《能促进文山红柱兰组培苗生长的丛赤壳科属真菌的分离与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《能促进文山红柱兰组培苗生长的丛赤壳科属真菌的分离与应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102876580 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 6 5 8 0 A *CN102876580A* (21)申请号 201010577761.5 (22)申请日 2010.12.08 CGMCC No.3929 2010.06.17 C12N 1/14(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人云南农业大学 地址 650201 云南省昆明市黑龙潭云南农业 大学 (72)发明人杨根华 李枝林 洪群艳 段春芳 陈思思 董文汉 (74)专利代理机构昆明今威专利商标代理有限 公司 53115 代理人刘明哲。
2、 (54) 发明名称 能促进文山红柱兰组培苗生长的丛赤壳科属 真菌的分离与应用 (57) 摘要 本发明涉及一种能促进文山红柱兰组培苗 生长的丛赤壳科属真菌的分离与应用，属于植物 保护和生物技术领域。其生产菌株为丛赤壳科 (Neonectriamacrodidyma spp.)属菌株，保藏号 CGMCC No.3929。发明的菌株具有能促进兰花组培 苗生长的显著特点。本发明将分离到的共生真菌 分两种方法接种到文山红柱兰组培幼苗中，用形 态学特征对分离菌株进行初步鉴定，结合分子生 物学如：ITS扩增、克隆测序等方法，鉴定出本次 筛选到能促进文山红柱兰组培苗生长的共生菌为 丛赤壳科(Neonectr。
3、ia macrodidyma spp.)属真 菌。本发明可以一定程度上解决兰科组培苗移栽 成活率低的问题，对今后兰花产业发展有积极的 促进作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1页 2 1.一种能促进文山红柱兰组培苗生长的共生真菌，其特征在于：该共生真菌菌株为丛 赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属，保藏号CGMCC No.3929。 2.权利要求1所述丛赤壳科(Neon。
4、ectria macrodidyma spp.)属菌株的培养方法，其 特征在于，将兰花根组织消毒完毕后，将部分组织捣碎，先观察有无菌丝团，如有菌丝团，将 兰花根切成薄片在水琼脂和PDA培养基上培养获得的，其水琼脂和PDA培养基配方如下： (1)水琼脂培养基配方：琼脂2.0； (2)PDA培养基配方：马铃薯20.0，葡萄糖2.0，琼脂2.0。 3.权利要求1所述的丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株在促进文山红 柱兰组培苗生长中的应用。 权 利 要 求 书CN 102876580 A 1/5页 3 能促进文山红柱兰组培苗生长的丛赤壳科属真菌的分离与 应用 技术。
5、领域 ： 0001 本发明是关于从兰花根中分离到的菌根菌对文山红柱兰组培苗生长有促进作用， 属于植物保护和生物技术领域。 背景技术 ： 0002 兰科(Orchidaceae)植物俗称兰花，全世界约有700属20000多种及大量变种，主 要分布于热带、亚热带和温带地区，尤其南美洲和亚洲的热带地区为多。兰科植物根据生长 环境的不同可分为地生兰、附生兰和腐生兰3类，作为一种重要的观赏花卉和药用植物资 源，在花卉和天然药物产业上有着巨大的经济价值和利用潜能。随着中药现代化和兰花产 业的快速发展，对兰科植物的需求迅速增长。但兰科植物种子细小，仅具未分化的原胚；根 粗大，根毛不发达。在自然条件下种子不能。
6、正常萌发，根也不能满足植物体对水分和营养物 质的需求，使兰科植物的人工栽培相当困难。近年来，组织快繁技术已应用于兰科植物，实 现了兰科植物的工厂化育苗，但组培苗移栽成活率很低，生长缓慢，很难大面积推广，其主 要原因在于兰花在短期内无法与相关的真菌形成菌根，菌根真菌对于兰科植物有着重要的 意义。研究表明，自然状态下只有真菌与兰科植物种子或根形成共生的菌根关系后，兰科植 物才能正常地萌发和生长发育。 0003 菌根是土壤中的一类真菌与植物根系之间所形成的互惠互利的共生联合体。1885 年Frank提出了“菌根(Mycorrhiza)”这一术语来描述植物与真菌的共生联合体，由此菌根 研究开始迅速发展。
7、。Link首先证实了兰科植物根中存在着真菌，之后，兰科植物与菌根关系 得到证实，并进行了广泛研究。1903年Bernard首次报道了真菌和兰科植物种子萌发的关 系。Burgeff对真菌和兰科种子研究得出，兰科种子在真菌的侵染下萌发，他分离并命名了 许多真菌，发展了消化真菌作为兰科植物生长营养来源的重要理论，之后国内外相继大量 开展了兰科菌根真菌与兰科植物之间的关系的研究。 0004 我国兰科植物菌根菌研究发展很快，天麻菌根菌已经成功地应用于天麻种子萌发 和人工栽培。但尚有很多兰科植物菌根菌需要研究，深入了解共生菌的种类及特点，探讨兰 科植物与真菌间的相互作用机制，筛选优良的兰科植物共生真菌，研。
8、制兰科菌剂，对于实现 兰科植物的工厂化生产具有重要的意义。 发明内容 ： 0005 本发明的主要目的是解决兰科组培苗移栽成活率低，筛选出有利于兰科植物生长 的共生菌。 0006 本发明采用的真菌是大理片丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属，建议 的分类命名：Neonectria macrodidyma。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2010年06月17日；保藏 登记入册的编号CGMCC No.3929。 说 明 书CN 102876580 A 2/5页 4 0007 本发明的真菌菌株丛赤壳。
9、科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株，分 离自兰花根内组织，经培养性状，形态学和分子鉴定，该菌株为丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属。该菌株具有以下特征：(1)该菌株在显微镜下可观察到菌丝无色， 多分枝；(2)该菌株能促进兰花组培苗的生长。 0008 本发明是这样实现的：分离兰花根内真菌，对分离到的真菌进行形态鉴定，并对其 进行兰花组培苗的接种筛选有效共生真菌，对有效菌株进行ITS区段克隆测序。 0009 本发明丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属的分离鉴定方法： 0010 1、菌根菌的分离和纯化 。
10、0011 PDA固体培养基配方为：20马铃薯，2葡萄糖，2琼脂粉。 0012 从兰花植株上取下健壮根段，冲洗干净，放入烧杯内待用。在进行好灭菌和消毒处 理的超净工作台上，将烧杯内的根段用70酒精消毒30s，再用0.1升汞溶液浸泡1min， 最后用无菌水清洗3-5遍。将根切成小片，干燥，放入PDA培养基中。24恒温黑暗培养。 当从根段周围长出菌丝后，挑出菌丝转移到另一培养皿内，待菌落长成后，重复取菌落边缘 部分进行转接纯化。 0013 2、分离菌株的形态学鉴定 0014 将纯化后的菌株在25的恒温下培养5-7天，用镊子或解剖针在菌落边缘取少量 菌丝放在载玻片上，用3的KOH溶液和0.05番红染液。
11、染色做成玻片，通过显微镜观察其 形态特征，初步鉴定分离菌株所属。 0015 3、分离菌株的分子鉴定 0016 3.1DNA的提取 0017 将菌丝接种于液体PDA中，在25条件放置于摇床上培养10天，用吸水纸吸干菌 丝水分称取重量，转入预冷的研钵内，用液氮将其充分研磨至粉末状，加入1mlDAN提取缓 冲液(100mM Tris-HCL PH8.0；100mM EDTA；250mM NaCl)、20SDS、5M NaCl、10CTAB，充 分混匀，在60条件下保温60分钟，10,000rpm离心5分钟取上清液，加入等体积的饱和 酚，离心取上清液，加入等体积的25241的饱和酚氯仿异戊醇，离心取上。
12、清液，加 入等体积的241的氯仿异戊醇震荡混合，离心取上清液，加2倍体积的冰无水乙醇置 于-20冰箱，沉淀DAN，离心，保留沉淀，并用70冰乙醇漂洗2次，自然风干或真空干燥， 加入TE缓冲液溶解DAN，置于-30待用。 0018 3.2分离菌株的5.8S rDNA-ITS克隆与测序 0019 用ITS1和ITS4引物进行DNA扩增。扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行， PCR反应体系为50uL。如下PCR循环：94预变性3min，循环1次；94变性1min，51退 火1min，72延伸1min，30次循环；最后72延伸10min。PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳 检测。PCR扩增产物。
13、用大连宝生物提供的试剂盒进行纯化，纯化产物可直接测序、备用。质 粒载体pGEM-T-easy与PCR纯化产物连接反应、转化，经红-白斑筛选后经重组质粒PCR，最 后选取阳性的重组子送上海生工进行DNA测序。 0020 3.3序列分析 0021 利用Bioxm、DNAMAN和BLAST等软件分析，与GenBank中登陆的已知序列进行同源 性比较。 0022 本发明丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属真菌促进文山红柱兰组培苗 说 明 书CN 102876580 A 3/5页 5 生长试验 0023 1、试验材料准备 0024 取土质较好的土壤，灭菌；选择文山红竹兰组。
14、培苗为供试材料，与兰花根材料中分 离的真菌进行接种实验。 0025 2、试验方法 0026 2.1拌土接种，把培养好的菌株接种到种有文山红柱兰组培苗的土中，进行共生培 养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，重复接种3次，2个月后观察兰花苗的叶色，长 势，根系生长情况，筛选出有效菌。 0027 2.2用分离的菌株侵染文山红柱兰组培苗根，保湿接种后一周后把兰花苗种于灭 菌土中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，重复接种3次，2个月后观察 兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效菌。 0028 3、试验结果 0029 表1丛赤壳科(Neonectria macrodidyma sp。
15、p.)属菌株与文山红柱兰组培苗共生 培养情况 0030 0031 从表1可以看出丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株接种的文山红 柱兰组培苗成活率较高，拌土接种和菌株侵根的平均成活率达到了89.17和87.78。对 组培苗移栽成活率起比较明显的促进作用。 0032 2个月后，经筛选，发现丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株接种 的文山红柱兰组培苗的叶色和长势都明显要比对照的好，兰苗叶色较绿，根系发达，长势良 好，筛选出有利于兰科植物生长的共生菌。 附图说明 0033 图1是丛赤壳科(Neonectria macrodidy。
16、ma spp.)属菌株在PDA培养基上的培养 性状图； 0034 图2是丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株接种到种有文山红柱兰 组培苗土中的接种效果与对照图； 0035 图3是丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株侵染文山红柱兰组培苗 根的接种效果图； 0036 图4是丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属菌株侵染文山红柱兰组培苗 根的接种对照图。 说 明 书CN 102876580 A 4/5页 6 具体实施方式 ： 0037 共生菌的分离： 0038 PDA固体培养基配方为：20马铃薯，2。
17、葡萄糖，2琼脂粉。 0039 从兰花植株上取下健壮根段，冲洗干净，放入烧杯内待用。在进行好灭菌和消毒处 理的超净工作台上，将烧杯内的根段用70酒精消毒30s，再用0.1升汞溶液浸泡1min， 最后用无菌水清洗3-5遍。将根切成小片，干燥，放入PDA培养基中。PDA固体培养基配方 为：20马铃薯，2葡萄糖，2琼脂粉。24恒温黑暗培养，当从根段周围长出菌丝后，挑 出菌丝转移到另一培养皿内，待菌落长成后，重复取菌落边缘部分进行转接纯化。 0040 分离菌株的形态鉴定：将纯化后的菌株在25的恒温下培养5-7天，用镊子或解 剖针在菌落边缘取少量菌丝放在载玻片上，用3的KOH溶液和0.05番红染液染色做成。
18、 玻片，通过显微镜观察其形态特征，初步鉴定分离菌株所属。 0041 有效菌株的筛选： 0042 把培养好的菌株接种到种有文山红柱兰组培苗的土中，进行共生培养，并以不接 菌的土所种的兰花作为对照，2个月后观察兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效 菌； 0043 用分离的菌株侵染文山红柱兰组培苗根，保湿接种后一周后把兰花苗种于灭菌土 中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，2个月后观察兰花苗的叶色，长 势，根系生长情况，筛选出有效菌。 0044 菌株的分子鉴定： 0045 分离菌株DNA的提取：将菌丝接种于液体PDA中，在25条件放置于摇床上培养 10天，用吸水纸吸干菌丝水分称。
19、取重量，转入预冷的研钵内，用液氮将其充分研磨至粉末 状，加入1mlDAN提取缓冲液(100mM Tris-HCL PH8.0；100mM EDTA；250mM NaCl)、20SDS、 5M NaCl、10CTAB，充分混匀，在60条件下保温60分钟，10,000rpm离心5分钟取上清 液，加入等体积的饱和酚，离心取上清液，加入等体积的25241的饱和酚氯仿异 戊醇，离心取上清液，加入等体积的241的氯仿异戊醇震荡混合，离心取上清液，加2 倍体积的冰无水乙醇置于-20冰箱，沉淀DAN，离心，保留沉淀，并用70冰乙醇漂洗2次， 自然风干或真空干燥，加入TE缓冲液溶解DAN，置于-30待用。 00。
20、46 分离菌株的5.8S rDNA-ITS克隆与测序：用ITS1和ITS4引物进行DNA扩增。扩 增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，PCR反应体系为50uL。如下PCR循环：94预变性 3min，循环1次；94变性1min，51退火1min，72延伸1min，30次循环；最后 72延伸 10min。PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物用大连宝生物提供的试剂盒进 行纯化，纯化产物可直接测序、备用。质粒载体pGEM-T-easy与PCR纯化产物连接反应、转 化，经红-白斑筛选后经重组质粒PCR，最后选取阳性的重组子送上海生工进行DNA测序。 所测序列为： 0047 TCC。
21、GTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTAT TTGTTGCCTCGGCGGTGCCTGTTCCGACAGCCCGCCAGAGGACCCCAAACCCTGATTACATTTAAGAAGTCTTCTGA GTAAACCGATTAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTAGTATTCTGGC。
22、 说 明 书CN 102876580 A 5/5页 7 GGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGCTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCTCCGCGCCC GCCGTCCCCTAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCTTCCTCTGCGTAGTAGCACACCTCGCACTGGGAAACAGCGC GGCCACGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAACGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT CAATAAGCGGAGGA 0048 利用Bioxm、DNAMAN和BLAST等软件分析，与GenBank中登陆的已知序列进行同源 性比较。经比对，该分离菌株属于丛赤壳科(Neonectria macrodidyma spp.)属真菌。即 得本发明共生真菌菌株。 说 明 书CN 102876580 A 1/1页 8 0001 序 列 表CN 102876580 A 1/2页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102876580 A 2/2页 10 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102876580 A 10 。