在具有腺毛的植物中产生萜烯和萜类 领域
本公开内容一般涉及在遗传改造的具有腺毛的植物中产生同源或异源的萜烯 (terpenes) 和萜类 (terpenoids)、 和 / 或高价值小分子。更具体地， 遗传改造的具有腺毛 的植物包含并表达编码在同源或异源的萜烯和萜类、 和 / 或高价值小分子的生物合成中具 有活性的蛋白的基因。
背景
大多数植物在其叶表面上具有称为毛状体的特化的毛发样结构。 这些结构参与大 量适应性功能， 包括保护不受草食动物和微生物侵害。 存在两种主要类型的毛状体 ： 腺毛和 非腺毛。腺毛不像非腺毛那么普遍， 能够合成和储存大量的次生代谢物作为植物精油的部 分。精油是一种挥发性的复杂混合物， 特征是强烈的气味， 主要包括萜烯。萜烯和其化学改 性形式 ( 通称为 “萜类” ) 是生物合成地来源于同样的基本五 - 碳异戊二烯构件的有价值的 烃类。
毛状体中发生的生物合成途径具有使得它们成为代谢工程的有吸引力的靶的多 种特征。 首先， 毛状体仅为产生大量特化的小分子而设计， 使得它们成为萜烯和来源于萜烯 的其他烃类的理想生产系统。 第二， 毛状体是非必需结构， 表示对其内源途径的修饰将不会 不利地影响植物健康。 第三， 由于毛状体的天然保护结构， 对其他植物组织有毒的化学物可 在植物精油中产生和富集， 而不对植物细胞产生细胞毒性。
胡椒薄荷 (peppermint) 是可用作产生油类和高价值小分子的通用平台的具有腺 毛的植物的一个实例。从胡椒薄荷 (Mentha×piperita) 叶蒸馏的精油用在多种消费品 中 ( 如， 口香糖、 牙膏和漱口水 )， 用作糖果和药品工业中的调味剂， 和用作芳香疗法的活性 成分来源。胡椒薄荷油主要由对薄荷烷型单萜 (monoterpenes) 组成， 含有少量 (smaller quantities) 其他单萜和微量 (minor quantities) 倍半萜 (sesquiterpenes)(Rohloff， 1999)。精油在特化的盾状腺毛中合成和积聚 (Gershenzon 等， 1989 ； McCaskill 等， 1992)。 这些毛状体包含以 8 细胞盘排列的分泌细胞， 它们负责合成精油。精油被排入通过表皮材 料的预形成层的分离而形成的新生腔 (Amelunxen， 1965)。 精油从胡椒薄荷盾状腺毛的挥发 是可忽略的 (Gershenzon 等， 2000)。
尽管类异戊二烯天然产物表现出巨大的结构多样性， 关键中间产物的生物合成 所基于的生化原理是相对简单的。术语类异戊二烯用于形式上来源于异戊二烯 (2- 甲 基丁 -1， 3- 二烯 ) 的化合物， 其构架通常可以任何类异戊二烯分子的重复出现来辨别 (Ruzicka， 1953)。所有类异戊二烯结构生物合成地来源于 “活性异戊二烯” (Lynen 等， 1958 ； Chaykin 等， 1958) 即异戊烯基二磷酸 (IPP)、 和其异构体二甲烯丙基二磷酸 (DMAPP) ( 图 1)。 起始分子 DMAPP 与链延伸分子 IPP 之间的缩合反应产生多种异戊二烯基二磷酸， 其 用作产生类异戊二烯终产物的萜烯合酶和次级修饰酶的前体。通用的 C5 中间产物 IPP 和 DMAPP 可经由两种不同途径产生。 在酵母、 真菌、 古细菌和动物中， 甲羟戊酸 (MVA) 途径负责 合成类异戊二烯中间产物， 而在大多数真细菌中不依赖 MVA 的途径起作用。两种途径在植 物和某些藻类中都发生， 其中 MVA 途径的酶存在于胞质 /ER 区室， 不依赖 MVA 途径的酶位于
质体 (Lange 等， 2000a)。因为在胡椒薄荷腺毛中产生高水平的 IPP 和 DMAPP(McCaskill 和 Croteau， 1995)， 存在利用这些毛状体作为产生来源于 IPP 和 DMAPP 前体的各种萜烯和萜类 的 “绿色工厂” 的可能。
尽管利用植物作为产生小分子的 “绿色工厂”的观念已经引起巨大兴趣， 迄 今有多种问题阻碍了代谢改造的努力 ： (1) 当萜烯和萜类以非特异性方式积聚时， 其积 聚导致细胞毒性 ； (2) 当萜类以非特异性方式产生时， 其通常为了储存而转化为共轭物 (conjugate)， 导致积聚水平低 ； 和 (3) 当在大多数植物中产生时， 萜类作为挥发物排出， 这 导致积聚水平低。
概述
本发明的一个实施方案是基于首次在遗传改造的具有腺毛的植物中成功产生新 的异源萜烯和 / 或萜类。具有毛状体的植物物种天然地进化了储存大量精油的能力。本 文描述的结果显示， 异源萜烯和萜类 ( 该植物天然不产生的萜烯和萜类 ) 被产生和积聚 在转基因植物的精油中。该转基因植物通过转化在异源萜烯和 / 或萜类的生物合成中具 有活性的一种或多种基因来产生。典型地， 生物合成途径通常或 “天然地” 存在于其他物 种的植物中， 但在根据本发明遗传改造的具有腺毛的植物中通常 ( 天然地 ) 不存在或不 运转。例如， 通过用来自青蒿 (Artemisia annua.) 的以下基因之一转化薄荷植物， 已在 该转基因植物中产生和积聚多种异源单萜和倍半萜 ： 紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 (ADS) 基因、 (-)- 芳樟醇合酶、 (+)- 柠檬烯合酶、 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶或 γ- 蛇麻烯合酶。在转基 因植物中产生的异源单萜和倍半萜包括紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 γ- 蛇麻烯， 这些都不是薄荷植物中通常产生的。这些结果显示， 遗传改造 的具有腺毛的植物是用于产生有价值的异源萜烯和萜类的适当的宿主。具有腺毛的植物 还可用于产生其他有价值的小分子， 例如， 来源于萜类或苯并素生物合成途径的小分子， 诸 如松香二烯 (abietadiene)、 紫穗槐 -1， 4- 二烯 (amorpha-1， 4-diene)、 5- 表 - 马兜铃烯 (5-epi-aristolochene)、 青蒿酸 (artemisinic acid)、 脱氢青蒿酸 (dehydroartemisinic acid)、 青 蒿 素 (artemisinin)、 反 式 α- 香 柠 檬 烯 (trans-alpha-bergamotene)、 β- 红 没 药 烯 (beta-bisabolene)、 α- 和 γ- 红 没 药 烯、 (+)- 冰 片 基 二 磷 酸 ((+)-bornyl diphosphate)、 δ- 杜 松 烯 (delta-cadinene)、 (-)- 莰 烯 ((-)-camphene)、 (+)-3- 蒈 烯 ((+)-3-carene)、 α- 和 β- 石竹烯 (caryophyllene)、 蓖麻烯 (casbene)、 对映 - 咖萨 -12， 15- 二烯 (ent-cassa-12， 15-diene)、 表柏木醇 (epi-cedrol)、 菊基二磷酸 (chrysanthemyl diphosphate)、 1， 8- 桉 树 脑 (1， 8-cineole)、 (-)- 柯 巴 基 二 磷 酸 ((-)-copalyl diphosphate)、对 映 - 柯 巴 基 二 磷 酸 (ent-copalyl diphosphate)、 β- 荜 澄 茄 烯 (beta-cubebene)、 荜澄茄醇 (cubebol)、 elisabethatriene、 β- 桉叶醇 (beta-eudesmol)、 法 呢 醇 (farnesol)、 α- 和 β- 法 呢 烯 (farnesene)、 牻 牛 儿 醇 (geraniol)、 牻牛儿 基 芳 樟 醇 (geranyllinalool)、 germacradienol/ 土 臭 味 素 (geosmin)、 大根香叶烯 (germacrene)A、 C 和 D、棉 酚 (gossypol)、 α- 古 芸 烯 (alpha-gurjunene)、 (+)-5(6)， 13-halimadiene-15-ol、 α-、 β- 和 γ- 蛇麻烯 (humulene)、 epi-isozizaene、 对映 - 贝 壳杉烯 (ent-kaurene)、 左旋海松二烯 (levopimaradiene)、 (-)- 柠檬烯 ((-)-limonene)、 (-)- 异 薄 荷 烯 醇 ((-)-isopiperitenol)、 (+)- 柠 檬 烯 ((+)-limonene)、 (-)- 芳 樟 醇 ((-)-linalool)、 长叶烯 (longifolene)、 对薄荷烷 -3， 8- 二醇 (p-menthane-3， 8-diol)、(+)- 薄 荷 呋 喃 ((+)-menthofuran)、 (-)- 薄 荷 酮 ((-)-menthone)、 (-)- 薄 荷 酮、 顺式 依 兰 油 二 烯 (cis-muuroladiene)、 月 桂 烯 (myrcene)、 E- 橙 花 叔 醇 (E-nerolidol)、 努 特 卡 酮 (nootkatone)、 β- 罗 勒 烯 (beta-ocimene)、 广 藿 香 醇 (patchoulol)、 并环 萜 烯 (pentalenene)、 β- 水 芹 烯 (beta-phellandrene)、 (-)- 紫 苏 醇 ((-)-perillyl alcohol)、海 松 -9(11)， 15- 二 烯 (pimara-9(11)， 15-diene)、顺 式 海 松 -7， 15- 二 烯 (syn-pimara-7， 15-diene)、 α- 和 β- 蒎烯 (pinene)、 (+)- 胡薄荷酮 ((+)-pulegone)、 顺 式玫瑰醚 (cis-rose oxide)、 对映 - 山达海松二烯 (ent-sandaracopimaradiene)、 δ- 蛇 床 烯 (delta-selinene)、 stemar-13-ene、 stemodene、 类 萜 菌 素 (terpenticin)、 γ- 萜 品 烯 (gamma-terpinene)、 α- 萜 品 醇 (alpha-terpineol)、 萜 品 油 烯 (terpinolene)、 四 氢大麻酚酸 (tetrahydrocannabinoic acid)、 单端孢霉烯 (trichodiene)、 (+)- 瓦伦烯 ((+)-valencene)、 马鞭草烯酮 (verbenone)、 岩兰螺旋二烯 (vetispiradiene)、 α- 岩兰酮 (alpha-vetivone)、 绿花白千层醇 (viridiflorol) 和 α- 姜烯 (alpha-zingiberene)。在 本发明的一些实施方案中， 萜烯和 / 或萜类是萜烯生物合成途径前体的衍生物， 其实例包 括但不限于异戊烯基二磷酸、 二甲基烯丙基二磷酸、 牻牛儿基二磷酸、 法呢基二磷酸、 牻牛 儿基牻牛儿基二磷酸和角鲨烯。 此外， 通过遗传改造来操纵具有腺毛的植物的遗传组分， 例 如， 以包含和表达编码催化不同目标修饰反应的一种或多种酶的基因， 可导致产生具有期 望的化学组成和特性的具体的目标化合物。 在一些实施方案中， 本发明提供一种遗传改造的具有腺毛的植物 ( 如， 薄荷植 物 )， 所述植物包含编码在至少一种或多种异源或同源的萜烯或萜类的生物合成中具有活 性的一种或多种蛋白的一种或多种可表达基因， 其中所述异源或同源萜烯或萜类在所述遗 传改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在所述遗传改造的具有腺毛的植物的所述 腺毛的油中。可表达基因的实例包括紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶、 (-)- 芳樟醇合酶、 (+)- 柠檬 烯合酶、 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶或 γ- 蛇麻烯合酶。异源或同源萜烯的实例包括单萜、 倍半 萜、 二萜 (diterpenes)、 三萜 (triterpenes) 和多萜 (polyterpenes)， 诸如， 如， 紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 / 或 γ- 蛇麻烯。
在其他实施方案中， 本发明提供一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法， 包括以 下步骤 ： i) 选择具有腺毛的植物 ( 如， 薄荷植物 ) ； 和 ii) 遗传改造具有腺毛的植物以包含 和表达编码在至少一种或多种萜烯和萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白的一 种或多种基因。 所述萜烯和萜类在具有腺毛的植物的腺毛中合成并储存在具有腺毛的植物 的腺毛的油中。适当基因的实例包括紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶、 (-)- 芳樟醇合酶、 (+)- 柠檬 烯合酶、 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶或 γ- 蛇麻烯合酶。异源或同源萜烯的实例包括单萜、 倍半 萜、 二萜、 三萜和多萜， 诸如， 如， 紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇 和 / 或 γ- 蛇麻烯。 在一些实施方案中， 所述具有腺毛的植物还包含抑制所述具有腺毛的植 物中一种或多种生物合成途径的一种或多种酶的表达的 RNA 序列。在其他实施方案中， 本 发明还提供一种产生一种或多种萜烯和萜类的方法， 包括以下步骤 ： 培养本发明的遗传改 造的具有腺毛的植物， 从具有腺毛的植物的所述腺毛的油回收一种或多种萜烯和萜类。这 一方法可包括用一种或多种茉莉酮酸酯 (jasmonates) 处理所述遗传改造的具有腺毛的植 物的步骤。
附图描述
图 1A 和 B.A， 为胡椒薄荷中单萜生物合成供应前体的质体不依赖甲羟戊酸 途 径 的 概 述。 以 下 酶 参 与 这 一 途 径 ： (1)1- 脱 氧 -D- 木 酮 糖 5- 磷 酸 合 酶 ； (2)1- 脱 氧 -D- 木 酮 糖 5- 磷 酸 还 原 异 构 酶 ； (3)2C- 甲 基 -D- 赤 藓 醇 4- 磷 酸 胞 苷 转 移 酶 ； (4)4-( 胞 苷 5’ - 二 磷 酸 )-2C- 甲 基 -D- 赤 藓 醇 4- 磷 酸 激 酶 ； (5)2C- 甲 基 -D- 赤 藓 醇 2， 4- 环 二 磷 酸 合 酶 ； (6)(E)-4- 羟 基 -3- 甲 基 - 丁 -2- 烯 基 二 磷 酸 合 酶 ； (7)(E)-4- 羟 基 -3- 甲基 - 丁 -2- 烯基二磷酸还原酶 ； (8) 异戊烯基二磷酸异构酶 ； (9) 牻牛儿基二 磷酸合酶。 “Lp1”代表反应的胞内位置白色体。B， 胡椒薄荷腺毛中对薄荷烷单萜代谢 的 概 述。 以 下 酶 参 与 这 一 途 径 ： (1)(-)- 柠 檬 烯 合 酶 ； (2)(-)- 柠 檬 烯 3- 羟 化 酶 ； (3) (-)- 反 式 异 薄 荷 烯 醇 ((-)-trans-isopiperitenol) 脱 氢 酶 ； (4)(-)- 反 式 异 胡 椒 酮 ((-)-trans-isopiperitenone) 还原酶 ； (5)(+)- 顺式异胡薄荷酮异构酶 ； (6)(+)- 薄荷呋 喃合酶 ； (7a)(+)- 胡薄荷酮还原酶 ((-)- 薄荷酮 - 形成活性 ) ； (7b)(+)- 胡薄荷酮还原酶 ((+)- 异薄荷酮 - 形成活性 ) ； (8a)(-)- 薄荷酮 ： (-)- 薄荷醇还原酶 ((-)- 薄荷醇 - 形成活 性)； (8b)(-)- 薄荷酮 ： (-)- 薄荷醇还原酶 ((+)- 新异薄荷醇 - 形成活性 ) ； (9a)(-)- 薄荷 酮： (+)- 新薄荷醇还原酶 ((+)- 新薄荷醇 - 形成活性 ) ； (9b)(-)- 薄荷酮 ： (+)- 新薄荷醇 还原酶 ((+)- 异薄荷醇 - 形成活性 )。 “Lp1” ＝白色体 ； “ER” ＝内质网 ； “Mit” ＝线粒体 ； “Cyt” ＝胞质 ( 反应的胞内位置 )。(+)- 薄荷呋喃对 (+)- 胡薄荷酮还原酶的抑制由弧形表 示。 图 2A-D. 以实时定量 PCR 确定的参与胡椒薄荷单萜生物合成的基因的表达谱， 利 用胡椒薄荷 β- 肌动蛋白基因 (AW255057) 作为内源对照。 以 30 天样品 ( 温室条件下生长的 野生型植物 ) 获得的 RNA 的平均信号强度用作校准物 ( 基于现有知识 ： 参与单萜生物合成 的基因的表达水平在这一叶发育阶段一致地低 ( 但可检测 ))。使用以下缩写和简称 ： DXS， 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸合酶 ； DXR， 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸还原异构酶 ； CMK， 4， 4-( 胞 苷 5’ - 二磷酸 )-2C- 甲基 -D- 赤藓醇 4- 磷酸激酶 ； HDS， (E)-4- 羟基 -3- 甲基 - 丁 -2- 烯 基二磷酸合酶 ； LS， (-)- 柠檬烯合酶 ； L3H， (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶 ； PR， (+)- 胡薄荷酮还原 酶； MFS， (+)- 薄荷呋喃合酶。A， 温室对照 ； B， 低光强度 ； C， 低水处理 ； D， 低光强度和高夜间 温度。
图 3A-F. 温室生长的野生型 (A) 和 MFS7 转基因植物 (B)、 以及在 (C) 低水处理、 (D) 低光照和 (E) 低光照与高夜间温度组合条件下生长的野生型植物的实验确定的单萜谱。X 轴是出叶后的天数 ； Y 轴是单萜 (μg/ 叶 )。以下符号用于表示单萜谱 ： (-)- 柠檬烯， 菱形 ； (+)- 胡薄荷酮， 方形中的对钩 ； (+)- 薄荷呋喃， 方形中的加号 ； (-)- 薄荷酮， 方形 ； (-)- 薄 荷醇， 三角形。图 F 概括腺毛密度和大小分布的数据 (n ＝ 5)， 以及出叶 30 天时的总精油产 量 (n ＝ 3)。
图 4. 茉莉酮酸甲酯 (MeJA) 处理对胡椒薄荷叶中精油产量的影响。缩写和简称 ： Con ＝未处理对照植物 ； MeJA ＝用 MeJA 处理的植物。
图 5A-C. 从以下获得的精油的气相 (GC) 色谱 ： A， 非转基因对照植物、 B， 表达紫穗 槐二烯合酶的转基因株系和 C， 包含抗疟疾药前体紫穗槐二烯的可信标准混合物 ( 下图 )。 紫穗槐二烯以精油的大约 8％在转基因植物中积聚， 而非转基因对照植物不含任何可检测 水平的该代谢物。转基因植物中新代谢物的身份通过气相色谱 / 质谱 (GC-MS) 分析证实 ( 与可信标准物的质谱比较 )。
详述
第一次， 转基因的具有腺毛的植物被成功地遗传改造以产生异源萜烯和萜类。具 体地， 已经制造了产生和积聚紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 γ- 蛇麻烯的示例转基因薄荷植物， 这是分别以编码在产生萜烯的生物合成途径中具有活 性的蛋白， 即紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 (ADS)、 (-)- 芳樟醇合酶、 (+)- 柠檬烯合酶、 (-)- 柠檬 烯 7- 羟化酶或 γ- 蛇麻烯合酶的基因转化植物的结果。转基因植物积聚异源萜烯和萜类 而不受有害作用影响或因为挥发而减少产量， 可能是因为萜烯被隔绝在植物腺毛中。这些 结果证明利用遗传改造的具有腺毛的植物作为产生萜烯和萜类的宿主的可行性。 本发明涵 盖在包含和表达编码在同源或异源萜烯和萜类的生物合成中具有活性的一种或多种蛋白 的基因的遗传改造的具有毛状体的植物中产生同源和异源萜烯和萜类 ( 和相关衍生物 ) 的 方法， 以及该遗传改造的具有腺毛的植物本身， 和其后代。
通常， 本发明的方法在具有腺毛的植物中实施， 所述植物的实例包括但不限于以 下属的植物 ： 辣椒属 (Capsicum)、 葛缕子属 (Carum)、 棉属 (Gossypium)、 葎草属 (Humulus)、 素 馨 属 (Jasminum)、 薰 衣 草 属 (Lavandula)、 母 菊 属 (Matricaria)、 薄 荷 属 (Mentha)、 荆 芥 属 (Nepeta)、 罗 勒 属 (Ocimum)、 牛 至 属 (Origanum)、 紫 苏 属 (Perilla)、 刺蕊草属 (Pogostemon)、 迷 迭 香 属 (Rosmarinus)、 鼠 尾 草 属 (Salvia)、 茄 属 (Solanum)、 百里香属 (Thymus) 等等。 在一些实施方案中， 具有腺毛的植物是薄荷植物， 例如， 薄荷属的薄荷植物。本发 明的实施中可利用的薄荷物种包括但不限于水薄荷 (Mentha aquatica)、 野薄荷 (Mentha arvensis)、 亚 洲 薄 荷 (Mentha asiatica)、 澳 洲 薄 荷 (Mentha australis)、 加拿大薄荷 (Mentha canadensis)、 哈特普列薄荷 (Mentha cervina)、 柠檬薄荷 (Mentha citrata)、 皱 叶薄荷 (Mentha crispata)、 Mentha cunninghamia、 兴安薄荷 (Mentha dahurica)、 Mentha diemenica、 Mentha gattefossei、 Mentha grandiflora、 薄 荷 (Mentha haplocalyx)、 日 本薄荷 (Mentha japonica)、 科佩特薄荷 (Mentha kopetdaghensis)、 森林薄荷 (Mentha laxiflora)、 欧 薄 荷 (Mentha longifolia)、 长 叶 薄 荷 (Mentha sylvestris)、 胡椒薄荷 (Mentha piperita)、 唇萼薄荷 (Mentha pulegium)、 科西嘉薄荷 (Mentha requienu)、 东北 薄荷 (Mentha sachalinensis)、 Mentha satureioides、 绿薄荷 (Mentha spicata)、 菠萝 薄荷 (Mentha suaveolens) 或灰薄荷 (Mentha vagans)。还可使用薄荷栽培种， 实例包括 但不限于水薄荷 (Water mint)、 水薄荷 (Marsh mint)、 姜味薄荷、 薄荷 (Corn Mint)、 野薄 荷、 日本薄荷、 中国薄荷 (Field Mint)、 Pudina、 亚洲薄荷、 澳洲薄荷、 哈特普列薄荷、 柠檬 薄荷、 皱叶薄荷、 兴安薄荷 (Dahurian Thyme)、 Slender mint、 森林薄荷、 长叶薄荷、 唇萼薄 荷、 科西嘉薄荷、 园林薄荷、 Native Pennyroyal、 留兰香、 Curly mint、 苹果薄荷、 菠萝薄荷、 Erospicata、 或灰薄荷。
本发明的具有腺毛的植物是遗传改造的。 “遗传改造” 是指与被根据本发明遗传 改造之前植物的遗传物质相比， 植物的遗传物质 ( 如， DNA、 RNA 等等 ) 已被改变或修饰。被 如此遗传改造的植物可以是天然或 “野生型” 植物， 或可以是此前已被 ( 或同时地 ) 以某种 方式遗传改造的植物 ( 如， 表现对疾病、 杀虫剂、 艰难生长条件诸如干旱的抗性 ； 或以包含 阻碍一种或多种蛋白或酶产生的抑制性 RNA ； 等等 )。可选地， 被本发明方法遗传改造的植 物可以是为其它植物品种、 物种等等的杂交种或杂种的植物， 是天然存在的杂种或特意培
育的杂种， 如， 通过选择和将两个品种或物种杂交。 遗传改造的植物和其后代都被本发明涵 盖。
在本发明的一些实施方案中， 进行的遗传改造修饰了植物， 使其包含 ( 通常表达 或过表达 ) 与植物中已经存在的遗传物质相同或相似的遗传物质 ( 即， 同源遗传物质 )， 但 该遗传物质在遗传改造后以不同的量或形式存在， 如， 可能引入目标基因的另外拷贝， 或可 能向植物的现有遗传物质引入突变， 等等。因为引入这样的同源序列而在植物中产生的产 物 ( 如， 萜烯和 / 或萜类 ) 称为同源产物， 如， 同源萜烯和萜类。
在本发明的其他实施方案中， 进行的遗传改造修饰了植物， 使其包含 ( 通常表达 或过表达 ) 植物中通常不存在的遗传物质， 导致产生转基因植物。 “转基因” 是指植物 ( 或 其后代 ) 被遗传改造以包含和表达一种或多种异源的目标核酸序列， 即， 天然不见于植物 中的核酸序列。这种核酸的实例包括但不限于 ： 编码或包含编码蛋白或肽的基因 ( 可称为 转基因、 外来基因、 异源基因、 过客基因等等 ) 的序列 ； 沉默或抑制 RNA ； 编码 tRNA 的序列 ； 编码不同遗传元件诸如启动子、 增强子和其他转录和 / 或翻译控制序列的序列 ； 等等。 这样 的异源核酸序列来自于另一生物体， 如， 来自于另一植物物种或品种， 或甚至来自于非植物 物种。在一些实施方案中， 异源核酸序列编码在目标萜烯和 / 或萜类的生物合成中具有活 性 ( 即， 参与， 可能是所需或必需的 )， 但通常 ( 天然地 ) 不见于或不由该植物产生的蛋白， 通常是酶。例如， 该蛋白可以是催化萜烯或萜类生物合成途径中一个或多个步骤的酶。这 些产物称为异源产物， 如， 异源萜烯和 / 或萜类。异源蛋白或酶可能直接参与萜烯 / 萜类产 生的生物合成途径， 或可能以间接方式调节生物合成， 如， 通过参与竞争性途径和增加竞争 性途径的活性， 通过催化随后进入萜烯 / 萜类生物合成途径的前体的形成， 等等。
通常， 植物的遗传改造进行的方式导致向植物的染色体掺入包含一种或多种目标 核酸序列 ( 通常是基因 ) 的 DNA， 尽管不必总是这种情况。DNA 还可能驻留其中或是染色体 外元件的部分。在遗传改造的植物中， 基因是可表达的， 即， 它们以允许或导致或促进该基 因在植物中转录为 RNA( 如， mRNA) 的方式缔合于 ( 可操作地连接于 ) 其他适当的遗传元件 诸如启动子、 增强子等等。 通常转录随后是成功翻译活性形式的蛋白或酶， 除了当基因编码 预期作为抑制物作用的 RNA 诸如 iRNA 或 siRNA 时。此外， 被引入遗传改造的植物的目标核 酸可能包含编码控制其他基因表达的因子的遗传序列。
可使用本领域已知的许多方法的任一种转化具有腺毛的植物。例如， 可使用农杆 菌属 (Agrobacterium)、 中华根瘤菌 (Sinorhizobium)、 中生根瘤菌 (Mesorhizobium) 或根 瘤菌属 (Rhizobium) 介导的转化方法， 如本领域已知的。( 例如， Broothaerts 等， 2005 ； Gelvin 等， 2005 对植物转化技术的描述 )。可选地， 用于转化植物的其他方法也是已知的， 包括但不限于 ： 利用包被有 DNA 的小的金属如， 金或钨颗粒 ( 或其他小颗粒 ) 的颗粒轰击， 将颗粒射入幼嫩植物细胞或植物胚胎 ； 电穿孔， 藉以利用电击在植物细胞膜中制造短暂的 孔， 允许 DNA 进入 ； 和病毒转导， 其中将期望的遗传物质包装入适当的植物病毒， 允许该修 饰的病毒感染植物。在后一种情况， 如果遗传物质是 DNA， 其可与染色体重组以产生转化体 细胞。 然而大多数植物病毒的基因组由单链 RNA 构成， 该单链 RNA 在受感染细胞的胞质中复 制。 对于这种基因组， 该方法是一种转染形式而不是真正的转化， 因为所插入的基因不进入 细胞核， 也不整合到宿主基因组中。受感染的植物的后代不含病毒， 也不含所插入的基因。 因此， 基因表达局限于被转染的植物， 不传递到下一代。具有毛状体的植物被遗传改造以包含一种或多种基因， 例如， 编码参与目标萜烯 或萜类的合成的蛋白的基因。一种或多种基因可以被过表达， 即， 表达的水平高于或大于 当基因在其自然或天然宿主中存在时通常观察到或获得的水平。一种或多种基因的表达 通常被启动子 ( 和可能的其它控制元件 ) 驱动， 该启动子 / 控制元件可能是天然缔合于该 基因的 ( 如， 启动子 / 控制元件驱动和 / 或调节基因在植物或基因来自的生物体， 即， 该基 因在自然界中存在的生物体中的表达 )。可选地， 可联合该基因采用异源启动子和控制元 件。 本发明的实践中可采用的启动子的实例包括但不限于多种细胞类型或组织特异性启动 子 ( 实例包括但不限于泛在启动子 ( 在生物体的几乎所有组织或细胞中具有活性的 ； 实例 包括但不限于花椰菜花叶病毒 35S 启动子、 泛素启动子、 肌动蛋白启动子、 乙醇脱氢酶启动 子； Gelvin， 2005) 和细胞类型或组织特异性启动子 ( 实例包括但不限于毛状体特异性启动 子 (Wang 等， 2002 ； Gutierrez-Alcala 等， 2005 ； Shangguang 等， 2008)。
在本发明的一个实施方案中， 一种或多种基因是对被遗传改造的植物中一种或多 种目标靶基因的序列 “反义” 的。对靶基因 “反义” 的基因的表达可以， 例如用于经由 RNA 干 扰 (RNAi) 敲低或敲除靶基因的表达。这种 RNA 的表达减少或消除一种或多种靶基因的表 达。这一策略可用于， 例如减少或消除否则干扰萜烯或萜类生物合成途径的酶的不需要的 活性， 所述干扰如， 通过竞争萜烯 / 萜类合成所需的底物的干扰， 或通过产生抑制萜烯 / 萜 类合成的物质， 或导致萜烯 / 萜类的不需要的修饰或催化等等。RNAi 可减少或消除这一活 性。 在一些实施方案中， 具有腺毛的植物被遗传改造和产生精油， 精油可被储存在例 如植物腺毛中， 精油可包含一种或多种同源或异源萜烯或修饰的萜烯 ( 如， 萜类 )。一种或 多种同源或异源萜烯 / 萜类可包括但不限于 ： 半萜 (hemiterpene)( 一个异戊二烯单元 ) 和 其含氧的萜类衍生物 ( 半萜类 (hemiterpenoids)) 诸如异戊烯醇和异戊酸等等 ； 单萜 ( 两 个异戊二烯单元 ) 诸如牻牛儿醇、 柠檬烯和萜品醇等等 ； 倍半萜 ( 三个异戊二烯单元 ) 诸如 法呢烯和法呢醇等等 ； 二萜 ( 四个异戊二烯单元 ) 诸如咖啡醇、 咖啡豆醇、 西柏烯、 紫杉烯等 等； 二倍半萜 (sesterterpenes)( 五个异戊二烯单元如， 牻牛儿基法呢醇等等 ； 三萜 ( 六个 异戊二烯单元 ) 诸如角鲨烯等等 ； 四萜 (tetraterpenes)( 八个异戊二烯单元 ) 诸如无环番 茄红素、 单环 γ 胡萝卜素和二环 α- 和 β- 胡萝卜烯类 ； 和多萜 ( 多个异戊二烯单元的长 链， 诸如杜仲胶 ( 天然胶乳 )。萜烯可以以分子的萜类形式， 可以是线性或环状的。萜烯 / 萜类可以是对具有腺毛的植物内源或外来的。 腺毛精油中储存的萜烯还可对腺毛细胞组织 比对植物的其他细胞组织具有减少的细胞毒性。 萜类对植物细胞培养物的毒性已经在许多 出版物中证明 (Scragg A.H. 等 1997)。另外， 腺毛精油中储存的同源或异源萜烯 / 萜类可 具有减少的挥发。
一种或多种基因的过表达可增加精油产生。 一种或多种基因的过表达可改变精油 与野生型植物精油相比的组成。一种或多种基因的过表达可在精油中富集目标萜烯 / 萜 类， 即， 目标萜烯 / 萜类与植物精油混合或与植物精油一起储存或构成植物精油的部分。目 标萜烯 / 萜类可以是转基因的具有毛状体的植物的总精油产量的至少约 5％、 10％、 15％、 20％、 25％、 30 ％、 35％、 40 ％、 45％、 50 ％、 55 ％、 60 ％、 65 ％、 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％或 90 ％。 转基因的具有毛状体的植物的每个叶可产生至少约 900μg 精油。温室中的良好产量通常 被认为是从约 1,500 到约 2,200μg 精油 / 叶。取决于生长区域， 这可表示为在田地中的产
量为＞约 100 磅 / 英亩。
在本发明的一些实施方案中， 该基因是包括紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 (ADS)、 (-)- 芳 樟醇合酶、 (+)- 柠檬烯合酶、 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶和 / 或 γ- 蛇麻烯合酶的一种或多种的 基因 ( 可以是转基因 )。 例如， ADS 转基因的过表达可导致产生紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟 醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 / 或 γ- 蛇麻烯的一种或多种。紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳 樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 / 或 γ- 蛇麻烯可占转基因的具有毛状体的植物总精油 产量的至少约 5％、 10％、 15％、 20％、 25％、 30％、 35％、 40％、 45％、 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％或 90％。
另外， 一种或多种基因可编码参与萜烯生物合成的蛋白。萜烯生物合成可以是 半萜、 单萜、 倍半萜、 二萜、 二倍半萜、 三萜、 四萜、 或多萜的生物合成。特别地， 一种或多种 基因 ( 可以是转基因 ) 可编码， 例如 (+)- 冰片基二磷酸合酶 ； (-)- 莰烯合酶 ； (+)-3- 蒈 烯合酶 ； 菊基二磷酸合酶 ； 1， 8- 桉树脑合酶 ； 牻牛儿醇合酶 ； 异戊二烯合酶 ； (-)- 柠檬烯 合酶 ； (+)- 柠檬烯合酶 ； 芳樟醇合酶 ； 月桂烯合酶 ； (E)-β- 罗勒烯合酶 ； (-)-β- 水芹烯 合酶 ； α-- 蒎烯合酶 ； β- 蒎烯合酶 ； (+)- 桧烯合酶 ； γ- 萜品烯合酶 ； α- 萜品醇合酶 ； 萜品油烯合酶 ； 紫穗槐 -4， 11- 二烯合酶 ； 5- 表 - 马兜铃烯合酶 ； (E)-β- 红没药烯合酶 ； (E)-γ- 红没药烯合酶 ； (+)-δ- 杜松烯合酶 ； β- 石竹烯合酶 ； 表柏木醇合酶 ； β- 荜澄茄 烯合酶 ； β- 桉叶醇合酶 ； (E， E)-α- 法呢烯合酶 ； (E)-β- 法呢烯合酶 ； germacradienol/ 土臭味素合酶 ； germacredienol 合酶 ； 大根香叶烯 A 合酶 ； 大根香叶烯 C 合酶 ； 大根香叶 烯 D 合酶 ； (-)-α- 古芸烯合酶 ； γ- 蛇麻烯合酶 ； epi-isozizaene 合酶 ； 长叶烯合酶 ； 顺 式依兰油二烯合酶 ； E- 橙花叔醇合酶 ； 广藿香醇合酶 ； 并环萜烯合酶 ； δ- 蛇床烯合酶 ； δ1- 四氢大麻酚酸 ； 单端孢霉烯合酶 ； (+)- 瓦伦烯合酶 ； 岩兰螺旋二烯合酶 ； α- 姜烯合 酶； 松香二烯合酶 ； 松香二烯 / 左旋海松二烯合酶 ； 蓖麻烯合酶 ； 对映 - 咖萨 -12， 15- 二烯 合酶 ； (-)- 柯巴基二磷酸合酶 ； 对映 - 柯巴基二磷酸合酶 ； elisabethatriene ； (+)-5(6)， 13-halimadiene-15-ol 合酶 ； 对映 - 贝壳杉烯合酶 ； 左旋海松二烯合酶 ； 海松 -9(11)， 15- 二烯合酶 ； 顺式海松 -7， 15- 二烯合酶 ； 对映 - 山达海松二烯合酶 ； stemar-13-ene 合酶 ； stemodene 合酶 ； 类萜菌素合酶 ； 牻牛儿基芳樟醇合酶 ； 无环单萜伯醇 ： NADP+ 氧化还原酶 ； 牻牛儿醇 10- 羟化酶 ； (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶 ； 紫穗槐 -4， 11- 二烯氧化酶 ； 青蒿醛 δ11(13) 还原酶 ； abietadienol/abietadienal 氧化酶 ； 5- 表 - 马兜铃烯 1， 3- 二羟化酶 ； (+)-δ- 杜 松烯 8- 羟化酶 ； premnaspirodiene 加氧酶 ； 紫杉烷二萜类 (taxoid)2-α- 羟化酶 ； 紫杉烷 5-α- 羟化酶 ； 紫杉烷 13-α- 羟化酶 ； 紫杉烷 10-β- 羟化酶 ； 紫杉烷 14-β- 羟化酶 ； 紫杉 烷二萜类 7-β- 羟化酶 ； 紫杉 -4(20)， 11(12)- 二烯 -5-α- 醇 O- 乙酰基转移酶 ； 紫杉烷二 萜类 2-α-O- 苯甲酰基转移酶 ； 紫杉烷二萜类 10-β-O- 苯甲酰基转移酶 ； N- 苯甲酰基转移 酶； 苯丙氨酸氨基变位酶 ； C13- 苯基丙酰基 -CoA 转移酶 ； 和 / 或牻牛儿基牻牛儿醇 18- 羟 化酶 ( 参见表 1)。
表1： 参与萜烯生物合成和修饰的酶
可选地或此外， 一种或多种基因可编码在质体不依赖甲羟戊酸途径中具有活性的 蛋白。具体地， 一种或多种基因可编码 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸合酶 ； 1- 脱氧 -D- 木酮糖
5- 磷酸还原异构酶 ； 2C- 甲基 -D- 赤藓醇 4- 磷酸胞苷转移酶 ； 4-( 胞苷 5’ - 二磷酸 )-2C- 甲 基 -D- 赤藓醇 4- 磷酸激酶 ； 2C- 甲基 -D- 赤藓醇 2， 4- 环二磷酸合酶 ； (E)-4- 羟基 -3- 甲 基 - 丁 -2- 烯基二磷酸合酶 ； (E)-4- 羟基 -3- 甲基 - 丁 -2- 烯基二磷酸还原酶 ； 异戊烯基 二磷酸异构酶 ； 或牻牛儿基二磷酸合酶。
一种或多种基因还可编码参与对薄荷烷单萜代谢的蛋白。具体地， 一种或多种基 因可编码 ： (-)- 柠檬烯合酶 ； (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶 ； (-)- 反式异薄荷烯醇脱氢酶 ； (-)- 反 式异胡椒酮还原酶 ； (+)- 顺式异胡薄荷酮异构酶 ； (+)- 薄荷呋喃合酶 ； (+)- 胡薄荷酮还原 酶； (-)- 薄荷醇还原酶 ； 和 (+)- 新薄荷醇还原酶。
另外， 一种或多种基因可编码 DXP 合酶 (DXPS) ； (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶 (L3H) ； 或 薄荷呋喃合酶 (MFS)。MFS 的反义转基因的表达可导致 (+)- 薄荷呋喃的产生减少。产生 (+)- 薄荷呋喃的量减少约 5％、 10％、 15％、 20％、 25％、 30％、 35％、 40％、 45％、 50％、 55％、 60％、 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％或 95％。
本发明的遗传改造的植物通常生长在适于其中包含的基因表达的条件下， 和允许 同源或异源的目标萜烯 / 萜类的产生和储存的条件下。本领域技术人员将理解， 这样的条 件包括提供足量的水、 营养、 光照等等， 以及适当的温度。条件可略微改变， 取决于植物物 种， 取决于被产生的萜烯 / 萜类、 植物生长的气候、 地理和地质、 可获得的资源、 以及其他因 素。 在本发明的一些实施方案中， 用化学物处理具有腺毛的植物 ( 转基因和非转基因 二者 ) 以增加植物的腺毛密度。例如， 植物激素茉莉酮酸甲酯、 茉莉酸 (jasmonoyl acid) (JA) 衍生物 (Wasternack， 2007)、 冠菌素、 和 / 或多种促乙烯释放剂可用于处理。在一个实 施方案中， 施加的化学物包括一种或多种茉莉酮酸酯， 这包括但不限于 ： 茉莉酮酸酯诸如茉 莉酮酸甲酯 ； 茉莉酸 (jasmonyl acid) 的氨基酸或肽共轭物 ( 如， 包括与甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸形成的共轭物 ) ； 多种噻唑衍生物 ； 9， 10- 二氢 -JA 和其甲酯、 coronalon 和其他 6- 取代的 4- 氧 - 茚满酰 - 异亮氨酸共轭物、 顺式茉莉酮等等。用于处理 的化学物可以是天然或合成的。在优选实施方案中， 具有腺毛的植物在生长阶段被用 MeJA 的稀溶液处理。MeJA 的工作溶液通常具有从约 10μM 至约 10mM 的浓度， 可稀释在例如， 水 或乙醇或其组合或适用于向植物施用的其他溶剂。例如， 可使用 1 ∶ 4,000(v ∶ v)MeJA 比 水的溶液。增溶剂和湿润剂也可与 MeJA 工作溶液联合。具有腺毛的植物可例如， 约每周 2 一次以约 100ml/m 的体积经例如 3 周的阶段处理。溶液可通过将植物蒙雾或喷雾， 或通过 任何其他适当的手段来施用。 与未处理对照植物相比， 植物毛状体密度的增加通常是例如， 约 5 ％、 10 ％、 15 ％、 20 ％或 25 ％， 通常导致被处理植物的精油产生增加至少约 5 ％、 10 ％、 15％、 20％或 25％ ( 如， 24％ ) 或更大。
可利用许多已知适当方法的任一种从遗传改造的具有毛状体的植物提取 ( 收获、 回收等等 ) 精油， 包括但不限于蒸汽蒸馏、 有机萃取和微波技术。可确定遗传改造的具有毛 状体的植物的总精油产量和产量 / 叶。精油的各化学成分可通过常规有机萃取和纯化方法 分离。另外， 可对具有腺毛的植物和其精油进行定性和定量分析。精油的组成和品质可利 用例如， 气相色谱 / 质谱 (GC/MS) 确定。叶可直接 ( 此前不冷冻 ) 利用例如， 10mL 戊烷在冷 凝器冷却的 Likens-Nickerson 装置中蒸汽蒸馏和溶剂萃取 (Ringer 等， 2003)。然后， 萜烯 和其他成分可通过在带有质谱检测的气相色谱中与可信标准物的保留时间和质谱比较来
鉴定。定量可通过带有火焰电离检测的气相色谱基于已知量可信标准物的校准曲线， 和对 作为内部标准的樟脑的峰面积标准化来实现。
由本发明方法产生的萜烯 / 萜类具有许多不同的用途， 如， 用在药物、 食品、 化妆 品、 用作杀虫剂、 用于治疗疾病情况等等。 此外， 在提取后或在叶中原处地， 油可用作生物燃 料。 实施例 实施例 1. 对精油产量的基因型依赖性和环境效应与腺毛密度直接相关
1.1 胡椒薄荷作为精油产生的模型
调整精油产量和组成的努力已经成功， 但进一步的改进只有当建立对目前理 解 较 少 的 控 制 腺 毛 形 成 和 单 萜 生 物 合 成 的 过 程 的 深 入 了 解 时 才 能 实 现。Mahmoud 和 Croteau(2001) 报告， 通过在胡椒薄荷植物过表达编码 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸还原异构 酶 (DXR) 的基因， 观察到最高达 1.5 倍的精油产量增加。(+)- 薄荷呋喃合酶 (MFS) 基因的 反义阻遏导致不期望的副产物 (+)- 薄荷呋喃量的显著减少。对编码 (-)- 柠檬烯合酶的基 因表达水平增加的转基因植物也报告总单萜产量轻微增加 (Diemer 等， 2001)， 而在独立研 究中检测到对产量的仅微小作用 (Krasnyansky 等， 1999)。过表达编码 (-)- 柠檬烯 3- 羟 化酶 (L3H) 的基因的转基因植物不积聚增加水平的重组蛋白， 精油的组成和产量与野生型 对照相同。然而， L3H 基因的共阻遏导致中间产物 (-)- 柠檬烯的积聚极大增加， 对油产量 没有明显影响 (Mahmoud 等， 2004)。
对上述转基因株系进行了再次研究以更好地理解控制胡椒薄荷中精油产量和组 成的因素。在对已在温室中繁殖 7 年的 MFS7 植物 (Mahmoud 和 Croteau， 2001) 的例行分 析中， 检测到与野生型对照相比精油量的显著增加。数据表示， 对精油产量的基因型依赖 性和环境效应与叶表面上的腺毛密度直接相关。另外， 植物激素茉莉酮酸甲酯被鉴定为腺 毛密度和精油产量的化学调节物。此外， 产生了新的一组转基因胡椒薄荷植物株系， 它们 表达以下异源基因 ： 来自青蒿的紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 (Mercke 等， 2000)、 来自柠檬薄荷 的 (-)- 芳樟醇合酶 (Crowell 等， 2002)、 (+)- 柠檬烯合酶 ( 通过定点诱变来自绿薄荷的 (-)- 柠檬烯合酶产生的突变体 ； Colby 等， 1993)、 来自紫苏的 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶 (Mau 等， 2010)、 和来自壮丽冷杉的 γ- 蛇麻烯合酶 (Steele 等， 1998)。这些转基因株系的一些 积聚紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇或 γ- 蛇麻烯， 这些不是胡 椒薄荷天然产生的。 这些结果在以下详述， 表示胡椒薄荷 ( 和可能地薄荷家族的其他成员 ) 可能可用作产生来源于萜类途径的高价值小分子的平台。
胡椒薄荷的毛状体还合成苯丙素 (Voirin 和 Bayet， 1992)， 可能也可实现在转基 因薄荷中产生高价值苯丙素。 有价值的苯丙素包括但不限于， 丁香酚、 蒌叶酚、 黄樟素、 草蒿 脑 ( 精油中存在 )、 芪类和黄酮类。胡椒薄荷的关键益处涉及这一事实， 即有价值的小分子 的产生局限于腺毛中特化的细胞。类似的方法应当适用于在特化的解剖学结构诸如腺毛、 分泌腔、 乳汁管、 树脂泡 (resin blister) 和树脂导管中产生苯丙素的其他植物。
1.2 生物合成的基因表达谱与单萜类 (monoterpenoid) 精油组成关联但不与产量 关联
为了评价基因表达谱， 在出叶 15 天后 ( 精油生物合成活性最大的时间 ) 从叶分
离分泌细胞， 提取 RNA( 从 Lange 等， 2000b 修改 )， 利用 qPCR 测定参与决定油质量和组成 的关键基因的表达水平。在胡椒薄荷中， 单萜类精油的前体经由质体不依赖甲羟戊酸途径 合成 (Eisenreich 等， 1997)( 图 1A)。野生型对照中编码 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸合酶 (DXS)、 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸还原异构酶 (DXR)、 4- 二磷酸胞苷 -2C- 甲基 -D- 赤藓醇 激酶 (CMK) 和 1- 羟基 -2- 甲基 -2-(E)- 丁烯基 4- 二磷酸合酶 (HDS) 的基因表达水平分别 比 MFS7 植物高 4.0 倍、 1.4 倍、 1.4 倍和 2.4 倍 ( 图 2)。因此， MFS7 植物中增加的油产量 ( 与野生型比较 ； 图 3) 没有反映在编码参与单萜途径的前体供应的酶的基因的表达谱中。 还研究了编码生物合成途径的单萜特异性部分的酶的相关基因的表达水平。编码 (-)- 柠 檬烯合酶 (LS)、 (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶 (L3H) 和 (+)- 薄荷呋喃合酶 (MFS) 的基因在野生型 对照中以高水平表达 ( 与 MFS7 植物相比高 4.4 倍、 2.9 倍和 7.2 倍 )， 而 (+)- 胡薄荷酮还 原酶 (PR) 基因以非常低的水平表达 ( 比 MFS7 植物低 6.9 倍 )。这些表达谱未提供为什么 MFS7 植物中检测到精油产量增加的指示。相反， MFS7 植物中 (+)- 胡薄荷酮和 (+)- 薄荷呋 喃减少的量 ( 与野生型相比 ) 的确反映在生物合成基因的表达水平 ( 低的 MFS 和高的 PR 表达水平 )。总之， 在野生型和 MFS7 植物二者中， 基因表达谱表现为与单萜组成一致， 但与 产量不一致。
除了这种基因型比较以外， 对在温室 ( 对照 ) 和不利环境条件下生长的野生型植 物进行了实验。对 DXS、 DXR、 CMK、 HDS 和 LS 的基因表达水平以同样方式进行了实验。与温 室生长 (GH) 对照相比， 它们的表达水平在干旱 (LW) 条件下减少 ( 图 2)。相反， 这些基因的 转录子丰度在低光照 (LL) 下和当植物在低光照 / 高夜间温度 (LL/HT) 下生长时增加 ( 图 2)。与 GH 对照相比， L3H 基因的表达水平在 LL 样品降低 ( 低 2.5 倍 )， 在 LW 和 LL/HT 样品 升高 ( 分别高 2.6 和 3.9 倍 )( 图 2)。编码 PR 的基因的表达水平在所有胁迫条件下略微增 加， 而 MFS 表达在 LL 和 LL/HT 条件下被显著诱导 ( 分别高 6.3 和 3.3 倍 )。因此， 在不同环 境条件下培养的野生型植物的总单萜类精油产量的测量差异 (GH ＞ LW ＞ LL ＞ LL/HT ； 图 3) 没有反映在一致地较低的单萜生物合成基因表达水平。然而， 基因表达谱与胁迫诱导的 油组成的变化一致， 尤其是 (+)- 薄荷呋喃的积聚增加。
1.3 最大腺毛大小是恒定的， 但大小分布和密度可显著改变
油产量的变化可能是负责合成和储存精油的腺毛的尺寸的环境和 / 或基因型依 赖性差异造成的。为了评价这一假说和使得能够估计油产量， 将毛状体分成 3 种不同的尺 寸类 ： 大 ( 直径 75-82μm)、 中等 ( 直径 65-74μm) 和小 ( 直径 50-65μm)。成熟腺毛的 填充精油的表皮下腔的体积近似为球形 ( 体积 ： 4/3πr3， 其中 r ＝半径 ) 减去分泌细胞的 2 2 体积 (1/3πh(R +Rr+r )， 其中 R ＝宽端的半径， r ＝窄端的半径， h ＝平截头体 (frustum) 高度 )， 乘以调整因子 (0.9) 以考虑油储存腔还包含非油粘胶的事实。如此， 估计毛状 -4 -4 体油含量为 2.03×10 μl( 大尺寸的毛状体 )、 1.40×10 μl( 平均尺寸的毛状体 ) 或 -4 0.66×10 μl( 小尺寸的毛状体 )。
出叶后 30 天时， WT 叶上大多数腺毛为中等尺寸 (57％ )， 有可观比例的 (39％ ) 大 尺寸毛状体和低比例的 (4％ ) 小尺寸毛状体 ( 图 3F)。相反， MFS7a 株系包含显著较高比例 的大尺寸腺毛 (30 天时 67％ )、 较少中等尺寸的毛状体 (33％ )， 没有小的毛状体 ( 图 3F)。 出叶后 30 天时， 温室生长植物的叶包含平均 10,151 个腺毛， 这与迄今所用的估计量非常 相似 (10,000 个毛状体 / 叶 )。在 30 天时， MFS7a 植物包含平均 12,382 个腺毛 / 叶， 比 WT高约 22％。当考虑腺毛的大小分布和密度二者时， 在 30 天时 WT 植物的总单萜产量计算为 1,477μg/ 叶 ( 图 3F)， 这仅比测量值 (1,535±156μg/ 叶 ) 低 3.8 ％。利用同样方法， 估 计 MFS7a 植物的总单萜含量为 2,028μg/ 叶 ( 比 2,079±155μg/ 叶的测量值低 2.5％ ； 图 3F)。这些计算的单萜含量在 MFS7a 比 WT 高约 37％， 这与实验确定的产量差异 (35％ ) 非 常接近。
在不利环境条件下生长的植物叶上的腺毛密度显著较低 ( 对 WT-LW、 WT-LL 和 WT-LL/HT 植物分别是 7,273、 7,004 和 5,014 个腺毛 / 叶 )( 图 3)。不同尺寸的腺毛的分 布在 WT-GH、 WT-LW 和 WT-LL 植物中相似。然而， 出叶后 30 天时， 在严重胁迫条件下生长 的植物 (WT-LL/HT) 具有显著较高比例的小尺寸毛状体， 以大尺寸的毛状体为代价。在水 缺乏条件下生长的植物 (WT-LW) 产生 974±51μg 总单萜 / 叶， 对应与温室生长对照相比 60％的减少。当胡椒薄荷植物在低光强度下生长时 (WT-LL)， 精油产量 (658±73μg 单萜 / 叶 ) 比 WT-GH 对照低约 2.3 倍。在严重胁迫条件下 (WT-LL/HT)， 测量的精油产量甚至低至 377±9μg 单萜 / 叶。
MFS7a 植物中高的油产量 ( 与 WT 相比 ) 的一种可能解释是从光合成细胞向非光 合成腺毛更高地输入碳水化合物， 从而导致每个毛状体中更大的前体池和可能更高的合 成。这意味着， 容纳精油的腔的体积将会更大。为了检验毛状体可能合成增加量的精油的 假设， 测量 WT 和 MFS7a 植物叶表面上腺毛的直径。有趣的是， 腺毛的最大直径证明是恒定 的 (82μm)， 独立于基因型或环境生长条件 ( 数据未显示 )。然而观察到， 不同尺寸的毛状 体的分布以基因型和环境依赖性方式与油产量相关。 例如， MFS7a 植物上的腺毛比野生型植 物出现和成熟的早， 这反映在大毛状体的比例增加 (75-82μm 直径 ； MFS7a-GH 中 67％相比 于 WT-GH 中 39％ ； 图 3F)。在某些不利环境条件下生长的植物 (WT-LW 和 WT-LL) 上腺毛的 出现和成熟与 WT-GH 对照相似， 不与油产量相关 ( 图 3F)。 只有在严重胁迫条件下生长的植 物 (WT-LL/HT) 具有高得多的小 (50-65μm 直径 ) 毛状体百分比 (WT-LL/HT 中 44％相比于 WT-GH 中 4％ )， 与低的油产量一致 ( 图 3F)。腺毛尺寸的梯度通常被认为是叶发育特定阶 段的指示物 (Turner 等， 2000)。因此， 结果显示， 胡椒薄荷腺毛的结构是个固定参数， 而控 制毛状体发育的程序是可变的。通过联合毛状体分布数据与 10,000 个腺毛 / 叶的估计值 (Colson 等， 1993)， 人们可估计 MFS7a-GH 和 WT-GH 植物的油产量。基于这些计算， WT-GH 和 MFS7a-GH 植物的总单萜含量被估计为分别非常接近 1,455 和 1,638μg/ 叶 (11％差异 )， 而 实验检测到 35％差异 ( 图 3F)。 利用同样方法， 在不利环境条件下生长的植物的油含量可被 极大地过量估计 ( 估计产量相比于实验产量 ： WT-LW， 1,489 相比于 974±51μg/ 叶 ； WT-LL， 1,460 相比于 658±73μg/ 叶 ； WT-LL/HT ： 1,007 相比于 377±9μg/ 叶 )， 从而表示对于更 准确的估计需要考虑另外的因素。
在收集腺毛分布数据时， 还计数了从在不同环境条件下生长的 WT 和 MFS7a 植物获 取的叶上腺毛的数量。当联合这些计数和毛状体分布数据时， 对大多数样品计算的油产量 从实验确定值偏离少于 12％ (WT-GH、 WT-GW、 MFS7a-GH、 MFS7a-LL 和 L3H-GH)。仅当植物生 长在严重胁迫条件下时观察到更大的不一致 (WT-LL， 估计值高 36％， WT-LL/HT， 估计值高 25％ )。然而， 油产量趋势 ( 如， MFS7a-GH ＞ WT-GH ； MFS7a-LL ＞ WT-LL ； WT-GH ＞ WT-LW ＞ WT-LL ＞ WT-LL/HT) 反映在所有近似值 ( 图 3F)。
1.4 腺毛密度和精油产量可被化学地调节已知植物激素茉莉酮酸甲酯 (MeJA) 在植物中诱导各种防御响应。用 MeJA 处理 薄荷植物导致显著更高的精油产量。这些产量提高是通过增加腺毛密度来实现的。因此， MeJA 介导的腺细胞形成诱导可能是具有特化的萜类分泌结构的植物之间共同的， 可用于增 加包含用于产生萜类的特化的腺细胞的许多植物的萜类精油和树脂产量。这些结果表示， 商业上相关的萜类精油产量改进可利用低剂量化学处理来实现。
当施加于针叶树的茎时， MeJA 导致在某些针叶树形成创伤性树脂导管， 伴随着诱 导萜类树脂分泌 (Martin 等， 2002 ； Hudgins 等， 2003 ； Hudgins 等， 2004)。 用 MeJA 喷射拟南 芥导致诱导叶表面上毛状体毛的产生。 MeJA 施加还诱导番茄叶上散发萜类的腺毛的数目增 加 (Boughton 等， 2005 ； van Schie 等， 2007)。迄今还未进行萜类积聚植物中 MeJA 对毛状 体密度和精油产量的影响的研究。
用低量的在水中稀释的 MeJA(1 ∶ 4,000， v ∶ v) 处理胡椒薄荷植物 ； 每周一次用 50ml/flat 处理， 持续 3 周， 测量单萜产量和腺毛密度。MeJA 处理的植物的叶比未处理的对 照植物包含显著更多 (24％ ) 单萜类精油 ( 图 4)， 这对应于腺毛密度增加。MeJA 介导的诱 导腺细胞形成可能是具有特化的萜类分泌结构的植物之间共同的， 因此可用于增加包含用 于产生萜类的特化的腺细胞的许多植物的萜类精油和树脂产量。这些结果表示， 商业上相 关的萜类精油产量改进可利用低剂量化学处理并通过调整参与萜类生物合成的所选基因 的表达水平来实现。可能其他化学物也可用于增加腺毛密度以及因此增加精油产量。
1.7 胡椒薄荷显示作为产生油类和高价值小分子的通用平台的潜力
在转基因植物中编码 L3H 的基因的共阻遏导致积聚 (-)- 柠檬烯 ( 也称为 l- 柠檬 烯 ) 作为主要单萜， 而对油产量没有有害影响 (Mahmoud 等， 2004)。 l- 柠檬烯的光学异构体 d- 柠檬烯是从柑属树皮商业地提取的， 用在固体涂料中以对产品赋予橙类气味， 用作辅助 冷却液， 以及最重要地用在清洁品中。 d- 柠檬烯作为生物可降解溶剂具有极佳性能， 可代替 宽范围的石油基产物， 包括石油精 (mineral spirits)、 甲基乙基酮、 丙酮、 甲苯、 乙二醇醚、 以及氟化和 / 或氯化的有机溶剂。已经报告柠檬烯可溶解聚苯乙烯， 因此可能在再生泡沫 聚苯乙烯方面也有应用 (Noguchi 等， 1998)。因为柠檬烯 ( 高度还原的烃 ) 是易燃的， 其也 已被认为是生物燃料添加剂 (Freisthler， 2006)。当柠檬烯被转化为脂环族、 烷基和芳香 族烃类时获得甚至更好的燃烧性能 (Cantrell 等， 1993)， 这些烃类结构上相似于用作实验 煤油替代品的烃混合物 (Dagaut 等， 2006)。因此， 柠檬烯产生的增强将是可持续的生物能 / 生物材料经济的期望的靶。胡椒薄荷是研究产生作为生物燃料和生物材料的前体的单萜 类烃类的选择的极佳模型系统。
胡椒薄荷可用于产生来源于萜类或苯丙素生物合成途径、 但不被野生型胡椒薄荷 植物合成的其他有价值的小分子。为了提供实例， 进行实验来在胡椒薄荷中产生萜类紫穗 槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇和 / 或 γ- 蛇麻烯。利用优化的方 案， 胡椒薄荷被转化赋予编码紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 )、 (-)- 芳樟醇合酶、 (+)- 柠檬烯合酶、 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶或 γ- 蛇麻烯合酶 ( 青蒿的紫穗槐 -1， 4- 二烯合酶 (ADS)) 的基因的 泛在表达的构建体。所得转基因植物的精油包含可检测量的紫穗槐 -1， 4- 二烯、 (-)- 芳樟 醇、 (+)- 柠檬烯、 (-)- 紫苏醇或 γ- 蛇麻烯， 这些是在胡椒薄荷精油中天然不积聚的 ( 表 2 和图 5A-C)。两种不同宿主用于这些转化实验 ： 野生型和编码 (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶的基 因的表达水平减少的转基因株系 (L3H20 ； Mahmoud 等， 2004)。 另外， 精油从胡椒薄荷的挥发是可忽略的 (Gershenzon 等， 2000)。
表 2. 转基因胡椒薄荷植物中新 ( 外来 ) 萜类的含量 .
对来自绿薄荷的 (-)- 柠檬烯合酶基因进行定点诱变。
单核苷酸交换突变体之一编码具有 (+)- 柠檬烯合酶活性的蛋白。
# 这些转化中的宿主植物是 (-)- 柠檬烯 3- 羟化酶表达水平显著减少的转基因株 系 (Mahmoud 等， 2004)， 它们积聚高水平的 (-)- 柠檬烯， 即 (-)- 柠檬烯 7- 羟化酶的底物。
迄今， 调整胡椒薄荷精油组成和产量的所有努力依赖于导致组成表达转基因的构 建体。在胡椒薄荷或其他产生萜类 / 苯丙素的植物中转基因的细胞类型特异性表达可利用 腺细胞特异性启动子实现。拟南芥中参与毛状体毛起始的多种转录因子已被表征 (Ishida 等， 2008)。然而， 目前可获得的证据表示， 这些调节物可在某些植物中 ( 如， 棉籽 ； Wang 等， 2004) 诱导腺毛形成， 但在其他植物中不诱导 ( 如， 烟草 ； Payne 等， 1999)。相反， 来自金鱼 草的 myb 转录因子 MIXTA 当在转基因烟草植物中表达时， 诱导子叶、 叶和茎上产生毛状体 (Payne 等， 1999)。Gutierrez-Alcala 等 (2005) 报告， 来自拟南芥的 O- 乙酰基丝氨酸 ( 硫 醇 ) 裂解酶基因的启动子当用作启动子 -GFP 融合蛋白时， 在胡椒薄荷和烟草中赋予转基因 的毛状体特异性表达。 然而， 这一启动子不是对腺毛特异性的， 因此不适于在胡椒薄荷腺毛 中产生有价值的小分子的利用。从烟草分离了毛状体特异性启动子， 但这一启动子赋予转 基因在腺毛和非腺毛中的表达 (Wang 等， 2002)。 基于此前的 EST 数据集 (Lange 等， 2000b)， 已知参与单萜类精油生物合成的基因在胡椒薄荷腺毛的分泌细胞中高度表达， 但未在其他 组织中检测到编码的酶的活性 (Croteau 等， 2005)。腺毛特异性启动子的利用将允许特异 性地改变精油组成和产量而不影响其他组织中的代谢。
2. 示例方法
2.1 植物材料和生长条件
将胡椒薄荷 (Mentha×piperita cv.Black Mitchum) 植物培养在温室中的土壤
21*102413681 A CN 102413694说明书19/24 页(Sunshine Mix LC1， SunGro Horticulture)， 补充来自钠蒸气灯 (sodium vapor light) 的 光照 ( 在植物冠盖水平光合活性的照射 850μmolm-2s-1)， 以 16h 的光周期和 27℃ /21℃ ( 日 / 夜 ) 的温度周期。转基因植物由 Dr.R.Croteau 实验室 (WSU) 仁慈地提供。对这些转基 因株系的初始表征此前已经公开 ： MFS7(Mahmoud 和 Croteau， 2001) 和 L3H20(Mahmoud 等， 2004)。以肥料混合物 (N ∶ P ∶ K 20 ∶ 20 ∶ 20， v/v/v ； 加上螯合铁和微量元素 ) 每天浇 灌植物。胁迫实验如下进行 ： (1) 减少水量 ( 常规体积的 50％ )， (2) 将植物移到以 16h 光 周期、 减少光照水平 ( 在植物冠盖水平光合活性的照射 300μmol m-2s-1) 的生长室， 和 (3) 联合低光照处理 ( 如上 ) 与高夜间温度 (30℃ /30℃ ； 日 / 夜 )。
2.2 单萜分析
叶直接 ( 此前不冷冻 ) 利用 10mL 戊烷在冷凝器冷却的 Likens-Nickerson 装置中 蒸汽蒸馏和溶剂萃取 (Ringer 等， 2003)。单萜通过在带有质谱检测的气相色谱中与可信标 准物的保留时间和质谱比较来鉴定。 定量通过带有火焰电离检测的气相色谱基于已知量可 信标准物的校准曲线和对作为内部标准的樟脑的峰面积标准化来实现。
2.3 腺毛分布的确定
胡椒薄荷叶上腺毛的分布利用 Turner 等 (2000) 所述的方法加上微小改变来评 价。简单地说， 沿着叶片 (blade) 切割叶， 将每半个分成 3 个取样区 ( 基部、 中间和顶端 )。 对远轴和近轴的叶表面都取样。将透射电镜方格 (Transmission Electron Microscopy grids)(50 目， 3mm 直 径 ； 含 12 个 方 格 网， 每 个 的 封 闭 面 积 为 约 0.180625mm2 ； Pelco International) 放置在叶表面上。腺毛计数在每个区域的五个方格中， 在五个不同叶上进 行。基于叶的数字化图片 (ImageJ ； National Institutes of Health 开发的开源软件 ) 利 用此前描述的方法 (Turner 等， 2000) 计算总叶面积和单独腺毛的直径。 每个毛状体的精油 体积的计算如 Rios-Estepa 等 (2008) 所述地进行。
2.4 构建体设计和农杆菌介导的胡椒薄荷转化
2.4.1 制备农杆菌菌株
代 表 编 码 青 蒿 的 紫 穗 槐 -1， 4- 二 烯 合 酶 (ADS) 的 基 因 的 cDNA 从 Dr.Peter Brodelius(Kalmar University， Sweden) 获得。一系列 PCR 方法用于产生包含接头的扩增 子， 然后利用 Gateway 克隆将其与 pDONR201 载体 (Invitrogen) 重组， 从而产生输入克隆。 然后将包含这些目标基因的盒插入 p*7WG2T-DNA 目的载体 (Karimi 等， 2002) 的花椰菜花 叶病毒 35S 启动子与 NOS 终止子之间。这一载体被改造以包含编码双丙氨磷乙酰基转移酶 (bialaphos acetyltransferase) 的植物选择标记基因， 该基因赋予对草铵膦 (Basta ) 的 抗性。通过电穿孔将载体质粒转化进入根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)( 菌株 EHA105 和 GV3101)。从 LB 平板 (1％琼脂， 含 10mg/l 壮观霉素和 50mg/l 利福平 ) 挑取单农 杆菌菌落， 在 5ml 液体培养基中 ( 与以上排除琼脂同样的组成 ) 在 28℃生长过夜。将此培 养物的 500μl 等份转移到 50ml 新鲜培养基， 在 28℃生长到 OD600 为 0.6-0.8。在 3,800×g 离心悬液 15min， 倾出上清液， 将细胞团悬浮在 50ml LS 培养基中。
2.4.2 转化胡椒薄荷叶
在 250ml Erlenmeyer 烧瓶中， 将叶浸没在含 1 滴 Tween 20 的 100ml 蒸馏 (SD) 水 中， 手摇烧瓶， 直到溶液明显起泡。加入 1ml 1％ (w/v)HgCl2 水溶液后， 用石蜡膜密封烧瓶， 简短地摇动， 在通风橱中培养叶 20min。倾出培养溶液后， 用 100ml SD 水洗涤叶。这种洗涤重复 3 次， 加入乙酰丁香酮 ( 终浓度 0.4mM) 和完整的农杆菌悬液。在保持叶浸没的同时， 修剪去叶片的上部 2/3， 切开靠近基部的叶侧部 ( 不切除 )。然后， 将叶在 25℃培养 20min， 用无菌镊子逐个取出， 在无菌纸巾上简短地吸水， 转移到共培养平板 (LS 培养基， 含 20g/l 蔗糖、 2mg/l 苯基噻二唑脲 (TDZ) 和 4g/l 吉兰糖胶， 调整到 pH 5.8)。
2.5 组织培养、 植株再生和分析
在黑暗中在 25℃与农杆菌一起培养叶 3-4 天后， 将叶转移到培养平板 (LS 培养基， 含 20g/l 蔗糖、 4g/l 吉兰糖胶、 4mg/l Basta、 200mg/l 特美汀和 0.5mg/l 6- 苄基氨基嘌呤 (BAP)， 调整到 pH 5.8 ； 称为培养基 M1)。将平板在黑暗中在 25℃培养 1-2 周。然后将叶 转移到含有相同培养基加 250ml/l 椰子水的培养平板 ( 称为培养基 M2) 并如上培养另 2-4 周 ( 每 14 天转移到新平板 )。通常 2-3 周后开始形成愈伤组织。为了诱导芽形成， 将带有 愈伤组织的叶每 1-2 周在 M2 培养基或缺少 TDZ、 Basta 和 BAP 的相同培养基 ( 称为培养基 M3) 之间交替培养。大多数情况下芽形成在 2-3 周后变得可见， 立即将平板转移到带有光 -2 -1 照架的生长室。用遮光布覆盖平板以减少光照到 20μmol m s 。芽出现 2 周后， 将带有愈 伤组织和芽的叶转移到生根培养基 (LS 培养基， 含 30g/l 蔗糖、 10mg/l 萘乙酸 (NAA)、 4mg/ lBasta、 4g/l 吉兰糖胶和 200mg/l 特美汀， 调整到 pH 5.8)。在另外 2 周后， 将再生的幼苗 -2 -1 转移到土壤， 在温室条件 (25℃、 70％相对湿度， 在冠盖水平照射 850μmol m s ) 下进一步 培养到成熟。通过 PCR 按照例行方案以基因组 DNA 检查再生的植株中转基因的存在 / 不存 在 (Weigel 和 Glazebrook， 2002)。精油分析如 2.2 所述地进行。
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