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1、(10)申请公布号 CN 102835300 A (43)申请公布日 2012.12.26 C N 1 0 2 8 3 5 3 0 0 A *CN102835300A* (21)申请号 201110170755.2 (22)申请日 2011.06.23 A01H 1/02(2006.01) A01H 1/06(2006.01) (71)申请人匡贤彦 地址 330096 江西省南昌市高新区万科四季 花城北区嘉兰苑8号楼A座102室 申请人李伟 应开 (72)发明人不公告发明人 (54) 发明名称 EMS诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方 法 (57) 摘要 本发明提出EMS诱变W64A玉米花。
2、粉高效获 得分蘖突变体的方法。涉及技术领域为EMS诱 变玉米花粉的方法。本发明要解决获得玉米显 性分蘖突变体所需EMS最适浓度和最适玉米自 交品系等技术问题。国际通用(玉米突变体手 册Mutants of Maize)EMS玉米花粉诱变浓度 较大(9.99X10 -3 ，体积比v/v)，国内公认EMS玉 米花粉诱变浓度较小(6.67X10 -4 ，体积比v/v)， 且玉米自交系品种难以掌握，获得分蘖玉米突变 体较少，遗传稳定性差。本发明采用EMS低浓度 (9.99X10 -4 ，体积比v/v)，处理玉米自交系W64A花 粉，高效获得稳定遗传的分蘖玉米突变体，突变率 达0.03，稳定遗传率高达8。
3、7.5。本发明可高 效获得具有农业增产和生物能源价值的分蘖突变 体，拓宽玉米育种的种质范围，并提供较高学术价 值的玉米突变体。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 1/1页 2 1.EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，其特征在于以 下操作： -下午(晴天)选取30株处于散粉早中期的W64A玉米自交系，给雄穗套袋； -下午(晴天)选取100株处于玉米授粉期的W64A玉米自交系，减去雌穗花丝顶端并 套袋； -次日上午8时(晴天)，取5。
4、0毫升石蜡油倒入200毫升量筒内，加入0.05毫升甲基 磺酸乙酯EMS，制备成EMS诱变溶液，加入磁力搅拌子，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌混 匀； -9-10时(晴天)从30个雄穗中采集5毫升花粉，放入干燥的15ml塑料管中； -30分钟内将塑料管中的花粉倒入EMS诱变溶液，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌混匀 50分钟，分装至新的50毫升的塑料管； -20分钟内，用柔软的毛刷蘸着EMS处理过的花粉，均匀刷在100株玉米雌蕊的新鲜花 丝上，并套袋。整个授粉过程控制在30分钟内。 2.EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，其特征在于 EMS诱变溶液的配方浓度(。
5、9.99X10 -4 ，体积比v/v)： 甲基磺酸乙酯EMS 0.05毫升 石蜡油 50毫升 3.EMS花粉诱变获得分蘖玉米突变体的方法，其特征在于玉米自交品系：W64A。 权 利 要 求 书CN 102835300 A 1/8页 3 EMS 诱变 W64A 花粉高效获得分蘖突变体的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种EMS诱变玉米花粉的方法，特别是涉及到一种甲基磺酸乙酯EMS 诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方法。 背景技术 0002 玉米是世界上仅次于小麦和水稻的农作物。通过杂交手段培育的新品种的发展空 间较小，品种的抗逆性不全面。利用诱变技术培育玉米新品种，其变异范围广，可产生自。
6、然 突变难以出现的新基因突变体。所以，玉米诱变技术是一种高效快速培育新品种的方法。目 前，玉米诱变技术有化学诱变、电离辐射诱变以及空间诱变方法等。 0003 甲基磺酸乙酯EMS(Ethyl methanesulfonate)是目前在玉米上使用最广和使用 效果最好的化学诱变剂。用EMS-石蜡油处理花粉，平均单个基因的显隐性突变率可达 1/1000-1/10000，可以在较大的诱变后代群体中筛选出目标突变体。利用EMS处理玉米花 粉的诱变技术不存在转基因产品的安全性问题，所以EMS化学诱变在2个世代(M1、M2)就 可创造迄今为止所积累的所有特用玉米类型，包括白玉米、甜玉米、糯玉米、超甜玉米、抗除。
7、 草剂玉米、高油酸玉米和高直链淀粉玉米。利用EMS处理玉米花粉的诱变技术，不仅可以创 造新型实用的具有经济价值的突变体种质资源，而且为玉米生长发育等基础性研究提供较 高学术价值的玉米突变体。 0004 玉米分蘖突变体有3-10根独立的分蘖，可形成独立的根系、节点、内部节点、叶、 玉米雌穗(玉米棒子)和雄穗。分蘖可增加产量和生物质，在农业生产和生物能源等领域 有着重大的经济和社会效益。 0005 通过EMS诱变技术产生的玉米分蘖突变体比率较小，且遗传不稳定，主要原因是 对EMS诱变溶液浓度和玉米自交品系的掌握。不同自交系对EMS的敏感程度不同，而且 不同玉米自交系中的特定基因不尽相同，甚至一些重。
8、要的基因在某些玉米自交系中根本不 存在，这就给重要突变体的筛选造成了障碍。目前，国际上通用的(如玉米突变体手册 Mutants of Maize)EMS玉米花粉诱变使用的浓度为9.99X 10 -3 (体积比v/v)，国内公认 的EMS玉米花 粉诱变浓度为6.67X 10 -4 (体积比v/v)。本发明测试了不同EMS诱变溶液 浓度(6.67X 10 -4 9.99X 10 -3 )以及不同玉米自交品系(W64A、B73、Mo17)对获得玉米分 蘖突变体比率的影响。本发明获得了在玉米自交系W64A中可作为EMS诱发分蘖突变体的 参考浓度9.99X10 -4 (体积比，v/v)。 发明内容 00。
9、06 EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，其特征在于 以下操作： 0007 -下午(晴天)选取30株处于散粉早中期的W64A玉米自交系，给雄穗套袋； 0008 -下午(晴天)选取100株处于玉米授粉期的W64A玉米自交系，减去雌穗花丝顶 端并套袋； 说 明 书CN 102835300 A 2/8页 4 0009 -次日上午8时(晴天)，取50毫升石蜡油倒入200毫升量筒内，加入0.05毫升 甲基磺酸乙酯EMS，制备成EMS诱变溶液，加入磁力搅拌子，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌 混匀； 0010 -9-10时(晴天)从30个雄穗中采集5毫升花粉，放入干燥的15。
10、ml塑料管中； 0011 -30分钟内将塑料管中的花粉倒入EMS诱变溶液，在搅拌器上以1000rpm连续搅拌 混匀50分钟，分装至新的50毫升的塑料管； 0012 -20分钟内，用毛笔刷蘸着EMS处理的花粉，均匀刷在100株玉米雌蕊的花丝上，并 套袋。整个授粉过程控制在30分钟内。 0013 EMS诱变溶液的配方： 0014 甲基磺酸乙酯EMS 0.05毫升 0015 石蜡油 50毫升 0016 本发明EMS花粉诱变在玉米自交系W64A中高效获得分蘖玉米突变体的方法，有以 下优点： 0017 1.显性诱变率高 0018 EMS花粉诱变玉米自交系W64A M1代26498植株中，除获得8株显性分。
11、蘖玉米突 变体，突变率达0.03。此外，还获得其他显性突变体包括29株雄性不育、15株黄化苗、12 株抽雄期提早、15株早熟、9株晚熟、59株矮杆、33株细杆、9株斑马条纹、17株带状条纹、2 株顶端雌蕊、卷叶片7株等。平均显性诱变率高达0.8。 0019 2.特异性较强 0020 EMS诱变浓度9.99X 10 -4 在玉米自交系W64A中，可高效获得8株分蘖显性突变体， 获得率高达0.03。而相同浓度(9.99X 10 -4 )在不同的玉米自交系(B73、Mo17)中，获得 率仅有0.0038。其他浓度(6.67X 10 -4 9.99X 10 -3 )在相同玉米自交系W64A中，分蘖 显。
12、性突变体的获得率仅有0.0035。 0021 3.稳定遗传 0022 在玉米自交系W64A中M1代检测到的8株分蘖显性突变体，经与其他玉米自交系 品种(B73、Mo17)杂交后，7株M1F1代均遵循分蘖性状：正常性状11的分离规律，稳 定遗传率达87.5。然而，在玉米自交系B73中代检测到的2株分蘖显性突变体，经与其 他玉米自交系品种(W64A、Mo17)杂交后，只有1株在其M1F1代遵循分蘖性状：正常性状 11的分离规律，稳定遗传率达50。 0023 4.简单易行 0024 设备要求简单，整个EMS处理花粉和授粉过程不足2小时。 0025 5.成本低 0026 试剂仅需甲基磺酸乙酯EMS(E。
13、thyl methanesulfonate)化学诱变剂和石蜡油 (paraffinoil)。 具体实施方式 0027 下面详细说明本发明实施例： 0028 本发明测试了不同EMS诱变溶液浓度(6.67X 10 -4 9.99X 10 -3 )以及不同玉米自 交品系(W64A、B73、Mo17)对获得玉米分蘖突变体比率的影响。试验重复5次。本发明获 说 明 书CN 102835300 A 3/8页 5 得了在玉米自交系W64A中可作为EMS诱发分蘖突变体的参考浓度9.99X 10 -4 (体积比，v/ v)。 0029 表1.相同玉米自交系W64A中不同EMS浓度对产生分蘖显性突变体的影响 00。
14、30 说 明 书CN 102835300 A 4/8页 6 E M S 浓度 ( E M S ： 石蜡油 ) 体积比 ( v / v ) M 1 代分蘖显性突变体数目 M 1 代群体数目 自交品系 分蘖显性突变体频率 6 . 6 7 X 1 0 - 4 0 1 8 2 3 W 6 4 A 0 6 . 6 7 X 1 0 - 4 0 2 1 5 9 W 6 4 A 0 6 . 6 7 X 1 0 - 4 1 6 7 3 2 W 6 4 A 0 . 0 1 6 . 6 7 X 1 0 - 4 0 1 4 4 5 W 6 4 A 0 6 . 6 7 X 1 0 - 4 1 5 8 2 4 W 6 4。
15、 A 0 . 0 2 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 3 5 0 8 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 2 6 7 9 3 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 2 6 2 0 5 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 3 9 8 6 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 2 6 0 0 6 W 6 4 A 0 . 0 3 4 . 9 9 X 1 0 - 3 0 4 1 2 9 W 6 4 A 0 4 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 9 2 3 W 6。
16、 4 A 0 4 . 9 9 X 1 0 - 3 0 4 7 2 6 W 6 4 A 0 4 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 3 9 2 W 6 4 A 0 4 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 5 7 3 W 6 4 A 0 9 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 7 9 4 W 6 4 A 0 9 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 8 4 2 W 6 4 A 0 9 . 9 9 X 1 0 - 3 0 4 0 3 2 W 6 4 A 0 9 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 6 2 3 W 6 4 A 0 9 . 9 9 X 1 0 - 3 0 3 4 2 1。
17、 W 6 4 A 0 0031 我们对相邻的浓度梯度的突变频率(表1)检测差异的显著性(Welch Two Sample t-test，df4)，只有梯度一(6.67X10 -4 )与梯度二(9.99X10 -4 )和梯度二(9.99X10 -4 )与 梯度三(9.99X10 -3 )之间可检测显著性差异(p值分别为0.0024和0.00004，显著水平阈值 说 明 书CN 102835300 A 5/8页 7 设为0.01)。统计分析显示浓度梯度二(9.99X10 -4 )的突变频率显著高于其他浓度梯度。 0032 表2.相同EMS浓度9.99X10 -4 在不同的玉米自交系中对产生分蘖显性。
18、突变体的影 响 0033 说 明 书CN 102835300 A 6/8页 8 E M S 浓度 ( E M S ： 石蜡油 ) 体积比 ( v / v ) M 1 代分蘖显性突变体数目 M 1 代群体数目 自交品系 分蘖显性突变体频率 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 3 5 0 8 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 2 6 7 9 3 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 2 6 2 0 5 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 3 9 8 6 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9。
19、 9 X 1 0 - 4 2 6 0 0 6 W 6 4 A 0 . 0 3 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 5 0 2 8 M o 1 7 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 5 3 2 8 M o 1 7 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 4 9 8 7 M o 1 7 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 5 5 2 0 M o 1 7 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 5 1 3 4 M o 1 7 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 7 3 7 1 B 7 3 0 . 0 1 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 3 9 0 9 B。
20、 7 3 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 3 8 9 5 B 7 3 0 9 . 9 9 X 1 0 - 4 1 6 9 2 9 B 7 3 0 . 0 1 9 . 9 9 X 1 0 - 4 0 4 0 0 8 B 7 3 0 0034 我们对不同的自交品系的突变频率(表2)检测差异的显著性(Welch Two Sample t-test，df4)，自交品系W64A与自交品系Mo17、自交品系B73之间均显示显著性差异(p 值均为0.00004，显著水平阈值设为0.01)，自交品系Mo17与自交品系B73之间未显示显著 说 明 书CN 102835300 A 7/8页 9 性差异。
21、(p值为0.1781，显著水平阈值设为0.01)。统计分析显示在自交品系W64A中获得 分蘖突变体的突变频率显著高于其他自交品系。 0035 我们研究了分蘖显性突变体杂交M1F1代分蘖突变体分离比率及遗传稳定性(表 3)。在W64A中用浓度为9.99X 10 -4 的EMS获得的8株玉米分蘖突变体Tlh(Tillers and leafy husk)，分别命名为Tlh1、Tlh2、Tlh3、Tlh4、Tlh5、Tlh6、Tlh7和Tlh8，经与其他玉米 自交系品种(B73、Mo17)杂交后，除Tlh3是遗传不稳定以外，其余7株在其M1F1代均遵循 分蘖性状正常性状11的分离规律，稳定遗传。其中。
22、Tlh2(图1.分蘖显性突变体 Tlh2)和Tlh7为强玉米分蘖突变体，Tlh1、Tlh4和Tlh6为中等玉米分蘖突变体，Tlh5和 Tlh8为弱玉米分蘖突变体。在W64A中用浓度为6.67X 10 -4 的EMS获得的2株玉米分蘖突 变体Tlh9和Thl10，经与其他玉米自交系品种(B73、Mo17)杂交后，Tlh9和Thl10在M1F1 代均呈现正常性状，遗传均不稳定，稳定遗传率为0。在B73中用浓度为9.99X10 -4 的EMS获 得的2株玉米分蘖突变体Tlh11和Thl12，经与其他玉米自交系品种(W64A、Mo17)杂交后， 只有Thl11在其M1F1代遵循分蘖性状正常性状11的分。
23、离规律，且表现为弱玉米分 蘖性状。Tlh12遗传不稳定，稳定遗传率仅有50。 0036 表3.分蘖显性突变体杂交M1F1代分蘖突变体分离比率及遗传稳定性 0037 说 明 书CN 102835300 A 8/8页 10 0038 数据结果显示，采用低浓度9.99X 10 -4 (体积比v/v)，将0.05毫升EMS与50毫升 石蜡油混合，处理玉米自交系W64A花粉，可高效获得稳定遗传的分蘖玉米突变体，突变率 达0.03，稳定遗传率高达87.5，其他显性突变体平均获得率高达0.8。 说明书附图说明 图1是分蘖显性突变体Tlh2图。 说 明 书CN 102835300 A 10 1/1页 11 图1 说 明 书 附 图CN 102835300 A 11 。