对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物.pdf

本发明涉及编码从属于亚科聚球藻亚科的细菌获得的编码羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC？1.13.11.27，本文中缩写为HPPD)的核酸序列以及由其编码的蛋白，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白或嵌合基因用于获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。

权利要求书包含与可在植物中表达的启动子有效连接的编码序列的嵌合基因，其特征在于，所述编码序列包含编码聚球藻亚科羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)蛋白质或与聚球藻亚科HPPD蛋白质具有至少75％序列同一性的蛋白质的核酸序列。根据权利要求1的嵌合基因，其特征在于，HPPD蛋白质是聚球藻属物种HPPD蛋白质或与聚球藻属物种HPPD蛋白质具有至少75％序列同一性的蛋白质。权利要求1或2的嵌合基因，其中编码所述蛋白质的DNA可通过使用至少20个核苷酸的引物或探针从聚球藻属DNA获得，所述引物或探针与SEQ ID No.1的DNA杂交。根据权利要求1至3中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码包含SEQ ID No.4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列的HPPD蛋白质，或者与SEQ ID No.4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的蛋白质。根据权利要求1至4中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其编码HPPD蛋白质序列，并且包含SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的核苷酸序列，或者是在严格杂交条件下与此类序列杂交的DNA。根据权利要求1至5中任意一项所述的嵌合基因，其特征在于，其在HPPD编码序列的下游包含编码在植物中具有活性的转运肽的核酸序列，使得转运肽/HPPD融合蛋白被所述嵌合基因编码。包含根据权利要求1至6中任意一项所述的至少一种嵌合基因的载体。植物细胞、植物部分、植物或种子，其特征在于其包含根据权利要求1至7中任意一项所述的嵌合基因。权利要求8的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含编码PDH酶的嵌合基因。权利要求8或9的植物细胞、植物部分、植物或种子，其还包含赋予对生长调控因子，优选对2，4‑D或麦草畏，和/或对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草剂的耐受性的一种或多种嵌合基因。获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的方法，其特征在于，将根据权利要求1至6之一的嵌合基因引入所述植物。用于在区域或田间控制杂草的方法，所述区域或田间含有根据权利要求8、9或10的植物或种子，或者待栽种权利要求8、9或10的植物或种子，所述方法包括向所述区域或田间应用对所述杂草来说是毒性的并且不显著影响根据权利要求8、9或10的种子或植物的剂量的HPPD抑制剂型除草剂，。根据权利要求12的用于控制杂草的方法，其特征在于，所述HPPD抑制剂选自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑CF3苯基)丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑2，3Cl2苯基)丙‑1，3‑二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和苄草唑。用于获得油或膳食的方法，所述方法包括种植根据权利要求8、9或10的植物，任选地，用HPPD抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒，以及碾磨种粒，以制造膳食，以及任选地，提取油。聚球藻亚科HPPD或者与聚球藻亚科HPPD具有至少75％序列同一性的HPPD用于使得植物对HPPD抑制剂型除草剂耐受的用途。权利要求15的用途，其中所述HPPD抑制剂型除草剂选自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑CF3苯基)丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑2，3 Cl2苯基)丙‑1，3‑二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌、二酮腈和苄草唑。

说明书对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物
导言
本发明涉及编码从属于亚科聚球藻亚科(Synechococcoideae)的细菌获得的羟苯基丙酮酸双加氧酶(EC 1.13.11.27，本文中缩写为HPPD)的核酸序列，以及由其编码的蛋白质，还涉及包含此类核酸序列的嵌合基因，还涉及此类核酸序列、蛋白质或嵌合基因用于获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。
发明背景
HPPD是催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸(本文中缩写为HPP)转化为尿黑酸(本文中缩写为HG)的反应的酶，尿黑酸是植物中生育酚和质体醌的前体(Crouch N.P.等人(1997)Tetrahedron，53，20，6993‑7010，Fritze等人，(2004)，Plant Physiology 134：1388‑1400)。生育酚作为膜连结的抗氧化剂发挥作用。质体醌首先作为PSII和细胞色素b6/f复合体之间的电子载体发挥作用，其次，其是八氢番茄红素不饱和酶(参与类胡萝卜素的生物合成)的氧化还原辅因子。
迄今为止，NCBI数据库中存在的超过700条来自多种生物的核酸序列被注释为编码具有HPPD结构域的推定蛋白质，包括UniProtKB/TrEMBL数据库中给出的Q2JX04或Q2JPN8检录号下以及NCBI蛋白质数据库中分别给出的YP_473959和YP_476507检录号下公开的序列。但对那些中的大多数(包括对应于检录号Q2JX04/YP_473959或Q2JPN8/YP476507的序列)而言，尚未在体外检验或植物内手段中证明源自此类序列的蛋白质具有HPPD酶促活性，也没有证明此类HPPD蛋白在植物中表达时可赋予针对HPPD抑制剂型除草剂的除草剂耐受性。在本领域范畴内已经描述了若干HPPD蛋白及其一级序列，特别是细菌(例如假单胞菌属(Rüetschi等人，Eur.J.Biochem.，205，459‑466，1992，WO 96/38567))、植物(例如拟南芥属(WO 96/38567，Genebank AF047834)、胡萝卜(WO 96/38567，Genebank 87257)、燕麦(Avena sativa)(WO 02/046387)、小麦(WO 02/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla)(WO 02/046387)、蒺藜草(Cenchrus echinatus)(WO02/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum)(WO 02/046387)、苇叶羊茅(Festuca arundinacea)(WO 02/046387)、狗尾草(Setaria faberi)(WO 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica)(WO 02/046387)、高粱属(Sorghum)(WO 02/046387)、球孢子菌属(Coccicoides)(Genebank COITRP)、日本黄连(Coptis japonica)(WO 06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(ES 2275365))或哺乳动物(例如小鼠或猪)的HPPD蛋白。指出的参考文献中公开的相应序列通过引用并入本文。
大多数植物通过arrogenate合成酪氨酸(Abou‑Zeid等人(1995)，Applied Env Microb 41：1298‑1302；Bonner等人，(1995)，Plant Cells Physiol.36，1013‑1022；Byng等人，(1981)，Phytochemistry 6：1289‑1292；Connely and Conn(1986)，Z.Naturforsch 41c：69‑78；Gaines等人，(1982)，Plants 156：233‑240)。在这些植物中，HPP仅源于酪氨酸的降解。另一方面，在例如酿酒酵母的酵母或大肠杆菌的细菌等的生物中，HPP是酪氨酸前体，并且通过预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase，下文中称为PDH)的作用(将预苯酸转化为HPP)来合成(Lingens等人，(1967)European J.Biochem 1：363‑374；Sampathkumar and Morrisson(1982)，Bioch Biophys Acta 701：204‑211)。在这些生物中，HPP的生产因此直接与芳香族氨基酸生物合成途径(莽草酸途径)相关联，而不与酪氨酸降解途径相关联。
对HPPD的抑制导致光合作用的解偶联，缺乏辅助捕光色素(accessory light‑harvesting pigments)，以及最重要地，由于缺少正常情况下由类胡萝卜素提供的光保护导致的UV照射和活性氧类别对叶绿体的破坏(褪色)(Norris等人(1995)，Plant Cell 7：2139‑2149)。光合活性组织的褪色导致生长抑制和植物死亡。
已证明，抑制HPPD并且与该酶特异性结合以抑制HPP向尿黑酸的转化的一些分子是非常有效的选择性除草剂。
目前，大多数可商业获得的HPPD抑制剂型除草剂属于这四个化学家族之一：
1)三酮类，例如，磺草酮[即2‑[2‑氯‑4‑(甲基磺酰基)苯甲酰基]‑1，3‑环己二酮]，甲基磺草酮[即2‑[4‑(甲基磺酰基)‑2‑硝基苯甲酰基]‑1，3‑环己二酮]；环磺酮(tembotrione)[即2‑[2‑氯‑4‑(甲基磺酰基)‑3‑[(2，2，2，‑三‑氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]‑1，3‑环‑己二酮]；庄无忌(tefuryltrione)[即2‑[2‑氯‑4‑(甲基磺酰基)‑3‑[[(四氢‑2‑呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]‑1，3‑环己二酮]]；bicyclopyrone[即4‑羟基‑3‑[[2‑[(2‑甲氧基乙氧基)甲基]‑6‑(三氟甲基)‑3‑吡啶基]羰基]二环[3.2.1]辛‑3‑烯‑2‑酮]；双环磺草酮(Benzobicyclon)[即3‑(2‑氯‑4‑甲磺酰基苯甲酰基)‑2‑苯基硫代二环[3.2.1]辛‑2‑烯‑4‑酮]
2)二酮腈类，例如2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑甲基磺酰基‑4‑三氟甲基苯基)‑丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑1‑[4‑(甲基磺酰基)‑2‑三氟甲基苯基]‑3‑(1‑甲基环丙基)丙‑1，3‑二酮；
3)异唑类，例如异氟草[即(5‑环丙基‑4‑异唑基)[2‑(甲基磺酰基)‑4‑(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，异氟草被快速代谢为DKN(展示出HPPD抑制剂性质的二酮腈类化合物)；和
4)pyrazolinate，例如苯吡唑草酮(topramezone)[即[3‑(4，5‑二氢‑3‑异唑基)‑2‑甲基‑4‑(甲基磺酰基)苯基](5‑羟基‑1‑甲基‑1H‑吡唑‑4‑基)甲酮]和pyrasulfotole[(5‑羟基‑1，3‑二甲基吡唑‑4‑基(2‑甲磺酰基‑4‑三氟甲基苯基(trifluaromethylphenyl))甲酮]；pyrazofen[2‑[4‑(2，4‑二氯苯甲酰基)‑1，3‑二甲基吡唑‑5‑基氧]苯乙酮]。
这些抑制HPPD的除草剂可在展现出代谢耐受性的作物植物(例如玉米(Zea mays)，它们在其中被迅速降解)中使用以抵挡草(grass)和/或阔叶杂草(Schulz等人，(1993).FEBS letters，318，162‑166；Mitchell等人，(2001)Pest Management Science，Vol 57，120‑128；Garcia等人，(2000)Biochem.，39，7501‑7507；Pallett等人，(2001)Pest Management Science，Vol 57，133‑142)。为拓展这些抑制HPPD的除草剂的范围，进行了若干努力，以向植物(特别是没有代谢耐受性或代谢耐受性运作欠佳的植物)赋予在农艺学田间条件下可接受的耐受性水平。
除了分流HPPD介导的尿黑酸生产(US 6,812,010)的尝试之外，还已过表达敏感型(sensitive)酶，以在植物中以相对除草剂来说足够的量生产靶标酶(WO96/38567)。HPPD的过表达导致对异氟草(IFT)的二酮腈类衍生物(DKN)的更好的出苗前(pre‑emergence)耐受性，但是就针对出苗后处理的耐受性而言，耐受性是不足的(Matringe等人，(2005)，Pest Management Science 61：269‑276)。
第三种策略是突变HPPD，以获得下述靶标酶，其保留有其催化HPP转化为尿黑酸的性质，同时对HPPD抑制剂不如突变前的天然HPPD敏感。
该策略已成功应用于生产对2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑甲基磺酰基‑4‑三氟甲基苯基)‑丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑1‑[4‑(甲基磺酰基)‑2‑三氟甲基苯基]‑3‑(1‑甲基环丙基)丙‑1，3‑二酮(属于二酮腈类家族的两种抑制HPPD的除草剂(WO 99/24585))耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile和更特别地Gly336Trp(突变的氨基酸的位置是参照假单胞菌属HPPD示出的)被鉴定为负责于针对用这些二酮腈类除草剂进行的出苗前处理的增加的耐受性的突变，并且它们不造成酶活性的变化。
更近来地，将假单胞菌属HPPD基因引入烟草和大豆的质体基因组已显示出比核转化更为有效，其甚至赋予了针对异氟草的出苗后应用的耐受性(Dufourmantel等人，2007，Plant Biotechnol J.5(1)：118‑33)。
在WO 04/024928中，发明人已寻求通过增加HPP前体进入这些植物的细胞的通量来增加异戊二烯基醌(prenylquinone)在植物细胞中的生物合成(例如质体醌、生物酚的合成)。这已经通过PDH酶的过表达将所述前体的合成与“莽草酸”途径关联来进行了。他们还提到，用编码PDH酶的基因转化植物使得增加所述植物对HPPD抑制剂的耐受性成为可能。
在专利申请WO 2009/144079中，公开了编码在荧光假单胞菌的HPPD蛋白的第336位突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列及其用于获得对HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物的用途。
在WO 2002/046387中，已经鉴定：来自植物的HPPD蛋白的若干结构域与赋予对多种HPPD抑制剂型除草剂的耐受性相关，但是既没有显示植物内数据也没有显示生物化学数据来验证所描述的结构域功能的影响。
在WO 2008/150473中，示例了两种不同的耐受性机制——经修饰的编码突变体HPPD酶的燕麦基因和CYP450玉蜀黍单加氧酶(nsf1基因)的组合，以获得改进的针对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性，但是没有公开证实基于两种蛋白质的组合的协同效果的数据。
尽管开发显示出针对上文所述的若干HPPD抑制剂型除草剂耐受的植物获得了成功，但仍需要开发和/或改进植物对较新的或对若干不同的HPPD抑制剂的耐受性，特别是对属于三酮类(例如磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、双环磺草酮和bicyclopyrone)和pyrazolinate(例如，苯吡唑草酮和pyrasulfotole)的类别的HPPD抑制剂的耐受性。
发明描述
本发明因此涉及转基因植物的生产，所述转基因植物含有编码可从或从属于聚球藻亚科的生物获得的HPPD蛋白质的基因及其变体或突变体，更尤其涉及来自属于聚球藻属(Synechococcus)的生物的编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPPD酶的基因，以及其变体或突变体，并且所述植物较之含此类HPPD编码转基因的植物而言对HPPD抑制剂更不敏感。
更具体地，本发明因此涉及对下述转基因植物的生产，所述转基因植物含有可从或从属于聚球藻亚科的生物(尤其是聚球藻属(Synechococcus)，更尤其是从聚球藻属物种，甚至更尤其从如(i)JA‑3‑3Ab；Cyanobacteria bacterium Yellowstone A‑Prime或(ii)JA‑2‑3B′a(2‑13)，Cyanobacteria bacterium Yellowstone B‑Prime给出的任何菌株获得的)获得的、编码展示出能催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质的HPPD酶的基因，其变体或突变体，并且所述植物较之不含任何此类HPPD转基因的植物而言对HPPD抑制剂更不敏感。来自聚球藻亚科的编码HPPD蛋白质的基因被选为优秀的HPPD抑制剂耐受的候选者，这是因为它们较之敏感的拟南芥属HPPD蛋白质(被用作为对HPPD抑制剂敏感的参照分子)而言在与HPPD抑制剂耐受性相关的位置上的氨基酸组成上具有高分歧性，这是在HPPD蛋白质中以实验和结构方式测定的。
在一种实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质。
在另一种实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质，并且其中SEQ ID No.4的第145位至第350位的任何氨基酸可改为任何天然存在的氨基酸，优选地，其可以是任何保守取代。
在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质，并且其在括号给出的其编号(相对于SEQ ID No.4的编号)所定义的位置上具有下述氨基酸中的一个或多个，即，His(143)、Ser(183)、Asn(198)、Gln(220)、His(221)、Tyr(250)、Gln(299)、Phe(312)、Glu(314)、Gly(326)和Asn(329)。
在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6或7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质，并且在表(i)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表(i)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。
表(i)：

在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6、7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质，并且在表(ii)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表(ii)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。
表(ii)：

在另一实施方式中，本发明涉及本文中命名为“本发明的HPPD蛋白质”或“聚球藻属HPPD蛋白质”的HPPD蛋白质，其是与SEQ ID No.4在2至350位氨基酸上的氨基酸序列(特别是与SEQ ID Nos.4、5、6、7中任一的氨基酸序列，优选SEQ ID No.6)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的HPPD蛋白质，并且在表(iii)的第二列给出的各位置上，原来出现的氨基酸可被表(iii)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。
表(iii)

这包括具有较之SEQ ID No.4在第2位氨基酸至第350位氨基酸的序列具有取代、缺失或添加的氨基酸的蛋白质，例如转运肽融合蛋白，或者在SEQ ID No.4的序列中具有氨基酸改变的蛋白质，所述蛋白质保留了HPPD蛋白的酶活性，并且当在植物中表达时仍赋予HPPD耐受性，优选是与SEQ ID No.4的蛋白质所赋予的范围相当的HPPD耐受性。这包括源于SEQ ID No.4的蛋白质的变体或突变体蛋白，例如SEQ ID NOs：5、6或7的蛋白质中的任何，特别是较之宿主植物内源HPPD而言对异唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPPD抑制剂型除草剂较不敏感的突变体或变体，优选是下述突变体或变体，当向表达其的宿主植物应用异唑类、二酮腈类、三酮类和/或pyrazolinate的类别的HPPD抑制剂型除草剂(特别是甲基磺草酮、环磺酮、异氟草或bicyclopyrone中的任何一种)时，更特别是当出苗后应用时，其向所述宿主植物赋予农艺学相关的除草剂耐受性。这还包括包含SEQ ID NO：4的序列的活性部分的蛋白质，当在植物中表达时所述部分赋予HPPD抑制剂耐受性。这包括与SEQ ID NO：4的序列具有基本相同的氨基酸序列的蛋白质，例如具有SEQ ID NO.4至7中任一的氨基酸序列的蛋白质。这包括下文定义的经分离的蛋白质，以及还有下述蛋白质，例如SEQ ID NO：4的蛋白质，其中某些氨基酸已经被下文定义的相似氨基酸替代，优选地，被保守氨基酸取代。本文还包括下述HPPD蛋白作为本发明的HPPD蛋白，所述蛋白质包含SEQ ID No.4的从2至350位的氨基酸序列，但是其中1‑20、1‑15、1‑10或1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸已被缺失，或者已被其它氨基酸取代，特别是保留了HPPD酶促活性并且当在宿主植物中表达时赋予针对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性的此类蛋白质。本文包括与下文描述的本发明的DNA序列同源的DNA序列编码的HPPD蛋白，或与SEQ ID NO：1的DNA的至少一部分(至少20‑30个核苷酸)杂交的DNA序列编码的HPPD蛋白或能使用基于SEQ ID NO：1的引物获得的DNA序列编码的HPPD蛋白，或与SEQ ID No：4具有至少75％序列同一性的HPPD蛋白，所述蛋白质由在微生物(例如细菌，例如亚科聚球藻属的微生物)的基因组中发现的DNA序列编码。本文包括下述聚球藻属HPPD蛋白作为本发明的HPPD蛋白，所述蛋白质当在植物中表达时向此类植物赋予除草剂耐受性，其中此类耐受性是针对HPPD抑制剂(例如甲基磺草酮、环磺酮、异氟草或bicyclopyrone)的，特别地，此类HPPD蛋白是聚球藻属物种HPPD蛋白，例如包含SEQ ID NO：4的从2至350位氨基酸的序列的蛋白质。这包括如下文详述的突变体或变体HPPD蛋白。
本发明包括并提供了能与下述基本经纯化的蛋白质特异性结合的抗体，所述蛋白质包含选自SEQ ID NOs：4、5、6或7构成的组的氨基酸序列，或其根据上表(i)、(ii)或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列。
本发明的另一方面涉及与本发明的蛋白质或肽分子中的一种或多种以及它们的同源物、融合体或片段特异性结合的抗体、单链抗原结合分子或其它蛋白质。在一种特别优选的实施方式中，抗体与具有SEQ ID NOs：4‑7中示出的氨基酸序列的蛋白质或其片段或其根据上表(i)、(ii)或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列特异性结合。
在另一实施方式中，抗体与包含选自SEQ ID NOs：4‑7中示出的氨基酸序列或其片段或其根据上表(i)、(ii)或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列的氨基酸序列的融合蛋白特异性结合。
在另一实施方式中，抗体与包含选自SEQ ID NOs：4‑7中示出的氨基酸序列或其片段、或其根据上表(i)、(ii)或(iii)中的一种或多种中公开的氨基酸替代衍生的序列的氨基酸序列的融合蛋白特异性结合。
本发明的抗体可用于定量或定性检测本发明的蛋白质或肽分子，或用于检测蛋白质的翻译后修饰。在本文中使用时，如果抗体或肽与本发明的蛋白质或肽分子的结合不被存在的无关分子竞争性抑制，则说该抗体或肽与本发明的蛋白质或肽分子“特异性结合”。
在另一实施方式中，本发明涉及在本文中被命名为“本发明的HPPD核酸/DNA”的HPPD核酸或DNA，其是编码上文定义的本发明的HPPD的核酸或DNA。这包括下述DNA，所述DNA包含选自SEQ ID No.1从第4位核苷酸至第1050位核苷酸的序列、SEQ ID No.2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列或SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列构成的组的核苷酸序列，或者所述DNA包含编码HPPD的DNA区域，或者这包括下述DNA，所述DNA与另一DNA足够互补，使得：当在60至65℃之间的温度在含有0.1％SDS的5xSSC(1xSSC(单‑强度柠檬酸钠)表示＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠、50mM磷酸钠pH 7.6)中孵育之后接着在相同温度下用含有0.1％SDS的5xSSC洗涤时，其仍与选自由SEQ ID Nos.1、2和3构成的组的序列杂交。当测试序列和本发明序列是双链时，构成测试序列的核酸优选具有相对选自由SEQ ID Nos.1、2和3构成的组的序列的TM而言10℃之内的TM。当测试序列和选自由SEQ ID Nos.1、2和3构成的组的序列被混合到一起并被同时变性时，序列的TM值优选在互相的5℃之内。更优选地，杂交在下文定义的相对严格的杂交条件下进行。
在一种实施方式中，变性的测试或本发明序列优选首先与支持物结合，并在60至65℃之间的温度下在含有0.1％SDS的5xSSC中进行指定时间的杂交，之后在相同的温度下但用0.1xSSC来洗涤支持物。当杂交涉及选自由SEQ ID Nos.1、2和3构成的组的序列时，杂交条件可较不严格，这将是技术人员显而易见的。
本文还包括编码本发明HPPD蛋白质的下述DNA序列作为本发明的HPPD DNA，所述DNA序列已被改造以适于在微生物或植物中表达，这例如通过用宿主细胞中更优选的密码子替代天然密码子来进行，或者其中为了易于克隆已添加或除去了某些限制性位点，或是具有一定数量的添加、替代或缺失的核苷酸的DNA序列。这还包括经分离的DNA序列和变体、突变体或合成DNA或核酸，如下文所进一步描述的。
在一种特殊的实施方式中，本发明的聚球藻属HPPD DNA在允许外源基因在植物中表达的启动子的控制下表达于植物中。在另一特别的实施方式中，在由此表达的HPPD酶的N‑末端定位有信号肽，例如转运肽，优选是质体转运肽，例如大约120个氨基酸(大约30至大约120个氨基酸)的叶绿体转运肽，更优选是双转运肽，例如下述经优化的转运肽，其第一个部分来自向日葵(Helianthus annuus)，第二个部分来自玉米(美国专利5,188,642中描述的)，或者植物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)的质体转运肽，如果合适的话，包括成熟RuBisCO ssu的N‑末端部分的数个氨基酸(EP 189 707)。
在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPPD蛋白的DNA，其源于SEQ ID No.1或可从SEQ ID No.1获得，并且已针对在大肠杆菌中的表达对其进行了优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列的DNA(包括作为边界的位置)。
在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPPD蛋白质的DNA，其源于SEQ ID No.1，并且已针对在植物中的表达对其进行了优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列的DNA(包括作为边界的位置)。
在另一特别的实施方式中，本发明的HPPD，例如包含SEQ ID No.4从第2位氨基酸至第350位氨基酸的氨基酸序列的HPPD，或包含SEQ ID Nos.4至7中任一的氨基酸序列的HPPD，较之宿主植物内源HPPD而言对异唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPPD抑制剂型除草剂或选自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑CF3苯基)丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑2，3 Cl2苯基)丙‑1，3‑二酮、bicyclopyrone、双环磺草酮、庄无忌和苄草唑(pyrazoxyfen)的HPPD抑制剂型除草剂较不敏感。
在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPPD蛋白的DNA，其来自SEQ ID NO：1并且已针对在大肠杆菌中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸的序列的DNA(包括作为边界的位置)，所述DNA编码较之宿主植物内源HPPD对异唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的至少一种HPPD抑制剂型除草剂(优选对环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、异氟草、二酮腈类、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、磺草酮、吡唑特(pyrazolate)和吡草酮(benzofenap))较不敏感的HPPD。
在另一特别的实施方式中，本发明包括编码本发明HPPD蛋白的DNA，其已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸的序列的DNA(包括作为边界的位置)，所述DNA编码较之宿主植物内源HPPD对异唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的至少一种HPPD抑制剂型除草剂(优选对环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、异氟草、二酮腈类、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、磺草酮、吡唑特和吡草酮)较不敏感的HPPD。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及包含编码本发明的HPPD蛋白的DNA的植物，这些植物的植物部分、植物细胞和后代，所述DNA已针对在大肠杆菌中的表达被优化或已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列或包含SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列的DNA，所述DNA编码较之宿主植物内源HPPD较不敏感的HPPD。此类植物包括但不限于田间作物、水果和蔬菜，例如卡诺拉油菜(canola)、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉蜀黍、小麦、大麦、稻、高粱、西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡萝卜、生菜、卷心菜、洋葱、豆类物种(soya spp)、甘蔗、豌豆、芸豆(field bean)、杨、葡萄、柑桔、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮草(turf)和饲料牧草、亚麻和油菜籽油菜(oilseed rape)以及产生坚果的植物。
在一种更特别的实施方式中，本发明涉及包含任何编码本发明的HPPD的DNA的植物，这些植物的植物部分、植物细胞或后代，所述DNA已针对在大肠杆菌中的表达被优化或已针对在植物中的表达被优化，例如经密码子优化的DNA，例如包含SEQ ID No.2从第25位核苷酸至第1071位核苷酸(包括作为边界的位置)或包含SEQ ID No.3从第400位核苷酸至第1446位核苷酸(包括作为边界的位置)的序列的DNA，所述DNA编码较之宿主植物内源HPPD较不敏感的HPPD，并且其中所述植物选自卡诺拉油菜、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉蜀黍、小麦、大麦、稻、马铃薯、豆类物种、甘蔗、豌豆、芸豆、杨、葡萄、苜蓿、黑麦、燕麦、草皮草(turf)和饲料牧草、亚麻和油菜籽油菜以及产生坚果的植物构成的组，进一步更优选地，此类植物选自豆类物种、稻、甜菜、小麦、棉花、卡诺拉油菜、油菜籽油菜或玉蜀黍构成的组。
在另一实施方式中，本发明的HPPD蛋白包含SEQ ID No.7的序列，并且较之植物(特别是宿主植物，其中本发明的此类HPPD被表达或将被表达)内源未经突变的HPPD而言对三酮类(命名为三酮类HPPD抑制剂，例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌，特别是环磺酮)的类别、二酮腈类的类别(异氟草)或pyrazolinate的类别(命名为pyrazolinate HPPD抑制剂，例如pyrasulfotole、吡唑特、苯吡唑草酮、吡草酮)的HPPD抑制剂较不敏感。
HPPD蛋白的酶活性可通过下述任何方法来测量，所述方法使得能测量HPP或O2底物的量的减少，或者测量源于酶促反应的任何产物(即尿黑酸或CO2)的积累。特别地，HPPD活性可通过Garcia等人(1997)，Biochem.J.325，761‑769或Garcia等人(1999)，Plant Physiol.119，1507‑1516中描述的方法来测量，所述参考文献通过引用并入本文。
根据本发明，三酮类的类别的HPPD抑制剂(或三酮HPPD抑制剂)表示具有三酮骨架的HPPD抑制剂。作为此类三酮HPPD抑制剂的例子，可举出下述分子，磺草酮[即2‑[2‑氯‑4‑(甲基磺酰基)苯甲酰基]‑1，3‑环己二酮]，甲基磺草酮[即2‑[4‑(甲基磺酰基)‑2‑硝基苯甲酰基]‑1，3‑环己二酮]和环磺酮[即2‑[2‑氯‑4‑(甲基磺酰基)‑3‑[(2，2，2，‑三‑氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]‑1，3‑环‑己二酮]，庄无忌[即2‑{2‑氯‑4‑甲磺酰基‑3‑[(RS)‑四氢‑2‑呋喃基甲氧基甲基]苯甲酰基}环己‑1，3‑二酮]，bicyclopyrone[即4‑羟基‑3‑{2‑[(2‑甲氧基乙氧基)甲基]‑6‑(三氟甲基)‑3‑吡啶基羰基}二环[3.2.1]辛‑3‑烯‑2‑酮]，双环磺草酮[即3‑(2‑氯‑4‑甲磺酰基苯甲酰基)‑2‑苯基硫代二环[3.2.1]辛‑2‑烯‑4‑酮]。
根据本发明，pyrazolinate的类别的HPPD(或pyrazolinate HPPD抑制剂)表示具有吡唑基团的HPPD抑制剂。作为此类pyrazolinate HPPD抑制剂的例子，可以举出苯吡唑草酮[即[3‑(4，5‑二氢‑3‑异唑基)‑2‑甲基‑4‑(甲基磺酰基)苯基](5‑羟基‑1‑甲基‑1H‑吡唑‑4‑基)甲酮]和pyrasulfotole[(5‑羟基‑1，3‑二甲基吡唑‑4‑基(2‑甲磺酰基‑4‑三氟甲基苯基)甲酮]。
本发明还涉及编码本发明的聚球藻属HPPD以及经改造的序列的核酸序列，特别是经分离的DNA，优选是可在植物中表达的嵌合基因。
本发明还涉及编码本发明的HPPD酶的核酸序列，所述HPPD酶保留了其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质，并且较之内源未经突变的植物HPPD对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)，或pyrazolinate的类别(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮、庄无忌、bicyclopyrone、双环磺草酮)的HPPD抑制剂较不敏感，并且其中，被编码的氨基酸序列显示出与SEQ ID No.4至少75％，80％，特别是至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步更优选至少98％，以及最优选至少99％的序列同一性。
在一种更特别的实施方式中，本发明的核酸编码较之宿主植物内源HPPD而言对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone和庄无忌)、pyrazolinate的类别(命名为pyrazolinate HPPD抑制剂，例如pyrasulfotole、吡唑特、苯吡唑草酮、吡草酮)、异唑类的类别(例如异氟草)、或二酮类的类别(例如二酮腈)的HPPD抑制剂较不敏感的HPPD酶。
根据本发明，“核酸序列”被理解为核苷酸序列，其可以是DNA或RNA类型，优选是DNA类型的，并且其特别是双链的，无论是天然或合成来源的，特别是下述DNA序列，其中编码根据本发明的HPPD的密码子已经根据其将表达于的宿主生物经过优化(例如，通过用较之原来的或来源生物而言、在此类宿主生物或此类宿主生物属于的组的密码子使用表中更优选或最优选的那些密码子替代其密码子实现的)。
“经分离的核酸/DNA/蛋白质”在本文中使用时指并非天然存在的核酸/DNA/蛋白质(例如，具有与天然存在的DNA不同的核苷酸序列的人工或合成DNA，或经修饰的蛋白质)或者不再存在于其原来存在的天然环境中的核酸/DNA/蛋白质，例如，在嵌合基因中与异源调控元件连结的DNA编码序列(例如与可在植物中表达的启动子有效相连的细菌编码序列)、转入另外的宿主细胞(例如转基因植物细胞)的DNA。
考虑到本发明的一种特别的实施方式和受欢迎的解决方案，即，对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂较不敏感的HPPD，使用WO 2009/14407中详细描述的方法，按照下文所述，使用三酮、异唑或pyrazolinate HPPD抑制剂，特别是选自环磺酮、甲基磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、磺草酮、bicyclopyrone、二酮腈、吡草酮、吡唑特、庄无忌(tefuryltrione)的HPPD抑制剂，来对耐受性水平测量加以分析。
“包含”某序列“X”的术语DNA或蛋白质在本文通篇中使用时表示至少包括或含有序列“X”的DNA或蛋白质，这使得：其它核苷酸或氨基酸序列可被包括于5’(或N‑末端)和/或3’(或C‑末端)端，例如，可选择标志物蛋白质(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)和/或5’前导序列或3’尾随序列。相似地，在本文通篇中以及本申请的权利要求中术语“包含”及其各种词性应当被理解为暗示了包括所指出的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。
在本发明的一种实施方式中，编码HPPD的编码区域包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQ ID Nos 4、5、6、7和16示出的氨基酸序列，例如SEQ ID Nos 1、2、3和15的核苷酸序列。
但是，应当清楚，还可使用这些核苷酸序列的变体，包括其插入、缺失和取代，达到相同的效果。等同地，提到的核苷酸序列的来自不同于聚球藻属的物种的同源体也可使用。
描述的核苷酸序列的变体将与鉴定出的编码HPPD酶的核苷酸序列(例如序列表中鉴定出的那些)具有优选至少大约70％、80％或85％或90％或95％的序列同一性。
与本发明所述的蛋白质具有“基本相同的氨基酸序列”的蛋白质指与根据本发明的蛋白质具有至少90％，特别至少95％，优选至少97％序列同一性的蛋白质，其中百分比序列同一性是通过使用在GCG(Madison，Wisconsin，USA)的Wisconsin软件包版本10.0的GAP程序中blosum62计分矩阵来测定的(使用GCG默认参数)。在本申请中通篇使用时，当“序列同一性”与蛋白质相关时，指使用该特定的分析时相同氨基酸的百分比。在本文中使用时，当“序列同一性”与DNA序列相关时，是通过使用GCG(Madison，Wisconsin，USA)的Wisconsin软件包版本10.0的GAP程序中nwsgapdna计分矩阵来测定的(使用GCG默认参数)。
就本发明的目的而言，表示为百分比的两条相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”指两条被最优比对的序列中具有相同残基的位置数(x100)除以被比较的位置数。缺口，即，比对中在一条序列中存在残基而在另一条中不存在残基的位置，被视为具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch 1970)来进行两条序列间的比对。可使用标准软件程序，例如，是Wisconsin软件包版本10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)一部分的GAP，使用默认计分矩阵，以及缺口制造罚分50和缺口延伸罚分3，来方便地进行计算机辅助的上述序列比对。
可通过对基因组序列数据进行计算机分析，来鉴定与编码根据本发明的HPPD酶的核苷酸序列同源的核苷酸序列。
还可使用鉴定出的编码根据本发明的HPPD酶的核苷酸序列或其部分作为探针，通过在严格条件下杂交，来鉴定和分离同源核苷酸序列。此类部分应当优选具有下述核苷酸序列，所述序列包含来自根据本发明的HPPD编码基因序列编码区域的至少40个连续核苷酸，优选地，来自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.15的编码区域。但是，探针也可包含源于HPPD编码核酸的核苷酸序列的更长的区域，例如来自任何提到的HPPD基因的大约50、60、75、100、200或500个连续核苷酸。优选地，探针应当包含编码高度保守区域的核苷酸序列，所述高度保守区域可通过比对不同HPPD蛋白而鉴定到。
在本文中使用时，“严格杂交条件”表示：如果在探针和靶序列之间存在至少95％(以及优选至少97％)的序列同一性，通常将发生的杂交。严格杂交条件的例子是在包含5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切载体DNA(例如鲑鱼精DNA)的溶液中孵育过夜，接着在大约65℃在0.1x SSC中洗涤杂交支持物，优选进行两次大约10分钟。其它杂交和洗涤条件是公知的，并且示例于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是第11章中。
还可使用特异于编码酶的HPPD基因的寡核苷酸(例如但不限于，包含选自SEQ ID Nos 1、2、3、15的核苷酸序列或它们的互补序列的大约20至大约50个连续核苷酸的寡核苷酸)作为引物，通过DNA扩增来获得此类变体序列。
本发明还包括下述变体HPPD酶，它们是与SEQ ID No.4或SEQ ID No.16的HPPD氨基酸序列相似的氨基酸序列，其中，一个或多个氨基酸已被插入、缺失或取代。在本发明上下文中，氨基酸序列的变体指尽管对其有任何氨基酸取代、添加或缺失，但具有与本文所述的氨基酸序列相似的催化活性的那些多肽、酶或蛋白质。优选地，变体氨基酸序列与SEQ ID No.4或SEQ ID No.16的氨基酸序列具有至少大约80％或85％或90％或95％的序列同一性。还优选地，包含变体氨基酸序列的多肽具有HPPD酶活性。用于测定HPPD酶活性的方法是本领域公知的，其包括WO 2009/144079中或WO 2002/046387中被详细描述的检验。
取代包括下述氨基酸变化，其中氨基酸被不同的天然存在的或非传统的氨基酸残基替代。此类取代可被分类为“保守的”，其中，在本发明的HPPD蛋白中含有的氨基酸残基被具有相似特征的另一天然存在的氨基酸替代，例如或本发明包括的取代还可以是“非保守的”，其中在本发明的HPPD蛋白中存在的氨基酸残基被具有不同性质的氨基酸取代，例如，来自不同组的天然存在的氨基酸(例如，用丙氨酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)。氨基酸取代典型地是单残基的，但是也可以是多个残基的，成串的或分散的。氨基酸缺失将通常是1‑10个氨基酸残基数量级上的，而插入可以是任何长度的。缺失和插入可以对N‑末端、C‑末端进行或者是内部缺失或插入。通常，在氨基酸序列内的插入将比氨基或羧基末端融合小，其在1至4个氨基酸残基的数量级上。“相似氨基酸”在本文中使用时指具有相似氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或特别是中性的侧链的氨基酸。“非相似氨基酸”在本文中使用时指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如，具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸是不相似的。极性侧链通常倾向于存在于蛋白质的表面，它们在那里可以和细胞中发现的水性环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸倾向于驻留于蛋白质的中心内，它们在那里可以与相似的非极性邻居相互作用(“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的例子是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(除了疏水性的半胱氨酸之外，全部都是亲水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的例子是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸(除了中性的甘氨酸之外，全部都是疏水性的)。
本发明还包括特异性识别根据本发明的HPPD酶的抗体。
本发明还涉及编码根据本发明的HPPD的核酸作为标志物基因或作为编码序列在转化植物的方法中的用途，使得可向植物赋予对是HPPD抑制剂的除草剂的抗性，本发明还涉及HPPD抑制剂在包含编码根据本发明的HPPD的核酸序列的植物上的用途。在本发明的一种实施方式中，在此类用途中，HPPD抑制剂是三酮类或pyrazolinate，优选是环磺酮、甲基磺草酮或磺草酮、bicyclopyrone和庄无忌。当然应当理解，该序列还可与其它基因标志物和/或编码具有有用的农业性质的一种或多种蛋白质的序列组合使用。
在作物的商业生产中，想要在可靠的杀虫剂管理下从作物植物的田间除掉不想要的植物(即，“杂草”)。理想的处理将是这样的，其可应用至整块田间，但是将仅除掉不想要的植物，同时使得作物植物未受影响。一种此类的处理系统将涉及使用对除草剂耐受的作物植物，使得当在除草剂耐受的作物植物田间喷雾除草剂时，作物植物将继续茂盛生长同时非除草剂耐受性的杂交被杀死或被严重损害。理想地，此类处理系统利用了变动的除草剂性质的优点，使得杂草控制能提供灵活度和经济性的可能的组合中最好的。例如，各除草剂在田间具有不同寿命，一些除草剂在应用到田间之后能在相对长的时间内保持下来并有效，而另一些除草剂则迅速被破坏为其它和/或非活性化合物。理想的处理系统将允许使用不同的除草剂，使得种植者可定制针对特定情况的除草剂选择。
虽然目前可商业获得大量的除草剂耐受性作物植物，但针对很多商业除草剂和除草剂/作物组合已提出了下述议题：各除草剂典型地具有针对常见杂草物种的不完全活性谱。对于已使用了一段时间的大多数各个除草剂来说，除草剂抗性杂草物种和生物型的种群已更为普遍(见例如Tranel and Wright(2002)Weed Science 50：700‑712；Owen and Zelaya(2005)Pest Manag.Sci.61：301‑311)。对超过一种除草剂有抗性的转基因植物已被描述过(见例如W02005/012515)。但是，在作物生产、杂草控制选择、残余杂草控制的延伸以及作物产量改进的每个方面，都持续需要改进。
本发明的HPPD蛋白质或基因有利地在植物中与编码向此类植物赋予有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的其它基因组合。在编码在经转化的植物上赋予有用的农艺学性质的蛋白质或RNA的基因中，可提到的是编码赋予对化学结构不同于HPPD抑制剂型除草剂的一种或多种除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列，赋予对某些昆虫的耐受性的蛋白质的DNA序列、赋予对某些疾病的耐受性的蛋白质的DNA序列，编码提供线虫或昆虫控制的RNA的DNA等等。
此类基因被特别描述于公开的PCT专利申请WO 91/02071和WO95/06128中。
在编码在经转化的植物细胞和植物上赋予对某些除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列中，可以提到bar或PAT基因或WO2009/152359中描述的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因(其赋予对草铵膦除草剂的耐受性)，编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂(草甘膦及其盐)的耐受性的合适的EPSPS的基因(US 4,535,060、US 4,769,061、US5,094,945、US 4,940,835、US 5,188,642、US 4,971,908、US 5,145,783、US5,310,667、US 5,312,910、US 5,627,061、US 5,633,435)，或编码草甘膦氧化还原酶的基因(US 5,463,175)。
在编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂的耐受性的合适的EPSPS的DNA序列中，将特别提到编码植物EPSPS(特别是玉蜀黍EPSPS)的基因，特别是其包含两处突变的玉米EPSPS，特别是在第102位氨基酸处和第106位氨基酸处的突变(WO 2004/074443)，其被描述于专利申请US 6566587中，在下文中被称为双突变体玉蜀黍EPSPS或2mEPSPS；或者编码分离自农杆菌属的EPSPS的基因，其被美国专利5,633,435的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3描述，也被命名为CP4。
在编码赋予对以EPSPS作为靶标的除草剂的耐受性的合适的EPSPS的DNA序列中，将特别提到编码来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的EPSPS GRG23以及突变体GRG23 ACE1、GRG23 ACE2或GRG23 ACE3(特别是WO2008/100353中描述的GRG23的突变体或变体，例如WO2008/100353中的SEQ ID No.29的GRG23(ace3)R173K)的基因。
在编码EPSPS(以及更特别地，上述编码基因)的DNA序列的情况下，编码这些酶的序列有利地在之前存在编码转运肽的序列，特别是美国专利5,510,471或5,633,448中描述的“经优化的转运肽”。
在WO 2007/024782中，公开了对草甘膦和至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂耐受的植物。更具体地，公开了含有编码GAT(草甘膦‑N‑乙酰转移酶)多肽和赋予对ALS抑制剂的抗性的多肽的基因的植物。
在US专利6,855,533中，公开了转基因烟草植物，其含有突变的拟南芥属ALS/AHAS基因。
在US专利6,153,401中，公开了含有编码通过代谢赋予对2，4‑D(2，4‑二氯苯氧乙酸)的耐受性的2，4‑D‑单加氧酶的基因的植物。
在US 2008/0119361和US 2008/0120739中，公开了含有编码通过代谢赋予对麦草畏(3，6‑二氯‑2‑甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因的植物。
上述所有除草剂耐受性均可与表现出是本发明主题的HPPD耐受性的那些组合。
在编码关于对昆虫的耐受性的性质的蛋白质的DNA序列中，将特别提到文献中广为描述并且本领域技术人员公知的Bt蛋白。还将提到从细菌(例如发光杆菌属)提取的蛋白质(WO 97/17432和WO 98/08932)。
在编码赋予对昆虫的耐受性的新颖性质的目的蛋白质的此类DNA序列中，将特别提到在文献中被广为描述并且本领域技术人员公知的Bt Cry或VIP蛋白。它们包括：Cry1F蛋白或源于Cry1F蛋白的杂交体(例如US 6,326,169、US 6,281,016、US 6,218,188中描述的杂交体Cry1A‑Cry1F蛋白或其毒性片段)，Cry1A型的蛋白质或其毒性片段，优选是Cry1Ac蛋白或源于Cry1Ac蛋白的杂交体(例如，US 5,880,275中描述的杂交体Cry1Ab‑Cry1Ac蛋白)或Cry1Ab或Bt2蛋白或其杀昆虫片段(如EP451878中描述的)，Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白(如WO02/057664中描述的)或其毒性片段，WO 2007/140256中描述的Cry1A.105蛋白(SEQ ID No.7)或其毒性片段，NCBI检录号ABG20428的VIP3Aa19蛋白，NCBI检录号ABG20429的VIP3Aa20蛋白(WO 2007/142840中的SEQ ID No.2)，COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白(分别见WO 2005/054479和WO 2005/054480)，WO01/47952中描述的Cry蛋白，Estruch等人(1996)，Proc Natl Acad Sci U S A.28；93(11)：5389‑94和US 6,291,156中描述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段，来自致病杆菌属(Xenorhabdus)(如WO98/50427中描述的)、沙雷氏菌属(特别是来自嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或发光杆菌属(Photorhabdus)的物种的菌株的杀昆虫蛋白，例如WO98/08932中所述的来自发光杆菌属的Tc‑蛋白(例如，Waterfield等人，2001，Appl Environ Microbiol.67(11)：5017‑24；Ffrench‑Constant and Bowen，2000，Cell Mol Life Sci.；57(5)：828‑33)。此外这些蛋白质中任何一种的下述任何变体或突变体也包括在本文中：在一些(1‑10，优选1‑5)个氨基酸上与上述任何序列(特别是它们的毒性片段的序列)不同的变体或突变体，或者与转运肽(例如质体转运肽)或其它蛋白质或肽融合的变体或突变体。
本发明还涉及嵌合基因(或表达盒)，其包含编码序列以及位于5’和/或3’位置(至少位于5’位置)的异源调控元件，它们能在宿主生物(特别是植物细胞或植物)中与含有编码前文定义的HPPD的至少一种核酸序列的编码序列一起发挥功能。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及前文描述的嵌合基因，其中宿主细胞选自细菌、酵母、毕赤酵母属、真菌、杆状病毒、体外细胞、原生质体、植物细胞、植物、植物部分及其植物种子。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及前文描述的嵌合基因，其中所述嵌合基因含有位于编码根据本发明的HPPD的核酸序列的5’位置处编码植物转运肽的核酸序列，该序列被安排于启动子区域和编码根据本发明的HPPD的序列之间，以允许转运肽/HPPD融合蛋白的表达。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及HPPD抑制剂型除草剂在包含根据本发明的HPPD耐受基因的植物、植物部分或植物种子上的用途，或者HPPD抑制剂型除草剂在其中将种植或播种此类植物、植物部分或种子的土壤上的用途，所述HPPD抑制剂型除草剂单独使用或与一种或多种作用方式不同于HPPD抑制剂的其它已知除草剂组合使用。在一种更特别的实施方式中，利用的HPPD抑制剂型除草剂选自三酮类(被命名为三酮HPPD抑制剂)(例如环磺酮、磺草酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌，特别是环磺酮)、二酮类的类别(例如二酮腈)、异唑类的类别(例如异氟草)或pyrazolinate的类别(被命名为pyrazolinate HPPD抑制剂)(例如pyrasulfotole、吡唑特、苯吡唑草酮、吡草酮)构成的组，进一步更具体地，本发明涉及环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈、bicyclopyrone、庄无忌、吡草酮、pyrasulfotole、吡唑特和磺草酮对此类HPPD抑制剂耐受性植物、植物部分或植物种子的应用。
作为在植物细胞和植物中作为启动子发挥功能的调控序列，可使用天然表达于植物中的基因的任何启动子序列，特别是尤其表达于植物叶中的启动子，例如细菌、病毒或植物来源的“组成型”启动子，或者“光依赖性”启动子，例如植物核酮糖‑二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，或者任何合适的可表达可使用的已知启动子。在植物来源的启动子中，将提到EP 0 507 698 A1中描述的组蛋白启动子、稻肌动蛋白启动子(US 5,641,876)或植物泛素启动子(US 5,510,474)。在植物病毒基因的启动子中，将提到花椰菜花叶病毒(CaMV 19S或35S，Sanders等人(1987)，Nucleic Acids Res.15(4)：1543‑58.)、圆环病毒(AU 689 311)或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV，US 7,053,205)的启动子。
在本发明的一种实施方式中，可使用特异于植物的特别的区域或组织的启动子，以表达本发明的HPPD，例如特异于种子的启动子(Datla，R.等人，1997，Biotechnology Ann.Rev.3，269‑296)，尤其是油菜籽油菜蛋白启动子(EP 255 378 A1)、菜豆蛋白启动子、麦谷蛋白启动子、向日葵蛋白启动子(WO 92/17580)、白蛋白启动子(WO 98/45460)、油质蛋白启动子(WO 98/45461)、SAT1启动子或SAT3启动子(PCT/US98/06978)。
还可使用可诱导启动子，其有利地选自苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、HMG‑CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂氨酸合成酶(nos)和vspB启动子(US 5 670 349，表3)、HMG2启动子(US 5 670 349)、苹果β‑半乳糖苷酶(ABG1)启动子和苹果氨基环丙烷羧酸合酶(ACC合酶)启动子(WO 98/45445)。
根据本发明，还可与启动子组合使用其它调控序列，所述序列定位于启动子和编码序列之间，例如转录活化因子(“增强子”)，例如申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)的或Carrington & Freed1990，J.Virol.64：1590‑1597描述的烟草蚀刻病毒(TEV)的转录活化因子，例如，或内含子，例如玉蜀黍的adh1内含子或稻肌动蛋白的内含子1。
在另一特别的实施方式中，本发明的基因以多个(优选两个)拷贝存在于植物中，它们每个被不同的可在植物中表达的启动子控制。
在另一特别的实施方式中，本发明的嵌合基因可与编码HPPD蛋白的任何其它嵌合基因组合，优选地，这些不同基因被在植物中具有活性的不同调控元件控制。
在另一特别的实施方式中，本发明的嵌合基因可与处于相同或不同可在植物中表达的启动子控制下的CYP450玉蜀黍单加氧酶(nsf1基因)基因组合。
作为调控终止子或聚腺苷化序列，可使用细菌来源(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子)、病毒来源(例如CaMV 35S终止子)或植物来源(例如，公开的专利申请EP 0 633 317 A1中描述的组蛋白终止子)的任何相应序列。
术语“基因”在本文中使用时指侧翼有5’和/或3’调控序列的允许RNA被转录的DNA编码区域，所述RNA可被翻译为蛋白质，典型地，至少包含启动子区域。当提到本发明的编码HPPD的DNA时，“嵌合基因”指下述HPPD编码DNA序列，其具有不同于驱动HPPD蛋白在其天然宿主细胞中表达的天然存在的细菌5’和/或3’调控序列的5’和/或3’调控序列(也被称为“异源启动子”或“异源调控序列”)。
术语“包含序列X的DNA/蛋白质”和“具有包含序列X的序列的DNA/蛋白质”在本文中使用时指下述DNA或蛋白质，它们在其核苷酸或氨基酸序列中至少包括或含有序列X，这使得在5’(或N‑末端)和/或3’(或C‑末端)末端可包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如，N‑末端转运或信号肽。术语“包含”在本文中使用时是表示“包括”的开放式语言，其表示除了具体列举的那些之外还可存在其它元件。术语“由......构成”在本文中使用时是封闭式语言，即，仅存在具体列举的这些元件。术语“编码包含序列X的蛋白质的DNA”在本文中使用时指包含下述编码序列的DNA，所述编码序列在转录和翻译后产生至少含有氨基酸序列X的蛋白质。编码蛋白质的DNA无须是天然存在的DNA，其可以是半合成的、完全合成的或人工DNA，并且可包括内含子和5’和/或3’侧翼区域。术语“核苷酸序列”在本文中使用时指DNA或RNA分子的序列，其可以是单链或双链形式的。
根据本发明的HPPD蛋白可根据本领域已知的流程被装备有信号肽，见例如公开的PCT专利申请WO 96/10083，或者它们可被另外的肽，例如导致蛋白质被运送至叶绿体的叶绿体转运肽(例如，Van Den Broeck等人，1985，Nature 313，358或US专利5,510,471的经修饰的叶绿体转运肽)替代，或被将蛋白质靶向至其它质体、线粒体、ER或另外的细胞器的肽或分泌性信号肽替代，或者其可被甲硫氨酸氨基酸或被甲硫氨酸‑丙氨酸二肽替代。在天然被靶向或分泌的蛋白质中发现了用于靶向至细胞内细胞器或用于分泌出植物细胞或分泌至细胞壁的信号序列，优选地，等人(1989，Mol.Gen.Genet.217，155‑161)、and Weil(1991，Mol.Gen.Genet.225，297‑304)、Neuhaus & Rogers(1998，Plant Mol.Biol.38，127‑144)、Bih等人(1999，J.Biol.Chem.274，22884‑22894)、Morris等人(1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328‑333)、Hesse等人(1989，EMBO J.8 2453‑2461)、Tavladoraki等人(1998，FEBS Lett.426，62‑66)、Terashima等人(1999，Appl.Microbiol.Biotechnol.52，516‑523)、Park等人(1997，J.Biol.Chem.272，6876‑6881)、Shcherban等人(1995，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92，9245‑9249)描述的那些，所有这些都通过引用并入本文，特别是来自玉米、棉花、大豆或稻的被靶向或分泌的蛋白质的信号肽序列。编码此类植物信号肽的DNA序列可被插入编码用于在植物中表达HPPD蛋白的嵌合基因中。
除非实施例中另有指明，用于制造和操纵重组DNA的所有流程都通过Sambrook等人，Molecular Cloning‑A Laboratory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1卷和第2卷中描述的标准流程来进行。用于植物分子生物学工作的标准材料和方法被描述于R.R.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)(由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)联合出版)中。用于PCR技术的流程可被发现于M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White编辑的“PCR protocols：a guide to methods and applications”(Academic Press，Inc.，1990)中。
术语“耐受性”、“耐受”或“较不敏感”可互换使用，它们表示根据用包含编码各HPPD蛋白的基因的核酸转化的菌株或植物的可视指标表型在不同浓度的多种HPPD抑制剂存在时筛选的HPPD内在耐受性的相对水平。与这些指标表型(棕色的形成、生长抑制、褪色、除草剂效果等等)相关的剂量应答和剂量应答的相对改变被方便地以例如在除草剂的不同浓度范围内基于植物损害、分生组织褪色症状等等以正常方式的GR50(生长降低50％的浓度)值或MIC(最小抑制浓度)值来表示，其中值的增加对应于表达的HPPD的内在耐受性增加。这些数据可以以例如源于剂量/应答曲线的GR50值来表示，所述曲线具有绘制于x轴上的“剂量”和绘制于y轴上的“百分比杀死(percentage kill)”、“除草剂效果”、“出苗绿色植物的数目”等等，其中增加的GR50值对应于表达的HPPD的内在耐受性水平增加。除草剂可合适地在出苗前或出苗后应用。
类似地，编码根据本发明的HPPD蛋白的核酸或基因或本发明的HPPD蛋白的耐受性水平是通过对测试植物(例如烟草，或作物植物，例如大豆或棉花)进行转基因、再生、育种和喷雾测试来筛选的，根据这些结果，这些植物较之不含任何外源编码HPPD蛋白的基因的植物或较之含有包含处于与本发明HPPD DNA相同启动子控制下的拟南芥HPPD编码DNA的基因的植物时，对HPPD抑制剂(例如环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈类和/或bicyclopyrone)至少更耐受2‑4倍。
“宿主生物”或“宿主”被理解为其中为了产生根据本发明的HPPD的目的可引入根据本发明的核酸或嵌合基因的任何单细胞或多细胞异源生物。这些生物特别是细菌，例如大肠杆菌，酵母，特别是酿酒酵母属或克鲁维酵母属的，毕赤酵母，真菌，特别是曲霉属，杆状病毒，或者优选地，植物细胞和植物。
根据本发明，“植物细胞”被理解为源于植物或在植物中发现的任何细胞，其能形成未分化组织(例如愈伤组织)、分化组织(例如胚胎)、植物的部分、植物或种子，或是它们的一部分。这包括原生质体和花粉、培养的植物细胞或体外生长的原生质体以及能再生为完整植物的植物细胞。
根据本发明，“植物”被理解为能光合作用的任何分化的多细胞生生物，特别是单子叶或双子叶生物，更尤其是意欲或不意欲用于动物或人类营养的栽培的植物，例如玉蜀黍或玉米，小麦、芸苔属物种的植物，例如油菜(Brassica napus)或芥菜(Brassica juncea)，豆类物种，稻，甘蔗，甜菜，烟草，棉花、蔬菜植物，例如黄瓜、韭、胡萝卜、西红柿、生菜、胡椒、甜瓜、西瓜等等。转基因植物在本文中使用时指包含稳定插入进其基因组的外来或异源基因的植物。
在一种实施方式中，本发明涉及对植物的转化。在植物中天然表达的基因的任何启动子序列，或天然表达于植物中的基因的启动子元件的任何杂交体或组合，包括农杆菌属或植物病毒启动子，或适于控制除草剂耐受性基因在植物中的转录的任何启动子，可在本发明的植物中用作为启动子序列(本文中命名为“可在植物中表达的启动子”)。此类合适的可在植物中表达的启动子的例子如上文所述。在本发明的一种实施方式中，此类可在植物中表达的启动子与编码本发明的HPPD蛋白的编码序列有效地相连，形成本发明的嵌合HPPD基因。
根据本发明，还可与启动子调控序列组合使用位于启动子和编码序列之间的其它调控序列，例如内含子序列或转录活化因子(增强子)。此类合适的调控序列的例子如上文所述。
细菌或病毒来源(例如来自根癌农杆菌的nos终止子)或植物来源(例如申请EP 0 633 317 A1中描述的组蛋白终止子)的任何相应的序列，可用作为转录终止(和聚腺苷化)调控序列。
在本发明的一种特别的实施方式中，在根据本发明的外源HPPD的编码核酸序列的5’(上游)利用编码转运肽的核酸序列，该转运肽序列被安排于启动子区域和编码外源HPPD的序列之间，以允许转运肽‑HPPD融合蛋白(例如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7的蛋白质)的表达。转运肽使得可以指导HPPD进入质体，更尤其是进入叶绿体，当本发明的HPPD蛋白进入质体时融合蛋白在转运肽和本发明的HPPD蛋白之间被切割。转运肽可以是单条肽，例如EPSPS转运肽(美国专利5,188,642中描述的)或植物核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)的转运肽，如果合适的话，包括成熟RuBisCO ssu的N‑末端部分的数个氨基酸(EP 189 707A1)，或者可以是若干转运肽的融合体，例如下述转运肽，其包含与具有质体定位的成熟蛋白的N‑末端序列的部分融合的第一植物转运肽，所述部分又进而融合至如专利EP 508 909 A1中描述的第二植物转运肽，并且，更尤其是下述经优化的转运肽，其包含向日葵RuBisCO ssu的转运肽，该转运肽融合至玉蜀黍RuBisCO ssu的N‑末端的22个氨基酸，这22个氨基酸进而融合至玉蜀黍RuBisCO ssu的转运肽，与其编码序列一起描述于EP 508 909 A1中。
本发明还涉及转运肽‑HPPD融合蛋白和编码此类融合蛋白的核酸或可在植物中表达的嵌合基因，其中该融合蛋白的两种元件如上文定义。
本发明还涉及克隆、转化和/表达载体，所述载体含有如上文定义的至少一种嵌合基因。除了上述嵌合基因之外，该载体可含有复制起点。该载体可以是质粒或质粒的部分、粘粒或噬菌体或病毒(已通过引入根据本发明的嵌合基因而经过了转化)。转化载体可以是技术人员公知的，并且被广为描述于文献中。可以使用的转化载体(特别是用于转化植物细胞或植物的)可以是可用于转化植物细胞或植物并且额外含有其自身复制和表达元件的病毒。根据本发明，用于转化植物细胞或植物的载体优选是质粒，例如卸甲农杆菌属Ti质粒。
本发明还涉及下述宿主生物，特别是植物细胞、种子或植物，其包含含有编码本发明HPPD蛋白(例如如上文定义的包含SEQ ID Nos 4、5、6或7的氨基酸序列的蛋白)的序列的嵌合基因，以及涉及本发明的植物或种子在田间的用途，以培养作物和收获植物产品，例如豆类物种、稻、小麦、大麦或玉米粒或棉桃，其中在一种实施方式中，所述用途涉及将HPPD抑制剂型除草剂应用于这些植物以控制杂草。在本发明的一种实施方式中，在此类用途中，HPPD抑制剂是三酮类或pyrazolinate，优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、吡唑特、吡草酮和庄无忌，特别是环磺酮(tembotrione)。
因此，本发明涉及下述宿主生物，特别是植物细胞、种子或植物，其特征在于其含有上文所述的至少一种HPPD嵌合基因，或者至少含有如前文所述的HPPD核酸序列。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及植物细胞或植物，其特征在于其至少含有下述核酸序列，所述核酸序列编码本发明的HPPD蛋白，所述蛋白质保留有其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质，并且使得该植物较之相同物种但是不包含本发明的此类HPPD蛋白的植物而言更为耐受，特别是对三酮类或pyrazolinate(优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、吡唑特、吡草酮和庄无忌，特别是环磺酮)耐受，并且含有本发明的HPPD的此类植物对HPPD抑制剂型除草剂(特别是对三酮类或pyrazolinate，优选为环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮或磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、吡唑特、吡草酮和庄无忌，特别是环磺酮)具有农艺学可接受的耐受性。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及下述植物细胞或植物，其特征在于，其至少含有编码本发明的HPPD的核酸序列，所述HPPD保留有其催化对羟苯基丙酮酸到尿黑酸的转化的性质并且较之宿主植物内源HPPD(例如来自拟南芥的HPPD，特别是包含SEQ ID No.11的氨基酸序列(从第126位氨基酸至第568位氨基酸)或包含SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的氨基酸序列(从第134位氨基酸至第575位氨基酸)的HPPD)对HPPD抑制剂较不敏感。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及下述宿主植物细胞、种子或宿主植物，其特征在于其至少含有编码如本文定义的本发明的HPPD的核酸序列，其中本发明的HPPD较之宿主植物内源HPPD对异唑类、二酮腈类、三酮类或pyrazolinate的类别的HPPD抑制剂型除草剂(更尤其地，来自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、bicyclopyrone、庄无忌、苯吡唑草酮、2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑CF3苯基)丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑SO2CH3‑4‑2，3 Cl2苯基)丙‑1，3‑二酮，甚至更特别地，环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈类(diketonitrile)、bicyclopyrone、苯吡唑草酮、吡唑特、吡草酮、磺草酮、庄无忌和pyrasulfotole，最特别地，环磺酮、甲基磺草酮和bicyclopyrone)更不敏感。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及下述植物细胞或植物，其特征在于其至少含有编码前文所述的本发明的HPPD的核酸序列，以及还含有包含上文所述的可在植物中表达的启动子的嵌合基因，所述启动子与编码PHD(预苯酸脱氢酶)酶的核酸序列有效连接(US 2005/0257283)。
本发明还涉及含有经转化的细胞的植物，特别是从经转化的细胞再生的植物，及其后代植物或种子，它们包含本发明的嵌合HPPD基因。再生可通过任何合适的方法来获得，所述方法取决于物种的性质，如例如在上述参考文献中描述的。可引用下述专利和专利申请，特别是在转化植物细胞和再生植物的方法方面：US 4,459,355、US 4,536,475、US 5,464,763、US 5,177,010、US 5,187,073、EP 267,159 A1、EP 604 662 A1、EP 672 752A1、US 4,945,050、US 5,036,006、US 5,100,792、US 5,371,014、US 5,478,744、US 5,179,022、US 5,565,346、US 5,484,956、US 5,508,468、US 5,538,877、US 5,554,798、US 5,489,520、US 5,510,318、US 5,204,253、US 5,405,765、EP 442 174 A1、EP 486 233 A1、EP 486 234 A1、EP 539 563 A1、EP 674 725A1、WO 91/02071和WO 95/06128。
本发明还涉及通过栽培和/或杂交上述转基因植物获得的转基因植物或其部分，还涉及转基因植物的种子(包含本发明的HPPD嵌合基因)。
本发明还涉及最终产物，例如从本发明的植物、其部分或种子获得的膳食或油。
可根据本发明获得的经转化的植物可以是单子叶类型的，例如小麦、大麦、甘蔗、稻、洋葱和玉米或玉蜀黍，或者可以是双子叶类型的，例如烟草、豆类物种、苜蓿、芸苔属物种的植物(例如油菜籽油菜)、棉花、甜菜、三叶草、蔬菜等等。
本发明涉及转化宿主生物(特别是植物细胞或植物)的方法，这通过在此类生物中整合上文定义的至少一种核酸序列或一种嵌合基因来进行，其中可通过任何合适的已知方式获得转化，所述方式被详细描述于专门的文献以及特别地，本申请提到的参考文献中，例如通过使用根据本发明的载体来进行。
根据本发明的一种转化方法包括用其上联结有DNA或含有DNA的固体或液体颗粒轰击细胞、原生质体或组织。另一转化方法包括使用嵌合基因作为转入植物的手段，所述嵌合基因被插入进根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒。还可使用其它方法，例如显微注射或电穿孔或使用PEG的直接基因转移。技术人员可选择用于转化选择的宿主生物(特别是植物细胞或植物)的任何合适的方法。作为例子，用于大豆转化的技术已被广泛描述于EP 1186666A1(通过引用并入本文)中公开的实施例1至3中。对于稻，可进行农杆菌属介导的转化(Hiei等人，1994 Plant J 6：271‑282和Hiei等人，1997 Plant Mol Biol.35：205‑21，通过引用并入本文)、电穿孔(US 5,641,664和US 5,679,558，通过引用并入本文)或轰击(Christou等人，1991，Biotechnology 9：957，通过引用并入本文)。用于转化单子叶植物(特别是稻)的一种合适技术被描述于WO92/09696(通过引用并入本文)中。对于棉花，已经描述了农杆菌属介导的转化(Gould J.H.和Magallanes‑Cedeno M.，1998 Plant Molecular Biology reporter，16：1‑10和Zapata C.，1999，Theoretical Applied Genetics，98(2)：1432‑2242，通过引用并入本文)、聚凝胺和/或处理介导的转化(Sawahel W.A.，2001，‑Plant Molecular Biology reporter，19：377a‑377f，通过引用并入本文)。
在本发明的一种特别的实施方式中，本发明的HPPD被靶向进叶绿体。这可通过下述方式来进行：将编码转运肽的核酸序列融合至编码本发明的HPPD蛋白的核酸序列，以获得编码上文所述的融合蛋白的核酸。
或者，可使用对质体(例如叶绿体基因组)的转化，将本发明的HPPD直接表达于质体(例如叶绿体)中。合适的方法包括通过用涂覆有DNA的固体颗粒或包含DNA的液体颗粒轰击植物细胞或组织，以及通过同源重组整合引入的编码本发明蛋白的基因。合适的载体和选择系统是本领域技术人员已知的。可用于向烟草植物的叶绿体基因组的此类整合的方式和方法的例子被给于WO 06/108830中，其内容通过引用并入本文。
本发明还涉及用于获得针对HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于用如前文所述的本发明的嵌合HPPD基因转化植物。
因此，本发明还涉及获得对HPPD抑制剂耐受的植物的方法，其特征在于，所述植物含有本发明的嵌合HPPD基因，所述基因包含编码序列以及位于5’以及任选在3’位置的能在宿主生物中发挥功能的异源调控元件，其特征在于，所述编码序列至少包含定义编码如前文所述的本发明的HPPD的基因的核酸序列。
在本发明的一种实施方式中，上述方法中的HPPD抑制剂是三酮或pyrazolinate除草剂，优选为环磺酮、甲基磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、pyrasulfotole、吡唑特、二酮腈(diketonitrile)、吡草酮或磺草酮，特别是环磺酮。
根据本发明，还提供了用于获得如上文所述的对HPPD抑制剂耐受的植物的方法，其特征在于获得下述植物，所述植物包含是本发明的嵌合HPPD基因的第一转基因，以及是包含与编码PDH(预苯酸脱氢酶)酶的核酸有效连接的可在植物中表达的启动子的嵌合基因的第二转基因。包含此类两种转基因的植物可这样获得：通过用一种转基因转化植物，然后再用第二转基因重转化该转基因植物，或者通过两种转基因(在相同或两个不同的转化DNA或载体中)同时转化植物，或者通过将包含第一转基因的植物与包含第二转基因的植物杂交，这是本领域公知的。
本发明还涉及在将栽种植物或将播种种子的田间、或在植物作物中选择性除去杂草或预防杂草发芽的方法，这通过向此类田间或植物作物应用HPPD抑制剂，特别是如上文定义的HPPD抑制剂型除草剂来实现，所述方法特征在于，将该HPPD抑制剂型除草剂应用至已经根据本发明转化过的植物，这在播种作物之前(下文中命名为栽种前应用)、作物出苗之前(下文中命名为出苗前应用)或作物出苗之后(下文中命名为出苗后应用)进行。
本发明还涉及在含有如本发明前文所述经转化的种子的区域或田间进行控制的方法，所述方法包括向所述田间的区域应用对于所述杂草来说是毒性的剂量的HPPD抑制剂型除草剂，但是对如本发明前文所述含有本发明的HPPD核酸或嵌合HPPD基因的种子或植物没有显著影响。
本发明还涉及栽培已经经根据本发明的嵌合基因转化过的植物的方法，所述方法包括在适于栽种所述植物的田间区域栽种包含本发明的嵌合基因的种子，以及如果存在杂草的话，向所述田间的所述区域应用对杂草有毒的剂量的靶标为上文定义的HPPD的除草剂，而不显著影响所述经转化的种子或所述经转化的植物，以及然后当栽培的植物或植物部分达到想要的成熟阶段时收获它们，并且如果合适的话，从收获的植物分离种子。
在上述方法中，其靶标是HPPD酶的除草剂可以根据本发明，在播种作物之前、作物出苗之后或作物出苗之后应用。
本发明还涉及获得油(特别是豆类物种、玉米或棉花油或膳食)的工艺，所述工艺包括种植表达本发明的HPPD蛋白的作物，特别是豆类物种作物，任选地用HPPD抑制剂型除草剂处理此类作物，收获种粒(grain)并碾磨种粒以制造膳食和提取油。此外，包含本发明的嵌合基因的种子或种粒(整个的、破裂的或压碎的)也是本发明的一部分。
因此，本发明涉及获得油或膳食的方法，所述方法包括种植如上文所述的经转化的植物，任选地，用HPPD抑制剂型除草剂处理此类植物，收获种粒，并碾磨种粒，以制造膳食和提取油。
本发明中还提供了涉及下述HPPD抑制剂型除草剂的上述方法，所述除草剂选自异氟草、环磺酮、甲基磺草酮、pyrasulfotole、磺草酮、bicyclopyrone、庄无忌、苯吡唑草酮、2‑氰基‑3‑环丙基‑1‑(2‑甲基磺酰基‑4‑三氟甲基苯基)‑丙‑1，3‑二酮和2‑氰基‑1‑[4‑(甲基磺酰基)‑2‑三氟甲基苯基]‑3‑(1‑甲基环丙基)丙‑1，3‑二酮。
本文还提供了涉及下述HPPD抑制剂型除草剂的上述方法，所述除草剂是三酮类的类别的，例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮，或pyrazolinate的类别的，例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。
在本发明的含义内，“除草剂”被理解为是自身具有除草剂活性的物质，或者与改变其效力的添加剂(例如，增加其活性的物质(协同性物质)或限制其活性的物质(安全剂))组合的物质。当然应当理解，就它们在实践中的应用而言，以本身已知的方式将上述除草剂与惯常用于农业化学中的配方佐剂组合。
HPPD抑制剂型除草剂(例如三酮类的类别的那些，例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮，或pyrazolinate的类别的那些，例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)具有杰出的、针对广谱的经济上重要的单子叶和双子叶一年生有害植物的除草剂活性。活性物质还可高效作用于难以控制的从根茎、木料(wood stocks)或其它多年生器官产生枝条的多年生有害植物。
本发明因此还涉及在包含根据本发明的HPPD的植物作物中控制不想要的植物或用于调控植物生长的方法，其中向植物(例如，有害植物，例如单子叶或双子叶杂草或不想要的作物植物)、向种子(例如种粒、种子或营养繁殖体，例如块茎或具有蓓蕾的枝条部分)或向种植植物的区域(例如栽培下的区域)应用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的一种或多种HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。在该上下文中，三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，可例如栽种前(如果合适的话，还通过掺入土壤中来应用)、出苗前或出苗后应用。可用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)控制的单子叶和双子叶杂草的各代表由此被提及，但这种提及并不表示仅限某些物种：
下述属的单子叶有害植物：山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agropyron)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、Apera、燕麦属(Avena)、臂形草属(Brachiaria)、雀麦属(Bromus)、蒺藜草属(Cenchrus)、鸭跖草属(Commelina)、狗牙根属(Cynodon)、莎草属(Cyperus)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、荸荠属(Eleocharis)、蟋蟀草属(Eleusine)、画眉草属(Eragrostis)、野粟属(Eriochloa)、羊茅属(Festuca)、飘拂草属(Fimbristylis)、异蕊花属(Heteranthera)、白茅属(Imperata)、鸭嘴草属(Ischaemum)、千金子属(Leptochloa)、黑麦草属(Lolium)、雨久花属(Monochoria)、粟(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、虉草属(Phalaris)、牧梯草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、筒轴茅属(Rottboellia)、慈姑属(Sagittaria)、藨草属(Scirpus)、狗尾草属(Setaria)、高粱属(Sorghum)。
下述属的双子叶杂草：白麻属(Abutilon)、苋属(Amaranthus)、豚草属(Ambrosia)、Anoda、春黄菊属(Anthemis)、Aphanes、蒿属(Artemisia)、滨藜属(Atriplex)、雏菊属(Bellis)、鬼针草属(Bidens)、荠属(Capsella)、飞廉属(Carduus)、决明属(Cassia)、矢车菊属(Centaurea)、藜属(Chenopodium)、蓟属(Cirsium)、旋花属(Convolvulus)、曼陀罗属(Datura)、山蚂蝗属(Desmodium)、Emex、糖芥属(Erysimum)、大戟属(Euphorbia)、鼬瓣花属(Galeopsis)、牛膝菊属(Galinsoga)、拉拉藤属(Galium)、木槿属(Hibiscus)、蕃薯属(Ipomoea)、地肤属(Kochia)、宝盖草属(Lamium)、独行菜属(Lepidium)、母草属(Lindernia)、母菊属(Matricaria)、薄荷属(Mentha)、山靛属(Mercurialis)、粟米草属(Mullugo)、勿忘我属(Myosotis)、罂粟属(Papaver)、牵牛属(Pharbitis)、车前属(Plantago)、蓼属(Polygonum)、马齿苋属(Portulaca)、毛莨属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、酸模属(Rumex)、猪毛菜属(Salsola)、千里光属(Senecio)、田菁属(Sesbania)、黄花稔属(Sida)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、苦苣菜属(Sonchus)、尖瓣花属(Sphenoclea)、繁缕属(Stellaria)、蒲公英属(Taraxacum)、遏蓝菜属(Thlaspi)、三叶草属(Trifolium)、荨麻属(Urtica)、婆婆纳属(Veronica)、堇菜属(Viola)、苍耳属(Xanthium)。
在包含本发明的HPPD蛋白、DNA或嵌合基因并且还可显示出针对不同于HPPD抑制剂型除草剂的除草剂的一种其它除草剂抗性的根据本发明的转基因作物中，在有用的植物和观赏植物的经济上重要的转基因作物(例如谷物，例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱和粟、稻和玉蜀黍或者甜菜、棉花、豆类物种、油菜籽油菜、马铃薯、西红柿、豌豆的作物和其它蔬菜)中使用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，是优选的。
因为其涉及与本发明所述的对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性不同的植物性质，产生较之现有植物具有经修饰的性质的新颖的植物的传统途径例如是传统育种方法和产生突变体。或者，具有经修饰的性质的新颖的植物可在重组方法协助下产生(见例如EP‑A‑0221044 A1、EP‑A‑0131624A1)。例如，下述已被描述于若干情况中：
‑针对修饰在植物中合成的淀粉的目的，对作物植物进行重组修饰(例如WO 92/11376，WO 92/14827，WO 91/19806)
‑对某些草铵膦类型(参见例如EP‑A‑0242236，EP‑A‑242246)或草甘膦类型(WO 92/00377)或磺酰脲类型(EP‑A‑0257993，US‑A‑5013659)的除草剂具有抗性的转基因作物植物，
‑转基因作物植物，例如玉米、棉花或豆类物种，其能产生苏云金芽孢杆菌毒素(Bt毒素)，或其杂交体或突变体，这使得植物对某些害虫具有抗性(EP‑A‑0193259)，
‑转基因作物植物，其具有经修饰的脂肪酸组成(WO 91/13972)，
‑经遗传修饰的作物植物，其具有新颖的组成成分或次级代谢物，例如新颖的植物抗毒素(phytoalexins)，这带来了增加的疾病抗性(EPA309862，EPA0464461)，
‑经遗传修饰的植物，其具有降低的光呼吸，其特点为更高的产量和更高的胁迫耐受性(EPA 0305398)，
‑产生药学上重要或诊断上重要的蛋白的转基因作物植物(“分子制药”)，
‑因更高的产量和更高的品质而与众不同的转基因作物植物，
‑因新颖的性质的组合(例如上述新颖的性质的组合)(“基因堆叠”)而与众不同的转基因作物植物。
可用来产生具有经修饰的性质的新颖的转基因植物的大量分子生物学技术原则上是已知的，例如I.Potrykus和G.Spangenberg(编著)Gene Transfer to Plants，Springer Lab Manual(1995)，Springer Verlag Berlin，Heidelberg，或Christou，″Trends in Plant Science″1(1996)423‑431)。
为进行此类重组操作，可将核酸分子引入质粒，这允许通过对DNA序列加以重组来进行诱变或序列修饰。例如，可在标准方法的协助下，进行碱基取代，除去部分‑序列，或添加天然或合成的序列。为将DNA片段互相连接起来，可向片段添加连接物或接头；见，例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；或Winnacker″Gene und Klone″，VCH Weinheim 2.ed.，1996。
可例如通过下述方式来产生具有针对基因产物的降低的活性的植物细胞：通过表达至少一种相应的反义RNA、用于获得共遏制效果的正义RNA或者形成双链沉默RNA分子(RNAi)的反义和正义RNA二者的组合，或者通过表达至少一种相应构建的核酶(其特异性切割上述基因产物的转录本)来实现。为实现此，可首先使用包含基因产物的全部编码序列(包括可能存在的任何侧翼序列)的DNA分子，或者仅包含编码序列中的部分的DNA分子，其中这些部分必须要足够长到能在细胞中带来反义效果。还可使用具有与基因产物的编码序列具有高同源性程度但是并非完全相同的DNA序列。
当在植物中表达核酸分子时，获得的蛋白可被定位于植物细胞的任何区室。但是，为了实现在特别的区室中的定位，可例如将编码区域与确保在特定区室中定位的DNA序列连接起来。此类序列是技术人员已知的(见例如Braun等人，EMBO J.11(1992)，3219‑3227；Wolter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846‑850；Sonnewald等人，Plant J.1(1991)，95‑106)。但是，核酸分子还可表达于植物细胞的细胞器中。
可通过已知的技术来再生转基因植物细胞，以产生完整植物。原则上，转基因植物可以是任何植物物种的植物，包括单子叶或双子叶植物。
因此，可获得下述转基因植物，除了具有本发明的嵌合HPPD基因之外，所述植物还具有同源(＝天然)基因或基因序列的过表达、遏制或抑制或异源(＝外来)基因或基因序列的表达导致的经修饰的性质。
在本发明的植物、植物细胞或种子上，优选在还对生长调控因子(例如2，4‑D或麦草畏)或对抑制必要的植物酶(例如乙酰乳酸合酶(ALS)、EPSP合酶或谷氨酰胺合酶(GS))的除草剂或对来自磺酰脲、草甘膦或草铵膦和类似活性物质的组的除草剂有抗性的转基因作物中使用三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。
本发明因此还涉及应用到根据本发明的HPPD耐受性植物上的除草剂的用途，用于控制有害植物(即杂草)，其还延伸至除了包含对三酮类的类别(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)、异唑类的类别(例如异氟草)或pyrazolinate的类别(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地，选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)的抗性之外还包含第二或更多种除草剂抗性的转基因作物植物。
三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮，可用于可润湿粉末、可乳化浓缩物、可喷雾溶液、粉剂(dusts)或颗粒剂形式的惯常制剂。
取决于主要生物和/或物理化学参数，可以以多种途径来配制三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂，特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮。可能的制剂的例子是可湿性粉(WP)、水溶性粉(SP)、水溶性浓缩物、可乳化浓缩物(EC)、乳剂(EW)(例如水包油或油包水的乳剂)、可喷雾溶液、悬浮浓缩物(SC)、基于油或水的分散液、混合油剂溶液、胶囊悬浮液(CS)、粉剂(DP)、拌种(seed dressing)产品、通过播种和在土壤上使用的颗粒剂、微颗粒形式的颗粒剂(GR)、喷雾颗粒体、包被的颗粒剂和吸附颗粒剂、水分散颗粒剂(WG)、水溶性颗粒剂(SG)、ULV制剂、微胶囊和蜡。
上述各个制剂类型原则上是已知的，并在例如Winnacker‑Küchler，″Chemische Technologie″[Chemical technology]，第7卷，C.Hanser Verlag Munich，第4版.1986；Wade van Valkenburg，″Pesticide Formulations″，Marcel Dekker，N.Y.，1973；K.Martens，″Spray Drying″Handbook，第3版.1979，G.Goodwin Ltd.London中描述。
需要的制剂辅助剂，例如惰性材料、表面活性剂、溶剂和其他添加剂也是已知的并在例如Watkins，″Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers″，第2版，Darland Books，Caldwell N.J.，H.v.Olphen，″Introduction to Clay Colloid Chemistry″；第2版，J.Wiley & Sons，N.Y.；C.Marsden，″Solvents Guide″；第2版，Interscience，N.Y.1963；McCutcheon′s ″Detergents and Emulsifiers Annual″，MC Publ.Corp.，Ridgewood N.J.；Sisley和Wood，″Encyclopedia of Surface Active Agents″，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；″″[Interface‑active ethylene oxide adducts]，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；Winnacker‑Küchler，″Chemische Technologie″[Chemical technology]，第7卷，C.Hanser Verlag Munich，第4版1986中描述。
基于这些制剂，可与其他杀虫活性物质比如，例如杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀真菌剂以及与安全剂、肥料和/或生长调控因子组合制备，例如以预混(ready mix)或罐混(tank mix)的形式。
可湿性粉是在可在水中均匀分散的制剂，并且其除了活性物质，也包含离子和/或非离子表面活性剂(湿润剂、分散剂)，例如除了稀释剂或惰性物质，包含聚氧乙烯化的烷基酚、聚氧乙烯化的脂肪醇、聚氧乙烯化的脂肪胺、脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、烷烃磺酸盐、烷基苯磺酸盐、木质素磺酸钠、2，2’‑二萘基甲烷‑6，6’‑二磺酸钠、二丁基萘磺酸钠或油酰基甲基牛磺酸钠。为了制备可润性粉，除草活性物质被精细碾磨，例如在惯常仪器如锤式粉碎机、鼓风粉碎机和喷射粉碎机中，并与制剂辅助剂同时或随后混合。
可乳化浓缩物是通过将活性物质溶解在有机溶剂(例如丁醇、环己烷、二甲基甲酰胺、二甲苯或其他高沸点芳香族或烃，或者有机溶剂的混合物)中然后添加一种或多种离子和/或非离子表面活性剂(乳化剂)来制备的。可使用的乳化剂的实例是：烷基芳基磺酸钙例如十二烷基苯磺酸钙，或非离子乳化剂例如脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、环氧丙烷/环氧乙烷缩合物、烷基聚醚、山梨聚糖酯比如，例如山梨聚糖脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨聚糖酯比如，例如聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。
粉剂是通过用精细分割的固体材料(比如，例如滑石、天然粘土例如高岭土、皂土和叶蜡石或硅藻土)碾磨活性物质获得的。
悬浮浓缩物可以是基于水或基于油的。它们可以通过例如市售球磨机的方法湿磨制备，如果适当，添加例如上文已经在其他制剂类型中列出的表面活性剂。
乳剂，例如水包油的乳剂(EW)可以通过例如搅拌器、胶体磨和/或静态混合器的方法用水性有机溶剂制备，如果适当，添加例如上文已经在其他制剂类型中列出的表面活性剂。
可以通过将活性物质喷雾到吸附性的、颗粒化的惰性材料上，或者在粘合剂(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠或矿物油)的帮助下将活性物质浓缩物施用于载剂(例如沙、高岭土或颗粒化的惰性材料)表面来制备颗粒剂。适当的活性物质也能够以惯常用于生产肥料颗粒的方法颗粒化，如果需要，作为与肥料的混合物。
水分散颗粒剂通常是通过惯常方法(例如喷雾干燥、流化床造粒、圆盘造粒、用高速搅拌器混合以及在没有固体惰性材料下挤压)制备的。
为制备圆盘颗粒、流化床颗粒、挤压颗粒和喷雾颗粒，参见例如″Spray‑Drying Handbook″第3版1979，G.Goodwin Ltd.，London；J.E.Browning，″Agglomeration″，Chemical and Engineering 1967，第147页及以下等.；″Perry′s Chemical Engineer′s Handbook″，第5版，McGraw‑Hill，New York 1973，第8‑57页中的方法。
关于作物保护产品制剂的进一步详情，参见例如G.C.Klingman，″Weed Control as a Science″，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，第81‑96页和J.D.Freyer，S.A.Evans，″Weed Control Handbook″，第5版，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1968，第101‑103页。
通常，农业化学制剂包含按重量计从0.1％至99％，特别是按重量计从0.1％至95％的根据本发明的化合物。在可湿性粉中，活性物质浓度是，例如按重量计约10至90％，按重量计、到100％的其余部分由惯常制剂组分组成。在可乳化浓缩物的情况下，活性物质浓度按重量计可总计约1至90，优选地5至80％。粉剂形式的制剂包含按重量计从1至30％的活性物质，优选地在大多数情况下为按重量计从5至20％的活性物质，可喷雾溶液包含按重量计约从0.05至80，优选地从2至50％的活性物质。在水分散颗粒剂的情况下，活性物质含量部分取决于活性化合物是液体或是固体形式，以及使用的造粒辅助剂、填充剂等。例如在水分散颗粒剂的情况下，活性物质含量在按重量计1至95％之间，优选地按重量计10至80％之间。
此外，如果适当，所述活性物质制剂包含每种情况下常规的辅助剂，例如粘合剂、湿润剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、防腐剂、防冻剂、溶剂、填充剂、载剂、着色剂、消泡剂、蒸发抑制剂以及pH和粘度调节剂。
基于这些制剂，还可制备三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinates的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)与其它杀虫活性物质(例如杀昆虫剂、杀螨剂、除草剂、杀真菌剂)以及与安全剂、肥料和/或生长调控因子的组合，例如以将应用到根据本发明的HPPD耐受性植物上的预混剂或罐混剂的形式。
在混合的制剂或者在罐混剂中，可与三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinate的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)组合应用至根据本发明的HPPD耐受性植物的活性物质是，例如，基于对乙酰乳酸核酶、乙酰‑CoA羧化酶、纤维素合酶、烯醇式丙酮莽草酸‑3‑磷酸合酶(enolpyruvylshikimate‑3‑phosphate synthase)、谷氨酰胺合成酶、对羟苯基丙酮酸双加氧酶、八氢番茄红素去饱和酶、光合体系I、光合体系II、原卟啉原氧化酶的抑制的已知活性物质，如例如Weed Research 26(1986)441‑445或″The Pesticide Manual″，14版，The British Crop Protection Council and the Royal Soc.of Chemistry，2003和其中引用的文献中所述。可与根据本发明的化合物组合的已知除草剂或植物生长调控因子是，例如，下述活性物质(根据International Organization for Standardization(ISO)通过通用名命名的或通过化学名命名的化合物，如果合适的话，与编号一起)，并且总是包含所有使用形式，例如酸、盐、酯和异构体，例如立体异构体和光学异构体。在本文上下文中，通过举例的方式提到了一种以及在某些情况下若干种使用形式：
乙草胺(acetochlor)、阿拉酸式苯(acibenzolar)、阿拉酸式苯‑S‑甲基、三氟羧草醚(acifluorfen)、三氟羧草醚钠(acifluorfen‑sodium)、苯草醚(aclonifen)、甲草胺(alachlor)、二丙烯草胺(allidochlor)、禾草灭(alloxydim)、禾草灭钠(alloxydim‑sodium)、莠灭净(ametryne)、氨唑草酮(amicarbazone)、先甲草胺(amidochlor)、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、aminocyclopyrachlor、aminopyralid、杀草强(amitrole)、氨基磺酸铵(ammonium sulfamate)、环丙嘧啶醇(ancymidol)、莎稗磷(anilofos)、黄草灵(asulam)、阿特拉津(atrazine)、唑啶炔草(azafenidin)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、叠氮津(aziprotryne)、BAH‑043、BAS‑140H、BAS‑693H、BAS‑714H、BAS‑762H、BAS‑776H、BAS‑800H、氟丁酰草胺(beflubutamid)、草除灵(benazolin)、乙基草除灵(benazolin‑ethyl)、bencarbazone、氟草胺(benfluralin)、呋草黄(benfuresate)、地散磷(bensulide)、甲基苄嘧黄隆(bensulfuron‑methyl)、苯达松(bentazone)、双苯嘧草酮(benzfendizone)、双环磺草酮(benzobicyclon)、吡草酮(benzofenap)、氟磺胺草(benzofluor)、benzoylprop、甲羧除草醚(bifenox)、双丙氨酰膦(bilanafos)、双丙氨酰膦钠盐(bilanafos‑sodium)、双嘧苯甲酸(bispyribac)、双嘧苯甲酸钠盐(bispyribac‑sodium)、除草定(bromacil)、溴丁酰草胺(bromobutide)、溴酚肟(bromofenoxim)、溴苯腈(bromoxynil)、bromuron、buminafos、羟草酮(busoxinone)、丁草胺(butachlor)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、抑草磷(butamifos)、丁烯草胺(butenachlor)、仲丁灵(butralin)、丁氧环酮(butroxydim)、丁草敌(butylate)、唑草胺(cafenstrole)、双酰草胺(carbetamide)、唑草酮(carfentrazone)、唑酮草乙酯(carfentrazone‑ethyl)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、草灭平(chloramben)、chlorazifop、chlorazifop‑butyl、氯溴隆(chlorbromuron)、氯草灵(chlorbufam)、伐草克(chlorfenac)、伐草克钠(chlorfenac‑sodium)、燕麦酯(chlorfenprop)、整形醇(chlorflurenol)、甲基整形醇(chlorflurenol‑methyl)、氯草敏(chloridazon)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、氯嘧磺隆乙酯(chlorimuron‑ethyl)、矮壮素(chlormequat‑chloride)、草枯醚(chlornitrofen)、chlorophthalim，敌草索二甲酯(chlorthal‑dimethyl)、绿麦隆(chlorotoluron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、cinidon、吲哚酮草酯(cinidon‑ethyl)、环庚草醚(cinmethylin)、醚磺隆(cinosulfuron)、烯草酮(clethodim)、炔草酸(clodinafop)、炔草酯(clodinafop‑propargyl)、苯哒嗪(clofencet)、广灭灵(clomazone)、氯甲酸草胺(clomeprop)、调果酸(cloprop)、克草立特(clopyralid)、cloransulam、cloransulam‑methyl、苄草隆(cumyluron)、氨基氰(cyanamide)、氰草津(cyanazine)、环丙酸酰胺(cyclanilide)、草灭特(cycloate)、环磺隆(cyclosulfamuron)、噻草酮(cycloxydim)、环莠隆(cycluron)、cyhalofop、氰氟草酯(cyhalofop‑butyl)、牧草快(cyperquat)、环丙津(cyprazine)、三环塞草胺(cyprazole)、2，4‑D、2，4‑DB、杀草隆(daimuron/dymron)、茅草枯(dalapon)、丁酰肼(daminozide)、棉隆(dazomet)、正癸醇(n‑decanol)、甜菜安(desmedipham)、敌草净(desmetryn)、detosyl‑pyrazolate(DTP)、燕麦敌(di‑allate)、麦草畏(dicamba)、敌草腈(dichlobenil)、滴丙酸(dichlorprop)、2、4‑滴丙酸(dichlorprop‑P)、二氯苯氧基丙酸(diclofop)、禾草灵(diclofop‑methyl)、二氯苯氧基丙酸‑P‑甲基(diclofop‑P‑methyl)、双氯磺草安(diclosulam)、diethatyl、乙酰甲草胺(diethatyl‑ethyl)、枯莠隆(difenoxuron)、野燕枯(difenzoquat)、吡氟草胺(diflufenican)、二氟吡隆(diflufenzopyr)、二氟吡隆钠(diflufenzopyr‑sodium)、恶唑隆(dimefuron)、敌草克(dikegulac‑sodium)、恶唑隆、哌草丹(dimepiperate)、二甲草胺(dimethachlor)、异戊乙净(dimethametryn)、二甲噻草胺(dimethenamid)、二甲噻草胺‑P(dimethenamid‑P)、噻节因(dimethipin)、醚黄隆(dimetrasulfuron)、氨氟灵(dinitramine)、达诺杀(dinoseb)、特乐酚(dinoterb)、草乃敌(diphenamid)、异丙净(dipropetryn)、敌草快(diquat)、敌草快二溴化物(diquat‑dibromide)、氟硫草定(dithiopyr)、敌草隆(diuron)、二硝酚(DNOC)、eglinazine‑ethyl、茵多酸(endothal)、茵草敌(EPTC)、禾草畏(esprocarb)、乙丁烯氟灵(ethalfluralin)、甲基胺苯磺隆(ethametsulfuron‑methyl)、乙烯利(ethephon)、磺噻隆(ethidimuron)、乙嗪草酮(ethiozin)、乙氧呋草黄(ethofumesate)、氯氟草醚(ethoxyfen)、氯氟苯醚(ethoxyfen‑ethyl)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、etobenzanid、F‑5331即N‑[2‑氯‑4‑氟‑5‑[4‑(3‑氟‑丙基)‑4，5‑二氢‑5‑氧‑1H‑四唑‑1‑基]‑苯基]乙基磺酰胺、涕丙酸(fenoprop)、恶唑禾草灵(fenoxaprop)、恶唑禾草灵‑P、恶唑禾草灵乙酯(fenoxaprop‑ethyl)、精恶唑禾草灵乙酯(fenoxaprop‑P‑ethyl)、四唑酰草胺(fentrazamide)、非草隆(fenuron)、麦草伏(flamprop)、高效麦草伏异丙酯(flamprop‑M‑isopropyl)、高效麦草伏甲酯(flamprop‑M‑methyl)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、双氟磺草胺(florasulam)、吡氟乐草灵(fluazifop)、吡氟乐草灵‑P(fluazifop‑P)、吡氟禾草灵(fluazifop‑butyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop‑P‑butyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、氟唑磺隆(flucarbazone)、氟唑磺隆钠(flucarbazone‑sodium)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氯乙氟灵(fluchloralin)、氟噻草胺(flufenacet(thiafluamide))、氟哒嗪(flufenpyr)、氟哒嗪乙酯(flufenpyr‑ethyl)、氟节胺(flumetralin)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、flumiclorac、flumiclorac‑pentyl、丙炔氟草胺(flumioxazin)、flumipropyn、伏草隆(fluometuron)、三氟硝草醚(fluorodifen)、氟草醚(fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen‑ethyl)、氟胺草唑(flupoxam)、flupropacil、四氟丙酸(flupropanate)、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron)、氟啶嘧磺隆‑甲基‑钠、抑草丁(flurenol)、丁基抑草丁(flurenol‑butyl)、氟啶草酮(fluridone)、氟草吡酮(flurochloridone)、氟草烟(fluroxypyr)、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr‑meptyl)、呋嘧醇(flurprimidol)、呋草酮(flurtamone)、嗪草酸(fluthiacet)、嗪草酸甲酯(fluthiacet‑methyl)、氟唑草胺(fluthiamide)、氟磺胺草醚(fomesafen)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、调吡脲(forchlorfenuron)、杀木膦(fosamine)、呋氧草醚(furyloxyfen)、赤霉烯酸(gibberellic acid)、草铵膦(glufosinate)、L‑草铵膦(L‑glufosinate)、L‑固杀草(L‑glufosinate‑ammonium)、固杀草(glufosinate‑ammonium)、草甘膦(glyphosate)、草甘膦异丙基铵(glyphosate‑isopropylammonium)、H‑9201、halosafen、吡氯黄隆(halosulfuron)、吡氯黄隆‑甲基(halosulfuron‑methyl)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、吡氟氯禾灵‑P(haloxyfop‑P)、吡氟氯禾灵‑乙氧乙基(haloxyfop‑ethoxyethyl)、吡氟氯禾灵‑P‑乙氧乙基(haloxyfop‑P‑ethoxyethyl)、吡氟氯禾灵‑甲基(haloxyfop‑methyl)、吡氟氯禾灵‑P‑甲基(haloxyfop‑P‑methyl)、环嗪酮(hexazinone)、HNPC‑9908、HOK‑201、HW‑02、咪草酸(imazamethabenz)、咪草甲酯(imazamethabenz‑methyl)、甲氧咪(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、抗倒胺(inabenfide)、茚草酮(indanofan)、吲哚基醋酸(indoleacetic acid)(IAA)、4‑吲哚‑3‑基丁酸(IBA)、碘磺隆(iodosulfuron)、甲基碘磺隆钠(iodosulfuron‑methyl‑sodium)、碘苯腈(ioxynil)、草特灵(isocarbamid)、异丙乐灵(isopropalin)、异丙隆(isoproturon)、异恶隆(isouron)、异恶酰草胺(isoxaben)、异恶氯草酮(isoxachlortole)、异氟草、恶草醚(isoxapyrifop)、KUH‑043、KUH‑071、隆草特(karbutilate)、ketospiradox、乳氟乐草灵(lactofen)、环草定(lenacil)、利谷隆(linuron)、马来酰肼(maleic hydrazide)、MCPA、MCPB、MCPB‑甲基、MCPB‑乙基和MCPB‑钠、mecoprop、mecoprop‑sodium、mecoprop‑butotyl、mecoprop‑P‑butotyl、mecoprop‑P‑二甲基铵、mecoprop‑P‑2‑乙基己基、mecoprop‑P‑钾、苯噻草胺(mefenacet)、氟磺酰草胺(mefluidide)、缩节胺(mepiquat‑chloride)、磺胺磺隆(mesosulfuron)、甲磺胺磺隆(mesosulfuron‑methyl)、甲基苯噻隆(methabenzthiazuron)、威百亩(metam)、恶唑酰草胺(metamifop)、苯嗪草酮(metamitron)、吡唑草胺(metazachlor)、灭草定(methazole)、去草酮(methoxyphenone)、甲基杀草隆(methyldymron)、1‑甲基‑环丙烯、甲基异硫氰酸盐(methyl isothiocyanate)、吡喃隆(metobenzuron)、吡喃隆、溴谷隆(metobromuron)、异丙甲草胺(metolachlor)、S‑异丙甲草胺(S‑metolachlor)、磺草唑胺(metosulam)、甲氧隆(metoxuron)、嗪草酮(metribuzin)、磺隆(metsulfuron)、甲磺隆(metsulfuron‑methyl)、草达灭(molinate)、庚酰草胺(monalide)、monocarbamide、monocarbamide二氢硫酸盐、绿谷隆(monolinuron)、单嘧磺隆(monosulfuron)、灭草隆(monuron)、MT 128、MT‑5950即N‑[3‑氯‑4‑(1‑甲基乙基)‑苯基]‑2‑甲基戊酰胺、NGGC‑011、萘丙胺(naproanilide)、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、NC‑310即4‑(2，4‑二氯苯甲酰基)‑1‑甲基‑5‑苄基氧吡唑、草不隆(neburon)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、氟氯草胺(nipyraclofen)、甲磺乐灵(nitralin)、除草醚(nitrofen)、硝酚钠(nitrophenolat‑sodium)(异构混合体)、三氟甲草醚(nitrofluorfen)、正壬酸(nonanoic acid)、氟草敏(norflurazon)、拦草净(orbencarb)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、氨磺乐灵(oryzalin)、农思它(oxadiargyl)、恶草灵(oxadiazon)、环氧嘧磺隆(oxasulfuron)、恶嗪草酮(oxaziclomefone)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、paclobutrazole、百草枯(paraquat)、百草枯二氯化物(paraquat dichloride)、正壬酸(pelargonic acid(nonanoic acid))、二甲戊乐灵(pendimethalin)、pendralin、五氟磺草胺(penoxsulam)、甲氯酰草胺(pentanochlor)、环戊恶草酮(pentoxazone)、黄草伏(perfluidone)、烯草胺(pethoxamid)、棉胺宁(phenisopham)、苯敌草(phenmedipham)、苯敌草‑乙酯(phenmedipham‑ethyl)、毒莠定(picloram)、氟吡酰草胺(picolinafen)、唑啉草酯(pinoxaden)、哌草磷(piperophos)、pirifenop、pirifenop‑丁基、丙草胺(pretilachlor)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、甲基氟嘧磺隆(primisulfuron‑methyl)、噻菌灵(probenazole)、氟唑草胺(profluazol)、环丙腈津(procyazine)、氨氟乐灵(prodiamine)、prifluraline、环笨草酮(profoxydim)、调环酸(prohexadione)、调环酸钙(prohexadione‑calcium)、prohydrojasmone、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、毒草胺(propachlor)、敌稗(propanil)、恶草酸(propaquizafop)、扑灭津(propazine)、苯胺灵(propham)、异丙草胺(propisochlor)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、丙苯磺隆钠(propoxycarbazone‑sodium)、炔苯酰草胺(propyzamide)、甲硫磺乐灵(prosulfalin)、苄草丹(prosulfocarb)、氟磺隆(prosulfuron)、丙炔草胺(prynachlor)、双唑草腈(pyraclonil)、吡草醚(pyraflufen)、吡草醚‑乙基(pyraflufen‑ethyl)、吡唑特(pyrazolynate，pyrazolate)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron‑ethyl)、苄草唑、pyribambenz、pyribambenz‑异丙基、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、稗草丹(pyributicarb)、pyridafol、哒草特(pyridate)、环酯草醚(pyriftalid)、嘧草醚(pyriminobac)、甲基嘧草醚(pyriminobac‑methyl)、pyrimisulfan、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草硫醚钠(pyrithiobac‑sodium)、pyroxasulfone、甲氧磺草胺(pyroxsulam)、二氯喹啉酸(quinclorac)、氯甲喹啉酸(quinmerac)、灭藻醌(quinoclamine)、精喹禾灵(quizalofop)、精喹禾灵‑乙基(quizalofop‑ethyl)、精喹禾灵‑P(quizalofop‑P)、精喹禾灵‑P‑乙基(quizalofop‑P‑ethyl)、喹禾糠酯(quizalofop‑P‑tefuryl)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、密草通(secbumeton)、稀禾定(sethoxydim)、环草隆(siduron)、西玛津(simazine)、西草净(simetryn)、SN‑106279、sulf‑allate(CDEC)、甲磺草胺(sulfentrazone)、嘧磺隆(sulfometuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron‑methyl)、草硫膦(sulfosate)(草甘膦‑trimesium)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、SYN‑523、SYP‑249、SYP‑298、SYP‑300、牧草胺(tebutam)、丁噻隆(tebuthiuron)、四氯硝基苯(tecnazene)、吡喃草酮(tepraloxydim)、特草定(terbacil)、特草灵(terbucarb)、特丁草胺(terbuchlor)、特丁通(terbumeton)、特丁津(terbuthylazine)、特丁净(terbutryne)、TH‑547、甲氧噻草胺(thenylchlor)、thiafluamide、噻氟隆(thiazafluron)、噻草啶(thiazopyr)、噻二唑草胺(thidiazimin)、噻苯隆(thidiazuron)、酮脲磺草吩(thiencarbazone)、酮脲磺草吩甲酯(thiencarbazone‑methyl)、噻磺隆(thifensulfuron)、噻吩磺隆‑甲基(thifensulfuron‑methyl)、禾草丹(thiobencarb)、仲草丹(tiocarbazil)、甲黄隆对(tralkoxydim)、野麦畏(tri‑allate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、三嗪氟草胺(triaziflam)、triazofenamide、苯磺隆(tribenuron)、苯磺隆‑甲基(tribenuron‑methyl)、三氯乙酸(trichloroacetic acid)(TCA)、绿草定(triclopyr)、灭草环(tridiphane)、草达津(trietazine)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、三氟啶磺隆钠(trifloxysulfuron‑sodium)、氟乐灵(trifluralin)、triflusulfuron、氟胺磺隆‑甲基(triflusulfuron‑methyl)、三甲隆(trimeturon)、trinexapac、抗倒酯(trinexapac‑ethyl)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、tsitodef、烯效唑(uniconazole)、烯效唑‑P(uniconazole‑P)、灭草敌(vernolate)、ZJ‑0166、ZJ‑0270、ZJ‑0543、ZJ‑0862和下述化合物

将要被应用到种植了根据本发明的HPPD耐受性植物的区域的、三酮类的类别的(例如环磺酮、磺草酮和甲基磺草酮)或pyrazolinates的类别的(例如pyrasulfotole和苯吡唑草酮)的HPPD抑制剂型除草剂(特别地选自环磺酮、磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和甲基磺草酮，更特别地，环磺酮)所需的应用速率作为外部条件(例如温度、湿度、使用的除草剂的性质等等)的函数变动。其可在宽的限度内变动，例如0.001至1.0kg/公顷及更多的活性物质，但是其优选在0.005至750g/公顷之间。
在HPPD抑制剂型除草剂与不同于HPPD抑制剂型除草剂的除草剂组合应用到根据本发明的HPPD耐受性植物的情况下，这些化合物可导致作物损伤(基于非HPPD抑制剂型除草剂的存在)。为降低/除掉此类作物损伤，可添加合适的安全剂。这些以解毒(antidotically)活性量使用的安全剂降低了例如，在经济上重要的作物中所用的除草剂/杀虫剂的植物毒性副作用，所述作物为例如谷物(小麦、大麦、黑麦、玉米、稻、粟)、苜蓿、甜菜、甘蔗、油菜籽油菜、棉花和豆类物种中，优选地，在玉米、棉花、甜菜或豆类物种中。
安全剂优选选自下述物质构成的组：
A)式(S‑I)的化合物

其中符号和指数具有下述含义：
nA是0至5的自然数，优选地，0至3；
RA1是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、硝基或(C1‑C4)‑卤代烷基；
WA是未经取代的或经取代的二价杂环基团，其选自部分不饱和的或芳香族的、具有1至3个N或O型的杂环原子的五元杂环构成的组，其中环中存在至少一个氮原子和至多一个氧原子，优选地，是选自(WA1)至(WA4)构成的组的基团，

mA是0或1；
RA2是ORA3、SRA3或NRA3RA4或饱和或不饱和的3至7元的、具有至少一个氮原子和至多3个杂原子(优选来自O和S构成的组)的杂环，其经由氮原子与(S‑I)中的羰基联结，未经取代或被选自(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基和任选经取代的苯基构成的组的基团(优选地，式ORA3、NHRA4或N(CH3)2的基团，特别是式ORA3的基团)取代；
RA3是氢或未经取代或经取代的脂肪烃基团，其具有优选总共1至18个碳原子；
RA4是氢、(C1‑C6)‑烷基、(C1‑C6)‑烷氧基或经取代的或未经取代的苯基；
RA5是H、(C1‑C8)‑烷基、(C1‑C8)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑烷氧基‑(C1‑C8)‑烷基、氰基或COORA9，其中RA9是氢、(C1‑C8)‑烷基、(C1‑C8)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑烷氧基‑(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C6)‑羟基烷基、(C3‑C12)‑环烷基或三‑(C1‑C4)‑烷基甲硅烷基；
RA6、RA7、RA8相同或不同，并且是氢、(C1‑C8)‑烷基、(C1‑C8)‑卤代烷基、(C3‑C12)‑环烷基或经取代的或未经取代的苯基；
优选地：
a)二氯苯基吡唑啉‑3‑羧酸的类型的化合物，优选地，下述化合物，例如1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑(乙氧基羰基)‑5‑甲基‑2‑吡唑啉‑3‑羧酸乙酯(S1‑1)(“吡咯二酸二乙酯”，见Pestic.Man.)以及相关化合物，如WO 91/07874中描述的；
b)二氯苯基吡唑羧酸的衍生物，优选地下述化合物，例如，1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑甲基吡唑‑3‑羧酸乙酯(S1‑2)、1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑异丙基吡唑‑3‑羧酸乙酯(S1‑3)、1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑(1，1‑二甲基乙基)吡唑‑3‑羧酸乙酯(S1‑4)、1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑苯基吡唑‑3‑羧酸乙酯(S1‑5)和相关化合物，如EP‑A‑333 131和EP‑A‑269 806中描述的；
c)三唑羧酸类型的化合物，优选地，下述化合物，例如，解草唑(‑乙酯)，即1‑(2，4‑二氯苯基)‑5‑三氯‑甲基‑(1H)‑1，2，4‑三唑‑3‑羧酸乙酯(S1‑6)和相关化合物，如EP‑A‑174 562和EP‑A‑346 620中描述的；
d)5‑苄基‑或5‑苯基‑2‑异唑啉‑3‑羧酸或5，5‑二苯基‑2‑异唑啉‑3‑羧酸的类型的化合物，优选地，下述化合物，例如5‑(2，4‑二氯苄基)‑2‑异唑啉‑3‑羧酸乙酯(S1‑7)或5‑苯基‑2‑异唑啉‑3‑羧酸乙酯(S1‑8)和相关化合物，如WO 91/08202中描述的，或5，5‑二苯基‑2‑异唑啉羧酸乙酯(S1‑9)(“双苯恶唑酸”)或5，5‑二苯基‑2‑异唑啉羧酸正丙酯(S1‑10)或5‑(4‑氟苯基)‑5‑苯基‑2‑异唑啉‑3‑羧酸乙酯(S1‑11)，如专利申请WO‑A‑95/07897中描述的。
B)式(S‑II)的喹啉衍生物

其中符号和指数具有下述含义：
RB1是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、硝基或(C1‑C4)‑卤代烷基；
nB是0至5的自然数，优选地，0至3；
RB2是ORB3、SRB3或NRB3RB4或饱和或不饱和的3至7元的、具有至少一个氮原子和至多3个杂原子(优选来自O和S构成的组)的杂环，其经由氮原子与(S‑II)中的羰基联结，未经取代或被选自(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基和任选经取代的苯基构成的组的基团(优选地，式ORB3、NHRB4或N(CH3)2的基团，特别是式ORB3的基团)取代；
RB3是氢或未经取代或经取代的脂肪烃基团，并且具有优选总共1至18个碳原子；
RB4是氢、(C1‑C6)‑烷基、(C1‑C6)‑烷氧基或经取代的或未经取代的苯基；
TB是(C1‑或C2)‑烷二基(alkanediyl)链，其未经取代或被一个或两个(C1‑C4)‑烷基或[(C1‑C3)‑烷氧基]羰基取代；
优选地：
a)8‑喹啉氧基乙酸(S2)类型的化合物，优选地是，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸1‑甲基己酯(通用名“喹氧乙酸”(S2‑1))(见Pestic.Man.)，
丁‑1‑基(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸1，3‑二甲酯(S2‑2)，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸4‑烯丙氧基丁酯(S2‑3)，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸1‑烯丙氧基丙‑2‑酯(S2‑4)，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸乙酯(S2‑5)，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸甲酯(S2‑6)，
(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸烯丙酯(S2‑7)，
2‑(2‑亚丙基亚胺氧基)‑1‑乙基(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸酯(S2‑8)，2‑氧丙‑1‑基(5‑氯‑8‑喹啉氧基)乙酸酯(S2‑9)和相关化合物，如EP‑A‑86 750、EP‑A‑94 349和EP‑A‑191 736或EP‑A‑0 492 366中描述的，以及它们的水合物和盐，如WO‑A‑2002/034048中描述的。
b)(5‑氯‑8‑喹啉氧基)丙二酸类型的化合物，优选地，下述化合物，例如(5‑氯‑8‑喹啉氧基)丙二酸二乙酯、(5‑氯‑8‑喹啉氧基)丙二酸二烯丙酯、(5‑氯‑8‑喹啉氧基)丙二酸甲基乙酯和相关化合物，如EP‑A‑0 582 198中描述的。
C)式(S‑III)的化合物

其中符号和指数具有下述含义：
RC1是(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C2‑C4)‑烯基、(C2‑C4)‑卤代烯基、(C3‑C7)‑环烷基，优选地，二氯甲基；
RC2、RC3相同或不同，并且是氢、(C1‑C4)‑烷基、(C2‑C4)‑烯基、(C2‑C4)‑炔基、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C2‑C4)‑卤代烯基、(C1‑C4)‑烷基氨甲酰基‑(C1‑C4)‑烷基、(C2‑C4)‑烯基氨甲酰基‑(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基‑(C1‑C4)‑烷基、二氧杂环戊基‑(C1‑C4)‑烷基(dioxolanyl‑(C1‑C4)‑alkyl)、噻唑基、呋喃基、呋喃基烷基、噻吩基、哌啶基、经取代的或未经取代的苯基，或者RC2和RC3一起形成经取代的或未经取代的杂环，优选地，唑烷、噻唑烷、哌啶、吗啉、四氢嘧啶或苯并嗪环；
优选地：
二氯乙酰胺类型的活性化合物，其经常用作为出苗前安全剂(土壤作用安全剂)，例如，
“二氯丙烯胺(dichlormid)”(见Pestic.Man.)(＝N，N‑二烯丙基‑2，2‑二氯乙酰胺)，
“R‑29148”(＝3‑二氯乙酰基‑2，2，5‑三甲基‑1，3‑唑烷，来自Stauffer)，
“R‑28725”(＝3‑二氯乙酰基‑2，2，‑二甲基‑1，3‑唑烷，来自Stauffer)，
“解草酮(benoxacor)”(见Pestic.Man.)(＝4‑二氯乙酰基‑3，4‑二氢‑3‑甲基‑2H‑1，4‑苯并嗪)，
“PPG‑1292”(＝N‑烯丙基‑N‑[(1，3‑二氧杂环戊‑2‑基)甲基]二氯乙酰胺，来自PPG Industries)，
“DKA‑24”(＝N‑烯丙基‑N‑[(烯丙基氨基羰基)甲基]二氯乙酰胺，来自Sagro‑Chem)，
“AD‑67”或“MON 4660”(＝3‑二氯乙酰基‑1‑氧杂‑3‑氮杂‑螺[4，5]癸烷，来自Nitrokemia或Monsanto)，
“TI‑35”(＝1‑二氯乙酰基氮杂环庚烷，来自TRI‑Chemical RT)
“diclonon”(dicyclonone)或“BAS145138”或“LAB145138”(＝3‑二氯乙酰基‑2，5，5‑三甲基‑1，3‑二氮杂二环[4.3.0]壬烷，来自BASF)，以及“解草呋”或“MON 13900”(见Pestic.Man.)(＝(RS)‑3‑二氯乙酰基‑5‑(2‑呋喃基)‑2，2‑二甲基唑烷)。
D)式(S‑IV)的N‑酰基磺酰胺及它们的盐

其中
XD是CH或N；
RD1是CO‑NRD5RD6或NHCO‑RD7；
RD2是卤素、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑卤代烷氧基、硝基、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、(C1‑C4)‑烷基磺酰基、(C1‑C4)‑烷氧基羰基或(C1‑C4)‑烷基羰基；
RD3是氢、(C1‑C4)‑烷基、(C2‑C4)‑烯基或(C2‑C4)‑炔基；
RD4是卤、硝基、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑卤代烷氧基、(C3‑C6)‑环烷基、苯基、(C1‑C4)‑烷氧基、氰基、(C1‑C4)‑烷硫基、(C1‑C4)‑烷基亚磺酰基、(C1‑C4)‑烷基磺酰基、(C1‑C4)‑烷氧基羰基或(C1‑C4)‑烷基羰基；
RD5是氢、(C1‑C6)‑烷基、(C3‑C6)‑环烷基、(C2‑C6)‑烯基、(C2‑C6)‑炔基、(C5‑C6)‑环烯基、苯基或3至6元的含有选自氮、氧和硫构成的组的vD杂原子的杂环基，其中最后七个提到的基团被选自卤素、(C1‑C6)‑烷氧基、(C1‑C6)‑卤代烷氧基、(C1‑C2)‑烷基亚磺酰基、(C1‑C2)‑烷基磺酰基、(C3‑C6)‑环烷基、(C1‑C4)‑烷氧基羰基、(C1‑C4)‑烷基羰基和苯基以及在环状基团的情况下还有(C1‑C4)‑烷基和(C1‑C4)‑卤代烷基构成的组的vD个取代基取代；
RD6是氢、(C1‑C6)‑烷基、(C2‑C6)‑烯基或(C2‑C6)‑炔基，其中最后三个提到的基团被选自卤素、羟基、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基和(C1‑C4)‑烷硫基构成的组的vD个基团取代，或
RD5或RD6与携带它们的氮原子一起形成吡咯烷基或哌啶基基团；
RD7是氢、(C1‑C4)‑烷基氨基、二‑(C1‑C4)‑烷基氨基、(C1‑C6)‑烷基、(C3‑C6)‑环烷基，，其中后两个提到的基团被选自卤素、(C1‑C4)‑烷氧基、卤素‑(C1‑C6)‑烷氧基和(C1‑C4)‑烷硫基以及在环状基团的情况下还有(C1‑C4)‑烷基和(C1‑C4)‑卤代烷基构成的组的vD个取代基取代；
nD是0、1或2；
mD是1或2；
vD是0、1、2或3；
从这些中间，优选是N‑酰基磺酰胺类型的化合物，例如下式(S‑V)的，其是例如从WO 97/45016已知的

其中，
RD7是(C1‑C6)‑烷基、(C3‑C6)‑环烷基，，其中后两个提到的基团被选自卤素、(C1‑C4)‑烷氧基、卤素‑(C1‑C6)‑烷氧基和(C1‑C4)‑烷硫基以及在环状基团的情况下还有(C1‑C4)‑烷基和(C1‑C4)‑卤代烷基构成的组的vD个取代基取代；
RD4是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、CF3；
mD是1或2；
vD是0、1、2或3；
以及还有
酰基氨磺酰基苯甲酰胺，例如下式(S‑VI)的，其是例如从WO 99/16744已知的，

例如下述这些，其中，
RD5＝环丙基，且(RD4)＝2‑OMe(“环丙磺酰胺”，S3‑1)
RD5＝环丙基，且(RD4)＝5‑Cl‑2‑OMe(S3‑2)
RD5＝乙基，且(RD4)＝2‑OMe(S3‑3)
RD5＝异丙基，且(RD4)＝5‑Cl‑2‑OMe(S3‑4)，和
RD5＝异丙基，且(RD4)＝2‑OMe(S3‑5)；
以及，还有
式(S‑VII)的N‑酰基氨磺酰基苯基脲的类型的化合物，其是例如从EP‑A‑365484已知的

其中
RD8和RD9互相独立地是氢、(C1‑C8)‑烷基、(C3‑C8)‑环烷基、(C3‑C6)‑烯基、(C3‑C6)‑炔基，
RD4是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、CF3；
mD是1或2；
这些中特别是
1‑[4‑(N‑2‑甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]‑3‑甲基脲，
1‑[4‑(N‑2‑甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]‑3，3‑二甲基脲，
1‑[4‑(N‑4，5‑二甲基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]‑3‑甲基脲，
1‑[4‑(N‑萘酰基氨磺酰基)苯基]‑3，3‑二甲基脲，
G)来自羟基芳香族和芳香族‑脂肪族羧酸衍生物的类别的活性化合物，例如
3，4，5‑三乙酰氧基苯甲酸乙酯、3，5‑二甲氧基‑4‑羟基苯甲酸、3，5‑二羟基苯甲酸、4‑羟基水杨酸、4‑氟水杨酸、1，2‑二氢‑2‑氧代‑6‑三氟甲基吡啶‑3‑甲酰胺、2‑羟基肉桂酸、2，4‑二氯肉桂酸，如WO 2004084631、WO 2005015994、WO 2006007981、WO 2005016001中所述；
H)来自1，2‑二氢喹喔啉‑2‑酮的类别的活性化合物，例如
1‑甲基‑3‑(2‑噻吩基)‑1，2‑二氢喹喔啉‑2‑酮、1‑甲基‑3‑(2‑噻吩基)‑1，2‑二氢喹喔啉‑2‑硫酮、1‑(2‑氨基乙基)‑3‑(2‑噻吩基)‑1，2‑二氢喹喔啉‑2‑酮盐酸盐、1‑(2‑甲基磺酰基氨基乙基)‑3‑(2‑噻吩基)‑1，2‑二氢‑喹喔啉‑2‑酮，如WO 2005112630中所述的，
I)除了针对有害植物的除草剂作用之外，还对作物植物(例如稻)具有安全剂作用的活性化合物，例如，“哌草丹”或“MY‑93”(见Pestic.Man.)(＝S‑1‑甲基‑1‑苯基乙基哌啶‑1‑硫代羧酸酯)，其已知为用于稻以抵挡除草剂草达灭的损害的安全剂，
“杀草隆”或“SK 23”(见Pestic.Man.)(＝1‑(1‑甲基‑1‑苯基乙基)‑3‑对‑甲苯基‑脲)，其已知为用于稻以抵挡除草剂唑吡嘧磺隆的损害的安全剂，
“苄草隆”＝“JC‑940”(＝3‑(2‑氯苯基甲基)‑1‑(1‑甲基‑1‑苯基‑乙基)脲，见JP‑A‑60087254)，其已知为用于稻以抵挡多种除草剂的损害的安全剂，
“去草酮”或“NK 049”(＝3，3′‑二甲基‑4‑甲氧基二苯甲酮)，其已知为用于稻以抵挡多种除草剂的损害的安全剂，
“CSB”(＝1‑溴‑4‑(氯甲基磺酰基)苯)(CAS登记No.54091‑06‑4，来自Kumiai)，其已知为在稻中针对多种除草剂的损害的安全剂，
K)式(S‑IX)的化合物，
如WO‑A‑1998/38856中描述的

其中符号和指数具有下述含义：
RK1、RK2互相独立地是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑烷基氨基、二‑(C1‑C4)‑烷基氨基、硝基；
AK是COORK3或COORK4；
RK3、RK4互相独立地是氢、(C1‑C4)‑烷基、(C2‑C6)‑烯基、(C2‑C4)‑炔基、氰基烷基、(C1‑C4)‑卤代烷基、苯基、硝基苯基、苄基、卤代苄基、吡啶基烷基或烷基铵，
nK1是0或1，
nK2、nK3互相独立地是0、1或2；
优选地：(二苯基甲氧基)乙酸甲酯(CAS登记No.：41858‑19‑9)，
L)式(S‑X)的化合物
如WO A‑98/27049所述

其中符号和指数具有下述含义：
XL是CH或N，
nL在X＝N的情况下是0至4的整数，
在X＝CH的情况下是0至5的整数，
RL1是卤素、(C1‑C4)‑烷基、(C1‑C4)‑卤代烷基、(C1‑C4)‑烷氧基、(C1‑C4)‑卤代烷氧基、硝基、(C1‑C4)‑烷硫基、(C1‑C4)‑烷基磺酰基、(C1‑C4)‑烷氧基羰基、任选经取代的苯基、任选经取代的苯氧基，
RL2是氢或(C1‑C4)‑烷基，
RL3是氢、(C1‑C8)‑烷基、(C2‑C4)‑烯基、(C2‑C4)‑炔基或芳基，其中上文提到的每个含碳基团是未经取代的或被一个或多个(优选可多至三个)相同或不同的选自卤素和烷氧基构成的组的基团取代；
或其盐，
M)3‑(5‑四唑基羰基)‑2‑喹诺酮的类别的活性化合物，例如
1，2‑二氢‑4‑羟基‑1‑乙基‑3‑(5‑四唑基羰基)‑2‑喹诺酮(CAS登记No.：219479‑18‑2)、1，2‑二氢‑4‑羟基‑1‑甲基‑3‑(5‑四唑基羰基)‑2‑喹诺酮(CAS登记No.：95855‑00‑8)，如WO‑A‑1999000020所述
N)式(S‑XI)或(S‑XII)的化合物，
如WO‑A‑2007023719和WO‑A‑2007023764所述

其中
RN1是卤素、(C1‑C4)‑烷基、甲氧基、硝基、氰基、CF3、OCF3，
Y、Z互相独立地是O或S，
nN是0至4的整数，
RN2是(C1‑C16)‑烷基、(C2‑C6)‑烯基、(C3‑C6)‑环烷基、芳基、苄基、卤代苄基，
RN3是氢、(C1‑C6)烷基，
O)选自下述物质构成的组的一种或多种化合物：
1，8‑萘酐，
O，O‑二乙基S‑2‑乙基硫代乙基二硫代磷酸酯(乙拌磷)，
4‑氯苯基甲基氨基甲酸酯(mephenate)，
O，O‑二乙基O‑苯基硫代磷酸酯(dietholate)，
4‑羧基‑3，4‑二氢‑2H‑1‑苯并吡喃‑4‑乙酸(CL‑304415，CAS登记No.：31541‑57‑8)，
2‑丙烯基1‑氧杂‑4‑氮杂螺[4.5]癸烷‑4‑硫代羰酸酯(MG‑838，CAS登记No.：133993‑74‑5)，
[(3‑氧代‑1H‑2‑苯并硫代吡喃‑4(3H)‑亚基)甲氧基]乙酸甲酯(来自WO‑A‑98/13361；CAS登记No.：205121‑04‑6)，
氰基甲氧基亚氨基(苯基)乙腈(解草胺腈)，
1，3‑二氧杂环戊烷‑2‑基甲氧基亚氨基(苯基)乙腈(解草腈)，
4′‑氯‑2，2，2‑三氟苯乙酮O‑1，3‑二氧杂环戊烷‑2‑基甲基肟(氟草肟)，
4，6‑二氯‑2‑苯基嘧啶(解草啶)，
2‑氯‑4‑三氟甲基‑1，3‑噻唑‑5‑羧酸苄酯(解草胺)，
2‑二氯甲基‑2‑甲基‑1，3‑二氧戊烷(MG‑191)，
包括立体异构体以及惯常用于农业中的盐。
类似地，与其它已知活性化合物，例如杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、驱鸟剂、植物养分和土壤结构改进剂也是可能的。
一些安全剂已经作为除草剂已知，因此，除了针对有害植物的除草剂作用之外，它们还通过保护作物植物发挥作用。除草剂(混合物)与安全剂的重量比通常取决于除草剂应用率和目的安全剂的有效性，并可在宽的限度内变动，例如在200∶1至1∶200的范围内，优选在100∶1至1∶100的范围内，特别是20∶1至1∶20的范围内。安全剂可被类似地配制进式(I)化合物或它们与其它除草剂/杀虫剂的混合物，并且作为完成的制剂或作为与除草剂的罐混剂提供并使用。
式(I)化合物所需要的应用速根据外部条件(例如温度、湿度和使用的除草剂的类型)等等而变动。其可在宽的限度内变动，例如0.001至10000g/公顷及更多的活性物质；但是其优选在0.5至5000g/公顷之间，特别优选为0.5至1000g/公顷，并且非常特别优选为0.5至500g/公顷。
当本发明的转基因植物含有一种或多用用于针对其它除草剂的耐受性的基因(例如，编码经突变的或未经突变的EPSPS的基因，其对植物赋予对草甘膦除草剂的耐受性，或者pat或bar基因，其赋予对草铵膦除草剂的耐受性)时，或者当转基因植物天然对其它除草剂具有抗性(例如磺酰脲耐受性)时，根据本发明的方法可包含同时或依时序交错组合应用HPPD抑制剂与所述除草剂或除草剂组合(例如草甘膦和/或草铵膦和/或磺酰脲除草剂)。
本发明还涉及编码本发明的HPPD的嵌合基因作为标志物基因在转化植物物种期间的用途，所述用途基于在上述HPPD抑制剂型除草剂上进行的选择。
本发明还涉及获得对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂有抗性的植物的方法，其特征在于，用在植物中表达本文定义的本发明的HPPD的嵌合基因转化植物。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及用于获得对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂有抗性的植物的所述方法，其特征在于，本发明的HPPD包含SEQ ID No.4(从第2位氨基酸至第350位氨基酸)或经改造适于玉米、稻、小麦、豆类物种、甘蔗、洋葱、芸苔属物种的植物或棉花的密码子选择的编码本发明的HPPD的合成DNA。
在另一特别的实施方式中，本发明还涉及用于获得对选自环磺酮、甲基磺草酮、二酮腈、异氟草、磺草酮、庄无忌和bicyclopyrone的三酮HPPD抑制剂有抗性的植物的所述方法。
在另一特别的实施方式中，本发明涉及用于获得对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂有抗性的植物的所述方法，其特征在于，所述植物还包含可在植物中表达的嵌合基因，所述基因编码PDH(预苯酸脱氢酶)酶或者至少具有PDH的酶。
本发明还涉及用于在区域或田间控制杂草的方法，所述方法包括在该区域或田间栽种对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂有抗性的、根据上文所述的方法获得的经转化的植物，或者来自它们的种子，以及应用对杂草有毒性的剂量的所述三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂，但不会显著影响到所述经转化的种子或所述经转化的植物。
本发明还涉及获得油或膳食的方法，所述方法包括种植对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂有抗性的、根据上文所述的方法获得的经转化的植物，或者来自此类植物的经转化的种子，任选地，用三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂处理此类植物或种子，收获谷粒，以及碾磨谷粒以制造膳食和提取油。
本发明还涉及如上文所述的本发明的HPPD的用途，其特征在于，所述HPPD抑制剂是选自环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌和磺草酮的三酮HPPD抑制剂。
本发明还涉及宿主生物，特别是植物细胞或植物，其含有包含编码根据本发明的HPPD的序列的嵌合基因，并且其还含有在该宿主生物中具有功能的基因，允许预苯酸脱氢酶(本文缩写为PDH)的过量表达。
术语“PDH酶”在本文中使用时指展示出预苯酸到HPP的转化的PDH活性的任何天然或经突变的PDH酶。特别地，所述PDH酶可来自任何类型的生物。可通过使得能测量预苯酸底物的量的减少或者能测量源于酶促反应的产物(即HPP或者辅因子NADH或NADPH之一)的积累的任何方法，来鉴定具有PDH活性的酶。
文献中描述了编码PDH酶的很多基因，它们的序列可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/中找到。特别已知的是编码酿酒酵母的PDH酶的基因(检索号S46037)(如Mannhaupt等人(1989)Gene 85，303‑311所述)，编码芽孢杆菌属的细菌(特别是枯草芽孢杆菌物种)的PDH酶的基因(检索号P20692)(如Henner等人(1986)Gene 49(1)147‑152中所述)，编码埃希氏菌属的细菌(特别是大肠杆菌物种)的PDH酶的基因(检索号KMECTD)(如Hudson等人(1984)J.Mol.Biol.180(4)，1023‑1051中所述)，编码欧文氏菌属的细菌(特别是草生欧文菌物种)的PDH酶的基因(检索号S29934)(如Xia等人(1992)J.Gen.Microbiol.138(7)，1309‑1316中所述)。
本发明还涉及获得对HPPD抑制剂有抗性的宿主生物(特别是植物细胞或植物)的方法，这通过将如上文定义的至少一种核酸序列或一种嵌合基因整合进此类生物，以及还同时或依序用在该宿主生物中具有功能以允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶表达的基因转化它来实现。
在一种特别的实施方式中，本发明涉及获得对三酮或pyrazolinate HPPD抑制剂(特别是环磺酮、甲基磺草酮、苯吡唑草酮、bicyclopyrone、庄无忌或磺草酮)有抗性的宿主生物(特别是植物细胞或植物)的方法。
可用于获得用允许HPPD酶过表达的基因以及用允许PDH酶过表达的基因二者转化过的宿主生物(特别是植物细胞或植物)的方式和方法被广泛描述于WO 04/024928中，其内容通过引用并入本文。
本说明书中提到任何在先公开文本(或源于其的信息)或者提到任何已知的内容，并不被、也不应当被认为是认可或承认任何形式的下述暗示：此类在先的公开文本(或信息)或已知内容形成本发明的领域中公知常识的一部分。
图
图1，质粒pSE420::FMP38e的图谱
图2，插入进烟草植物中的T‑DNA的图谱
图3，根据实施例5至13插入不同植物的T‑DNA的图谱；缩写具有下述含义
A、B、C和G，烟草植物，D、E和F，玉米植物，H，大豆植物，I，稻植物，以及J，棉花植物。35S：CaMV35S启动子，KanR：赋予对抗生素卡那霉素的抗性的基因，nos：胭脂氨酸合酶启动子，Ter：终止子，H6：编码His标签的序列，OTP：经优化的转运肽，BAR(双丙氨酰膦抗性，WO 8705629)和PAT(膦丝菌素N‑乙酰转移酶，EP 257542)：赋予对双丙氨酰膦、膦丝菌素或草铵膦的耐受性的基因，2mEPSPS：编码来自玉米的双突变体(Thr102Ile和Pro106Ser)EPSPS(5‑烯醇丙酮基莽草酸合酶)的基因(US 20030027312)，2mAHAS：编码来自拟南芥属的双突变体ALS(乙酰乳酸合酶)(Pro197Ala和Trp574Leu；US 5378824)，HA：来自拟南芥属基因的组蛋白启动子，TEV：烟草蚀刻病毒，FMP38e：针对在大肠杆菌中的表达而优化的编码FMP38的基因，其在其最5’端具有编码His标签的序列，FMP38t：针对在双子叶植物中的表达而优化的编码FMP38的基因，其在其最5’端具有编码His标签的序列，FMP38t‑h，针对在双子叶植物中的表达而优化的编码FMP38的基因，FMP38m，针对在玉米植物中的表达而优化的编码FMP38的基因，LB，左边界，RB，右边界。
序列表
SEQ ID No.1：编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.2：针对大肠杆菌而优化的编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列，其在5’端含有编码丙氨酸和6个组氨酸氨基酸的核酸。
SEQ ID No.3：针对烟草(Nicotiana tabaccum)而优化的编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列，其在5’端含有编码经优化的转运肽和HIS标签的核酸序列。
SEQ ID No.4：聚球藻属物种HPPD氨基酸序列，源于SEQ ID No.1。
SEQ ID No.5：SEQ ID No.2编码的蛋白。
SEQ ID No.6：与OTP(经优化的转运肽(WO 2009/144079))融合的聚球藻属物种HPPD氨基酸序列(SEQ ID No.4)。
SEQ ID No.7：SEQ ID No.3编码的蛋白。
SEQ ID No.8：编码拟南芥HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.9：拟南芥HPPD氨基酸序列。
SEQ ID No.10：SEQ ID No.8编码的蛋白加上在起头的氨基酸甲硫氨酸直接下游的额外的丙氨酸，之后是6个组氨酸的氨基酸。
SEQ ID No.11：SEQ ID No.9的蛋白，加上位于所述蛋白最N‑末端的OTP序列。
SEQ ID No.12：SEQ ID No.10的蛋白，加上直接位于所述蛋白最N‑末端的OTP序列。
SEQ ID No.13：引物序列Xho‑OTP‑for。
SEQ ID No.14：引物序列NcoI‑OTP‑rev。
SEQ ID No.15：编码从菌株JA‑2‑3B’a获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.16：SEQ ID NO：15编码的蛋白质。
SEQ ID No.17：针对双子叶植物优化的编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.18：针对玉米植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.18：针对玉米植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.19：针对欧洲油菜植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.20：针对甜菜(Beta vulgaris)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.21：针对陆地棉(Gossypium hirsutum)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.22：针对大豆(Glycine max)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.23：针对大麦(Hordeum vulgare)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.24：针对稻(Oryza sativa)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
SEQ ID No.25：针对小麦(Triticum aestivum)植物优化的、编码从菌株JA‑3‑3Ab获得的聚球藻属物种HPPD的核酸序列。
实施例
在下文实验实施例的协助下，本发明的多个方面将被更好地理解。下文这些实施例中描述的所有方法或操作都是以举例的方式提供的，并且对应于从达到相同或相似结果可获得的不同方法中做出的选择。该选择对于结果的品质没有影响，并且，由此，技术人员可使用任何合适的方法来达到相同或相似的结果。用于操作DNA片段的大多数方法被描述于″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes 1 and 2，Ausubel F.M.等人，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience(1989)出版的，或Molecular cloning，T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，1982，或Sambrook J.and Russell D.，2001，Molecular Cloning：a laboratory manual(第三版)中。
实施例1
制备SEQ ID No.5的聚球藻属物种HPPD(命名为FMP38e)和由SEQ ID No.10确定的拟南芥HPPD
最初，将拟南芥AtHPPD编码序列(1335bp；Genebank AF047834；WO 96/38567)克隆进表达载体pQE‑30(QIAGEN，Hilden，德国)的BamHI和HindIII限制性位点之间。获得的载体被称为“pQE30‑AtHPPD”。
使用大肠杆菌K12优化的密码子选择(Eurofins MWG operon (Ebersberg，德国)，GENEius软件)，修饰和合成编码UniProtKB/TrEMBL中以检索号Q2JX04列出的蛋白的原始聚球藻属物种Ss HPPD序列(1053bp)，并将其克隆进经修饰的pBluescript载体(Eurofins MWG operon，Ebersberg，德国)。在该载体中，对应于MCS(多克隆位点)的序列被部分除去，仅对应于限制性酶HindIII的识别的序列保留在插入序列的两端。
在5’端，直接在ATG下游，插入编码丙氨酸的核酸序列和编码N‑末端HIS6‑标签(6x HIS，是cac cat cac cat cat cac编码的)的核酸序列。在ATG上游，添加了两个额外的半胱氨酸碱基对，以获得对应于限制性酶NcoI的识别位点的序列，以及在终止密码子的下游，添加了对应于限制性酶XbaI的识别位点的序列。用限制性酶NcoI和XbaI消化得到的载体“pBluescript‑FMP38e”，通过电泳在琼脂糖凝胶上分离没有移动到大约3000bp(对应于DNA)的载体尺寸的长度的条带。然后使用MinEluteTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化编码HPPD的DNA，并将其克隆进之前用相同限制性酶切割过的pSE420(RI)NX载体(见下文)。
克隆和表达载体pSE420(RI)NX(5261bp)基于Invitrogen(Karlsruhe，德国)的质粒pSE420。对该载体的修饰包括添加nptII基因(新霉素磷酸转移酶；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning：a laboratory manual(第三版))，该基因赋予对抗生素卡那霉素的抗性，并且缺少超级连接子区域(多克隆位点)的大部分。
质粒具有trp‑lac(trc)启动子和lacIq基因(在每种大肠杆菌宿主菌株中提供lac遏制子)。lac遏制子与lac操纵基因(lacO)结合，并且限制靶基因的表达；这种抑制可通过用异丙基β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导来减轻。
得到的载体被称为“pSE420(RI)NX‑FMP38e”(见图1)，其被用于转化大肠杆菌BL21细胞(Merck，Darmstadt，德国)。
关于被用作为参照的AtHPPD(拟南芥HPPD)，见WO 2009/144079。
在含有pQE30‑AtHPPD或pSE420(RI)NX‑FMP38e的大肠杆菌K‑12BL21中进行HPPD的表达。令细胞生长直到OD达到0.5，然后通过用1mM IPTG(与lac遏制子结合并导致其从lac操纵子解离)诱导，从trp‑lac(trc)启动子启动表达。表达在28℃进行15小时。
为制备预起始培养物，用50μL大肠杆菌K‑12BL21甘油贮液接种2mL TB培养基(100μg＊mL‑1羧苄青霉素)。于37℃在140rpm的振荡下对预起始培养物培育15小时。用200μl预起始培养物启动起始培养物(补充有100μg＊L‑1的5mL TB)，起始培养物在37℃被培育3小时。
为制备主培养物，用4mL起始培养物接种400mL TB培养基(100μg＊mL‑1羧苄青霉素)。于37℃在140rpm振荡下对该起始培养物加以培育，直到达到OD6000.5。然后用400μl 1M IPTG溶液诱导重组蛋白表达。令细胞再在这些条件下生长一小时，然后将温度降低至28℃，在140rpm振荡培养物15小时。通过在4℃以6000xg离心15分钟，收获细胞。细胞沉淀物被贮藏于‑80℃。
天然形式的His6‑AtHPPD和His6‑FMP38e的分离和纯化
细胞裂解
使用裂解酶(切割形成细菌细胞壁的肽聚糖中N‑乙酰基胞壁酸和N‑乙酰基‑D‑葡糖胺残基之间的1，4‑β‑键的酶)。然后通过细菌细胞的内部压力破坏细胞膜。此外，裂解缓冲液含有核酸酶，这是水解所有形式的DNA和RNA但是不损害蛋白由此能大大降低细胞裂解液的粘度的内切核酸酶。自然条件下的裂解在冰上进行。
为纯化His6‑标签化的蛋白，按照用户操作说明书使用Ni‑NTA Fast Start试剂盒。
通过固定的金属离子亲和层析(IMAC)来纯化His6‑标签化的蛋白
将对裂解反应进行离心之后获得的澄清的细胞裂解液(10mL)上样到Ni‑NTA Fast Start柱(来自Ni‑NTA Fast Start试剂盒(Qiagen，Hilden，德国))上，按照操作说明书进行纯化。用2.5mL洗脱缓冲液来洗脱His6‑标签化的蛋白。
通过凝胶过滤对HPPD溶液脱盐
按照用户操作说明书，将用2.5mL洗脱缓冲液从Ni‑NTA Fast Start柱上洗脱的HPPD溶液应用到Sephadex G‑25 PD‑10柱(GE Healthcare，Freiburg，德国)上。全部样品都进入凝胶床之后，用3.5mL贮藏缓冲液进行洗脱。
将从脱盐柱上洗脱的HPPD溶液于‑80℃以1mL等分试样冷冻。
使用Bradford蛋白检验测定HPPD蛋白浓度
使用标准Bradford检验(Bradford，(1976)，Anal Biochem 72：248‑254)来测定蛋白浓度。
使用SDS‑PAGE测定HPPD溶液的纯度
使用凝胶Novex 4‑12％ Bis‑Tris Gels(Invitrogen，Karlsruhe，德国)，通过SDS‑PAGE蛋白凝胶电泳来检查洗脱的蛋白的完整性，大约10μg蛋白被上样。向1‑10μL蛋白溶液中加入10μL Laemmli样品缓冲液，在90℃对混合物温育10分钟。短的离心步骤之后，将全部混合物上样进之前固定于XCell SureLockTM Novex Mini‑Cell凝胶腔(填装有MOPS SDS运行缓冲液(用ddH2O从20x溶液稀释的))中的SDS凝胶槽中。然后向凝胶腔应用150V，进行1小时。为染色蛋白条带，将凝胶浸入考马斯亮蓝R‑250染色溶液中。为对聚丙烯酰胺凝胶脱色，将其浸入考马斯亮蓝R‑250脱色溶液中，直到蛋白条带在白色凝胶上呈现为蓝色。
实施例2
HPPD酶“SEQ ID No.5”和“SEQ ID No.10”对HPPD抑制剂的耐受性的动力学表征和评估。
通过标准分光光度检验(广泛描述于WO 2009/144079中的方法)来检查HPPD活性
HPPD体外动力学性质的测定
使用HPLC检验，测定针对不同HPPD酶制备物的Km、Vmax和kcat值以及针对不同HPPD抑制剂的Ki、K1＝Kon和K‑1＝Koff，以测量HPPD活性。检验混合物在1ml的体积中含有150mM Tris‑HCl缓冲液(pH 7.8)、10mM抗坏血酸钠、650个单位的牛过氧化氢酶(Sigma C30(Sigma‑Aldrich，Munich，德国)，34mg蛋白/ml，23,000单位/mg)以及适量HPP、经纯化的HPPD和HPPD抑制剂。对于Km、Vmax和kcat值测定，检验混合物中的HPP浓度在10至400μM之间变动。对于Ki、K1＝Kon和K‑1＝Koff值测定，使用2mM HPP。所有检验都通过向检验混合物中添加HPPD酶来开始，并在0至240秒的一系列时间后通过向含有20μl 10％高氯酸的反应检验管中添加200μl反应混合物来停止。通过在10,000g离心5分钟来沉降沉淀的蛋白。将100μl上清液上样到用10％甲醇、0.1％三氟乙酸(缓冲液A)平衡过的250x 4mm Knauer(Berlin，德国)Eurospher100‑5 C18‑柱上。用缓冲液A也以1.5ml/分钟的流速进行4分钟洗涤，接着用95％的甲醇进行3分钟洗涤，再用缓冲液A进行2分钟洗涤，来洗脱柱。在292nm处监测HGA(尿黑酸)和HPP(羟苯基丙酮酸)的洗脱。大约5分钟时洗脱HGA，之后洗脱HPP。用HGA的标准浓度组提供标准曲线，以校正HGA峰对HGA浓度的292nm吸光度。
为进行Km和Vmax值测定，从形成的HGA对时间的图来测定不同底物浓度处HPPD反应的最初速率，使用ID Business Solutions Ltd.(www.idbs.com)XLfit软件套装，将其拟合至针对单反应酶(unireactant enzymes)的Michaelis‑Menten等式。为测定Ki、K1＝Kon和K‑1＝Koff值，使用ID Business Solutions Ltd.XLfit软件套装，将不同抑制剂浓度下HPPD反应的时间过程拟合至针对机制A，竞争性抑制，针对紧密结合抑制剂的等式(Cha，S.(1975)Tight‑binding inhibitors‑I.Kinetic behaviour.Biochemical Pharmacology 24，2177‑2185)。
表1：对HPPD酶(拟南芥“SEQ ID No.10”和聚球藻属物种“SEQ ID No.5”)的动力学表征和它们对HPPD抑制剂环磺酮和二酮腈的分别的耐受性
在下面给出的表1中，“Km”(Michaelis‑Menten常数)表示用于表征酶的动力学参数，其被定义为允许达到反应最大速率的一半的底物浓度。Km进一步被定义为反应速率达到其最大值的一半(Vmax/2)时的底物浓度，其中Vmax的含义是反应的最大速度。
Kon＝K1等于酶‑底物结合的结合速率常数，而Koff＝K‑1等于酶‑抑制剂复合体解离的速率常数。Ki定义了抑制剂常数。

在上表1中，可以清楚看出，尽管细菌HPPD“SEQ ID No.5”和植物HPPD“SEQ ID No.10”的动力学参数Km和Vmax没有显示出任何显著的差异，细菌HPPD“SEQ ID No.5”远比植物HPPD“SEQ ID No.10”对测试的HPPD抑制剂更耐受。
在存在若干HPPD抑制剂时测定HPPD活性
在该内容中，pI50‑值表示以摩尔浓度表示的抑制50％酶活性所需的抑制剂浓度的对数值。
使用WO 2009/144079中广泛描述的检验，以2mM固定的HPP浓度和3分钟的固定的温育时间，使用ID Business Solutions Ltd.XLfit软件套装，从HPPD活性对抑制剂浓度的剂量应答图来测定针对HPPD抑制剂的pI50‑值。
表2：测定pI50 HPPD酶(拟南芥(SEQ ID No.10)和聚球藻属物种(SEQ ID No.5))和它们对下面列出的若干HPPD抑制剂环磺酮、二酮腈、甲基磺草酮、bicyclopyrone、pyrasulfotole、磺草酮、吡唑特、庄无忌和吡草酮的分别的耐受性。符号“＞＞”表示值远比指出值的要高，但是在测试的抑制剂浓度范围(2.5x10‑6、5.0x10‑6、1.0x10‑5、2.5x10‑5、6.3x10‑5、2.5x10‑4M)内无法精确计算。


表3：针对来自拟南芥(SEQ ID No.10)和聚球藻属物种(SEQ ID No.5)的HPPD，测定在存在5.0x10‑6M抑制剂时较之在不存在抑制剂时测量的活性的抑制百分比。


在上表2和3中，可以清楚看出，在所有测试的HPPD抑制剂浓度下，细菌HPPD“SEQ ID No.5”较之通过用HPPD“SEQ ID No.10”在相同实验条件下观察到的较之植物都显示出针对所有测试的HPPD抑制剂更高的耐受性水平。
实施例3：构建嵌合基因，用于在烟草植物中评估HPPD抑制剂型除草剂耐受性
A)构建嵌合基因
含有编码OTP的序列的载体pRP‑RD224(被广泛描述于WO2009/144079中)被用于对应于限制性酶XhoI的识别位点的核酸序列上游和对应于限制性酶NcoI的识别位点的核酸序列下游的PCR介导的连接。按照用户操作说明书，将获得的PCR产物克隆进载体‑BluntII‑(Invitrogen，Karlsruhe，德国)。得到的载体被称为“pCR‑TOPO‑OTP”。按照标准DNA测序来验证正确序列的插入。用限制性酶NcoI和XhoI消化对应于OTP的DNA，通过合适的凝胶电泳分离，并克隆进之前已相应地用NcoI和XhoI限制性酶消化的质粒pRT100(Toepfer，(1987)，Nucleic Acids Res 15：5890)中。质粒pRT100含有CaMV35S启动子和CaMV35S终止子。随后用限制性酶NcoI和XbaI消化得到的载体。用限制性酶NcoI和XbaI处理载体pSE420(RI)NX‑FMP38e(见图1)，以获得对应于“SEQ ID No.2”的DNA片段。通过用限制性酶HindIII消化得到的载体，将CaMV35S::OTP::FMP38e::CaMV35‑term盒(见图2)亚克隆进之前用相同的酶消化过并去磷酸化的二元载体pBin19(Bevan(1984)，Nucleic Acids Res.12：8711‑8721.)中。得到的载体被称为“FMP38ebv”。
用载体pQE‑30‑AtHPPD进行NcoI限制性位点和编码加到5’端的N‑末端His6‑标签的序列和加到AtHPPD的3’端的XbaI限制性位点的PCR介导的连接。
从琼脂糖凝胶分离AtHPPD基因的PCR产物，用限制性酶NcoI和XbaI切割，用MinEluteTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化，并克隆进用相同限制性酶切割过的pSE420(RI)NX载体。
产生的载体被称为“pSE420(RI)NX‑AtHPPD”，用限制性酶NcoI和XbaI消化其，并将其克隆进之前开口的载体pRT100(Toepfer等人，(1987)，Nucleic Acids Res 15：5890)，该载体含有CaMV35S启动子和CaMV35S终止子。产生的载体被称为“pRT100‑AtHPPD”。
用限制性酶NcoI和XhoI消化载体pCR‑TOPO‑OTP，将对应于OTP的DNA条带克隆进之前用上述限制性酶开口的载体pRT100‑AtHPPD。随后用限制性酶HindIII消化得到的载体，将感兴趣的表达盒克隆进之前开口并去磷酸化的二元载体pBin19。得到的载体被称为“AtHPPDbv”。
用二元载体FMP38ebv和AtHPPDbv转化根癌农杆菌(ATHV，源于EHA101)感受态细胞，在补充有抗生素卡那霉素和利福平的YEB培养基上进行选择(之前在专利申请US005925808A中被广泛描述过)
用含有感兴趣的二元载体(FMP38ebv或AtHPPDbv)的这些农杆菌属的菌株转化来自烟草Nicotiana tabacum L.cv Samsun NN植物的叶盘(其具有大约5x5mm2的尺寸)(如Horsch等人，(1985)，Science 227；1229‑1231中广泛描述的)。
将叶盘与含有二元载体FMP38ebv或AtHPPDbv的根癌农杆菌细胞一起共培养两天。然后将叶盘转至培养基，以允许枝条在MS(Musharige and Skoog，(1962)，Physiol Plant 15(3)：473‑497)培养基上再生6周，所述培养基补充有BAP(1mg/mL；苄基氨基嘌呤)、羧苄青霉素(250mg/mL)、头孢噻肟(250mg/mL)、卡那霉素(75mg/mL)和环磺酮(10‑6M)。
将再生的愈伤组织转移到培养基上，以诱导根发育6至12周：MS(1/2)，其中补充有羧苄青霉素(250mg/mL)、头孢噻肟(250mg/mL)、卡那霉素(75mg/mL)和环磺酮(10‑6M)。
在该培养基上6周后，将用含有二元载体AtHPPDbv的根癌农杆菌转化的枝条转移到耗尽了HPPD抑制剂环磺酮的相同培养基上。
结果概括于下表3。
在整个实验期间，含有叶盘的平板被放置于受控条件下的生长腔中(光16小时，黑暗8小时，25℃)
愈伤组织的生根
将来自用编码包含SEQ ID No.11(拟南芥)或SEQ ID No.7(聚球藻属物种)的HPPD的核酸序列转化的细胞的再生枝条愈伤组织转移到诱导根生长的培养基上，培养6至12周，所述培养基还补充有HPPD抑制剂环磺酮。在含有SEQ ID No.11(拟南芥)定义的HPPD的事件上，或在经转化的愈伤组织上，在上述给定的条件下均没有观察到根的生长。与之相反，在相同条件下，含有SEQ ID No.7定义的HPPD的愈伤组织清楚地发育出大量健康的根(见下表4)。
表4

叶盘再生
从含有HPPD SEQ ID No.11(拟南芥)或SEQ ID No.7(聚球藻属物种)的植物切下叶盘，再在标准培养条件下，在补充有BAP(1mg/mL；苄基氨基嘌呤)、羧苄青霉素(250mg/mL)、头孢噻肟(250mg/mL)的MS培养基上再生6周，所述培养基还以提到的浓度包含下述列出的HPPD抑制剂之一(环磺酮(10‑6M)、二酮腈(5.10‑6M)、甲基磺草酮(10‑6M)和bicyclopyrone(10‑6M))，使用不含HPPD抑制剂的培养基作为阳性对照。在实验结束时，按照下文所述评估再生水平：
“‑”表示叶盘看起来和补充有上文所述的抑制剂的培养基上的来自野生型烟草植物的叶盘相同。
“++++”表示叶盘看起来像在没有抑制剂的培养基上的来自野生型烟草植物的叶盘。
“+”、“++”和“+++”指再生的叶盘被抑制剂的存在严重(+)、中度(++)和较少(+++)影响。
实验结果概括于表5中。
表5：多种HPPD抑制剂对来自包含编码从拟南芥属(SEQ ID No.11)或从聚球藻属物种(SEQ ID No.7)获得的HPPD的基因的转基因植物的叶盘的再生的影响。

虽然在含有SEQ ID No.7(聚球藻属物种)定义的HPPD的植物的情况下，显示出较之该未经处理的对照而言相同或仅轻微降低的再生，但含有SEQ ID No.11(拟南芥)定义的HPPD的相应植物却没有显示出任何再生，但是在所有测试的HPPD抑制剂存在时，较之未经处理的对照均清楚发育出可见的褪色表型。
实施例4：温室试验，以评估表达编码耐受性HPPD蛋白的转基因烟草植物对HPPD抑制剂型除草剂的耐受性
制备表达拟南芥属或FMP38 HPPD酶的转基因植物品系。温室测试除草剂耐受性
对环磺酮、异氟草和bicyclopyrone的应答
将上文提到的(实施例3)含有来自拟南芥属的编码HPPD的基因或来自聚球藻属物种的编码FMP38HPPD的基因FMP38e的T0烟草植物转移到温室(28/20℃)，以进一步发育和产生种子。收获这些种子，将其放到土壤(ED73，混合有沙子和奥绿肥(osmocote)Pro)，以在温室中发芽(28/20℃)。三至四周后，将小植物转移到含有上文提到的土壤的单个罐中。两周后，用下述物质喷雾尺寸为4‑6cm直径的植物
‑环磺酮，100gAI/公顷，其是从WP20(可润湿粉末20％)制剂制备的，所述制剂补充有硫酸铵和甲基酯raps油，或
‑异氟草，100gAI/公顷，其是从WP20制剂制备的，所述制剂补充有硫酸铵和甲基酯raps油，或
‑“盲制剂”，其是从没有活性成分(AI)的WP20制剂制备的，所述制剂补充有硫酸铵和甲基酯raps油，然后转移到具有充足光条件(20000Lux)的生长腔中。
应用(DAT)不同除草剂后七天，较之在以与含有转基因的烟草植物相同时间和相同条件被喷雾的野生型烟草植物上观察到的应答，评估转化的植物的症状(100％表示植物显示出与野生型植物相同的褪色表型，0％表示植物看起来像用“盲制剂”处理的野生型植物，中间的百分比代表观察到的症状的程度)。
表6：野生型烟草植物(A)，和含有作为备选的上文描述的具有启动子CaMV 35S、编码OTP的序列和编码拟南芥属HPPD的序列(B)或启动子CaMV35S、编码OTP的序列和编码HPPD FMP38的序列FMP38e(C)的表达盒的T1种群。通过喷雾应用100g AI/公顷的环磺酮或异氟草(补充有硫酸铵和甲基酯raps油)后7天，评估除草剂损害。清楚地，含有FMP38e基因的植物对环磺酮和异氟草远更耐受。属于组别(B)和(C)的植物在除草剂应用之前没有经过针对各转基因的存在的选择。






对bicyclopyrone的应答
野生型烟草植物和携带来自聚球藻属物种的编码HPPD的基因FMP38e的T1烟草植物的种子被播种于补充有50g/L卡那霉素的MS培养基(Murashige and Skoog 1964)上。四周后，将绿色小植物转移至土壤，如上文所述在温室培养三周，然后用含有bicyclopyrone(100g AI/公顷)、硫酸铵和甲基酯raps油的混合物对其喷雾。基于处理后七天应答于除草剂发展出的表型将植物分类到两个组别中。类别I被定义为应答于除草剂处理展示出没有损伤至轻微损伤的植物(损伤：0‑30％)，类别II被定为展示出强烈损伤至与在进行相同处理的野生型植物上看到的损伤相似的损伤的植物(损伤：31‑100％)。在这种情况下，仅含有至少一种T‑DNA的植物被暴露给除草剂处理。
表7

含有HPPD FMP38的植物展示出对HPPD抑制剂型除草剂bicyclopyrone的耐受性。
可从上面给出的数据概括出，从若干独立的转基因事件获得的表达来自聚球藻属物种的编码FMP38 HPPD的基因FMP38e的植物对在标准农艺学条件下应用的剂量的若干HPPD抑制剂型除草剂高度耐受。
实施例5：构建二元载体，以在植物中表达若干经双子叶植物优化的变体，以及温室测试，以评估含有此类变体的烟草植物的耐受性
FMP38t(SEQ ID No.3)、FMP38t‑h(SEQ ID No.17)克隆进pBin19
设计具有针对在双子叶植物中的表达而优化过的密码子选择的、编码HPPD蛋白FMP38的基因，将其命名为FMP38t‑h(SEQ ID No.17)，具有在其最5’端处的编码OTP和HIS TAG的额外序列的相同基因被称为FMP38t(SEQ ID No.3)。使用限制性酶NcoI和XbaI，将对应于FMP38t‑h基因的序列克隆进之前描述的载体pRT100‑OTP(含有CaMV35S启动子和终止子)。得到的载体被称为pRT100‑OTP‑FMP38t‑h。使用限制性酶XhoI和XbaI，将对应于FMP38t的序列克隆进之前描述的载体pRT100，得到的载体被称为pRT100‑OTP‑FMP38t。使用限制性酶SbfI，将对应于PromCaMV35S‑OTP‑FMP38t‑h‑TerCaMV35S和PromCaMV35S‑OTP‑HIS6‑FMP38t‑TerCaMV35S的片段亚克隆进pBIN19载体(如上文所述)。得到的二元载体被分别称为pBin19‑FMP38t‑h(图3C)和pBin19‑FMP38t(图3B)，它们可用于例如转化双子叶植物，例如烟草植物(如上文所述)。然后针对其对HPPD抑制剂型除草剂(例如环磺酮)的耐受性，对经过足够生长的转化子植物加以测试。观察到的应答于除草剂处理的症状的发展被评估，并与相同条件下的野生型植物的应答相比较。
植物转化和用100g AI/TBT来选择T0
作为例子，将含有T‑DNAPromCaMV35S‑OTP‑HIS6‑FMP38t‑TerCaMV35S的生根植物转移到标准生长条件下的温室中。两周的适应期后，用含有100g环磺酮/公顷的混合物(从WP(可润湿粉末20％)制剂制备的，补充有硫酸铵和甲基酯raps油)处理T0植物。处理后两周，将评估由于应用除草剂的症状。植物被分类为四个组别。被评估为“0”的经处理植物看起来像未经处理的烟草植物。被评估为“1”的植物展示出由于应用除草剂导致的短暂的轻微褪色表型。被评估为“2”的植物展示出轻微至强烈的褪色症状。最后，被评估为“3”的植物看起来像经过了相同处理的野生型烟草植物。结果被概括于下表8中。
表8：表达FMP38 HPPD的T0烟草植物的应答


总而言之，表达FMP38HPPD的若干烟草植物对环磺酮耐受。
实施例6：在载体中克隆编码FMP38HPPD的基因FMP38e、FMP38t和FMP38m，以转化玉米植物
FMP38e(SEQ ID No.2)、FMP38t(SEQ ID No.3)、FMP38m‑h(SEQ ID No.18)
a‑FMP38e，于pHoe6/Ac中：具有针对大肠杆菌优化的密码子使用的基因，加上在其最5’端处的编码OTP的序列和编码His标签的序列
用限制性酶HindIII消化含有编码HPPD FMP38的基因(针对在大肠杆菌中的表达优化过，并处于CaMV35S启动子的控制下)的载体pRT100‑FMP38e。
将CaMV35S::OTP::FMP38e::CaMV35S‑term盒进一步克隆进之前用相同的限制性酶消化过并去磷酸的二元载体pHoe6/Ac(US 6,316,694)。得到的载体被称为pHoe6/Ac/FMP38e。
b‑FMP38t，于pHoe6/Ac中(SEQ ID No.3)：具有针对双子叶植物优化的密码子使用的基因，加上在其最5’端处的编码OTP的序列和编码His标签的序列
FMP38t，于pRT100中。定制了编码蛋白FMP38(针对在烟草中的表达优化过)的基因加上在5’端含有编码经优化的转运肽和HIS标签的序列的基因版本，将其称为FMP38t。向该序列上游添加针对限制性酶XhoI的识别序列，下游添加针对限制性酶XbaI的识别序列。用限制性酶XhoI和XbaI消化对应于OTP和FMP38t的DNA，按照合适的凝胶电泳来分离，并克隆进之前用XhoI和NcoI限制性酶消化过的pRT100(Toepfer，(1987)，Nucleic Acid Res 15：5890)中。质粒pRT100含有CaMV35S启动子和CaMV35S终止子。得到的载体被称为pRT100‑FMP38t，并用限制性酶HindIII对其进行消化，以将对应于CaMV35S::OTP::FMP38t::CaMV35S‑term盒的DNA与载体剩余部分分离开，以将其克隆进之前限制性消化过的载体pHoe6/Ac(US 6.316.694)中。得到的载体被称为pHoe6/Ac/FMP38t(图3)。
c‑FMP38m，于pHoe6/Ac中(SEQ ID No.18)：具有针对单子叶植物优化的密码子使用的基因，加上在其最5’端处的编码OTP的序列。
FMP38m，于pRT100‑OTP(NcoI‑XbaI)中，然后HindIII
订购经针对在单子叶植物中的表达而优化的编码FMP38的基因的变体(被称为FMP38m)，在起始密码子的上游添加NcoI识别位点，而在终止密码子的下游添加限制性酶XbaI的识别序列。用限制性酶NcoI和XbaI消化对应于FMP38m的DNA序列，然后通过凝胶电泳分离，最后从凝胶分离。将分离的DNA片段与之前也用相同的限制性酶消化过的载体pRT100‑OTP(上文提到的)混合。得到的载体被称为pRT100‑OTP‑FMP38m，其含有表达盒CaMV35S::OTP::FMP38m::CaMV35Sterm，使用限制性酶HindIII分离所述表达盒，然后再克隆进之前开口并去磷酸化的载体pHOE6/Ac中，该载体含有编码PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)酶的基因，这赋予对除草剂草铵膦的抗性(US 6,316,694)。得到的质粒被称为pHoe/Ac/FMP38m(图3F)。
玉米转化：
质粒pHoe6/Ac(US 6,316,694)、pHoe6/Ac/FMP38e、pHoe6/Ac/FMP38t和pHoe6/Ac/FMP38m被用于转化玉米培养物。
玉米培养、原生质体分离、转化和可育转基因玉米植物的再生按照美国专利6284945“Zea mays(L.)with capability of long term，highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize having a heterologous gene，and their preparation”来进行。
在含有膦丝菌素的培养基上选择经转化的愈伤组织。然后再将再生的生根植物转移至土壤，并令其在标准条件下(28/20℃)在温室生长并且产生种子。成年植物生长，直到产生种子，收集种子用于后续播种，用各HPPD抑制剂型除草剂处理经过了足够发育的植物。
实施例7：构建含有FMP38e基因的载体，以表达进稻植物
例如用驱动基因FMP38e表达的CaMV35启动子来构建用于稻植物转化的二元载体，所述基因具有针对在大肠杆菌细菌中表达优化的密码子选择，并且在其最5’端添加了编码His标签的序列以及再上游编码OTP的序列，之后是CaMV35S终止子。此外，转化载体还含有PAT基因盒(其中，基因被CaVM35S启动子驱动，之后是CaMV35S终止子)，用于转化过程中基于草铵膦的选择(见图3I)。二元载体被称为pTMV369。以相似的方式构建相似二元载体，但其中包含表达编码HPPD酶的拟南芥属基因的表达盒。
实施例8：转化稻植物
使用本领域公知的方法实现稻转化。简言之，使用未成熟的胚(来自恢复系6G4317)进行对稻的根癌农杆菌介导的转化。简言之，在授粉后8‑12天收获来自供体植物的穗。除去未成熟种子的外稃。之后使用基于NaOCl的溶液和Tween对种子灭菌。用乙酰水杨酸预诱导这些种子。然后在存在乙酰丁香酮时，于24℃在黑暗中将根癌农杆菌细菌与预诱导的种子共培养4天。之后，从胚移出胚芽鞘，并洗涤，然后放到补充有膦丝菌素的培养基上，在16小时的光周期节律下于28℃放置三周。然后从胚切下生长中的愈伤组织，将其转移至含有triacillin、膦丝菌素、L‑脯氨酸和硫酸铜(II)的新鲜培养基。
对于每种愈伤组织品系和每种环磺酮浓度，将从不同愈伤组织块随机分离的3个枝条转移到具有环磺酮的MS/2。一般而言，在愈伤组织已被放到再生培养基上9周之后将枝条从再生培养基转移到MS/2。
在26.5℃(16小时光周期)培养培养物，2周后评估症状。
已经基于褪色，对转移的枝条的新发育的叶进行了评分，并将其归为三组：
a)无褪色
b)中等褪色
c)完全褪色
在“中等褪色”的组别中，具有下述区别：具有显示出仅非常少的褪色症状并且由此趋向为绿叶的新叶的枝条，和具有几乎完全褪色的新叶的枝条。
表9

在温室试验中对环磺酮的应答
将T0生根小植物(在仅膦丝菌素或补充有环磺酮的膦丝菌素上选择)转移至温室中的土壤。在适应期后，用不同的HPPD抑制剂型除草剂处理经过足够生长的植物。作为例子，用制剂类型WP20的环磺酮以100g AI/公顷(补充有硫酸铵和甲基酯raps油)喷雾T0植物。在喷雾应用之后七天，评估由于应用除草剂导致的症状，并与经过相同处理的野生型植物上观察到的症状加以比较。
在处理后七天，基于应答于除草剂发展出的表型，将植物分类进三个组别。类别I被定义为没有展示出损伤的植物，类别II被定义为展示出应答于除草剂处理的短暂轻微的损伤的植物(损伤：10‑40％)，类别III被定义为展示出强烈损伤至与在经历相同处理的野生型植物中观察到的损伤相似的损伤的植物(损伤：41‑100％)。
通常，可以看出，甚至仅含一种T‑DNA插入片段的植物也显示出对HPPD抑制剂型除草剂环磺酮的暴露田间剂量的显著且足够的耐受性水平。
表10：

总之，可以看出，表达蛋白FMP38的稻植物要比野生型稻植物或表达敏感型拟南芥HPPD的植物对HPPD抑制剂型除草剂环磺酮的应用更为耐受。
实施例9：构建二元大豆转化载体
例如用驱动基因FMP38t‑h(SEQ ID No.17)表达的CaMV35启动子来构建用于大豆转化的二元载体，所述基因具有针对在双子叶植物中表达优化的密码子选择，并且在其最5’端添加了编码OTP的序列以及再上游的序列TEV(烟草蚀刻病毒)以改进mRNA在植物中的稳定性，之后是CaMV35S终止子。基因FMP38t‑h的核苷酸序列被提供于SEQ ID No.17中。此外，转化载体还含有PAT基因盒(其中，基因被CaVM35S启动子驱动，之后是CaMV35S终止子)，用于转化过程中基于草铵膦的选择，以及含有2mEPSPS基因盒(其中基因被来自拟南芥属的组蛋白启动子驱动)，以向经转化的植物赋予对除草剂草甘膦的耐受性(见图3H)。该二元载体被称为pFCO111。
实施例10：大豆T0植物的建立和选择
使用本领域公知的方法来实现大豆转化，例如使用根癌农杆菌介导的转化大豆半种子外植体，如Paz等人(2006，Plant cell Rep.25：206)描述的。使用异氟草作为选择标记来鉴定转化子。观察到绿色枝条的出现，将其记录为对除草剂异氟草的耐受性的指标。总共0.6％的转基因测试的枝条显示出相当于未经异氟草处理的野生型大豆枝条的正常的发绿，而用相同量的异氟草处理过的野生型大豆枝条则完全褪色。这表明，FMP38蛋白的存在使得能对HPPD抑制剂型除草剂像异氟草具有耐受性。
将耐受性的绿色枝条转移到生根培养基中或接枝。适应期后，将生根的小植物转移到温室。
然后用HPPD抑制剂型除草剂，例如用环磺酮以100g AI/公顷的比率对含有转基因的植物进行喷雾。应用后十天，评估由于应用除草剂导致的症状，并将其与在相同条件下于野生型植物上观察到的症状相比。
实施例11：构建二元棉花转化载体
例如用驱动基因FMP38t‑h(SEQ ID No.15)表达的CaMV35启动子来构建用于棉花转化的二元载体，所述基因具有针对在双子叶植物中表达优化的密码子选择，并且在其最5’端添加了编码OTP的序列以及再上游的序列TEV(烟草蚀刻病毒)以改进mRNA在植物中的稳定性，之后是CaMV35S终止子。基因FMP38t‑h的核苷酸序列被提供于SEQ ID No.17中。此外，转化载体还含有PAT基因盒(其中，基因被CaVM35S启动子驱动，之后是CaMV35S终止子)，用于转化过程中基于草铵膦的选择，以及2mEPSPS基因盒(其中基因被来自拟南芥属的组蛋白启动子驱动)，以向经转化的植物赋予对除草剂草甘膦的耐受性(见图3J)。
实施例12：棉花T0植物的建立和选择
使用本领域公知的方法来实现棉花转化，尤其是PCT专利公开文本WO 00/71733中描述的那种是尤其优选的方法。
将再生的植物转移到温室。适应期后，用补充有硫酸铵和甲基酯raps油的HPPD抑制剂型除草剂(例如环磺酮)以100g AI/公顷对经过足够生长的植物进行喷雾。喷雾应用后7天，评估用除草剂处理导致的症状，并将其与在相同条件下经受相同处理的野生型棉花植物上观察到的症状相比。
实施例13：构建二元转化载体，用于产生对具有不同作用模式的四种除草剂耐受的植物
例如用驱动基因FMP38t‑h(SEQ ID No.17)表达的CaMV35启动子来构建用于双子叶植物转化的二元载体，所述基因具有针对在双子叶植物中表达优化的密码子选择，并且在其最5’端添加了编码OTP的序列，之后是CaMV35S终止子。基因FMP38t‑h的核苷酸序列被提供于SEQ ID No.17中。此外，转化载体还含有PAT基因盒(其中，基因被CaVM35S启动子驱动，之后是CaMV35S终止子)，用于对表达该基因的植物赋予草甘膦耐受性，以及含有编码双突变体(Thr102Ile和Pro106Ser)EPSPS的2mEPSPS基因盒(其中基因被来自拟南芥属的组蛋白启动子驱动)，以向经转化的植物赋予对除草剂草甘膦的耐受性，以及含有拟南芥2mAHAS基因盒，其编码被CaMV35S启动子驱动的耐受性的ALS酶(乙酰乳酸合酶，Pro197Ala，Trp574Leu)，向表达该基因的植物赋予对来自磺酰脲或咪唑啉酮的类别的除草剂的抗性(见图3G)。
最后将基因盒克隆进载体pHoe6/Ac(US 6,316,694)，最后的载体被称为pHoe6/FMP38t‑h/PAT/EPSPS/AHAS，其被用于通过根癌农杆菌介导的本领域的方法来转化双子叶植物。将T0植物转移至土壤，并且在适应期后，用来自HPPD抑制剂类别的除草剂，然后用草甘膦，然后用草铵膦以及最后用来自例如磺酰脲类别的除草剂连续对经足够生长的植物进行喷雾。
实施例14：产生显示出对三种不同作用模式的除草剂的耐受性的转基因植物
例如用驱动基因FMP38t‑h(SEQ ID No.17)表达的CaMV35启动子来构建用于烟草转化的二元载体，所述基因具有针对在双子叶植物中表达优化的密码子选择，并且在其最5’端添加了编码OTP的序列，以及再上游的序列TEV(烟草蚀刻病毒)以改进mRNA在植物中的稳定性，之后是CaMV35S终止子。基因FMP38t‑h的核苷酸序列被提供于SEQ ID No.17中。此外，转化载体还含有PAT基因盒(其中，基因被CaVM35S启动子驱动，之后是CaMV35S终止子)，用于转化过程中基于草铵膦的选择，以及2mEPSPS基因盒(其中基因被来自拟南芥属的组蛋白启动子驱动)，以向经转化的植物赋予对除草剂草甘膦的耐受性(见图3H)。二元载体被称为pFCO111。上述载体被用于转化从烟草植物获得的叶盘，这按照实施例3来进行。
将转基因烟草植物转移至温室，并用草甘膦以1121g AI/公顷的比率处理。从此类耐受性的烟草植物产生并收获种子。将这些种子放到土壤上，以在温室发芽。三至四小时后，每个事件50个小植物被转移至单个的盆中。两周后，用下述物质对尺寸4‑6cm的植物进行喷雾：
‑草铵膦(glufosinate‑ammonium)1000gAI/公顷
‑草甘膦     1121gAI/公顷
‑环磺酮     100g AI/公顷
‑环磺酮+草甘膦100g AI/公顷+1121gAI/公顷
九天后，评估各除草剂应用导致的症状。