泰地罗新半抗原、人工抗原及其制备方法技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种泰地罗新半抗原、人工抗原及其制备方法。
背景技术
泰地罗新（Tildipirosin）是由英特威-先灵葆雅动物保健公司开发的一种新型的大环内酯类动物专用抗生素，CAS登录号为：328898-40-4，化学名称为：20-Deoxo-23-deoxy-5-O-[3,6-dideoxy-3-(dimethylamino)-β-D-glucopyranosyl]-20,23-di-1-piperidinyltylonolide，结构式如下：
。
2011年3月8日，欧盟兽用药品委员会（CVMP）准许了以泰地罗新为主要成分的无菌注射液（商品名为Zuprevo）的市场许可申请。在兽医临床上主要用于治疗由溶血曼海姆菌、多杀性巴氏杆菌及睡眠嗜血杆菌引起的牛呼吸道感染和由胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波士杆菌及副猪嗜血杆菌引起的猪呼吸道感染。
泰地罗新在动物组织中的残留会威胁到食品安全，对人类健康造成危害。鉴于此，欧盟兽用药品委员会对泰地罗新在动物性食品中的残留也制定了最高残留限量。
目前，检测泰地罗新残留量的方法主要是固相萃取液-质联用技术（SPE-HPLC-MS/MS），由于复杂的仪器设备和繁琐的操作过程以及对检验人员的高技能要求导致不适合现场监控和大量样本的筛查。免疫化学分析方法特别是酶联免疫吸附分析（ELISA）技术具有快速、操作简单、灵敏度高、适应性强等优点，适合高通量样品筛选。因此，ELISA方法对于快速检测泰地罗新在动物组织中的残留更具优势。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种泰地罗新半抗原、人工抗原及其制备方法。合成的半抗原既保留了泰地罗新的基本结构又有利于与载体蛋白偶联，用于人工抗原的制备，易于被动物机体识别；人工抗原可用于泰地罗新的ELISA残留检测，与目前使用的固相萃取液-质联用（SPE-HPLC-MS/MS）检测方法相比，具有简便、快速、灵敏度高、适宜高通量筛选的优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种泰地罗新半抗原，其分子结构式为：
本发明也提供了上述泰地罗新半抗原的制备方法，它按照以下步骤顺序进行：
（11）用丙酮或甲醇将泰地罗新溶解，制成溶液A；
（12）搅拌状态下，向溶液A中滴加丁二酸酐或邻苯二甲酸酐的丙酮溶液，滴加完毕后继续搅拌反应，至反应完全，得透明溶液；
（13）蒸除溶剂，得到淡黄色无定形粉末，后加入二氯甲烷溶解，水洗，用碱液调节pH值，分离二氯甲烷层，干燥，过滤，蒸除溶剂，得粗产品；过硅胶柱，浓缩，得到泰地罗新半抗原。
作为本发明的一种限定，上述制备方法中：
①所述的步骤（11）中泰地罗新与丙酮或甲醇的质量份数比为1:10～15；
②所述的步骤（12）中溶液A与丁二酸酐或邻苯二甲酸酐的丙酮溶液的质量份数比为1:1～2；滴加完毕后25℃搅拌反应15 h；
③所述的步骤（13）中水洗至pH值为5.5～7.0；
所述的碱液为1mol/L的NaOH，用其调节pH值至10；
过硅胶柱所用的洗脱液为体积比为1～4∶1的乙酸乙酯与石油醚的混合物。
本发明还提供了一种泰地罗新人工抗原，其分子结构式为：
。
本发明也提供了上述泰地罗新人工抗原的制备方法，它是采用混合酸酐法或活性酯法制备所述的泰地罗新人工抗原。
作为本发明的另一种限定，所述混合酸酐法按照以下步骤顺序进行：
（21）将0.8-1.0mmol泰地罗新半抗原与等当量的三正丁胺溶于10-20mL二恶烷中，搅拌30 min后，加入等当量的氯甲酸异丁酯，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5-8.5，搅拌反应1 h，制得溶液B；
（22）另取10 mg/mL的载体蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液50-100 mL，将溶液B滴加至缓冲液中，在3-5℃下搅拌反应24 h，制得溶液C；
（23）将溶液C于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥，得泰地罗新人工抗原M1，-20℃保存。
作为进一步限定，上述步骤（22）中所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。
本发明还有一种限定，所述活性酯法按照以下步骤顺序进行：
（31）将0.8～1.0mmol的N，N，-二环己基碳二亚胺溶于10～20mL二恶烷中，搅拌状态下滴入等当量的泰地罗新半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的二恶烷溶液中，室温搅拌反应24 h，制得溶液D；
（32）将溶液D离心，取上清液滴加至50～100 mL的10mg/mL载体蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，3～5℃搅拌反应24 h，制得溶液E；
（33）将溶液E于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M2，-20℃保存。
作为进一步限定，步骤（32）中所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明以泰地罗新为前体合成了泰地罗新的半抗原即泰地罗新的结构衍生物，该衍生物在保留泰地罗新基本结构的基础上引入桥结构和用于偶联载体蛋白的活性基团，有利于其与载体蛋白偶联，偶联后又充分暴露出本身分子量较小的泰地罗新的基本结构，即泰地罗新的结构特征没有被载体蛋白的空间结构掩盖，避免其被大分子掩埋而影响动物机体的识别。所制得的泰地罗新半抗原既保留了泰地罗新的基本结构又有利于与载体蛋白偶联，用于人工抗原的制备，易于被动物机体识别；其人工抗原可用于泰地罗新的ELISA残留检测，与目前使用的固相萃取液-质联用技术（SPE-HPLC-MS/MS）检测方法相比，具有简便、快速、灵敏度高、适宜高通量筛选的优点。本发明的制备方法用于泰地罗新半抗原、人工抗原的制备。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例１ 一种泰地罗新半抗原、人工抗原及它们的制备方法
① 一种泰地罗新半抗原及其制备方法
一种泰地罗新半抗原其结构如下：
；
上述泰地罗新半抗原的一种制备方法，按照以下步骤顺序进行：
（11）在干燥的N2条件下，将1份泰地罗新用10份丙酮溶解，制成溶液A1；
（12）搅拌状态下，继续通入N2，并向溶液A1中滴加1.5份丁二酸酐的丙酮溶液，滴加完毕后25℃搅拌反应15 h，至反应完全，得透明溶液；
（13）减压旋转蒸发除去溶剂，得到淡黄色无定形粉末，后加入二氯甲烷溶解，水洗，用1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH值为10，分离二氯甲烷层，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋转蒸发去除溶剂，得粗产品；过硅胶柱，洗脱液为体积比为2∶1的乙酸乙酯与石油醚的混合物，将产物管合并，减压旋转蒸发至干，得泰地罗新半抗原。
上述制备方法的反应过程如下：
将合成的半抗原进行ESI质谱鉴定，具有[M-1]-分子离子峰833.5。
元素分析（C45H75N3O11）实测值（理论值，%）：C 64.82（64.80），H 9.05（9.06），N 5.06（5.04），O 21.07（21.10）。表明泰地罗新半抗原分子中含45个C，75个H，3个N，11个O，分子量为834.09。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm):0.90(t,3H,CH2CH3),0.96(d,3H,4-CH3),1.16(d,3H,8-CH3),1.18(d,3H,5-CH3),1.20(d,1H,CH),1.35(d,2H,CH),1.45(d,1H,CH),1.53(m,8H,CH2),
1.57(m,2H,CH2),1.59(m,4H,CH2),1.79(q,1H,CH),2.05(q,1H,CH),2.21(d,3H,CH3),2.23(s,1H,CH),2.26(s,6H,N(CH3)2),2.27(s,1H,CH),2.43(t,2H,CH2),2.45(t,8H,CH2),2.48(d,1H,CH),2.52(d,1H,CH),2.52(t,1H,CH),2.54(t,2H,CH2),2.81(t,1H,CH),2.83(t,2H,CH2),2.99(t,1H,CH),3.40(t,1H,CH),3.55(t,1H,CH),3.58(s,1H,OH),3.60(s,1H,OH),3.84(t,1H,CH),3.85(d,1H,CH),3.98(t,1H,CH),4.62(t,1H,CH),5.44(t,1H,CH=C),5.54(d,1H,CH),6.33(d,1H,CO-CH=CH),7.40(d,1H,CO-CH=CH), 11.28(s,1H,COOH)。
②一种泰地罗新人工抗原及其制备方法
一种泰地罗新人工抗原其结构如下：
；
制备上述泰地罗新人工抗原的方法，它采用活性酯法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（31）将0.8mmol的N，N，-二环己基碳二亚胺（DCC）溶于20mL二恶烷中，搅拌状态下滴入等当量的上述泰地罗新半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的二恶烷溶液中，室温搅拌反应24 h，制得溶液D1；
（32）将溶液D1离心，取上清液滴加至50 mL的10mg/mL牛血清白蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，5℃搅拌反应24 h，制得溶液E1；
（33）将溶液E1于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M21，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、牛血清白蛋白（BSA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与BSA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与BSA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与BSA分子的偶联比率为18∶1。
上述制备方法的反应过程如下：
实施例2 一种泰地罗新人工抗原的制备方法
如实施例1所述的泰地罗新人工抗原，它采用混合酸酐法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（21）将1.0mmol上述泰地罗新半抗原与等当量的三正丁胺溶于15mL二恶烷中，搅拌30 min后，加入等当量的氯甲酸异丁酯，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5，搅拌反应1 h，制得溶液B1；
（22）将溶液B1滴加至70 mL 10 mg/mL的鸡卵清蛋白(OVA)的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，5℃搅拌反应24 h，制得溶液C1；
（23）将溶液C1于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M11，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、鸡卵清蛋白（OVA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与OVA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与OVA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与OVA分子的偶联比率为11∶1。
上述制备方法的反应过程如下：
实施例3 一种泰地罗新半抗原、人工抗原及它们的制备方法
① 一种泰地罗新半抗原及其制备方法
一种泰地罗新半抗原其结构如下：
；
上述泰地罗新半抗原的制备方法，它按照以下步骤顺序进行：
（11）在干燥的N2条件下，将1份泰地罗新用15份甲醇溶解，制成溶液A2；
（12）搅拌状态下，继续通入N2，并向溶液A2中滴加1.0份邻苯二甲酸酐的甲醇溶液，滴加完毕后25℃搅拌反应15 h，为透明溶液；
（13）减压旋转蒸发除去溶剂，得到淡黄色无定形粉末，后加入二氯甲烷溶解，水洗，用1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH值为10，分离二氯甲烷层，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋转蒸发去除溶剂，得粗产品；过硅胶柱，洗脱液为体积比为4∶1的乙酸乙酯与石油醚的混合物，将产物管合并，减压旋转蒸发至干，得泰地罗新半抗原。
上述制备方法的反应过程如下：
将合成的半抗原进行ESI质谱鉴定，具有[M-1]-分子离子峰881.5。
元素分析（C49H75N3O11）实测值（理论值，%）：C 66.74（66.72），H 8.58（8.57），N 4.75（4.76），O 19.93（19.95）。表明泰地罗新半抗原分子中含49个C，75个H，3个N，11个O，分子量为882.13。
1H NMR ( CDCl3)δ( ppm ): 0.90（t,3H,CH2CH3）,0.96(d,3H,4-CH3),1.16(d,3H, 8-CH3),1.18(d,3H,5-CH3),1.20(d,1H,CH),1.35(d,2H,CH2),1.45(d,1H,CH),1.53(m,8H,CH2),
1.57(m,2H,CH2),1.59(m,4H,CH2),1.79(q,1H,CH),2.05(m,1H,CH),2.21(d,3H,CH3),2.23(s,1H,CH),2.26(s,6H,N(CH3)2),2.27(s,1H,CH),2.43(t,2H,CH2),2.45(t,8H,CH2),2.48(d,1H,CH),2.52(d,1H,CH),2.52(t,1H,CH),2.81(t,1H,CH),2.99(q,1H,CH),3.40(t,1H,CH),3.55(t,1H,CH),3.58(s,2H,OH),3.84(t,1H,CH),3.85(d,1H,CH),3.98(t,1H,CH),4.62(t,1H,CH),5.44(d,1H,CH=C),5.54(d,1H,CH),6.33(d,1H,CO-CH=C),7.40(d,1H,11-CH),7.86~8.32(m,4H,ArH),11.32(s,1H,COOH)。
②一种泰地罗新人工抗原及其制备方法
一种泰地罗新人工抗原其结构如下：
；
制备上述泰地罗新人工抗原的方法，它采用活性酯法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（31）将1.0mmol的N，N，-二环己基碳二亚胺溶于10mL二恶烷中，搅拌状态下滴入等当量的上述泰地罗新半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的二恶烷溶液中，室温搅拌反应24 h，制得溶液D2；
（32）将溶液D2离心，取上清液滴加至100 mL的10mg/mL牛血清白蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，4℃搅拌反应24 h，制得溶液E2；
（33）将溶液E2于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M22，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、牛血清白蛋白（BSA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与BSA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与BSA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与BSA分子的偶联比率为24∶1。
上述制备方法的反应过程如下：
。
实施例4 一种泰地罗新人工抗原的制备方法
如实施例3所述的泰地罗新人工抗原，它采用混合酸酐法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（21）将0.8mmol上述泰地罗新半抗原与等当量的三正丁胺溶于20mL二恶烷中，搅拌30 min后，加入等当量的氯甲酸异丁酯，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，搅拌反应1 h，制得溶液B2；
（22）将溶液B2滴加至100 mL 10 mg/mL的鸡卵清蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，4℃搅拌反应24 h，制得溶液C2；
（23）将溶液C2于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M12，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、鸡卵清蛋白（OVA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与OVA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与BSA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与OVA分子的偶联比率为8∶1。
上述制备方法的反应过程如下：
实施例5 一种泰地罗新半抗原、人工抗原及它们的制备方法
① 一种泰地罗新半抗原及其制备方法
一种泰地罗新半抗原其结构如下：
；
上述泰地罗新半抗原的制备方法，它按照以下步骤顺序进行：
（11）在干燥的N2条件下，将1份泰地罗新用12份丙酮溶解，制成溶液A3；
（12）搅拌状态下，继续通入N2，并向溶液A3中滴加2.0份丁二酸酐的丙酮溶液，滴加完毕后25℃搅拌反应15 h，得透明溶液；
（13）减压旋转蒸发除去溶剂，得到淡黄色无定形粉末，后加入二氯甲烷溶解，水洗，用1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH值为10，分离二氯甲烷层，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋转蒸发去除溶剂，得粗产品；过硅胶柱，洗脱液为体积比为1∶1的乙酸乙酯与石油醚的混合物，将产物管合并，减压旋转蒸发至干，得泰地罗新半抗原。
将合成的半抗原进行ESI质谱鉴定，具有[M-1]-分子离子峰833.4。
元素分析（C45H75N3O11）实测值（理论值，%）：C 64.78（64.80），H 9.08（9.06），N 5.03（5.04），O 21.11（21.10）。表明泰地罗新半抗原分子中含45个C，75个H，3个N，11个O，分子量为834.09。
1H NMR ( CDCl3 )δ( ppm ): 0.90(t,3H,CH2CH3),0.96(d,3H,4-CH3),1.16(d, 3H,8-CH3),1.18(d,3H,5-CH3),1.20(d,1H,CH),1.35(d,2H,CH),1.45(d,1H,CH),1.53(m,8H,CH2),
1.57(m,2H,CH2),1.59(m,4H,CH2),1.79(q,1H,CH),2.05(q,1H,CH),2.21(d,3H,CH3),2.23(s,1H,CH),2.26(s,6H,N(CH3)2),2.27(s,1H,CH),2.43(t,2H,CH2),2.45(t,8H,CH2),2.48(d,1H,CH),2.52(d,1H,CH),2.52(t,1H,CH),2.54(t,2H,CH2),2.81(t,1H,CH),2.83(t,2H,CH2),2.99(t,1H,CH),3.40(t,1H,CH),3.55(t,1H,CH),3.58(s,1H,OH),3.60(s,1H,OH),3.84(t,1H,CH),3.85(d,1H,CH),3.98(t,1H,CH),4.62(t,1H,CH),5.44(t,1H,CH=C),5.54(d,1H,CH),6.33(d,1H,CO-CH=CH),7.40(d,1H,CO-CH=CH), 11.28(s,1H,COOH)。
②一种泰地罗新人工抗原及其制备方法
一种泰地罗新人工抗原其结构如下：
；
上述泰地罗新人工抗原的制备方法，它采用活性酯法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（31）将0.9mmol的N，N，-二环己基碳二亚胺溶于15mL二恶烷中，搅拌状态下滴入等当量的上述泰地罗新半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺的二恶烷溶液中，室温搅拌反应24 h，制得溶液D3；
（32）将溶液D3离心，取上清液滴加至70 mL的10mg/mL鸡卵清蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，3℃搅拌反应24 h，制得溶液E3；
（33）将溶液E3于4℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M23，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、鸡卵清蛋白（OVA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与OVA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与OVA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与OVA分子的偶联比率为22∶1。
实施例6 一种泰地罗新人工抗原及其制备方法
如实施例1所述的泰地罗新人工抗原的制备方法，它采用混合酸酐法制备而得，它按照以下步骤顺序进行：
（21）将0.9mmol上述泰地罗新半抗原与等当量的三正丁胺溶于10mL二恶烷中，搅拌30 min后，加入等当量的氯甲酸异丁酯，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，搅拌反应1 h，制得溶液B3；
（22）将溶液B3滴加至50 mL 10 mg/mL的牛血清白蛋白的二恶烷与磷酸盐缓冲液中，3℃搅拌反应24 h，制得溶液C3；
（23）将溶液C3于3℃用蒸馏水透析3天，每天换液4次，冷冻干燥得泰地罗新人工抗原M13，-20℃保存。
用磷酸盐缓冲液溶解半抗原、牛血清白蛋白（BSA）、人工抗原，分别稀释至适宜浓度，进行紫外光谱（200-400nm）扫描，结果表明人工抗原与BSA的紫外光谱相比发生了显著变化，说明半抗原与BSA成功偶联制得人工抗原。通过三者在同一波长下的吸光度值计算其偶联比率，经计算，泰地罗新半抗原分子与BSA分子的偶联比率为15∶1。
实施例7 实施例1-6制得的人工抗原免疫动物及ELISA竞争抑制试验
分别以实施例1、实施例3和实施例6合成的人工抗原为免疫原免疫小鼠，从第二次加强免疫开始每次免疫10天后采集尾部血清；分别以实施例2、实施例4和实施例5合成的人工抗原为包被抗原进行间接竞争性ELISA分析。结果表明，第五次加强免疫后，获得了特异性的抗血清。在倍比稀释的抗血清中加入10 μg/mL的泰地罗新进行抑制，结果比对照吸光度显著降低，随着血清稀释倍数的增加，吸光度呈明显的递减梯度，效价值如下表所示：