一种富含神经节苷脂的保健奶和奶制品及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种奶及奶制品，属营养食品技术领域，具体地说涉及一种富含神经节苷脂(英文名称Ganglioside)的保健奶及奶制品。背景技术
乳类食品是含有较齐全的营养素、免疫物质和酶生长因子等多种生物活性成分的“完善食品”，具有良好的保健功能。由于动物乳(牛奶、羊奶、马奶等)及其制品中所含生物活性成分远较人乳为低，且有些成分配比不合理，当前市场上推出了满足不同需要的“配方奶”。
常用的配方奶大多是用牛奶为基础原料，并对牛奶营养成分中不适宜的部分，如过高酪蛋白、脂肪和过高钠盐等进行改良、加工处理，同时强化某些营养素以补充牛奶的不足，使之更适于消化吸收。美国斯坦利研究所开发出含有大量免疫球蛋白的牛乳；欧洲已有加入溶菌酶的调制奶粉；国内已有食品用超氧化物歧化酶(SOD)添加剂，并有强化SOD的牛奶、冰淇淋等产品；此外，美国惠氏公司和日本相继开发出添加有牛磺酸、乳铁蛋白(LF)、核甘酸、各种双歧杆菌活化因子和酷蛋白磷酸肽(CPP)的牛乳及制品或保健饮料。目前，已有多个专利公开了保健配方奶的配制方法，其中中国专利95113377.2公开了一种“抗人体消化道病原体生物免疫牛奶”；中国专利96116032.2、中国专利97120264.8公开了一种“保健牛奶及其配制方法”；中国专利99121491.9公开了一种“抗呼吸道疾病免疫乳制品”；中国专利99809381.5公开了一种“防龋性乳制品及其用途”；中国专利96199507.6公开了一种“抗耳炎的预防免疫牛奶制剂”等。
上述专利所披露地各科配方奶中，未见一种富含神经节苷脂的保健奶和奶制品的公开报道。
神经节苷脂是一种含唾液酸的糖鞘脂，主要存在于哺乳动物脑灰质，是中枢神经系统某些神经元膜的特征性脂成分，其理化性质如下：
神经节苷脂分子由一个亲水基团(唾液酸低聚糖)和一个亲脂基团(酰基鞘氨醇)组成。亲脂性基团嵌入神经细胞膜的双脂质层，亲水性基团突出于细胞外液，有助于最大程度上维持细胞表面负电荷。这种物理上的不对称性和化学结构，使神经节苷脂类物质与细胞外各种信息相互作用，并能导致部分细胞膜结构的改变。所以，目前认为细胞膜上的神经节苷脂类物质的变化对调节神经元和细胞内外信息传递有重要意义。
在体内主要有，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)、一唾液酸四己糖神经节苷脂(GD1a)、二唾液酸四己糖神经节苷脂(GD1b)、三唾液酸四己糖神经节苷脂(GT1b)以及GM3、GD3、GQ1b等形式。熔点：190℃；溶解度：易溶解于水、乙醇。
神经节苷脂的生理学功能有：1.经离体神经细胞培养和外科神经去势的动物模型证实，外源性神经节苷脂与细胞膜结合后能增加神经生长因子的功能，促进神经生长，加速神经支配功能的恢复。增加感觉神经、交感神经和中枢胆碱能神经元轴索生长的营养作用；2.经在体动物实验，发现神经节苷脂促进神经生长，加速受损神经恢复；3.离体和在体实验均显示，外源神经节苷脂能平稳进入细胞膜，同时激活细胞膜上的钠-钾-ATP酶的活性，该酶的活化是信息传递的基础；4.动物实验显示，神经节苷脂具有周围神经镇痛作用。
目前已有成熟的从动物组织中提取神经节苷脂的技术和进一步分离纯化的技术，其中的GM1作为药品已有市售产品，其商品名为：施捷因，单唾液酸四己糖神经节苷脂钠盐注射液，进口注册证号x19990444，x19990445，生产商：阿根廷TRB药厂trb pharma s.a；专利19901117公开了“没有被非常规病毒污染的糖神经鞘脂混合物的制备与纯化方法”；中国专利95111569公开了“一种含神经节苷脂为主的糖脂类物质的生产方法”。
随着现代神经修复学的发展，受损神经不可恢复的理论被改写，科学界在近二十年的研究中发现，神经节苷脂对神经的营养和促进生长的作用在神经修复学中独树一帜；而牛奶等动物奶品及奶制品，因其营养全面、均衡、廉价已成为人们日常的健康食谱必备。因此提供一种富含神经节苷脂的保健奶和奶制品作为人们的日常保健食品十分有益。发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种富含神经节苷脂的保健奶和奶制品，以克服现有产品领域的缺陷；
本发明需要解决的技术问题之二是公开上述保健奶和奶制品在增强学习和记忆功能中的应用；
本发明需要解决的技术问题之三是公开上述保健奶和奶制品在增强机体内抗病毒作用中的应用；
目前在临床上已被证实的神经节苷脂的药用价值有：1.由于各种原因引起的中枢神经系统结构损伤的功能恢复；2.对脑血管意外及创伤后的中枢神经系统后遗症有治疗作用；3.对缺血性和出血性的脑病变有治疗作用。这些方面进一步说明神经节苷脂有营养并促进神经生长，加速受损神经恢复的生理功能。此外，科学界已证实神经节苷脂可作为干扰素发挥抗病毒作用过程中的细胞膜受体，参与协助机体内的抗病毒过程。各类牛奶及奶制品中含有人体易于吸收的均衡营养素，其中所含的必需脂肪酸(又称多不饱和脂肪酸)对脑和神经的发育关系极大，是合成脑磷脂和神经节苷脂的主要原料。将神经节苷脂按一定的配比加入奶及奶制品中，不仅保持神经节苷脂和奶品本身的营养价值，同时可使各种营养成分相辅相成，更利于机体对神经节苷脂的吸收利用；此外，奶及奶制品已作为人们每日必备的保健饮品，其芳香口味能迎合各年龄人群的需要。因此提供一种对大脑及神经发育、记忆力起重要作用，并具有抗病毒作用的富含神经节苷脂的保健奶和奶制品是十分必要的。
本发明的保健奶和奶制品的组分和重量百分比含量包括：
神经节苷脂 0.01～50.00％
奶或奶制品 50.00～99.99％。
优选的含量为：
神经节苷脂 0.01～9.99％
奶或奶制品 90.01～99.99％。
较优选的含量为：
神经节苷脂 10.01～30.00％
奶或奶制品 70.00～89.99％。
较优选的含量为：
神经节苷脂 30.01～50.00％
奶或奶制品 50.00～69.99％。
最优选的含量为：
神经节苷脂 1.00～10.00％
奶或奶制品 99.00～90.00％。
所说的奶为普通的动物奶，如牛奶等；
所说的奶制品为由动物奶制成的产品，如奶粉和奶酪等。
上述配比是以普通动物奶或其奶制品为基础，不含其它添加剂，在实际使用时可添加食品上可以接受的任何载体，如食用纯净水、稳定剂、香精等，采用公知的方法制备成乳类食品上的剂型，如牛奶、奶粉、奶酪和奶味咀嚼片等。
上述的神经节苷脂采用《一种分离纯化制备神经节脂工艺》申请号：85102590，公开的技术进行制备，或采用市售产品，如宝智生物制品有限公司生产的规格为10公斤的型号为Y/G2001-5的神经节苷脂粗产品，再用本实验室建立的方法进行纯化；
上述的奶品或奶制品采用市售产品，如上海光明乳业集团，产品纯鲜奶、奶粉和奶酪。
本发明的保健奶及奶制品可用于增强学习和记忆功能；
本发明的保健奶及奶制品也可用于增强机体的抗病毒。
为了更好地理解本发明的实质，以下将用该奶品的配制、食品安全性(毒理)试验以及功效试验及结果来说明本发明的内容。
本发明采用的神经节苷脂是由宝智生物制品有限公司提供粗产品，并应用本实验室的纯化技术得到高纯度的神经节苷脂。具体工艺如下：
粗产品于40～60℃浓缩，用5倍量的丙酮沉淀神经节苷脂，弃去丙酮，在低于60℃温度下真空干燥。
本发明采用的奶品或奶制品购自光明乳业集团，产品纯鲜奶、奶粉和奶酪。
采用常规方法将上述两种主要原料配比制成配方奶和奶粉，配方奶中含神经节苷脂5mg/250mL；奶粉中含神经节苷脂5mg/100mg。
实验结果分述如下：
一.食品安全性毒理实验
1.材料与方法
40只22月龄雄性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供)，体重(450±40)g，平均分成4组，神经节苷脂按10mg/kg、1.0mg/kg、0.1mg/kg配方奶剂型分三组，连续喂养60天。
2.结果
服用该配方奶组大鼠无死亡，另一组用普通脱脂牛奶作对照；比较各组体重情况、血液学和生化检测、脏器重量和组织学检查均正常，结果显示服用组与对照组无显著差异。脏器组织学病理切片检查由上海第二医科大学病理教研组完成。
上述结果说明，富含神经节苷脂的配方牛奶无毒性，食用安全。
二.功效实验
一)增强学习和记忆功效方面的比较
1.材料和方法
改善记忆的大白鼠60只随机平均分成2组，采用实施例2中的配方奶，神经节苷脂0.1mg/每天，连续服用60天，对照组以普通脱脂牛奶代替；
在小鼠穿梭箱内进行主动回避条件性反射训练，10次测定中有9次出现条件性反应定为学会标准。达到学会后，停止训练1个月后再进行记忆保持检查。
2.结果
(1)学习情况：对照组小鼠达到学会标准所需的训练次数为33.1±3.4，服用组学会所需次数明显少于对照组，统计分析P＜0.01；结果见表1。
(2)记忆保持情况：停止训练1个月后，对照组小鼠正确反应的百分数为32.2±9.8；实验组正确反应的百分数均高于对照组，统计分析P＜0.01；结果见表1。
表1 学会次数和正确反应百分数 组别 动物组数 学会次数(次) 正确反应百分数(％) 对照组 30 33.1±3.4 32.2±9.8 实验组 30 20.2±4.3 50.0±2.9
与对照组比较，P＜0.01
3.结论
富含神经节苷脂的牛奶比普通牛奶有明显的增强小鼠学习和记忆的功能。
二)预防病毒感染
在BALB/C小鼠中用一种感染模型研究神经节苷脂对流感病毒的预防作用。
1.材料和方法
(1)病毒：流感病毒A3型鼠肺适应株FM1。
(2)实验动物：BALB/C小鼠购自湖北省医学科学院动物室，126只，雌雄各半，体重16～21g，随机分笼，小鼠自由采食和饮水，饲料为标准BALB/C小鼠饲料，饮用水为纯净水。
(3)模型与方法：
A.取120只BALB/C小鼠在乙醚浅度麻醉下滴鼻，感染低浓度流感病毒A3型肺适应株FM130ul(9DL50)；
B.实验组：30只，在感染病毒前10天开始饮用实施例2中的配方奶，每天一次，感染后再连续饮用15天；
C.病毒对照组(包括三组)：
C1(普通牛奶组)：其中30只，饮用普通脱脂牛奶；
C2(神经节苷脂水溶液组)：另30只，饮用以纯净水稀释的神经节苷脂(神经节苷脂含量同实施例2)；
C3(纯净水组)：剩余30只，饮用纯净水，方法同B；
感染病毒后，与正常组和病毒对照组比较，观察进食、精神状态、体重、发病时间、病程时间，进行组间t检验。
1.结果
(1)发病小鼠症状表现：进食锐减、活动少、卡他症状、发热、体重每天减0.1g；
(2)实验组仅18只发病，与病毒对照组比较，发病时间推迟(P＜0.01)，病程缩短(P＜0.01)；结果见表2和表3；
(3)实验组比普通牛奶病毒对照组(C1组)，发病时间推迟(P＜0.05)，病程缩短(P＜0.05)；结果见表2和表3；
(4)普通牛奶组比纯净水对照组(C3组)和神经节苷脂水溶液组(C2组)，发病时间推迟(P＜0.05)，病程无显著改变(P＞0.05)；神经节苷脂水溶液组与纯净水组，两组结果无显著差异(P＞0.05)见表2和表3。
表2 流感病毒A3型鼠肺适应株FM1感染BALB/C小鼠发病时间比较 组别 组数 发病数 发病时间(天) P 1 2 3 4 5 6 7 实验组 30 18 0 0 2 4 7 3 2 ＜0.01 C1组 30 24 4 5 7 6 1 1 0 ＜0.05 C2组 30 29 6 7 10 5 1 0 0 ＞0.05 C3组 30 30 6 8 11 4 1 0 0 ＞0.05
实验组P与各C组相比＜0.01；C1组与其余对照C组相比P＜0.05；C2组和C3组相比P＞0.05。
表3 流感病毒A3型鼠肺适应株FM1感染BALB/C小鼠病程时间比较 组别 发病数 发病时间(天) P 1～2 3～4 5～6 7～8 实验组 18 2 12 3 1 ＜0.01 C1组 24 1 4 8 11 ＞0.05 C2组 29 0 4 3 12 ＞0.05 C3组 30 0 2 5 13
实验组P与各C组相比＜0.01；其余对照C组与C3组相比P＞0.05。
3.结论
流感A3病毒感染的BALB/C小鼠因服用富含神经节苷脂的牛奶，其发病时间推迟、病程缩短；而单纯服用神经节苷脂水溶液效果不显著，可能是由于牛奶有助于神经节苷脂的吸收和利用，同时牛奶本身也具有一定的预防病毒感染的功效。附：富含神经节苷脂的乳品功效成分(神经节苷脂)的测定▲样品预处理(适用于液体)一、制备干粉
1.在浓缩的乳品中加入等体积的冷丙酮，混匀，待沉淀；
2.离心2000rpm，5分钟，弃上层丙酮层；
3.在固体沉淀层中，加入等体积丙酮，重复混匀和离心步骤2次；
4.取出固体沉淀待残留丙酮大量挥发后，真空干燥，得白色粉状物。二、抽提和分配
1.在白色粉中加5倍体积，温度为45～60℃的氯仿、甲醇混合液，体积比为
(2∶1)，匀浆，转速1500转/分，时间30秒/次，重复匀浆3次，间歇20
分钟；
2.离心2000rpm，5分钟，虹吸并收集上层清夜；
3.在白色粉中加5倍体积，温度为45～60℃的氯仿、甲醇混合液，体积比为
(1∶1)，匀浆，转速1500转/分，时间30秒/次，重复匀浆3次，间歇20
分钟；
4.离心2000rpm，5分钟，虹吸并收集上层清夜；
5.在白色粉中加5倍体积，温度为45～60℃的氯仿、甲醇混合液，体积比为
(1∶2)，匀浆，转速1500转/分，时间30秒/次，重复匀浆3次，间歇20
分钟；
6.离心2000rpm，5分钟，虹吸并收集上层清夜；
7.合并3次上层清夜，加入氯仿，使氯仿、甲醇体积比为2∶1；加入1/3体积
的0.58％的盐水，待分层，虹吸收集水相；
8.在下层相中加入1/3体积的0.58％的盐水，待分层，虹吸收集水相，此步骤
再重复1次；合并3次所得的水相；三、浓缩和沉淀
1.将合并3次所得的水相，于50～60℃减压浓缩；
2.在浓缩的液体中加入一定量的氯仿、甲醇(体积比1∶1)，于50～60℃减压
浓缩至近干；
3.加入一定量的氯仿、甲醇(体积比1∶2)洗涤，于50～60℃减压浓缩后，
加入至少5倍体积的冷丙酮混匀，待沉淀；
4.滤去液体，得到白色沉淀后，待残留丙酮大量挥发后，真空干燥。▲神经节苷脂的测定
参照Biochim Biophys Acta 1957 Vol.24 p604的方法和国际上同行实验室的分析方法加以改良而制定，经实践证明完全适用于在科研分析和商品检验中对神经节苷脂含量的正确测定，经上海技术监督局审核批准，已列入“企业标准”。
1.材料
(1)间苯二酚储液：2克间苯二酚溶于100毫升蒸馏水中，冰箱放置。
(2)对照工作液(A液)：80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、19.75毫升蒸馏水。
(3)间苯二酚工作液(B液)：10毫升间苯二酚储液、80毫升盐酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、9.75毫升蒸馏水。此工作液至少在使用前的4小时配制，冰箱放置。
(4)正戊醇(C液)。
(5)标准品：唾液酸(Sigma产品)
(6)紫外分光光度计：SPD-1型，日本产(Spectrophotometric Detector SPD-1，Shimadzu，Japan)
2.方法
电子天平精确称取0.3毫克标准样品溶于10毫升蒸馏水中，即为毫克/毫升标准溶液储液，由上述标准溶液储液配成10微克，20微克，30微克，40微克，50微克(系500微升中的浓度)储液，冰箱放置。
◆标准曲线的制作：
a.取具塞试管5支，分别准确加入500微升已配制的5种浓度标样，然后加入蒸馏
水1.5毫升。
b.边振荡，边加入2毫升B液；空白对照：加500微升上述任意一种浓度的标样，
加1.5毫升水后，加2毫升A液。
c.100℃度水浴加热15分钟，然后在冷流动水中冷却10分钟。
d.边振荡，边加入4毫升C液，冰浴中冷却15分钟。
e.离心5分钟(3000转/分)，吸取上清液，在OD580测定吸收值，作出标准曲线(在
OD580读数为纵轴，浓度为横轴)。
◆样品的测定
称取处理后的样品2.5克溶于5毫升蒸馏水中，稍离心后，取三支具塞试管，分别加入摇匀样品500微升。以下操作方法均按照标准曲线的制作方法进行。样品中神经节苷脂含量的计算：
斜率：斜率从标准曲线中求得。稀释倍数：指测定是标准溶液总体积500微升与加入的被测样品体积比。5.82系校正因子。具体实施方式
以下将通过实施例对本发明的具体实施方式作说明。
实施例1
采用宝智生物制品有限公司提供的神经节苷脂粗产品，于40～60℃浓缩，用5倍量的丙酮沉淀神经节苷脂，弃去丙酮，在低于60℃温度下真空干燥。
采用的奶品或奶制品为光明乳业集团的产品纯鲜奶、奶粉和奶酪。
实施例2
按本技术领域人员公知的方法以光明乳业集团的纯鲜奶为载体，将实施例1的神经节苷脂经搅拌、净乳、均质、巴氏消毒精制而成。其包装规格为250mL、500mL或1L盒装，人体每日饮用量不少于250mL，主要成分的配比是：
神经节苷脂原料： 2克
纯鲜奶： 100克
实施例3
按本技术领域人员公知的方法以光明乳业集团的脱脂奶粉为载体，将实施例1的神经节苷脂经超细粉碎、与奶粉混合、加入食品领域可接受的调味剂和稳定剂、消毒精制而成。人体每日饮用量不少于10g，主要成分的配比是：
神经节苷脂原料： 0.5克
脱脂奶粉： 1000.0克。
实施例3
按本技术领域人员公知的方法以光明乳业集团的奶酪为载体，将实施例1的神经节苷脂经超细粉碎、与奶酪混合、加入食品领域可接受的调味剂和稳定剂、消毒精制而成。人体每日饮用量不少于5g，主要成分的配比是：
神经节苷脂原料： 1克
脱脂奶粉： 1000克。