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1、(10)申请公布号 CN 102845302 A (43)申请公布日 2013.01.02 C N 1 0 2 8 4 5 3 0 2 A *CN102845302A* (21)申请号 201110173915.9 (22)申请日 2011.06.27 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路35号 (72)发明人贾忠奎 怀慧明 马履一 张东升 (54) 发明名称 君白菊组织培养快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明提供一种君白菊的组织培养与快速繁 殖方法。选取君白菊植株的带芽茎段为外植体，消 毒灭菌后接种培养。经过丛生芽诱导或诱。
2、导丛生 芽的叶片产生愈伤组织，再进行愈伤组织的增殖 和不定芽分化，最后再将其进行诱导生根的培养， 建立了君白菊的无性繁殖体系。本发明首次建立 了君白菊的组织培养快速繁殖体系，为君白菊进 一步经济、生态等综合价值的开发和利用提供了 技术保障。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1页 2 1.一种君白菊组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：将带芽茎段消毒 灭菌后接种进行丛生芽诱导增殖，再将丛生芽生成的无菌叶片切成0.5cm0.5cm的小块 进行愈伤。
3、组织诱导和不定芽诱导，将上述两种方法获得的不定芽进行生根诱导。 2.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的带芽茎段消毒 灭菌方法包括：用75酒精浸润带芽茎段外植体30S后无菌水冲洗4次，再用3-5 NaClO溶液浸润带芽茎段外植体并振荡消毒液5min后无菌水冲洗4次。 3.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的带芽茎段丛生 芽诱导培养基为：MS+3.0mg.L -1 6-BA+0.5mg.L -1 NAA。 4.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述无菌叶片的愈伤 组织诱导培养基为MS+5.0mg.L -1 6-BA+1.0mg.。
4、L -1 NAA；不定芽诱导分化培养基为：MS+3.0mg. L -1 6-BA+0.5mg.L -1 NAA。 5.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的不定芽生根培 养基为：1/2MS+1.0mg.L -1 IBA。 6.根据权利要求1所述的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，培养基均添加7g.L -1 琼 脂，25g.L -1 蔗糖，PH为5.8-6.0，高压灭菌12120min，培养条件为室温252，空气相对 湿度60左右，光照强度为2000-3000lx，光周期为光培养16h和暗培养8h。 权 利 要 求 书CN 102845302 A 1/4页 3 君白菊组织培。
5、养快速繁殖方法 0001 1.技术领域：本发明是涉及一种组织培养的技术方法，更具体的说涉及一种君白 菊的组织培养快速繁殖方法。 0002 2.技术背景：君白菊是北京林业大学经过十几年的潜心研究而培育出的优质菊 花品种。它的花序直径多为1.54cm，呈现扁球形或球形，外围为多层白色或黄色舌状花， 中央为管状花。君白菊气清香，味甘、微苦，花性辛、甘、苦，微寒，具有疏散风热，平肝明目， 清咽润喉，护肝正气等医学功效和药用价值。此外，君白菊还是一种优质的饮用茶品种，它 是唯一不须使用任何农药的高品质饮用菊花，含有人体保健最需要的17种氨基酸和8种矿 物质，无论在营养、口感还是在保健方面都超过了传统茶菊。
6、，它的胎菊中维生素E含量高出 普通饮用菊花数倍，拥有很好的抗衰老功效。因此，它也被誉为菊之秀，花之魁，绿之宝，作 为重要的花卉经济品种，君白菊在食用、药用、保健等方面的开发还具有着很大的潜力。 0003 3.发明内容：本发明的目的是提供一种君白菊组织培养快速繁殖的方法，发明人 在开展君白菊组织培养的研究中，从君白菊组织培养的基本过程，包括丛生芽诱导、叶片愈 伤组织诱导、不定芽分化、不定芽生根等阶段，筛选出最佳培养基，使君白菊实现了有效繁 殖，从而达到本发明的目的。 0004 本发明提出的君白菊组织培养快速繁殖方法包括下述培养阶段： 0005 a)带芽茎段的选择与消毒灭菌：选择室内盆栽君白菊植株。
7、作为待选外植体材料， 每天浇水一次，每月用2的NaClO消毒液对植株进行消毒一次。选取健壮无病虫害的茎， 剪取顶端以下3-4个幼嫩的带腋芽的茎段作为外植体材料。首先对带芽茎段材料进行初步 灭菌，用75酒精浸润材料30S后，迅速用无菌水冲洗4次，然后再用3-5NaClO溶液 消毒5min(优选4)，灭菌时不停的振荡消毒液使其与材料充分接触，消毒结束后用无菌 水冲洗4次，待接种。 0006 b)丛生芽诱导阶段：将消毒后的带芽茎段接种于诱导培养基上，正常培养15-20 天后，可产生不定芽。所述诱导培养基为以MS培养基为基本培养基，附加6-BA 3.0mg.L -1 ， NAA0.5mg.L -1 ；。
8、另添加琼脂7g.L -1 ，蔗糖25g.L -1 。 0007 c)叶片的愈伤组织诱导阶段：将b)中带芽茎段丛生芽诱导中形成的无菌叶片切 成0.5cm0.5cm左右的小块，作为叶片不定芽再生诱导的外植体，接种到愈伤组织诱导培 养基中。正常培养15-20天后产生大量愈伤组织。所述诱导培养基为：以MS培养基作为基 本培养基，附加6-BA 5.0mg.L -1 ，NAA 1.0mg.L -1 ，另添加琼脂7g.L -1 ，蔗糖25g.L -1 。 0008 d)不定芽诱导分化阶段：将c)中诱导出的良好的愈伤组织切成1.5cm1.5cm 的小块接种于分化培养基中，正常培养15-20天后在愈伤组织中有不。
9、定芽产生。上述分化 培养基为：以MS培养基作为基本培养基，添加6-BA 3.0mg.L -1 ，NAA0.5mg.L -1 ，另添加琼脂 7g.L -1 ，蔗糖25g.L -1 。 0009 e)生根培养阶段：将丛生芽诱导和愈伤组织分化形成的不定芽切割成约 1.5-2.0cm的带腋芽小茎段接种于生根培养基中，25-30天后生成不定根。上述生根培养基 为：以1/2MS为基本培养基附加1.0mg.L -1 IBA。 0010 上述步骤中正常培养的条件为：室温252，空气相对湿度60左右，光照强度 说 明 书CN 102845302 A 2/4页 4 为2000-3000lx，光周期为光培养16h、。
10、暗培养8h。 4. 附图说明 ： 0011 附图1空白对照生长 0012 附图2丛生芽诱导 0013 附图3不定芽分化 0014 附图4不定芽诱导生根 5. 具体实施方式 ： 0015 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 0016 实施例1 0017 选取室内盆栽君白菊植株的带芽茎段为外植体，用75酒精对其进行灭菌 15-30S(优选30S)，无菌水冲洗4次后对材料进行初步消毒，再用3-5NaClO溶液消毒 5min(优选5)，无菌水冲洗4次后进行全面消毒处理。经此方法灭菌后，外植体污染率低 于5。成活率均高于90以上。 0018 将灭菌后的带芽茎段接种于附加不同生长调节剂的。
11、MS培养基中，每瓶接种2-3 个，置于室温252，空气相对湿度60，光照强度2000-3000lx，光培养/16h、暗培养/8h 条件下进行培养。1-2天后，腋芽迅速膨大萌发成幼嫩小叶片，95以上的外植体完成启动 生长，经过30天培养后，统计结果(表1)显示，MS+3.0mg.L -1 6-BA+0.5mg.L -1 NAA中丛生芽 诱导效果最好，增殖系数可达5.5。 0019 表1不同生长调节剂对带芽茎段丛生芽诱导的影响 0020 0021 实施例2 0022 以丛生芽诱导中形成的无菌叶片作为外植体，切成0.5cm0.5cm左右的小块，接 种到附加不同生长调节剂的诱导培养基中培养，培养条件为。
12、室温252，空气相对湿度 60，光照强度2000-3000lx，光培养/16h、暗培养/8h。15天后，在叶片与培养基接触的地 方开始有少量的愈伤组织生长，靠近叶柄的地方愈伤组织生长量较大。15-30天时，愈伤组 织生长迅速，呈现黄绿色或淡绿色的颗粒状突起，愈伤组织紧实，生长情况较好。统计结果 (表2)显示，MS+5.0mg.L -1 6-BA+1.0mg.L -1 NAA培养基中愈伤组织诱导率最高，达到100， 愈伤量较多。 0023 表2不同生长调节剂的MS培养基对愈伤组织诱导的影响 说 明 书CN 102845302 A 3/4页 5 0024 0025 将诱导的浅绿色，紧实，生长良好的。
13、愈伤组织接种于附加不同生长调节剂的 MS分化培养基中，20天后，部分愈伤组织开始进行不定芽分化，统计结果(表3)表明， MS+3.0mg.L -1 6-BA+0.5mg.L -1 NAA培养基不定芽诱导率可达28.6，分化系数最高的培养基 为MS+2.0mg.L -1 6-BA+0.2mg.L -1 NAA，分化系数为2.3。 0026 表3不同生长调节剂对不定芽分化的影响 0027 0028 实施例3 0029 将丛生芽和愈伤组织诱导的不定芽切割成约1.5-2.0cm的带腋芽小茎段接种于 添加了不同生长素调节剂的1/2MS生根培养基中，每瓶接种1个不定芽，置于室温252， 空气相对湿度60，。
14、光照强度2000-3000lx，光培养/16h、暗培养/8h条件下培养。40天后 统计其生根率，结果(表4)如下，添加了细胞生长素的培养基可以有效提高君白菊的生根 率，改善根的质量，其中，IBA和NAA均可以使君白菊的生根率达到80以上，在生根质量方 面，添加IBA激素的处理根较粗壮，根质量高，而添加了NAA激素的根生长孱弱，长势差。综 合分析，以1/2MS为基本培养基，附加1.0mg.L -1 IBA为君白菊不定芽生根的最佳培养基，生 根率可达86.2，生根条数为31条。 0030 表4不同生长调节剂的1/2MS培养基对生根的影响 0031 0032 说 明 书CN 102845302 A 4/4页 6 0033 以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本技术领域的普通工人来说，在 不脱离本技术发明的原理前提下，还可以做出若干适当的改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明保护范围内。 说 明 书CN 102845302 A 1/2页 7 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102845302 A 2/2页 8 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102845302 A 。