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1、10申请公布号CN104046602A43申请公布日20140917CN104046602A21申请号201410288942422申请日20140624C12N9/2020060171申请人东北农业大学地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号72发明人刘宁李春武玉婷74专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所特殊普通合伙11419代理人何自刚54发明名称一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法57摘要本发明公开了一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，属于酶化学技术领域。本发明以高碘酸钠为氧化剂，氧化处理多糖制备氧化多糖，再以氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析和冻干后获。
2、得多糖修饰米根霉脂肪酶。在PH763，反应时间1553H，还原剂浓度02MOL/L，葡聚糖浓度03的条件下修饰后，米根霉脂肪酶活性提高22倍。同时，50处理30MIN后，相对于未修饰脂肪酶，修饰后的脂肪酶稳定性提高78。本发明具有成本低，安全无毒，兼顾脂肪酶活性和稳定性的特点，适于产业化推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页10申请公布号CN104046602ACN104046602A1/1页21一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，其特征在于，以高碘酸钠为氧化剂，氧化处理多糖制备氧化多糖，再以。
3、氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析和冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。2权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下1将多糖配成浓度为10MG/ML的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为50MMOL/L，20黑暗下反应2H后再于4黑暗下反应24H，反应完后加入乙二醇终止反应，获得氧化多糖溶液；2向PH76的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1所得的氧化多糖溶液，混合均匀后获得混合溶液，20下反应155H；3向反应完的步骤2中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为02MOL/L，于20下反应1H后获得多糖修饰溶液；4利用透析袋透析步骤3所得多糖修饰溶液，冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。。
4、3权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1所述多糖为葡聚糖、聚蔗糖或菊糖。4权利要求3所述方法，其特征在于，所述葡聚糖的分子量为20KDA或200KDA，所述聚蔗糖的分子量为70KDA或400KDA，所述菊糖的分子量为5KDA。5权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中所述混合溶液氧化多糖的浓度为03。6权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4所述透析袋，分子截留量为3500DA。7权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下1将分子量200KDA的葡聚糖配制成浓度为10MG/ML的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为50MMOL/L，20下反应24H，反应完毕后加入乙二醇终止反应，获得氧化葡聚。
5、糖溶液；2向PH76的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1所得的氧化葡聚糖溶液，混合均匀后获得混合溶液，20下反应155H；3向反应完毕的步骤2中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为02MOL/L，于20下反应1H后获得葡聚糖修饰溶液；4利用分子截留量3500DA的透析袋透析步骤3所得葡聚糖修饰溶液，冻干后获得葡聚糖修饰米根霉脂肪酶。权利要求书CN104046602A1/7页3一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法技术领域0001本发明涉及一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，属于酶化学技术领域。技术背景0002米根霉脂肪酶RHIZOPUSORYZAELIPASE，ROL是由丝状真菌产生的一。
6、种具有严格1,3位置特异性和对中长链底物专一性的脂肪酶。一般野生型的米根霉菌种脂肪酶活性较低，需经过进一步的基因克隆与表达方可获得高效脂肪酶。0003在对脂肪酶催化活性，稳定性，选择性等方面的研究中发现，从自然界中筛选到的产脂肪酶野生菌株，它的表达产量受宿主菌基因的严格调控，只能达到满足微生物自身代谢，而不能达到市场高效表达提高产量的要求。现有的酶性能改性技术主要包括固定化、化学修饰、体外定向进化、生物印记及蛋白质工程的定点突变技术。在众多方法中，化学修饰可以在不知酶蛋白结构的情况下，允许大范围的化学基团快速的引入到酶的结构中，使酶蛋白折叠构象发生改变，继而改变酶结构及催化性能。化学修饰方法又。
7、可以分为交联酶晶体、酶蛋白侧链功能基共价修饰、酶蛋白表面修饰、结合定点突变的化学修饰、通过酶活性位点氨基酸原子置换进行化学突变等方法。0004然而，在现有的酶化学修饰中，在改变脂肪酶活性的同时，也会使酶的稳定性受到很大的影响，很难达到活性和稳定性的同时提高。选择多糖作为修饰剂对脂肪酶进行化学修饰，可以同时提高脂肪酶活性和稳定性，具有很好应用潜力。发明内容0005为解决上述问题，本发明提供了一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法。利用氧化多糖对米根霉脂肪酶进行化学修饰，同时提高了酶活和稳定性，具有很高的应用推广价值。本发明所采取的技术方案如下0006一种提高米根霉脂肪酶活性和稳定性的方法，是以高。
8、碘酸钠为氧化剂，氧化处理多糖制备氧化多糖，再以氧化多糖为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，经透析和冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。0007所述方法的步骤如下00081将多糖配成浓度为10MG/ML的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为50MMOL/L，黑暗下反应2H后再于4黑暗下反应24H，反应完后加入乙二醇终止反应，获得氧化多糖溶液；00092向PH76的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1所得的氧化多糖溶液，混合均匀后获得混合溶液，20下反应155H；00103向反应完的步骤2中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为02MOL/L，于20下反应1H后获得多糖修饰溶液；00114利用透析袋透。
9、析步骤3所得多糖修饰溶液，冻干后获得多糖修饰米根霉脂肪酶。说明书CN104046602A2/7页40012所述方法步骤1中所述多糖为葡聚糖、聚蔗糖或菊糖。0013所述方法中所述葡聚糖的分子量为20KDA或200KDA，所述聚蔗糖的分子量为70KDA或400KDA，所述菊糖的分子量为5KDA。0014所述方法中步骤2中所述混合溶液氧化多糖的浓度为03。0015所述方法中步骤4所述透析袋，分子截留量为3500DA。0016所述方法的具体步骤如下00171将分子量200KDA的葡聚糖配制成浓度为10MG/ML的溶液，并在溶液中加入高碘酸钠至其浓度为50MMOL/L，20下反应24H，反应完毕后加入乙。
10、二醇终止反应，获得氧化葡聚糖溶液；00182向PH76的米根霉脂肪酶磷酸盐缓冲溶液中加入步骤1所得的氧化葡聚糖溶液，混合均匀后获得混合溶液，20下反应155H；00193向反应完的步骤2中的溶液中加入固体硼氢化钠至其浓度为02MOL/L，于20下反应1H后获得葡聚糖修饰溶液；00204利用分子截留量3500DA的透析袋透析步骤3所得葡聚糖修饰溶液，冻干后获得葡聚糖修饰米根霉脂肪酶。0021本发明的有益效果00221本发明针对天然米根霉脂肪酶的催化活性低及稳定性差的问题，利用大分子多糖对米根霉脂肪酶进行修饰，使修饰后酶的催化活性提高，稳定性也显著提高。克服了现有技术中不能实现酶活性与酶稳定性同时。
11、提高的技术缺陷，使米根霉脂肪酶的性能显著提高，更适用于工业化应用。00232本发明确定了修饰酶反应的最佳工艺条件在PH763、时间1553H、还原剂浓度为020MOL/L、葡聚糖浓度为030，米根霉脂肪酶活性提高了22倍。00243本发明中采用的修饰剂安全，无毒，对修饰酶应用于食品加工行业，提供了较高的安全性。附图说明0025图1为反应时间对修饰酶活性的影响。0026图2为PH对修饰酶活性的影响。0027图3为还原剂浓度对修饰酶活性的影响。0028图4为葡聚糖浓度对修饰酶活性的影响。0029图5为不同修饰反应因素响应面趋势图；0030APH和时间对酸解活性影响的曲面图；BPH和还原剂浓度对酸解。
12、活性影响的曲面图；C时间和葡聚糖浓度对酸解活性影响的曲面图。0031图6为原酶和修饰酶的最适作用温度。0032图7为温度对原酶和修饰酶活性的影响。0033图8为PH对原酶和修饰酶活性的影响。具体实施方式0034本发明针对米根霉脂肪酶的催化活性低及稳定性差的问题，利用氧化多糖对米根说明书CN104046602A3/7页5霉脂肪酶进行修饰，修饰后酶的活性和稳定性同时显著提高。所用修饰剂安全无毒，更适用于工业化应用。下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。0035实施例1氧化多糖修饰米根霉脂肪酶的制备与检测00361多糖的氧化0037将多糖溶解为10MG/ML溶液后，向溶液中加。
13、入高碘酸钠使其浓度为50MMOL/L。将上述体系在室温黑暗下反应2H后再于4黑暗下反应24H，最后加入500L的乙二醇混匀以终止反应。1H后，将产物透析处理后，得到多糖氧化物，分装为1ML于4冰箱中储存。00382脂肪酶的化学修饰0039称取20MGROL在2MLPH68磷酸盐002MOL/LNA2HPO4/NAH2PO4缓冲液中溶解。将一定体积的多糖氧化物加入到酶溶液中，混合均匀后，在室温下培养848H后，加入不同浓度的硼氢化钠，不断搅拌混匀，1H后将样品经透析处理移去溶剂，再经冻干，得到多糖修饰的米根霉脂肪酶。00403脂肪酶酸解方法0041将猪油和辛酸以31的比例放于5ML离心管中，振荡。
14、混匀后放于40水浴锅中，再加入底物质量5的脂肪酶催化酸解反应，两个小时后取出离心管，9000R/MIN下离心5MIN。吸取上层油相保存于4冰箱，待分析。00424薄层色谱分离0043分离条件硅胶板G板；展开剂V石油醚乙醚乙酸80/20/2。板子浸入展开剂的深度距离板子底边0510CM。展开完成后，取出板子晾干，均匀喷洒012,7二氯荧光素显色。甘油脂肪酸分离后，各组分的保留参数RF值分别为固醇RF081，甘三酯RF069，1,3甘二酯RF031，1,2甘二酯RF022，甘一酯RF002，脂肪酸RF050。00445甲酯化方法0045将薄层分离后的甘三酯和甘二酯置于25ML圆底烧瓶，加入2ML0。
15、5MOL/L的KOH甲醇溶液振荡混匀，在70水浴中反应10MIN，取出冷却后，加入即时配制的BF3甲醇溶液3MLVBF3乙醚V甲醇13，再于70水浴回流反应5MIN，取出冷却，加入2ML正己烷充分振荡，使样品完全萃取于正己烷中，再加入饱和氯化钠溶液，静置5MIN后，吸取上层正己烷于样品瓶中保存。00466气相色谱测定条件0047实验分析采用安捷伦7890气相色谱仪和氢火焰离子检测器FID。色谱柱FFAP100M025MM020M；燃气H2，流量30ML/MIN；助燃气空气，流量300ML/MIN；载气HE，流量1ML/MIN；柱前压375MPA；分流比501；进样量1L；进样口温度240；炉温。
16、140，维持5MIN；检测器温度250。使用安捷伦化学工作站HP3398AGCHEMSTATION进行数据采集分析，采用面积归一化法计算。00487酶活性定义0049酸解反应是甘油三酯在脂肪酶的催化下与脂肪酸之间发生酰基转移从而改变甘油三酯结构组成的方法。以猪油和辛酸为底物，通过测定辛酸在甘油三酯上的结合率，来反映脂肪酶的酸解活性。0050说明书CN104046602A4/7页60051实施例2葡聚糖DEXTRAN对米根霉脂肪酶化学修饰的优化00521单因素实验0053采用葡聚糖20万作为修饰剂对米根霉脂肪酶进行化学修饰，以反应时间848H、反应PH68、还原剂浓度00504和葡聚糖浓度011。
17、为主要影响因素，分别对其进行单因素实验，考察各因素对酶修饰效果影响。0054图1为当反应PH为75，还原剂浓度为02MOL/L，葡聚糖浓度为05时，反应时间对修饰酶活性的影响。从图2中可知，当反应时间小于16H时，酶活性随时间的延长而升高，在16H时达到最高点，后又随时间降低。所以后续优化实验时，反应时间的中心值选择在16H附近。0055图2为当反应时间为20H，还原剂浓度为02MOL/L，葡聚糖浓度为05时，反应PH对修饰酶活性的影响。从图2中可知，酶在酸性条件下修饰后，活性较低，随PH升高有显著提高，在PH为76时达到最高，随后又快速降低。0056图3为当反应时间为20H，反应PH为75，。
18、葡聚糖浓度为05时，还原剂浓度对修饰酶活性的影响。从图3中可知，酶活性随还原剂浓度先升高后缓慢降低，在02MOL/L时达到最高点。所以后续优化实验中，还原剂浓度的中心值选择在02MOL/L附近。0057图4为当反应时间为20H，反应PH为75，还原剂浓度为02MOL/L时，葡聚糖浓度对修饰酶活性的影响。从图4中可知，酶活性随葡聚糖浓度先升高后降低，在030时达到最高点。所以后续优化实验中，还原剂浓度的中心值选择在030附近。00582响应面优化0059根据响应面实验设计原理，在上述单因素实验的基础上，设计四因素三水平的响应面实验共计29个。以反应时间、反应PH、还原剂浓度和葡聚糖浓度为自变量，。
19、以酸解活性为响应值，建立二次多项式回归模型，实验设计因素及编码水平见表1。0060表1实验设计因素及编码水平00610062响应面优化实验根据BOXBEHNKEN设计原理，在表1的基础上，设计29组响应面优化分析实验，实验设计及结果见表2。0063表2葡聚糖修饰ROL的BOXBEHNKEN实验设计及结果0064说明书CN104046602A5/7页700650066对上述表2中的实验数据利用DESIGNEXPERT700软件分析，获酸解率对编码自变量PH、时间、还原剂浓度和葡聚糖浓度的二次多项回归模型0067酸解率3696216A257B0067C142D278AB1007AC060AD124。
20、BC029BD156CD1125A21225B21209C21572D20068对模型进行方差分析及回归系数显著性检验，见表3。模型方程方差分析可以看出，二次多项式模型差异性显著P001，R209917；缺失项P00518005不显著。从表3中可以看出，APH、BTIME、交互项AC和二次项为极显著P001；D葡聚糖浓度、交互项AB和CD为显著P005；其他项均不显著。由回归方程系数检验可知，4个一次模型中系数项绝对值的大小依次为BADC，说明修饰时间对酸解活性影响最大，其次是PH和葡聚糖浓度，还原剂的浓度对修饰酶的活性影响最弱。0069表3响应面回归方程方差分析0070说明书CN104046。
21、602A6/7页80071注表示P005，显著；表示P001，极显著。0072图5为不同修饰反应因素响应面趋势图。由响应面三维空间曲线图是根据不同因素对响应值影响强弱的立体直观反映，当曲线面陡峭时表明对响应值影响大，当曲线面平缓时表明对响应值影响小。从二维等高线是两种因素交互作用的结果，通过其形状可以判断出各因素交互作用的大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则说明两因素的交互作用对响应值影响不显著。0073图5A为PH和时间对酸解活性影响的曲面图，由图看出等高线形状呈椭圆形，表明交互作用显著。曲面陡峭，PH和时间对酸解活性的影响显著P005。当还原剂浓度和葡聚糖浓度固定在0水平上，当反应时。
22、间不变时，随着PH的变化，酸解活性呈现先升高后降低的趋势，当PH在76附近时，酸解活性达到最大。当PH不变时，随着反应时间的延长，活性在反应时间为16H左右时达到最大值。在实验设计的条件范围内，两者交互作用表现为酸解活性的增大。0074图5B为PH和还原剂浓度对酸解活性影响的曲面图，由图可知，响应面的坡度较为陡峭，表明PH和还原剂浓度两个因素对酸解活性影响较大，二者的等高线形状呈明显的椭圆形，表明交互作用极显著。0075图5C时间和葡聚糖浓度对酸解活性影响的曲面图，由图可知，当还原剂浓度和PH固定在0水平上，在葡聚糖浓度不变时，随反应时间的延长，酸解率先升高后降低；在时间不变时，随葡聚糖浓度的。
23、变化，酸解活性也是先升高后降低。所以反应时间在1418H之间，葡聚糖浓度在025035之间时，酸解活性达到最高值。且两者交互作用表现为酸解活性增大，但等高线形状近圆形，表明两因素交互作用对酸解影响不够显著。0076基于以上响应面分析和进一步软件分析计算，得到酸解活性最大时的各因素水平说明书CN104046602A7/7页9是PH763、时间1553H、还原剂浓度为020MOL/L和葡聚糖浓度为030，酸解率的预测值为3728。0077为验证模型预测的准确性，在PH763、时间1553H、还原剂浓度为020MOL/L、葡聚糖浓度为030的条件下重复进行3次实验。实验结果酸解率分别为3780、36。
24、07和3883，平均值为3757，相对误差为077，与优化分析中所得理论值基本一致，证明此模型合理有效。0078实施例3酶活性和稳定性的测定00791酶最适作用温度0080在35、40、45、50、55和60温度下，以猪油和辛酸为底物，测定ROL及DEXTRANROL的酸解活性，测定结果如图6所示。从图6可知，ROL和DEXTRANROL随温度的变化趋势基本一致，ROL及DEXTRANROL酸解率先升高后降低，都在40时达到最大值，所以ROL和DEXTRANROL的最适作用温度为40，此时DEXTRANROL的酸解活性是ROL的22倍，且ROL在55已经几乎失去活性，而DEXTRANROL在6。
25、0时仍具有一定的活性，所以DEXTRANROL有一定耐高温能力。00812酶的热稳定性0082将ROL和DEXTRANROL溶液分别于在45、50、55、60和65水浴中保温30MIN后，再测定酶的酸解活性，定义酶活性最高一组的相对酶活为100，结果如图7所示。由图7可知，DEXTRANROL在4045之间的热稳定性较好，在保温30MIN后，活性仍能保持在98以上，随后缓慢下降，在65时保温30MIN后，相对活力剩余不到5，酶几乎全部已经失去活性。ROL的稳定性较差，随温度升高，酶活力损失强烈。00833酶PH稳定性0084将酶溶于不同PH49的磷酸缓冲液中，于4冰箱中储存1H后，再对酶的酸解。
26、活性进行测定。定义酶活性最高一组的相对酶活为100，结果如图8所示。由图8可知，DEXTRANROL和ROL在中性溶液中储存后对其活性影响较小，仍保持最高活力。DEXTRANROL比ROL的耐酸碱性明显提高，在PH为6的弱酸性溶液中储存后，DEXTRANROL仍保留95以上的活力而ROL仅为90，在弱碱性条件下，DEXTRANROL保留活力高于原酶20，且在PH为9时，ROL几乎失活，而DEXTRANROL仍保留50以上活力。说明书CN104046602A1/3页10图1图2图3图4说明书附图CN104046602A102/3页11图5图6图7说明书附图CN104046602A113/3页12图8说明书附图CN104046602A12。