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1、(10)申请公布号 CN 102835312 A (43)申请公布日 2012.12.26 C N 1 0 2 8 3 5 3 1 2 A *CN102835312A* (21)申请号 201210293863.3 (22)申请日 2012.08.17 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人中国热带农业科学院南亚热带作物 研究所 地址 524000 广东省湛江市麻章区湖秀路1 号 (72)发明人张燕梅 周文钊 戴梅莲 李俊峰 陆军迎 林映雪 (74)专利代理机构广州市南锋专利事务所有限 公司 44228 代理人刘广生 (54) 发明名称 一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法 (57) 。
2、摘要 本发明涉及一种克服剑麻不定芽玻璃化的方 法，是通过将愈伤组织直接接种在SZ培养基上 诱导不定芽；SZ培养基的组分为硝酸钾2267mg/ L，磷酸二氢钾400mg/L，硫酸铵150mg/L，二水氯 化钙400mg/L，七水硫酸镁400mg/L，一水硫酸锰 10mg/L，七水硫酸锌5mg/L，硼酸5mg/L，碘化钾 1mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/ L，六水氯化钴0.1mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，乙 二胺四乙酸二钠37.3mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L， 盐酸比多醇1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，肌醇200mg/ L，甘氨酸3mg/L，蔗糖300。
3、00mg/L，卡拉胶8000mg/ L，pH5.8，6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，3-吲哚丁酸 0.1mg/L，-萘乙酸0.1mg/L；用SZ培养基进行 H.11648麻愈伤组织不定芽诱导，愈伤组织分化 率在90%以上，愈伤组织诱导的不定芽玻璃化比 率在8%以下，即该方法可明显克服剑麻不定芽玻 璃化的发生。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1页 2 1.一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于：包括如下步骤： 将淡黄绿色的剑麻愈伤组织直接接种在SZ培养基上诱导不定芽，所述的。
4、SZ培养基组 成为：硝酸钾2267mg/L，磷酸二氢钾400 mg/L，硫酸铵150mg/L，二水氯化钙400 mg/L，七 水硫酸镁400 mg/L，一水硫酸锰10mg/L，七水硫酸锌5mg/L，硼酸5mg/L，碘化钾1mg/L，二 水钼酸钠0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.1mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，乙二 胺四乙酸二钠37.3mg/L，盐酸硫胺素0.8 mg/L，盐酸比多醇1.0 mg/L，烟酸1.0mg/L，肌醇 200 mg/L，甘氨酸3mg/L，蔗糖30000mg/L，卡拉胶8000mg/L，pH5.8，6-苄氨基嘌呤3.0mg/ L，3-吲哚丁酸0。
5、.1mg/L，-萘乙酸0.1mg/L。 2.根据权利要求1所述的一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于：所述的SZ 培养基的pH值为5.8。 权 利 要 求 书CN 102835312 A 1/5页 3 一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，特别涉及一种克服H.11648麻再 生体系建立过程中不定芽玻璃化的方法。 背景技术 0002 剑麻为我国热区的特色纤维作物，主要分布在广东、广西、福建、海南和云南等地， 近几十年，剑麻育种工作者不断从国外引进一些新的种质资源，也先后开展了剑麻杂交育 种工作，并且获得了一些优良种质，但剑麻种质资源严。
6、重缺乏的现象仍然存在。目前我国唯 一当家品种H.11648，种植面积达98%以上。由于该品种抗真菌能力较差，病虫害不断滋生， 严重影响了剑麻的高产稳产。并且剑麻生命周期长，一生仅开一次花，杂交育种时间长、效 率低，因此利用生物技术开展剑麻遗传改良和种质创新尤为重要。 0003 国内外对剑麻的组织培养做了一定的探索，已成功的建立了亚洲马盖麻（A. cantala Robx）、灰叶剑麻（A. fourcroydes Lem）、普通剑麻（A. sisalana Perrine）、蓝 剑麻（A. tequilana Weber cultivar azul）、A. parrasana Berger、 A。
7、. tequilana、A. crassispina、 A. duranguensisA. vera-cruz Mill.、 A. atrovirens、A. arizonica和 Agave sisalana Perrine ex Engelmann等体外再生体系并获得了完整的再生植株，中国热 带农业科学院南亚热带作物研究所也开展了H.11648麻的再生体系研究，获得了一定数量 的再生植株，但均存在一定程度的玻璃化现象，最高时玻璃化比例达100%，玻璃化的植株形 态异常，无法正常生长，并且组培苗玻璃化问题已成为植物组织培养过程中的瓶颈。因此， 解决剑麻组培苗玻璃化问题，建立稳定高效的再生体系。
8、对开展剑麻生物技术育种有重要的 理论和现实意义。 发明内容 0004 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种克服剑麻不定芽玻璃化的方 法。 0005 为实现上述目的本发明所采用的技术方案是： 一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，包括如下步骤： 通过将愈伤组织直接接种在SZ培养基上来诱导不定芽发生，所述的SZ培养基包括大 量元素、微量元素、铁盐、有机成分、蔗糖、卡拉胶以及激素等八个组分，大量元素及其含量 分别为硝酸钾2267mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，硫酸氨150mg/L，二水氯化钙400 mg/L，七水 硫酸镁400 mg/L； 铁盐及其含量为七水硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸。
9、二钠37.3mg/L； 微量元素及其含量分别分为一水硫酸锰10mg/L，七水硫酸锌5mg/L，硼酸5mg/L，碘化 钾1mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.1mg/L; 有机成分及其含量分别为盐酸硫胺素0.8 mg/L，盐酸吡哆醇1.0 mg/L，烟酸1.0mg/L， 肌醇200 mg/L，甘氨酸3mg/L。 说 明 书CN 102835312 A 2/5页 4 0006 培养基的蔗糖30000mg/L，卡拉胶8000mg/L。 0007 培养基的激素为6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，3-吲哚丁酸0.1mg/L，-萘乙酸0.1mg/ L。 0008 所述的。
10、SZ培养基的pH值为5.8。 0009 本发明的优点在于： 本发明通过调节培养基的有效组分来克服剑麻不定芽玻璃化的现象，该方法操作步骤 简单易行，效果非常显著，不仅降低了生产成本，同时也为解决剑麻不定芽玻璃化问题提供 有效途径，为剑麻再生体系建立和遗传转化等研究奠定了基础。 具体实施方式 0010 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。实施例中的MS、SH及SZ培养基成分及含量见附件2，实施例中的 6-BA为6-苄氨基嘌呤，NAA为-萘乙酸，IBA为3-吲哚丁酸，除特别说明外，所有实施例 中蔗糖、卡拉胶、pH值、光照时间及强度、温度、湿度等。
11、均相同。 0011 实施例1 2010年6月，分别在MS+6-BA3.0mg/LNAA0.2mg/L和SH+6-BA3.0mg/LNAA 0.2mg/ L培养基上接种30个H.11648麻愈伤团块，培养条件为：光照12h， 黑暗12h，光照强度为 2000Lx，温度262，湿度相对60%。2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率分 别为88.3%和89.2%，不定芽玻璃化比率分别为94.8%和88.5%。 0012 实施例2 2010年7月，将培养容器的塑料瓶盖改为透气性好的封口膜，分别在MS+6-BA3.0mg/L NAA0.2mg/L和SH+6-BA3.0mg/LNAA 0.2mg/L培。
12、养基上接种30个H.11648麻愈伤团 块，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率分别为74.4%和83.3%，不定芽玻璃化比 率分别为68.9%和62.8% 实施例3 2010年7月至9月，以SH为基本培养基，采用完全组合方式对NAA（0.1 mg/L，0.5 mg/ L，1.0 mg/L）、IBA（0.1 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L）和6-BA（1 mg/L，3mg/L，5mg/L）的浓 度及组合进行优化，其它培养条件不变。2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率在 34.3-100.0%之间，不定芽玻璃化比率在52.8%至100%之间，其中6-BA3.0mg/L、。
13、NAA0.1mg/ L、IBA0.1mg/L组合玻璃化比率均优于其它激素组合，愈伤组织不定芽诱导率为100.0%，玻 璃化比率为52.8%。 0013 实施例4 2010年10月至2011年3月，在SZ+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L培养基上接 种1,350块愈伤组织，塑料瓶盖，其它培养条件不变，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定 芽诱导率为90.3%，不定芽玻璃化比率为8.2%。 0014 实施例5 2011年3月17号，在SZ +6-BA3.0mg/LNAA0.1mg/LIBA0.1mg/L、MS+6-BA3.0mg/ LNAA 0.1mg/LIBA0.。
14、1mg/L和SH+6-BA3.0mg/LNAA 0.1mg/LIBA0.1mg/L培养基 上分别接种40个H.11648麻愈伤组织团块，培养条件不变。2个月后统计试验结果，三种培 说 明 书CN 102835312 A 3/5页 5 养基愈伤组织不定芽诱导率分别为90.6%、93.2%和88.9%，但诱导的不定芽玻璃化比率相 差较大，其中以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为3.1%，以MS为基本培养基获 得的不定芽玻璃化比率为87.5%，以SH为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为42.5%，以 SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化率比MS培养基低84.4%，比SH基本培养基低39.4%。 。
15、0015 实施例6 2011年4月19号，在相同培养条件下，分别在SZ +6-BA3.0mg/LNAA0.1mg/L IBA0.1mg/L、MS+6-BA3.0mg/LNAA0.1mg/LIBA0.1mg/L和SH+6-BA3.0mg/L NAA0.1mg/LIBA0.1mg/L的培养基上接种141、125、131个H.11648麻愈伤组织团块，2个 月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率均为100%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻 璃化比率为3.6%，以MS为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为89.3%，以SH为基本培养 基获得的不定芽玻璃化比率为41.2%，以SZ为基本培养基获得的不定芽。
16、玻璃化比率比MS和 SH基本培养基分别低85.7%和37.6%。 0016 实施例7 2011年5月20号， 在相同培养条件下，分别在SZ +6-BA3.0mg/LNAA0.1mg/ LIBA0.1mg/L、MS+6-BA3.0mg/LNAA0.1mg/LIBA0.1mg/L和SH+6-BA3.0mg/L NAA0.1mg/LIBA0.1mg/L的培养基上接种225、170、146个H.11648麻愈伤组织团块，2个 月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率92.3%、81.8%和93.5%，以SZ为基本培养基获 得的不定芽玻璃化比率为3.03%，以MS为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为81.。
17、5%，以 SH为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为44.1%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃 化比率比MS和SH基本培养基分别低78.47%和41.07% 实施例8 从2011年12月至2012年5月，共接种H.11648麻愈伤组织1，680块于SZ +6-BA3.0mg/ LNAA 0.1mg/LIBA0.1mg/L培养基上，获得了24,024株再生植株，其中玻璃化的植株 有187株，玻璃化比例为7.8%。 0017 附件1 具体实施例 说 明 书CN 102835312 A 4/5页 6 注：附件1表中的MS、SH和SZ培养基的成分及含量见附件2，表中的6-BA为6-苄氨 基嘌呤，NAA为-萘乙酸，IBA为3-吲哚丁酸,培养条件为光照12h，黑暗12h，光照强度 为2000Lx，温度262，湿度相对60%。培养容器的盖子为塑料瓶盖。培养基中的蔗糖 为30000mg/L，卡拉胶为8000mg/L，pH5.8，所有数据均为接种2个月后统计的结果。 0018 附件2 所用培养基的组成成分及含量 说 明 书CN 102835312 A 5/5页 7 注: “-”表未添加。 说 明 书CN 102835312 A 。