例3b)进行的衍生作用高得多。
利用新鲜物质和储藏在4℃的物质检测衍生物和增溶产物的复性行为(参见实施例4的详细情况)。在生产过程中与pH值无关的4星期后，根据3c制备的衍生物展示了未改变的复性行为，增溶产物的复性产量下降到60％，而根据前面技术制备的衍生物(3b)下降到80％。正如预期的，这与MALDI-MS的数据一致，衍生物的稳定性取决于衍生程度。
实施例4
rh-NGF的复性
为了从实施例3制备的增溶产物/衍生物中制备具有生物活性的rh-NGF，用1摩尔/升Tris-HCl,0.5摩尔/升精氨酸，1毫摩尔/升EDTA,1毫摩尔/升GSH,pH9.1组成的复性缓冲液在4℃将含有失活，可溶形式的溶液稀释20到500倍。
为了检测复性rh-NGF，在通过POROS R1/H柱(2.1×100毫米，Perseptive Biosystems,Freiburg,Germany)上反相层析，在温育24小时后定量混合物。将水中的5％的乙腈(0.1％TEA)作为起始缓冲液，用高达80％水中的乙腈(0.1％TEA)梯度在20分钟以1毫升/分钟的流速进行洗脱。通过在生物测定(参见下面)中蒸发洗脱部分鉴定天然NGF。
将rh-NGF刺激来自分解的鸡胚背根神经节的感觉神经元以便产生树突的能力(=DRG测试=背根神经节测试，Levi-Montalcini,R.,Meyer,H.和Hamburger,V.1954，癌症综述14,49-57；Varon,S.,Nomura,J.,Perez-Polo,J.R.和Shooter,E.M.,1972,Meth.神经化学，3,203-229；EP-A0335673,14-15,实施例c)用于确定在HPLC部分或直接在复性溶液中的复性的有生物活性的rh-NGF的浓度。
在48孔的平板中，在1:2的步骤中以c=100纳克/毫升到c=100皮克/毫升浓度的稀释系列中测试HPLC部分。在这一过程中，将300微升培养基(F14培养基；Coon,M.G.和Weiβ,M.G.,1969，美国核酸抗性进程62,862-859)和100微升细胞悬浮液加上面陈述的100微升稀释液(=最后浓度c=20纳克/毫升到20皮克/毫升)在来自Falcon公司的细胞培养平板中混合，并在37℃和3.5％CO2时温育48小时。作为生物活性的量度定量已经形成树突的细胞数目。将已知浓度为2.5S的来自鼠领下腺的NGF溶液(Boeringer Mannheim公司)用作参考。在离心和用F14培养基可选择地预先稀释后类似地检测复性制备物。
实施例5
克隆FX蛋白酶基因的催化区
(质粒：pFX-CD)
方法
制备DNA技术
如分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，Sambrook,J.等人(1989)叙述的标准方法用于操作DNA。根据制造商的指导使用分子生物学试剂。
蛋白质测定
利用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数(ε=43490厘米2/摩尔)决定280纳米的光密度确定蛋白酶突变体fFX-EGF2-AP-CD的蛋白质浓度。
表达载体
用于表达血液凝固蛋白酶突变体的载体的基础是核心链霉抗生物素的表达载体pSAM-CORE。Kopetzki,E.等人，在WO93/09144中叙述了质粒p-SAM-CORE的制备和说明。
在pSAM-CORE载体中，需要的蛋白酶突变基因替代了核心链霉抗生物素基因。
克隆
根据Mullis,K.B.和Faloona,F.A.(酶学方法，155,(1987)350-355)利用PCR引物N1(SEQ ID NO:1)和N2(SEQ ID NO:2)
N1:5’- EcoRⅠ BspHⅠAAAAAAGAATTCTCATGATCGTGGTGGGAGGCCAGGAATGCAAG-3’
N2:5’-
HindⅢAAAAAAAAGCTTCATTACTTGGCCTTGGGCAAGCCCCTGGT-3’
和来自Stratagene公司(La Jolla,CA，美国)的市场可得的人肝cDNA基因库作为模板在聚合酶链式反应(PCR)中扩增FX cDNA，该cDNA是编码从氨基酸位置217到454的FX蛋白酶区的碱基对649到1362(cDNA核酸序列和氨基酸序列编号是根据Kaul,R.K.等人的公开物(基因41(1986)311-314)。将PCR引物导入编码区的5’末端的特殊的BspHⅠ切割位点和编码区的3’末端的特殊的HindⅢ的切割位点。
利用限制性内切酶BspHⅠ和HindⅢ消化大约740bp的长PCR产物，在琼脂糖凝胶电泳纯化后，将725bp长的BspHⅠ/HindⅢ-FX片断连接进2.55kbp长的NcoⅠ/HindⅢ-pSAM-CORE载体片断中。用DNA测序检测通过限制图谱鉴定的需要质粒pFX-CD和通过PCR分离的FXcDNA序列。
实施例6
克隆含有EGF2区，激活肽和催化区的FX蛋白酶基因(质粒：pFX-EGF2-AP-CD)
利用PCR引物N3(SEQ ID NO:3)和N2(SEQ ID NO:2)
N3：
EcoRⅠ5’AAAAAAGAATCCATTAAAGAGGAGAAATTAAAATGCGGAAGCTCTGCAGCCTGGACAAC-3’
和将来自Stratagene公司(La Jolla,CA，关国)的市场可得的人肝cDNA基因库(载体：λZAPⅡ)作为模板DNA通过PCR扩增FX cDNA,FX cDNA来自bp322到1362，编码从氨基酸位置108到454的EGF区，激活肽和催化蛋白酶区。PCR引物导入了编码区的5’末端的ATG起始密码和单一的EcoRⅠ切割位点，和编码区的3’末端的独特的HindⅢ的切割位点。
用限制性内切酶EcoRⅠ和BstEⅡ消化大约1.09bp长的PCR产物，在琼脂糖凝胶纯化后，将1.02kbp长的EcoRⅠ/BstEⅡ-FX片断连接进2.58bp长的EcoRⅠ/BstEⅡ-pFX-CD的载体片断(实施例5)中。通过DNA测序检测限制图谱鉴定的需要质粒pFX-EGF2-AP-CD和PCR分离的FX cDNA序列。
实施例7
a)在大肠杆菌中表达蛋白酶基因
为了表达蛋白酶基因，利用实施例6所述的表达质粒pFX-EGF2-AP-CD(氨苄青霉素抗性)和lacⅠq阻遏物质粒pUBS520(卡那霉素抗性，制备和说明参见：Brinkmann,U.等人，基因85(1989)109-114)转化大肠杆菌K12菌株(如UT5600 Grodberg,J.和Dunn,J.J.Bacteriol.170(1988)1245-1253)。
在含有50-100毫克/升氨苄青霉素和50毫克/升卡那霉素的DYT培养基(1％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)Bacto胰化蛋白胨，Difco和0.5％NaCl)中，在37℃，振摇培养物，培养转化的UT5600/pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD细胞直到550纳米的光密度(OD550)为0.6-0.9，随后用IPTG诱导(最后浓度1-5毫摩尔/升)。在4-8小时(h),37℃诱导后，离心收集细胞(Sorvall RC-5B离心机，GS3转头，6000rpm,15分钟)，用50毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液pH7.2洗涤，并储藏在-20℃直到进一步加工。从1升振摇培养物中产生4-5克细胞(湿重)。
b)表达分析
将各种情况下的1毫升离心培养基中沉淀的细胞再悬浮于0.25毫升10毫摩尔/升Tris-HCl,pH7.2中，利用来自Branson公司(Heusenstamm，德国)的Sonofier裂解器B15通过超声波处理(在50％强度，30秒2次脉冲)溶胞细胞。使不溶细胞成分沉淀(Eppendorf5415离心器，14000rpm,5分钟)并在上清液中加入1/5体积5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液：50毫摩尔/升Tris-HCl,pH6.8,1％SDS,1％巯基乙醇，10％甘油，0.0001％溴酚兰)。将不溶细胞碎片部分(沉淀)再悬浮于0.3毫升含有6-8摩尔/升的脲的1×SDS样品缓冲液中，将样品在95℃温育5分钟，再次离心。然后，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白质(Laemmli,U.K.，自然227(1970)680-685)并用考马斯亮兰R染料染色。
在大肠杆菌中合成的FX-EGF2-AP-CD蛋白酶突变体是均一的，全部在不溶细胞碎片部分(内含体，IBs)发现。表达产量是总大肠杆菌蛋白质的50％。
实施例8
内含体(IBs)的细胞溶菌，增溶和制备
将来自3升的振摇培养物的细胞沉淀(15克湿重)再悬浮于75毫升50毫摩尔/升的Tris-HCl,pH7.2。将悬浮液与0.25毫克/毫升溶菌酶混合，在0℃温育30分钟。在加入2毫摩尔/升MgCl2和10微克/毫升DNase I(Boehringer Mannhein GmbH，目录号104159)后，通过在来自SLM Amico公司(Urabana,IL，美国)的French压力器中高压分散，机械地分解细胞。随后，在室温下(RT)消化DNA30分钟。在制备物中加入37.5毫升50毫摩尔/升Tris-HCl pH7.2,60毫摩尔/升EDTA,1.5摩尔/升NaCl,6％Brij X-100，在室温下进一步温育30分钟，在Sorvall RC-5B离心器(GSA转头，12000rpm,15分钟)中离心。丢弃上清液，在沉淀中加入100毫升50毫摩尔/升Tris-HCl，pH7.2,20毫摩尔/升EDTA，在4℃温育30分钟，搅拌和再次沉淀。重复最后的洗涤步骤。在-20℃储藏纯化的IBs(1.5-2.0克湿重，25-30℃干重，100-150毫克蛋白酶)直到进一步加工。
实施例9
增溶和还原/衍生和透析IBs
将纯化的IBs悬浮于6摩尔/升盐酸胍，100毫摩尔/升Tris-HCl,20毫摩尔/升EDTA,pH8.0中，IBs沉淀的浓度为100毫克(湿重)，对应的蛋白质浓度是5-10毫克/毫升，增溶等分试样，同时在室温下存在200毫摩尔/升GSSG或200毫摩尔/升GSH时搅拌1到3小时。通过离心(Sorvall RC-5B离心器，SS34转头，16000rpm,15分钟)分离不溶成分，在4℃,pH5.0在6摩尔/升盐酸胍中透析不溶成分24小时。通过SDS-PAGE检测衍生物。
实施例10
FX-EGF2-AP-CD的复性对还原/衍生的依赖
通过在5毫升复性缓冲液(50毫摩尔/升Tris-HCl,0.6摩尔/升精氨酸/10毫摩尔/升CaCl2/2毫摩尔/升EDTA/2毫摩尔/升GSH/0.5毫摩尔/升GSSG,pH8.5)中单一加入50微升IB增溶物/衍生物，在4℃时，对在6摩尔/升盐酸胍中增溶，和用100毫摩尔/升DTE还原或用不同浓度的GSSG/GSH衍生的FX-EGF2-AP-CD蛋白酶突变体进行复性。
对100倍体积的.50毫摩尔/升Tris-HCl,150毫摩尔/升NaCl,5毫摩尔/升CaCl2,0.1％的聚丙烯甘油8000(PEG8000),pH8.0，在4℃，8-16小时透析复性蛋白两次。通过离心沉淀蛋白质(Eppendorf5415离心器，14000rpm,5分钟)，将清澈的上清液用于活化。
实施例11
用RVV-X激活rFX-EGF2-AP-CD蛋白酶突变体
在各种情况下，将1毫升复性和透析rFIX-EGF-AP-CD样品与10微升来自Sigma Aldrich Chemie GmbH公司(Deisenhofen,GFR)的Russel蝰蛇毒(RVV)溶液(1毫克/毫升冻干物溶解于20毫摩尔/升Tris-HCl,pH7.6)混合，并在37℃温育1-2天。利用染色体基因肽底物Chromozym X(参见实施例12)检测酶对rFX-EGF2-AP-CD的激活时间过程直到完全消化(plateau，最大激活)。在这个过程中，从反应混合物在4-6小时的间隔取样(20微升)，确定产生的Fxa活性。
实施例12
Fxa活性测试
利用来自Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim,GFR，目录号789763)的染色体基因底物Chromozym X确定复性的和活化的rFXa-EGF2-AP-CD的活性。将20微升样品与180微升50毫摩尔/升Tris-HCl,150毫摩尔/升NaCl,5毫摩尔/升CaCl2,0/1％PEG8000,pH8.0和20微升4毫摩尔/升Chromozym X在微滴平板中，在室温下混合，通过在ELISA读数器中，在405纳米测量吸光值确定线性起始斜度(ΔA/分钟)。
测试原则 rFXa-EGF2-AP-CD
MOC-D-NleGlyArg-pNA---------------------->MOC-D-NleGlyArg+pNA
测量信号：pNA(p-硝基苯胺)
Fxa底物：MOC-D-NleGlyArg-pNA(Chromzym X)
测试混合物：180微升缓冲液
+20微升底物(Chromozym X,4毫摩尔/升)
+20微升rFXa-EGF2-AP-CD样品
实施例13
确定复性效率
将产生的rFXa-EGF2-AP-CD活性(plateau值)用于计算复性效率。将在测量系列内内的最高值作为参考，设定为100％。
与衍生蛋白比较还原蛋白导致的复性产量是60％。
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WO91/03568
WO91/08762
WO92/22665
WO93/09144
WO95/30686
序列表(1)一般信息：(Ⅰ)申请人：
(A)姓名：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B)街道：Sandhofer街116
(C)城市：Mannheim
(E)国家：德国
(F)邮编(ZIP):D-68305
(G)电话：08856/60-3446
(H)电传：08856/60-3451(ⅱ)发明题目：激活变性蛋白的过程(ⅲ)序列数目：4(ⅳ)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30B版(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：
(Ⅰ)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)几何结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(A)叙述：/desc=“引物”
(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO:1AAAAAAGAAT TCTCATGATC GTGGGAGGCC AGGAATGCAA G 41(2)SEQ ID NO:2的信息
(Ⅰ)序列特征：
(A)长度：41个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)几何结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(A)叙述：/desc=“引物1”
(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO:2AAAAAAAAGC TTCATTACTT GGCCTTGGGC AAGCCCCTGG T 41(2)SEQ ID NO:3的信息
(Ⅰ)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)几何结构：线性
(ⅱ)分子类型：其它核酸
(A)叙述：/desc=“引物”
(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO:3AAAAAAGAAT CCATTAAAGA GGAGAAATTA AAATGCGGAA GCTCTGCAGC CTGGACAAC 59(2)SEQ ID NO:4的信息
(Ⅰ)序列特征：
(A)长度：394个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链数：单链
(D)几何结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO:4AGAATTCAAG AAGGAGATAT ACATATGTCA TCATCACATC CAATCTTCCA CAGGGGCGAG 60TTCTCGGTGT GTGACAGTGT CAGCGTGTGG GTTGGGGATA AGACCACCGC CACAGATATC 120AAGGGCAAGG AGGTGATGGT GTTGGGAGAG GTGAACATTA ACAACAGTGT ATTCAAACAG 180TACTTTTTTG AGACCAAGTG CCGGGACCCA AATCCCGTCG ACAGCGGGTG CCGGGGCATT 240GACTCAAAGC ACTGGAACTC ATATTGTACC ACGACTCACA CCTTTGTCAA GGCGCTGACC 300ATGGATGGCA AGCAGGCTGC CTGGCGGTTT ATCCGGATAG ATACGGCCTG TGTGTGTGTG 360CTCTCTAGAA AGGCTGTGAG ATGATAAAAG CTTG 394