《狼毒不定根的诱导及组织培养的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《狼毒不定根的诱导及组织培养的方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102870672 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 0 6 7 2 A *CN102870672A* (21)申请号 201110193279.6 (22)申请日 2011.07.12 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人中国林业科学研究院林业研究所 地址 100091 北京市海淀区东小府2号 (72)发明人邱德有 刘洪伟 杨艳芳 张楠 (54) 发明名称 狼毒不定根的诱导及组织培养的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的诱导及组织培养的方法， 属于细胞工。
2、程技术领域。包括(1)种子的萌发： 狼毒种子经HgCl 2 消毒后置于MS固体培养基上， 于光照下萌发；(2)愈伤组织的诱导：将步骤(1) 获得的小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、 6-苄氨基腺嘌呤和椰子汁的MS固体培养基上，于 无菌避光条件下诱导形成愈伤组织；(3)不定根 的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织置于含吲哚 丁酸和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条 件下诱导形成不定根；(4)不定根的培养：将步骤 (3)获得的不定根置于含有吲哚丁酸的MS固体培 养基上培养。本发明方法简单、有效物质含量高。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (19)中华人民共和国。
3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1页 2 1.一种狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的诱导及组织培养的方法，其特征在 于，包括以下具体步骤： (1)狼毒无菌小苗的获得：取狼毒的种子置于MS固体培养基上，于光照培养条件下萌 发成无菌小苗； (2)狼毒愈伤组织的诱导：具体为取步骤(1)获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置于含 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调节剂 和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成愈伤组织； (3)狼毒不定根的诱导：取步骤(2。
4、)获得的狼毒愈伤组织置于含吲哚丁酸和椰子汁的 MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根； (4)狼毒不定根的培养：取步骤(3)获得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固体培 养基上，于无菌避光条件下培养。 2.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中 所述的小苗为诱导自野生狼毒植物的种子。 3.根据权利要求2所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中 所述的愈伤组织，是指源于狼毒无菌小苗的愈伤组织。 4.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中 所述的培养基，是指不含任何植物生长调节剂的MS固体培。
5、养基。 5.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中 所述的光照培养条件下，是指于24-26、3000勒克斯(lux)光照强度的条件下诱导25-30 天。 6.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中 所述的培养基，是指含有0.2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1-1mg/L萘乙酸(NAA)、 0.02-0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2-3ml/L椰子汁的MS固体培养基。 7.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(3)中 所述的培养基，是指含有5-20m。
6、g/L吲哚丁酸和1-2ml/L椰子汁的MS固体培养基。 8.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(4)中 所述的培养基，是指含有1-2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基。 9.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)、 步骤(3)、步骤(4)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26无菌避光条件下培养25-30 天。 权 利 要 求 书CN 102870672 A 1/3页 3 狼毒不定根的诱导及组织培养的方法 技术领域 0001 本发明涉及的是一种细胞工程技术领域的方法，特别是涉及一种狼毒不定根的诱 导及组织培养的方法。 背景技术。
7、 0002 狼毒是我国特有的、贵重中药材之一，含杀虫、杀菌及抗癌等多种生物活性物质。 二萜类化合物Prostratin(图1)最早由Cashmore等人从新西兰植物稻花一种(Pimelea prostrata)中分离得到。近年来，人们在太平洋岛国萨摩亚的Mamala树Homalanthus nutans中也分离到了该二萜类化合物并且发现Prostratin能够激活潜伏的HIV病毒，表现 出良好的抗HIV的活性，有望开发成一种新药，但人们经研究发现Mamala树资源很少，其中 的Prostratin的含量很低。我国的学者发现狼毒(Euphorbia fischeriana)的根中也含 有Pros。
8、tratin，但其Prostratin的含量也很低。由于狼毒大戟的生长受地理条件的限制， 资源十分有限，导致药材供不应求，不能满足医药市场的需求。为解决资源紧缺的问题，研 究生物技术培养狼毒的方法成为当务之急。规模化药用植物组织培养可以解决以上问题， 通过组织培养方法可以获得有效成分含量高、生产周期短的狼毒组织培养物，从而代替野 生或人工土地栽培的狼毒，既可解决占地问题，又可解决狼毒药材的资源问题，具有重要的 经济价值、生态效益和社会效益。 0003 不定根培养是上世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。不定根是一种分化 的植物器官，是由植物的愈伤组织诱导而来。和悬浮培养细胞相比较，药用植物的。
9、不定根其 有效成分含量很稳定；和大田人工栽培的植物相比，不仅有效成分含量高而稳定，而且不定 根培养不受气候、土地等因素的影响，可以周年大规模生产，适合于药用植物尤其是狼毒这 种根类药材的组织培养和规模化生产，以获得狼毒药材的替代物或生产其主要有效成分。 0004 经对现有文献的检索发现，目前除戴传超等人进行了药用植物京大戟(Euphorbia pekinensis)悬浮细胞培养的研究外(见：戴传超、余伯阳、薛菲、蒋继宏，药用植物大 戟悬浮细胞的培养，南京林业大学学报(自然科学版)，2005，29(2)：57-60)，尚无狼毒 (Euphorbia fischeriana)细胞、组织培养和生产方。
10、法的文献报道，也未见有涉及狼毒 (Euphorbia fischeriana)不定根诱导及不定根培养体系建立的文献报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于针对狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根细胞工程生产技 术，提供一种狼毒不定根的诱导及组织培养的方法。使其来自于自大田栽培狼毒植物的种 子的无菌小苗在愈伤组织诱导基上诱导形成愈伤组织，并使狼毒愈伤组织在不定根诱导培 养基上诱导形成不定根，形成一种规模大、周期短、质量可控、成本低的不定根生产方法。 0006 本发明是通过下述技术方案实现的，包括如下具体步骤： 0007 (1)狼毒无菌小苗的获得：取野生狼毒植株的种子置于M。
11、S固体培养基上，于光照 培养条件下萌发成无菌小苗； 说 明 书CN 102870672 A 2/3页 4 0008 (2)狼毒愈伤组织的诱导：具体为取步骤(1)获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置 于含2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调 节剂和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成愈伤组织； 0009 (3)狼毒不定根的诱导：取步骤(2)获得的狼毒愈伤组织置于含吲哚丁酸和椰子 汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根； 0010 (4)狼毒不定根的培养：取步骤(3)获得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固 体培养基。
12、上，于无菌避光条件下培养。 0011 步骤(1)中所述的小苗为诱导自野生狼毒植株的种子。 0012 步骤(2)中所述的愈伤组织，是指源于无菌小苗的愈伤组织。 0013 步骤(1)中所述的培养基，是指不含任何植物生长调节剂的MS固体培养基。 0014 步骤(1)中所述的光照培养条件下，是指于24-26、3000勒克斯(lux)光照强度 的条件下诱导25-30天。 0015 步骤(2)中所述的培养基，是指含有0.2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、 0.1-1mg/L萘乙酸(NAA)、0.02-0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2-3ml/L椰子汁的MS 固体培养基。 。
13、0016 步骤(2)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26无菌避光条件下诱导25-30 天。 0017 步骤(3)中所述的培养基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和1-2ml/L椰子汁的MS 固体培养基。 0018 步骤(3)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26无菌避光条件下诱导25-30 天。 0019 步骤(4)中所述的培养基，是指含有1-2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基。 0020 步骤(4)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26无菌避光条件下诱导25-30 天。 0021 本发明方法简便、效率高，来源于狼毒无菌小苗愈伤组织不定根的诱导率在 90.0以上，狼毒有效物质prost。
14、ratin含量高，建立了完善的不定根培养体系。 附图说明 0022 图1为狼毒有效物质prostratin的化学结构图。 0023 图2为prostratin标准品的高效液相色谱图。 0024 图3为狼毒不定根样品的高效液相色谱图。 0025 图4为狼毒不定根样品加prostratin标准品后的高效液相色谱图。 具体实施方式 0026 实施例1：狼毒种子的萌发 0027 取野生狼毒植株的种子，经0.2HgCl 2 消毒12分钟、用无菌水冲洗3遍后置于不 含任何植物生长调节剂的MS固体培养基上，于26、3000勒克司(lux)光照条件下培养25 天，即可萌发成小苗。 0028 实施效果：狼毒种子。
15、的萌发率达5.0，所萌发成的无菌小苗具有完整的根、茎、 说 明 书CN 102870672 A 3/3页 5 叶，生长正常。 0029 实施例2：狼毒愈伤组织的诱导 0030 将实施例1获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置于含1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D)，0.5mg/L萘乙酸，0.1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调节剂和3ml/L椰 子汁的MS固体培养基上，于24-26无菌避光条件下诱导25天，即得到狼毒的愈伤组织。 0031 实施效果：狼毒愈伤组织诱导率达80.0。2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，萘乙酸， 6-苄氨基腺嘌呤这三种植物生长调节剂和椰子汁的共。
16、同作用促进了愈伤组织的形成和生 长。 0032 实施例3：狼毒不定根的诱导 0033 将实施例2获得的狼毒愈伤组织置于含10mg/L吲哚丁酸这种植物生长调节剂和 2ml/L椰子汁的MS固体培养基上，于24-26无菌避光条件诱导培养25天，即得到狼毒的 不定根。 0034 实施效果：不定根诱导率达90.0，不定根细、短，并侧向分生出细、短的不定根， 不定根发生轻微的愈伤化。 0035 实施例4：狼毒不定根固体培养体系的建立 0036 将实施例3获得的狼毒不定根从其母体愈伤组织上分离，将分离到的不定根置于 含有2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基上，于24-26无菌避光条件诱导培养25天，即得到 大量的狼毒的不定根。 0037 实施效果：建立了不定根的体外固体培养体系，侧向分生出大量细长的不定根。经 高效液相色谱仪分析，所得狼毒不定根中有效物质prostratin的含量为42.21g/g干重。 说 明 书CN 102870672 A 1/2页 6 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102870672 A 2/2页 7 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102870672 A 。