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1、(10)申请公布号 CN 102415336 A (43)申请公布日 2012.04.18 C N 1 0 2 4 1 5 3 3 6 A *CN102415336A* (21)申请号 201110259350.6 (22)申请日 2011.09.05 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人中国科学院南京土壤研究所 地址 210000 江苏省南京市北京东路71号 (72)发明人苏彦华 金曼 丛郁 杨顺瑛 宋志忠 (74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人孙忠浩 (54) 发明名称 加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高出 愈率和质量的方法 (57) 摘要。
2、 本发明涉及一种利用超声波促进粳稻成熟 种胚愈伤组织形成的方法，其特征在于：在成 熟种幼胚置于愈伤组织诱导培养基前，以频率 2729kHz，功率50W的超声波对粳稻成熟种胚进 行530分钟的处理，可以不同程度加快成熟种胚 愈伤组织的出愈速度，增强愈伤组织的质量，同时 提高愈伤组织的出愈率。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102415344 A 1/1页 2 1.一种加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质量的方法，其特征在于： 在成熟种幼胚置于愈伤组织诱导培养基前，以频率2729。
3、KHz，功率50W的超声波对粳稻成 熟种胚进行530分钟的处理。 2.根据权利要求1所述的加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质量的 方法，其特征在于：所述的以频率2729KHz，功率50W的超声波对粳稻成熟种胚进行530 分钟的处理包括：取表面洁净的种子，剥去颖壳，用5%次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗5 次，在超净工作台上晾干后，将粳稻种胚置于三角瓶并浸泡于植物组织培养液中，在超声波 振荡器的内槽中振荡530分钟，沥干后用清水清洗5次，于灭菌的吸水纸上吸干后再置于 愈伤组织诱导培养基上培养。 权 利 要 求 书CN 102415336 A CN 102415344 A 1/5页 。
4、3 加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质量的 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种水稻基因工程中种胚愈伤组织的形成，尤其是一种加快粳稻成熟 种胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质量的方法，属于生物工程育种领域。 背景技术 0002 水稻是我国乃至全世界的主要粮食作物之一，世界一半以上人口以大米为主食, 因此,水稻在世界粮食生产和安全中起重要的作用。提高水稻产量和改善水稻品质一直是 育种学家极其关注的问题。采用转基因技术, 将外源基因导入水稻, 丰富水稻的基因型 , 培养优质、高产、多抗新品种是现代水稻育种的发展方向，而建立高效而稳定的组织培养再 生体系是进行转基因育种的前提。幼穗、幼。
5、胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质 量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中。但上述材料多受季节限制, 取 材不便,阻碍了水稻组织培养的进一步发展。利用水稻成熟胚进行愈伤组织诱导后，进而 具有材料来源广、取材不受季节和地理环境限制、操作方便、不易污染等优点,因而被很多 水稻生物技术工作者使用。有关粳稻成熟胚组织培养, 多采用再生率较高的品种,如中花 系列等。实际生产中真正推广的一些主要品种植株再生成功报道不多,这些品种往往出愈 率不高,可利用的基因型有限（李霞，阎丽娜，周月兰.不同理化因子对苏沪香粳成熟胚愈 伤组织诱导的影响.江苏农业学报，2008,24(增刊):40-44。
6、）。因此，研究对生产有重要价 值和影响的粳稻品种的成熟胚组织的诱导技术, 具有实际应用价值。通过不同培养基、不 同激素类型及浓度对水稻成熟种胚愈伤组织诱导、分化进行了相关研究的报道很多（李玉 静，陈彦龙，王玲玲，赵颂民，朱正歌. 2，4-D和6-BA对水稻愈伤组织培养力的影响. 河北 师范大学学报，2005，4：395-398+403；王萍，李杰，王恩旭，王罡，季静，徐大勇. 水稻成熟 胚愈伤组织的诱导与增殖研究.种子，2008，5：17-19；危晓薇，王冬梅，祖木热木吐尔逊， 水稻成熟胚愈伤组织诱导及其植株再生. 新疆农业科学，2007，6：889-891）。由于不同品 种的水稻遗传背景差异。
7、很大，因此其成熟胚愈伤组织诱导培养基的激素比例有着较大的差 异，对新品种的愈伤组织诱导更换新的激素比例。 0003 大量的研究发现，外界环境应力（如声、光、电、磁和机械等）对作物的生长发育 具有明显的影响（李雪琦，申广浩，漆家学，刘娟，王楠，超声波的生物效应及其应用，2010， 6:32-36）。超声波（频率大于20 kHz弹性机械波）具有穿透力强、功率大和方向性好的特 点，是一种重要的环境应力。超声波对不同作物（植物组织）的刺激效应不同，在一种作物 上表现为正向效应，而在另一种作物上可能表现为负向效应。频率超过能听到的声波范围 (50 2104/秒)的声波被称为超声波，其波长短于普通电波，可。
8、以在固体内部传播。超 声波包括纵波和横波两种振动方式，质点振动方向与波的传播方向一致的称为纵波，垂直 的称为横波，它们同时对物体产生影响，并很容易相互交换。产生超声波的原理是当电压加 至具有伸缩特征的材料上时，材料就会按照电压的正负和大小进行振动，产生超声波。在仪 器中超声波产生的原理是一个短而持续时间的脉冲电压去激励换能器，从而产生短的超声 说 明 书CN 102415336 A CN 102415344 A 2/5页 4 脉冲。通常用来作脉冲激励源的电路是电容放电回路，并由换能器把电能转变成超声脉冲。 超声波是一种弹性机械波, 其生物性效应非常复杂, 一般认为超声波的生物学效应主要 有机械。
9、作用、热化作用以及空化作用。由于生物组织大多数属于软组织，因而在超声波的机 械力作用下，其细微结构发生形变。这种形变将随着超声波强度的增强而增大，当增加到一 定强度时，细胞就会被击穿。生物组织在超声波机械能的作用下由于黏滞吸收，将一部分超 声转化为热能，使生物组织的温度上升，称为超声波的热化作用。在超声波作用下，还会产 生空化作用，表现出空泡湮灭过程。小泡内部产生高温高压，甚至产生电离效应及放电，推 测这可能是导致空泡周围细胞壁和质膜破损或可逆的质膜透性改变的主要机理，从而使细 胞内外发生物质交换。超声波的生物学效应根据不同的条件而会产生不同的结果。它即可 以引起生物大分子甚至细胞的破坏，也可。
10、以促进生物大分子的合成和生物体的生长。这些 条件包括超声波处理的频率、强度、作用时间和生物体的结构功能状态。植物细胞经超声波 处理，出现了一致现象，即低剂量、短时间的温和处理能明显加速和诱导植物细胞的分裂， 刺激细胞生长，加速原生质体的蛋白合成；而处理时间延长，处理剂量加大则会造成负面的 不可恢复的影响。目前，超声波已经在提取此生代谢物，促进种子发芽率，提高转基因效率 等生物领域中得到广泛的应用。 0004 目前在有关粳稻成熟胚组织培养，多采用再生率较高的品种，如中花系列等，而实 际生产中真正推广的一些主要品种成熟种胚愈伤组织往往出愈率不高，在水稻的遗传转 化、品种培育中可利用的基因型有限，导。
11、致植株再生成功报道不多中。因此，研究对生产有 重要价值和影响的粳稻品种的成熟胚组织和植株再生技术，具有实际应用价值。 发明内容 0005 本发明的目的在于：针对粳稻品种成熟种胚的愈伤组织出愈往往出愈率不高，在 水稻的遗传转化、品种培育中可利用的基因型有限的实际问题，提供一种加快水稻成熟种 胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质量的方法。 0006 本发明的目的是这样实现的：一种加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高 出愈率和质量的方法，其特征在于：在成熟种幼胚置于愈伤组织诱导培养基前，以频率 2729KHz，功率50W的超声波对粳稻成熟种胚进行530分钟的处理。 0007 在本发明中，所述的以频率27。
12、29KHz，功率50W的超声波对粳稻成熟种胚进行 530分钟的处理包括：取表面洁净的种子，剥去颖壳，用5%次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲 洗5次，在超净工作台上晾干后，将粳稻种胚置于三角瓶并浸泡于植物组织培养液中，在超 声波振荡器的内槽中振荡530分钟，沥干后用清水清洗5次，于灭菌的吸水纸上吸干后再 置于愈伤组织诱导培养基上培养。 0008 本发明的优点在于：由于在成熟种幼胚置于愈伤组织诱导培养基前，以超声波对 粳稻成熟种胚进行处理，可以快捷稳定的加快粳稻成熟种胚形成的时间，提高粳稻成熟种 胚的质量，提高粳稻成熟种胚的出愈率。 附图说明 0009 图1用超声波对南粳44成熟种胚采用不同处理时。
13、间，其在愈伤组织诱导培养期间 的出愈率； 说 明 书CN 102415336 A CN 102415344 A 3/5页 5 图2用超声波对南粳44成熟种胚采用不同处理时间，其在愈伤组织诱导培养12天的 愈伤组织质量。 0010 图3用超声波对武育粳18成熟种胚采用不同处理时间，其在愈伤组织诱导培养期 间的出愈率； 图4用超声波对武育粳18成熟种胚采用不同处理时间，其在愈伤组织诱导培养9天的 愈伤组织质量。 具体实施方式 0011 实施例1 1 材料与方法 试验材料 以南粳44成熟种胚为材料，以昆山超声波仪器厂出品的QB-50B型超声波清洗器（超声 波频率28KHz，超声波功率50W）为仪器，。
14、进行试验。 0012 植物组织培养液：NB培养基(青岛海博生物技术有限公司，货号：HB8681)， pH=5.8。 0013 愈伤组织诱导培养基：NB(青岛海博生物技术有限公司，货号：HB8681)+2,4-D 2mg.L -1 +6-BA 0.5mg mg.L -1 +CH（水解酪蛋白）0.3g L -1 +脯氨酸 2.8g.L -1 +蔗糖30g. L -1 +gelrite 2 g.L -1 pH=5.8。 0014 培养条件：28，光照16h/d, RH 70%。 0015 取表面洁净的种子，剥去颖壳，5%次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗5次，超净工作 台上晾干后，将水稻种胚置于含有。
15、NB液体培养液的三角瓶中，在超声波振荡器的内槽中振 荡，振荡时间分为0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟5个处理，以0分钟为对照组，其 余均为实验组。处理后用清水清洗5次，于灭菌的吸水纸上吸干后置于诱导培养基上培养， 分别于3天、6天、9天、12天记录出愈率和出愈质量。每个处理18颗水稻成熟种胚，每个处 理8次重复。 0016 2 结果与分析 统计方法与数据处理 出愈指数以愈伤块的直径衡量，分为若干等级：直径10mm，为 级；5mm直径10mm,为级；直径5mm 为级。 0017 愈伤组织指数=（出愈数愈伤级数）/(调查愈伤数最高级数) 100。 0018 2.1 超声波处理对愈伤组织。
16、出愈时间的影响。 0019 由图1可见，经过超声波处理的成熟种胚的愈伤组织的出愈速度要快于对照。 对照9天所能达到的出愈率，超声波处理在6天 即可以达到。每个处理均在12d达到最大 的出愈率，每个实验组的出愈率均高于对照组，其中以超声波处理20min所获得的出愈率 最高，可达90.9%，对照组的出愈率仅为50.7%。可见超声波处理可以显著提高南粳44成熟 种胚的出愈率。 0020 由图2可见，每个实验组的愈伤组织指数均高于对照组，其中超声波处理20分 钟其级愈伤的比例也达到10%，级愈伤比例为33%，级愈伤比例为47%；而对照处理组 说 明 书CN 102415336 A CN 1024153。
17、44 A 4/5页 6 中没有级愈伤，级愈伤的比例仅为9%，级愈伤42%，通过愈伤组织指数计算显示，对 照组的愈伤组织指数为19.9%，各实验组根据处理时间的不同，依次分别为：27.8%、36.3%、 48.3%和28.2%，超声波处理20分钟的实验组，愈伤组织指数由对照组的19.9%提高到 48.3%。由此表明超声波处理在提高出愈率的同时，也可以加强愈伤组织的质量。 0021 实施例2 1 材料与方法 试验材料 以武育粳18成熟种胚为材料，以昆山超声波仪器厂出品的QB-50B型超声波清洗器（超 声波频率28KHz，超声波功率50W）为仪器，进行试验。 0022 植物组织培养液：MS(青岛海博。
18、生物技术有限公司，货号：HB8469)，pH=5.8。 0023 愈伤组织诱导培养基：MS培养基(青岛海博生物技术有限公司，货号： HB8469)+2,4-D 2.5mg.L -1 +6-BA 0.5mg mg.L -1 + CH（水解酪蛋白）0.3g L -1 +脯氨酸 2.8g. L -1 +蔗糖30g.L -1 +gelrite 2 g.L -1 pH=5.8。 0024 培养条件：28，光照16h/d, RH 70% 取表面洁净的种子，剥去颖壳，5%次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗5次，超净工作台上 晾干后，将水稻种胚置于含有MS培养基的三角瓶中，在超声波振荡器的内槽中振荡，振荡 时。
19、间分为0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟7个处理，以0分钟为 对照组，其余均为实验组。处理后用清水清洗5次，于灭菌的吸水纸上吸干后置于诱导培养 基上培养，分别于3天、6天、9天记录出愈率和出愈质量。每个处理15颗水稻成熟种胚，每 个处理6次重复。 0025 2 结果与分析 统计方法与数据处理 统计方法和数据处理均按照与实施例1相同的标准。 0026 由图3可见，经过超声波处理的成熟种胚的愈伤组织的出愈速度要快于对 照。每个处理均在9d达到最大的出愈率，每个实验组的出愈率均高于对照组，其中以超声 波处理15min所获得的出愈率最高，可达94.4%，对照组的出愈率仅为。
20、66.7%。可见超声波 处理可以显著提高武育粳18成熟种胚的出愈率。 0027 由图4可见，超声波处理15分钟，其级愈伤的出愈率达到47%，级愈伤为27%， 级愈伤为21%；而对照处理组中级愈伤的出愈率为17%，级愈伤为33%，级愈伤17%。 通过愈伤组织指数计算显示，对照组的愈伤组织指数为44.44%，各实验组根据处理时间的 不同，依次分别为： 45.55%、54.07%、71.48%、66.30%、53.33%和45.55%。超声波处理15分 钟的实验组，愈伤组织指数由对照组的44.44%提高到71.48%。由此表明超声波处理在提高 出愈率的同时，也可以加强愈伤组织的质量。 0028 通过。
21、以上实施例可以说明，在对粳稻成熟种胚进行组织培养时，不管选择哪种粳 稻品种的成熟种胚和哪种愈伤组织诱导培养基，只要在粳稻成熟种幼胚置于愈伤组织诱导 培养基前，以频率2729KHz，功率50W的超声波对粳稻成熟种胚进行530分钟的处理，都可 以不同程度加快成熟种胚愈伤组织的出愈速度，提高愈伤组织的质量和出愈率。 0029 以上各实施例不是对本发明的限制，只要根据权利要求的启示，结合本领域的基 说 明 书CN 102415336 A CN 102415344 A 5/5页 7 本常识，采用与实施例相似的方法加快粳稻成熟种胚愈伤组织出愈速度提高出愈率和质 量，均属于本发明的保护范围。 说 明 书CN 102415336 A CN 102415344 A 1/1页 8 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102415336 A 。