一种RNA及产生该RNA的基因在调控水稻根系发育中的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210347712.1	申请日：	2012.09.18
公开号：	CN102851280A	公开日：	2013.01.02
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/11申请日:20120918\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/11; C12N15/29; C12N15/82; A01H5/00	主分类号：	C12N15/11
申请人：	中国科学院遗传与发育生物学研究所
发明人：	王秀杰; 王猛; 储成才; 曹守云
地址：	100101 北京市朝阳区北辰西路1号院2号
优先权：
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司 11245	代理人：	关畅
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内容摘要

本发明公开了一种RNA及其对应基因在调控水稻根系发育中的应用。本发明提供的Os-npcR1RNA或产生Os-npcR1RNA的基因调控植物根系发育中的应用；所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。本发明的实验证明，本发明将水稻os-npcR1基因进行转基因过表达，得到转基因水稻，该转基因水稻的根系发育受到抑制，说明该基因能减少水稻的根系，但不影响其地上部分的生长发育。因此该基因可为农作物密植相关的育种提供重要参考或作为候选基因。

权利要求书

权利要求书Os‑npcR1RNA或产生Os‑npcR1RNA的基因在调控植物根系发育中的应用；所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸。根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。根据权利要求1‑3中任一所述的应用，其特征在于：所述抑制根系发育体现在减少主根长度；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。一种培育转基因植物的方法，为将产生Os‑npcR1RNA的基因导入目的植物，得到抑制根系发育的转基因植物，所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抑制根系发育体现在所述转基因植物的主根长度小于所述目的植物。根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸；所述产生Os‑npcR1RNA的基因通过表达载体导入所述目的植物。根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达载体为将所述产生Os‑npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os‑npcR1RNA的载体。根据权利要求5‑8任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。一种表达载体，为将产生Os‑npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os‑npcR1RNA的载体；所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸。

说明书

说明书一种RNA及产生该RNA的基因在调控水稻根系发育中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA及产生该RNA的基因在调控水稻根系发育中的应用。
背景技术
植物通过根系从土壤中吸收水分、矿物质及其它营养成分，因此，根系对植物的生长发育极其重要。而单、双子叶植物的根系之间存在显著不同，如双子叶植物中的拟南芥有主根，并在主根上产生侧根，而单子叶植物水稻则以庞大的不定根系为主。因此，尽管近几年在拟南芥根系发育的研究中取得了较大进展，但对粮食作物水稻的相关机制了解并不多。已报道的参与水稻根系发育的基因较少，仅有CRL1（CROWN ROOTLESS1）、WOX11(WUSCHEL‑relatedhomeoboxgene）以及RSL4(ROOT HAIR DEFECTIVE6‑LIKE4)等，它们都是编码蛋白的功能基因。到目前为止，还没有长的非编码RNA（non‑protein coding RNA，npcRNA）参与水稻根系发育的报道。植物长非编码RNA研究是最近几年兴起的热点，2012年先后有两篇文章报道一个长非编码RNA（LDMAR)在水稻的光敏感核不育中具有重要调控作用。虽然转录组测序结果显示了植物中存在大量长非编码RNA，但大部分均功能未知。
发明内容
本发明的一个目的是提供水稻中一种长RNA Os‑npcR1RNA及产生该RNA的基因Os‑npcR1的用途。
本发明提供的Os‑npcR1RNA或产生该RNA的基因在调控植物根系发育中的应用；所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。
上述应用中，所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸。
上述应用中，所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。
上述应用中，所述抑制根系发育体现在减少主根长度；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；在本发明的实施例中采用单子叶植物为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将产生Os‑npcR1RNA的基因导入目的植物，得到抑制根系发育的转基因植物，所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。
上述方法中，所述抑制根系发育体现在所述转基因植物的主根长度小于所述目的植物。
所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸。所述产生Os‑npcR1RNA的基因通过表达载体导入所述目的植物。
上述方法中，所述表达载体为将所述产生Os‑npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os‑npcR1RNA的载体。在本发明的实施例中，表达载体为os‑npcR1‑1300，具体为将序列表中的序列1自5’末端第8‑521位核苷酸插入pCAMBIA1300的XbaⅠ和SacⅠ酶切位点间得到的载体。
上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；在本发明的实施例中采用单子叶植物为水稻。
本发明的第三个目的是提供一种表达载体。
本发明提供的表达载体，为将产生Os‑npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os‑npcR1RNA的载体；所述Os‑npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述产生Os‑npcR1RNA的基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5’末端第8‑521核苷酸。在本发明的实施例中，表达载体为os‑npcR1‑1300，具体为将序列表中的序列1自5’末端第8‑521位核苷酸插入pCAMBIA1300的XbaⅠ和SacⅠ酶切位点间得到的载体。
本发明的实验证明，本发明将水稻产生os‑npcR1RNA的基因进行转基因过表达，得到转基因水稻，该转基因水稻的根系发育受到抑制，说明该基因能减少水稻的根系，但不影响其地上部分的生长发育。因此该基因可能应用在农作物密植相关的育种研究与生产中。
附图说明
图1为PCR扩增得到os‑npcR1
图2为转基因水稻的PCR鉴定
图3为os‑npcR1调控水稻根系发育
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、os‑npcR1RNA编码基因的获得
1、水稻总RNA的提取
1）Trizol法提取：
(1)取适量日本晴水稻（O．Sativa L．spp．japonica，varnipponbare，以下也称为野生型水稻；Loss of Function of OsDCL1 Affects MicroRNA Accumulation and Causes Developmental Defects in Rice,Plant Physiology,2005,V139(1)296‑305；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）材料（0.1g）加入液氮研磨15min,至粉末状，将粉末倒入2mL离心管（约占1/2管），然后立即加入1mL Trizol试剂。将粉末与Trizol试剂混匀，在室温下孵育5min,以便核酸蛋白复合体完全解离。
(2)将离心管于4℃12000rpm离心15min。
(3)将上清液转移到新的2mL离心管中，并向其中加入等体积0.5ml氯仿，手动剧烈振荡管体15s后，室温静至2～3min。
(4)将离心管于4℃12000rpm离心15min。
(5)将上层的水相转移至新的离心管中，向其中加入等体积的异丙醇以沉淀RNA。混匀后，于－20℃静置10min。
(6)将离心管于4℃12000rpm离心10min。
(7)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，4℃12000rpm离心3min。
(8)除去乙醇溶液，在超净台吹干。
(9)加入20μl不含RNA酶的水溶解沉淀，得到RNA溶液。
2）RNA的纯化（除DNA）
(1)将RNA溶液加水至39μl，按下表加入其余试剂，混匀。

混合溶液于37℃反应40min。
(2)向EP管内加入不含RNase的水450μl，使总体积达到500μl。
(3)向其中加入500μl水饱和酚，剧烈振荡，于4℃12000rpm离心10min。
(4)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈振荡，于4℃12000rpm离心10min。
(5)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀。
(6)向离心管中加入1/10V3M NaAc溶液（pH 5.2）,‑70℃放置过夜。
(7)于4℃12000rpm离心10min。
(8)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，4℃12000rpm离心3min。
(9)除去乙醇溶液，在超净台吹干。
(10)加入20μl不含RNA酶的水溶解沉淀，得到总RNA。
2、水稻RNA的反转录
20μl的反转录反应体系中加入总RNA5微克。
(1)按照以下体积把试剂和溶液加入PCR小管内

(2)70℃加热5min后迅速冰浴2min。
(3)向小管内按照以下体积加入试剂

(4)42℃反应1小时。
(5)95℃加热5min，终止反转录反应，得到cDNA。
3、os‑npcR1编码基因的获取
根据水稻基因组序列设计os‑npcR1的特异引物P1和P2，引物序列如下：
P1：ATCTAGAATGGTCTGGATTCGCCTCGTC
P2：TGAGCTCTGCAGATGTACGCAGTACAGCCAAAGA
以上面反转录得到的水稻cDNA为模板，扩增该基因，反应体系如下：

然后按照下列程序进行PCR扩增，

PCR结果如图1所示，M：Marker；P：PCR扩增产物，得到528bp的PCR产物。
将该PCR产物插入EZ‑T载体（北京康润诚业生物科技有限公司）中，得到重组质粒os‑npcR1‑EZ‑T，经过测序，该质粒上的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列1所示的核苷酸，其中序列表中的序列1自5’末端第8‑521位核苷酸所示的基因命名为os‑npcR1，该基因转录的RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2，命名为os‑npcR1。
实施例2、转os‑npcR1水稻的获得及功能鉴定
一、转os‑npcR1水稻的获得
1、含有os‑npcR1过量表达重组载体的构建
将实施例1得到的质粒os‑npcR1‑EZ‑T用XbaⅠ和SacⅠ限制性内切酶消化os‑npcR1‑EZ‑T，回收约528bp的目的片断，同时用XbaⅠ和SacⅠ限制性内切酶消化表达载体pCAMBIA1300（购自CAMBIA，澳大利亚），回收载体片断，然后将目的片断和载体片断连接，得到重组表达载体os‑npcR1‑1300，将该重组表达载体送去测序，结果该载体为将序列表中的序列1自5’末端第8‑521位核苷酸插入pCAMBIA1300的XbaⅠ和SacⅠ酶切位点间得到的载体。
2、转os‑npcR1水稻的获得
将上述重组表达载体os‑npcR1‑1300转入农杆菌AGL1（ATCC No.BAA‑101，购自ATCC）中，得到重组菌，提取该重组菌的质粒送去测序，该质粒为os‑npcR1‑1300，将含有该质粒的重组菌命名为AGL1/os‑npcR1‑1300。
通过重组菌AGL1/os‑npcR1‑1300通过农杆菌介导的方法转化到日本晴水稻的愈伤中，培育，在潮霉素培养基上筛选抗性愈伤，得到T0代转os‑npcR1水稻。
3、转os‑npcR1水稻的鉴定
1）基因组DNA的提取
（1）取一定量野生型水稻叶片，加入液氮，充分研磨后，将粉末倒入1.5ml离心管中；
（2）待离心管中液氮挥发完全后，立即加入500ul DNA提取缓冲液（0.1mol/LTris·HCl（pH 8.0），0.5mol/LNaCl，0.05mol/L EDTA，0.5%SDS），充分混匀后，65℃保温30分钟，期间不断温和上下颠倒离心管，使样品与缓冲液充分混合；
（3）以12,000rpm室温离心15分钟；
（4）将上清液转移至另一离心管；
（5）加入等体积tris‑酚，抽提一遍；
（6）再用等体积的氯仿抽提一遍；
（7）取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，‑20静置10分钟,以12,000rpm离心10分钟；
（8）用70%的乙醇洗剂，DNA沉淀在超净工作台吹干后，用灭菌双蒸水溶解备用，得到基因组DNA。
2）转基因水稻的PCR鉴定
以上述提取T0代转os‑npcR1水稻叶片的基因组DNA，然后用35S启动子的特异引物P3和os‑npcR1的特异引物P2进行转基因植物的PCR鉴定。P3引物序列如下：
P3：AACAGAACTCGCCGTAAAGACTG。
结果如图2所示，1、2、3分别为T0代转os‑npcR1水稻的PCR产物；+：PCR反应的正对照；‑：以野生型水稻为模板的PCR反应负对照，得到1034bp的为阳性转基因植物，共得到20株阳性T0代转os‑npcR1水稻。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA1300转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，采用上述引物进行鉴定，没有目的片段，说明为阳性T0代转空载体水稻。
二、转os‑npcR1水稻的获得及功能鉴定
将阳性T0代转os‑npcR1水稻、野生型水稻和T0代转空载体水稻分别播种后第15天，观察根系；每个株系6株，实验重复三次，结果取平均值。
结果如图3所示，阳性T0代转os‑npcR1水稻根系（转基因水稻）明显弱于野生型水稻（对照），但并没有改变地上部分的生长状况。
统计主根长度，阳性T0代转os‑npcR1水稻的主根长度为5厘米；
野生型水稻的主根长度为2.4厘米；
野生型水稻和T0代转空载体水稻os‑npcR1的结果无显著差异。
上述结果说明水稻os‑npcR1基因调控了水稻的根系发育，对于将来的转基因育种具有重要意义。

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1、(10)申请公布号 CN 102851280 A (43)申请公布日 2013.01.02 C N 1 0 2 8 5 1 2 8 0 A *CN102851280A* (21)申请号 201210347712.1 (22)申请日 2012.09.18 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 2号 (72)发明人王秀杰王猛储成才曹守云 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理。

2、有限公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称一种RNA及产生该RNA的基因在调控水稻根系发育中的应用 (57) 摘要本发明公开了一种RNA及其对应基因在调控水稻根系发育中的应用。本发明提供的 Os-npcR1RNA或产生Os-npcR1RNA的基因调控植物根系发育中的应用；所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。本发明的实验证明，本发明将水稻os-npcR1基因进行转基因过表达，得到转基因水稻，该转基因水稻的根系发育受到抑制，说明该基因能减少水稻的根系，但不影响其地上部分的生长发育。因此。

3、该基因可为农作物密植相关的育种提供重要参考或作为候选基因。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书6页序列表2页附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 6 页序列表 2 页附图 1 页 1/1页 2 1.Os-npcR1RNA或产生Os-npcR1RNA的基因在调控植物根系发育中的应用；所述 Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产生Os-npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5末端第8-521核苷酸。 3.根据权利要求1或2所述的应用，。

4、其特征在于：所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。 4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述抑制根系发育体现在减少主根长度；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。 5.一种培育转基因植物的方法，为将产生Os-npcR1RNA的基因导入目的植物，得到抑制根系发育的转基因植物，所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抑制根系发育体现在所述转基因植物的主根长度小于所述目的植物。 7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述产生Os-npcR1RNA的基因的核苷。

5、酸序列为序列表中序列1自5末端第8-521核苷酸；所述产生Os-npcR1RNA的基因通过表达载体导入所述目的植物。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达载体为将所述产生Os-npcR1RNA 的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os-npcR1RNA的载体。 9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。 10.一种表达载体，为将产生Os-npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os-npcR1RNA的载体；所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述产。

6、生 Os-npcR1RNA的基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5末端第8-521核苷酸。权利要求书CN 102851280 A 1/6页 3 一种 RNA 及产生该 RNA 的基因在调控水稻根系发育中的应用技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA及产生该RNA的基因在调控水稻根系发育中的应用。背景技术 0002 植物通过根系从土壤中吸收水分、矿物质及其它营养成分，因此，根系对植物的生长发育极其重要。而单、双子叶植物的根系之间存在显著不同，如双子叶植物中的拟南芥有主根，并在主根上产生侧根，而单子叶植物水稻则以庞大的不定根系为主。因此，尽管近几年在。

7、拟南芥根系发育的研究中取得了较大进展，但对粮食作物水稻的相关机制了解并不多。已报道的参与水稻根系发育的基因较少，仅有CRL1（CROWN ROOTLESS1）、WOX11(WUSCH EL-relatedhomeoboxgene）以及RSL4(ROOT HAIR DEFECTIVE6-LIKE4)等，它们都是编码蛋白的功能基因。到目前为止，还没有长的非编码RNA（non-protein coding RNA，npcRNA）参与水稻根系发育的报道。植物长非编码RNA研究是最近几年兴起的热点，2012年先后有两篇文章报道一个长非编码RNA（LDMAR)在水稻的光敏感核不育中具有重要调控作用。

8、。虽然转录组测序结果显示了植物中存在大量长非编码RNA，但大部分均功能未知。发明内容 0003 本发明的一个目的是提供水稻中一种长RNA Os-npcR1RNA及产生该RNA的基因 Os-npcR1的用途。 0004 本发明提供的Os-npcR1RNA或产生该RNA的基因在调控植物根系发育中的应用；所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。 0005 上述应用中，所述产生Os-npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5 末端第8-521核苷酸。 0006 上述应用中，所述调控植物根系发育为抑制植物根系发育或促进植物根系发育。 0007 上述应用中，所述抑制根系。

9、发育体现在减少主根长度；所述植物为单子叶植物或双子叶植物；在本发明的实施例中采用单子叶植物为水稻。 0008 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。 0009 本发明提供的方法，为将产生Os-npcR1RNA的基因导入目的植物，得到抑制根系发育的转基因植物，所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2。 0010 上述方法中，所述抑制根系发育体现在所述转基因植物的主根长度小于所述目的植物。 0011 所述产生Os-npcR1RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5末端第8-521 核苷酸。所述产生Os-npcR1RNA的基因通过表达载体导入所述目的植物。 00。

10、12 上述方法中，所述表达载体为将所述产生Os-npcR1RNA的基因插入pCAMBIA1300 中，得到的表达Os-npcR1RNA的载体。在本发明的实施例中，表达载体为os-npcR1-1300，具说明书CN 102851280 A 2/6页 4 体为将序列表中的序列1自5末端第8-521位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba和Sac 酶切位点间得到的载体。 0013 上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；在本发明的实施例中采用单子叶植物为水稻。 0014 本发明的第三个目的是提供一种表达载体。 0015 本发明提供的表达载体，为将产生Os-npcR1RNA的基因。

11、插入pCAMBIA1300中，得到的表达Os-npcR1RNA的载体；所述Os-npcR1RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述产生Os-npcR1RNA的基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5末端第8-521核苷酸。在本发明的实施例中，表达载体为os-npcR1-1300，具体为将序列表中的序列1自5末端第 8-521位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba和Sac酶切位点间得到的载体。 0016 本发明的实验证明，本发明将水稻产生os-npcR1RNA的基因进行转基因过表达，得到转基因水稻，该转基因水稻的根系发育受到抑制，说明该基因能减少水稻的根系，但不影响其地上部分的生。

12、长发育。因此该基因可能应用在农作物密植相关的育种研究与生产中。附图说明 0017 图1为PCR扩增得到os-npcR1 0018 图2为转基因水稻的PCR鉴定 0019 图3为os-npcR1调控水稻根系发育具体实施方式 0020 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0021 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0022 实施例1、os-npcR1RNA编码基因的获得 0023 1、水稻总RNA的提取 0024 1）Trizol法提取： 0025 (1)取适量日本晴水稻（OSativa Lsppjaponica，varnipponba。

13、re，以下也称为野生型水稻；Loss of Function of OsDCL1 Affects MicroRNA Accumulation and Causes Developmental Defects in Rice,Plant Physiology,2005,V139(1)296-305；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）材料（0.1g）加入液氮研磨15min,至粉末状，将粉末倒入2mL离心管（约占1/2管），然后立即加入1mL Trizol试剂。将粉末与Trizol试剂混匀，在室温下孵育5min,以便核酸蛋白复合体完全解离。 0026 (2)将离心管于412000。

14、rpm离心15min。 0027 (3)将上清液转移到新的2mL离心管中，并向其中加入等体积0.5ml氯仿，手动剧烈振荡管体15s后，室温静至23min。 0028 (4)将离心管于412000rpm离心15min。 0029 (5)将上层的水相转移至新的离心管中，向其中加入等体积的异丙醇以沉淀RNA。混匀后，于20静置10min。 0030 (6)将离心管于412000rpm离心10min。说明书CN 102851280 A 3/6页 5 0031 (7)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，412000rpm离心 3min。 0032 (8)除去乙醇溶液，在超。

15、净台吹干。 0033 (9)加入20l不含RNA酶的水溶解沉淀，得到RNA溶液。 0034 2）RNA的纯化（除DNA） 0035 (1)将RNA溶液加水至39l，按下表加入其余试剂，混匀。 0036 0037 混合溶液于37反应40min。 0038 (2)向EP管内加入不含RNase的水450l，使总体积达到500l。 0039 (3)向其中加入500l水饱和酚，剧烈振荡，于412000rpm离心10min。 0040 (4)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈振荡，于412000rpm 离心10min。 0041 (5)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀。 0。

16、042 (6)向离心管中加入1/10V3M NaAc溶液（pH 5.2）,-70放置过夜。 0043 (7)于412000rpm离心10min。 0044 (8)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，412000rpm离心 3min。 0045 (9)除去乙醇溶液，在超净台吹干。 0046 (10)加入20l不含RNA酶的水溶解沉淀，得到总RNA。 0047 2、水稻RNA的反转录 0048 20l的反转录反应体系中加入总RNA5微克。 0049 (1)按照以下体积把试剂和溶液加入PCR小管内 0050 0051 (2)70加热5min后迅速冰浴2min。 0052 (3)。

17、向小管内按照以下体积加入试剂说明书CN 102851280 A 4/6页 6 0053 0054 (4)42反应1小时。 0055 (5)95加热5min，终止反转录反应，得到cDNA。 0056 3、os-npcR1编码基因的获取 0057 根据水稻基因组序列设计os-npcR1的特异引物P1和P2，引物序列如下： 0058 P1：ATCTAGAATGGTCTGGATTCGCCTCGTC 0059 P2：TGAGCTCTGCAGATGTACGCAGTACAGCCAAAGA 0060 以上面反转录得到的水稻cDNA为模板，扩增该基因，反应体系如下： 0061 0062 然后按照下列程序进。

18、行PCR扩增， 0063 0064 0065 PCR结果如图1所示，M：Marker；P：PCR扩增产物，得到528bp的PCR产物。 0066 将该PCR产物插入EZ-T载体（北京康润诚业生物科技有限公司）中，得到重组质粒 os-npcR1-EZ-T，经过测序，该质粒上的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列1所示的核苷酸，其中序列表中的序列1自5末端第8-521位核苷酸所示的基因命名为os-npcR1，该基因转录的RNA的核苷酸序列为序列表中的序列2，命名为os-npcR1。 0067 实施例2、转os-npcR1水稻的获得及功能鉴定 0068 一、转os-npcR1水稻的获得 006。

19、9 1、含有os-npcR1过量表达重组载体的构建说明书CN 102851280 A 5/6页 7 0070 将实施例1得到的质粒os-npcR1-EZ-T用Xba和Sac限制性内切酶消化 os-npcR1-EZ-T，回收约528bp的目的片断，同时用Xba和Sac限制性内切酶消化表达载体pCAMBIA1300（购自CAMBIA，澳大利亚），回收载体片断，然后将目的片断和载体片断连接，得到重组表达载体os-npcR1-1300，将该重组表达载体送去测序，结果该载体为将序列表中的序列1自5末端第8-521位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba和Sac酶切位点间得到的载体。 00。

20、71 2、转os-npcR1水稻的获得 0072 将上述重组表达载体os-npcR1-1300转入农杆菌AGL1（ATCC No.BAA-101，购自 ATCC）中，得到重组菌，提取该重组菌的质粒送去测序，该质粒为os-npcR1-1300，将含有该质粒的重组菌命名为AGL1/os-npcR1-1300。 0073 通过重组菌AGL1/os-npcR1-1300通过农杆菌介导的方法转化到日本晴水稻的愈伤中，培育，在潮霉素培养基上筛选抗性愈伤，得到T0代转os-npcR1水稻。 0074 3、转os-npcR1水稻的鉴定 0075 1）基因组DNA的提取 0076 （1）取一定量野生型水稻叶。

21、片，加入液氮，充分研磨后，将粉末倒入1.5ml离心管中； 0077 （2）待离心管中液氮挥发完全后，立即加入500ul DNA提取缓冲液（0.1mol/ LTrisHCl（pH 8.0），0.5mol/LNaCl，0.05mol/L EDTA，0.5%SDS），充分混匀后，65保温30 分钟，期间不断温和上下颠倒离心管，使样品与缓冲液充分混合； 0078 （3）以12,000rpm室温离心15分钟； 0079 （4）将上清液转移至另一离心管； 0080 （5）加入等体积tris-酚，抽提一遍； 0081 （6）再用等体积的氯仿抽提一遍； 0082 （7）取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心。

22、管，使异丙醇与上清液充分混匀，-20静置10分钟,以12,000rpm离心10分钟； 0083 （8）用70%的乙醇洗剂，DNA沉淀在超净工作台吹干后，用灭菌双蒸水溶解备用，得到基因组DNA。 0084 2）转基因水稻的PCR鉴定 0085 以上述提取T0代转os-npcR1水稻叶片的基因组DNA，然后用35S启动子的特异引物P3和os-npcR1的特异引物P2进行转基因植物的PCR鉴定。P3引物序列如下： 0086 P3：AACAGAACTCGCCGTAAAGACTG。 0087 结果如图2所示，1、2、3分别为T0代转os-npcR1水稻的PCR产物；+：PCR反应的正对照；-：以。

23、野生型水稻为模板的PCR反应负对照，得到1034bp的为阳性转基因植物，共得到20株阳性T0代转os-npcR1水稻。 0088 采用同样的方法将空载体pCAMBIA1300转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，采用上述引物进行鉴定，没有目的片段，说明为阳性T0代转空载体水稻。 0089 二、转os-npcR1水稻的获得及功能鉴定 0090 将阳性T0代转os-npcR1水稻、野生型水稻和T0代转空载体水稻分别播种后第15 天，观察根系；每个株系6株，实验重复三次，结果取平均值。说明书CN 102851280 A 6/6页 8 0091 结果如图3所示，阳性T0代转os-npcR。

24、1水稻根系（转基因水稻）明显弱于野生型水稻（对照），但并没有改变地上部分的生长状况。 0092 统计主根长度，阳性T0代转os-npcR1水稻的主根长度为5厘米； 0093 野生型水稻的主根长度为2.4厘米； 0094 野生型水稻和T0代转空载体水稻os-npcR1的结果无显著差异。 0095 上述结果说明水稻os-npcR1基因调控了水稻的根系发育，对于将来的转基因育种具有重要意义。说明书CN 102851280 A 1/2页 9 0001 0002 序列表CN 102851280 A 2/2页 10 序列表CN 102851280 A 10 1/1页 11 图1 图2 图3 说明书附图CN 102851280 A 11 。

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