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本发明涉及一种利用基因工程技术催化合成乙酸乙酯（EA）的方法，提供了一种低损耗、低能耗的乙酸乙酯生产方法。其技术方案是将稻米脂肪酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使稻米脂肪酶产量大幅增加，将该展示了稻米脂肪酶的基因工程菌加入乙酸、乙醇、沸点在45~60℃的有机溶剂的混合体系中，于30~45℃进行催化合成反应，期间间歇静置分层或用除水剂除去下层的水液，上层经45~60℃加热回收有机溶剂，即可得纯度93%以上的乙酸乙酯。而展示有稻米脂肪酶的基因工程菌通过分离、冲洗、离心后可重复使用。

1.  乙酸乙酯的合成方法，主要包括：利用脂肪酶催化乙酸和乙醇反应生成乙酸乙酯，其特征是：将序列为SEQ NO1的稻米脂肪酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使稻米脂肪酶产量大幅增加，将该展示了稻米脂肪酶的基因工程菌加入乙酸、乙醇、沸点在45~60℃的有机溶剂混合体系中，于30~45℃进行催化合成反应，期间间歇静置分层或用除水剂除去下层的水液，上层经45~60℃加热回收有机溶剂，即得乙酸乙酯。

2.  根据权利要求1所述的乙酸乙酯的合成方法，其特征在于：以重量计在100份乙酸与乙醇混合体系（W/W=1.7~1.4）中，加入50~100份的正己烷或丙酮、2~6份表面展示有稻米脂肪酶的酵母菌菌体（湿重）于30~45℃进行催化合成反应1~8 h后，定时静置分层或用2~10份重3A分子筛除去下层的水液，于45~60℃回收有机溶剂后得到乙酸乙酯。

3.  根据权利要求1或2所述的乙酸乙酯的合成方法，其特征在于展示稻米脂肪酶的酵母菌通过分离、冲洗、离心后可重复使用。

一种乙酸乙酯的合成方法
技术领域
本发明涉及有机化学和生物技术领域，特别涉及一种利用基因工程技术催化合成乙酸乙酯（EA）的方法。
背景技术
乙酸乙酯（EA）是一类重要的有机溶剂和有机化工基本原料，广泛应用于有机合成、医药、香料、食品等行业，近年随着锂电行业的兴起，EA的用量逐渐增大，预计未来几年国内市场对乙酸乙酯的需求量将保持在10%左右的增长率^[1]。
从生产工艺来看，在国内外市场中，采用乙酸酯化法制备乙酸乙酯的生产能力约占总生产能力的67.5%，我国制备乙酸乙酯主要采取乙酸酯化法；传统的乙酸酯化法多以硫酸为催化剂，但硫酸对设备腐蚀严重，其强氧化性易引发副反应，产品分离提纯工序多，难度大，温度高，耗能高；因此，近些年有许多努力尝试从不同的方向来克服这些缺陷^[2]；如葛清秀等^[3]研究采用碱性脂肪酶来催化合成乙酸乙酯，该研究虽避免了使用强酸为催化剂，在36℃的温度下即可合成乙酸乙酯，但所用酶难以重复使用，反应时间较长需48小时，产率低于80%，且所用正庚烷沸点为98.5℃，在与乙酸乙酯分离时还需较高温度，耗能较大。
而展示酶的酵母菌细胞具有固定化酶可重复使用的优点，又具有制备简单，可高密度培养获得大量菌体，成本较低的特点，因而自上世纪末问世以来，发展迅猛，已有许多种蛋白或酶被成功表达的报道，该技术关键在于能否构建展示在酵母表面具所需活性蛋白或多肽且能扩增生产的基因工程菌，目前除本发明人外尚未见酵母展示稻米脂肪酶及其应用的报道，未见酵母展示脂肪酶特别是稻米脂肪酶催化合成乙酸乙酯的研究报道。
参考文献：
[1]王超，候涛.一种乙酸乙酯脱水除杂方法：中国，201010598729.5[P].2010-12-21
[2]韦毅，黄科林，王桂英，彭小玉.乙酸乙酯合成的研究进展[J].大众科技，2013,15（6）：104-106.
[3]葛清秀，陈建平，黄祖新，柳荣金，孙斌.碱性脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸乙酯的研究[J].食品工业科技，2006，（2）：156-158。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是乙酸乙酯传统酯化工艺中强酸催化剂对设备腐蚀严重、高温分馏产物能耗高，而普通脂肪酶催化合成乙酸乙酯时间长、产率低、难重复利用的问题。
本发明采取的技术方案是：将序列为SEQ NO1的稻米脂肪酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使稻米脂肪酶产量大幅增加，将该展示了稻米脂肪酶的基因工程菌加入乙酸、乙醇、沸点在45~60℃的有机溶剂混合体系中，于30~45℃进行催化合成反应，期间间歇静置分层或用除水剂除去下层的水液，上层经45~60℃加热回收有机溶剂，即得乙酸乙酯。
具体而言，以重量计在100份乙酸与乙醇混合体系（W/W=1.7~1.4）中，加入50~100份的沸点在45~60℃之间如丙酮或正己烷类有机溶剂、2~6份表面展示有稻米脂肪酶的酵母菌菌体（湿重），于30~45℃进行催化合成反应1~8 h后，定时静置分层或用2~10份重3A分子筛除去下层的水液，于45~60℃回收有机溶剂后得到乙酸乙酯。
本发明与现有技术相比，反应时间短，转化率高，1~6 h乙酸乙酯转化率即可达93%以上，反应后分离所得基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化合成反应，重复使用6次后，其单位时间内乙酸转化成乙酸乙酯转化率[=（反应前NaOH滴定算出的乙酸mol数-反应后NaOH滴定算出的乙酸mol数）/反应时间]仍可达83%以上，因而绿色、节能、环保，大幅降低了生产成本。
 
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1 、毕赤酵母展示稻米脂肪酶
1、Rlipase基因合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57载体上（pUC57-Rlipase），DNA序列如SEQ1所示。
2、  Rlipase亚克隆到pPIC9K载体中
分别将pUC57-Rlipase和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切， 酶切反应体系分别如下：
pUC57-Rlipase质粒                 34 ml
10* buffer                                4 ml
Eco RI                                     1 ml
Not I                                        1 ml
总共40ml体系，
pPIC9K质粒                          6 ml
10* buffer                              2 ml
Eco RI                                 1 ml
Not I                                    1 ml
ddH₂O                                10 ml
总共20 ml体系，
分别混匀后放在37℃水浴锅中反应4 h。
3、采用胶回收试剂盒回收目的基因片断Rlipase和pPIC9K载体片断，分别用20 ml水洗脱，之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下：
Rlipase片段                           3 ml
pPIC9K片段                          1 ml
10* T4 Ligase buffer               2 ml
T4 Ligase                               1 ml
ddH₂O                                  13 ml
总共20 ml体系；22℃过夜连接，之后转化到DH5a感受态细胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB（Miller broth (1%NaCl)：1% peptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl）固体培养基上进行37℃过夜培养；挑取克隆进行摇菌，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双酶切鉴定；
酶切反应体系如下：
pPIC9K- Rlipase                    8 ml
10* buffer                             2 ml
Eco RI                                  1 ml
Not I                                     1 ml
ddH2O                                  8 ml
总共20 ml体系，
混匀后放在37℃水浴锅反应4 h，成功构建pPIC9K-Rlipase载体。
4、pPIC9K-Rlipase转化到毕氏酵母GS115中
1）、 试剂 
（1） 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；
（2） 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装； 
（3） 2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存； 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； 2）、毕氏酵母的转化 
（1）煮沸1 ml鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 
（2）将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 
（3）对于每一个转化，按以下顺序加入：          
 50% PEG3350                                       240 ml           
1 M LiCl                                                 36 ml           
2 mg/ml 单链Salmon sperm DNA             25 ml           
5～10 mg/50ul H₂O 质粒DNA                 50 ml 
（4）剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1 min）； 
（5）30℃水浴孵育30 min； 
（6）42℃水浴热休克20～25 min； 
（7）6000～8000 rpm离心收集酵母菌体； 
（8）重悬酵母于1ml YPD培养基（1%酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖），30℃摇床孵育； 
（9）1～4 h后，取25～100 ml菌液铺YD选择性培养基平板(1.67%YNB+2%葡萄糖+1%琼脂粉)，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30℃培养至转化子出现）；
3）备注：
（1）YNB从化学试剂商店订购，其配方为：YNB 1L含：维生素：生物素类：2 mg，尼克酸：400 mg，盐酸硫铵：400 mg，叶酸：2 mg，肌醇：2000 mg，对氨基苯甲酸：200 mg，核黄素：200 mg，泛酸钙：400 mg，盐酸吡哆醇：400 mg；微量元素：括号内表示所含微量元素，硼酸（B）：500 mg，硫酸铜（Cu）：40 mg，碘化钾：100 mg，氯化铁(Fe)：200 mg，硫酸锰(Mn)：400 mg，钼酸钠(Mo)：200 mg，硫酸锌：400 mg；大量元素：括号内表示所含大量元素，硫酸镁（Mg）：0.5 g，氯化钠(Na)：0.1g，磷酸二氢钾(K)：1g；硫酸铵（N）：5g，可溶性氯化钙：0.1g；
（2）GS115是组氨酸缺陷性菌，因此在YD培养基上不能生长，只有成功转化了pPIC9K的GS115菌才能在YD培养基上生长。
 
实施例2 酵母菌扩增培养
1、从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250 rpm培养过夜；
2、按1%的接种量转移到新鲜的BMGY培养基中，30℃，250 rpm培养5 d，每隔24 h加甲醇诱导，收集发酵菌体，用pH8.0缓冲液洗涤3次，用少量缓冲液重悬，即得重组稻米脂肪酶粗酶液。
 
实施例3、乙酸乙酯的催化合成
 以重量计在100份乙酸与乙醇混合体系（W/W=1.5）中，加入100份正己烷或丙酮、4份表面展示有稻米脂肪酶的酵母菌菌体（湿重）和6份3A分子筛，于35~45℃进行催化合成反应2 h后，定时静置分层或用除水剂除去下层的水液，于50~55℃回收正己烷或丙酮后得到93.2%的乙酸乙酯；
其中展示稻米脂肪酶的酵母菌通过分离、冲洗、离心后可重复使用。重复使用6次，其相对酶活力以单位时间内乙酸转化成乙酸乙酯转化率计算[=（反应前NaOH滴定算出的乙酸mol数-反应后NaOH滴定算出的乙酸mol数）/反应时间]如表1所示：
表1  毕赤酵母展示稻米脂肪酶重复使用后的相对酶活力