玉米低温诱导型启动子及活性分析 技术领域 本发明属生物工程技术领域， 涉及一段 DNA 序列， 在低温胁迫下它可以作为启动 子调控基因的表达， 具体涉及一种来源于玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 并在植物 中高度表达的低温诱导型启动子序列。
背景技术 中国是一个人口众多的农业大国， 粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温 伤害 ( 包括冷害和冻害 ) 是影响我国大部分地区的严重气象灾害， 尤其是东北和黄淮海地 区， 如东北地区在 1969 年、 1972 年和 1976 年发生了 3 次严重的低温冷害， 每次均使粮食减 产 50 亿千克以上。由于我国幅员辽阔， 地形多样， 低温冷冻害发生范围非常广， 从亚热带、 暖温带、 中温带一直到寒温带都有冷冻害发生， 如 2008 年初发生在我国南方大部分地区的 雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达 11 亿多元。目前， 冷冻害对农业生产造成 的损失人们还没有太好的办法。 对于蔬菜等相对小规模的农业生产， 人们采用了温室栽培， 可以一定程度上抵御冷冻害对生产造成的损失， 但温室的建设无疑增加了生产成本， 用过 的塑料等也容易造成污染。而对于小麦等需要大面积种植的粮食作物， 利用温室栽培显然 不现实， 人们只能根据气象专家对气候的预测来避开低温时期， 但由于气候的多变性， 预测 的准确性很低， 对生产指导意义不大。因此， 科学研究者只能转而培育抗低温的品种。
自转基因技术成熟以来， 科学家们已经得到了很多转基因品种。 然而， 由于转入的 基因大多数是由组成型启动子驱动表达的， 组成型启动子具有高效表达、 且在植物整个生 长期都表达的特点， 这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点， 不利于植物的正 常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下， 能够快速有效地诱导基 因的转录， 来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特 定的组织器官、 环境下诱导基因转录， 解决组成型启动子面对的问题。 ， 解决组成型启动子 面对的问题。迄今为止， 从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。
目前， 分离和鉴定的低温诱导型启动子并不多， 主要有油菜的 bn115、 拟南芥 rd29A、 cor15a 和 adh、 小麦 wes 120 和玉米 mlip 15 等基因启动子。其中拟南芥 Columbia 品种的基因组中分离得到 cor15a 基因的启动子， 片段大小为 900bp， 并构建了与 GUS 基因 融合表达载体， 转入马铃薯， 进行 GUS 活性检测。转基因马铃薯经过低温处理之后， 可检测 GUS 的活性， 反之， 则检测不到 GUS 的活性， 说明该启动子受低温诱导。 美国康涅狄格大学的 Mariya K 等构建了 cor15a 基因的启动子驱动 FAD7 基因的质粒， 将其整合到烟草的基因组 中， 使烟草获得了抗低温的特性。
利用低温诱导型启动子驱动抗低温基因的高效表达， 从而改良作物的耐低温性成 为目前研究的热点。然而， 目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此， 对于 新的抗 低温相关启动子的克隆、 顺式作用元件具体序列的确定、 各元件之间的相互作用， 以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
发明内容 本发明的一个目的是提供一种低温诱导型启动子序列， 该启动子序列能够诱导目 的基因高水平表达， 而且该启动子来源于玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3。
本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温诱导型启动子真核表达载 体， 该载体指导高水平表达目的基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子序列和 5’ 非翻译区。
本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚， 该转基因玉 米胚能反映启动子诱导活性的高低。
为实现上述目的， 本发明克隆了玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱 导型启动子区， 并构建了用于植物转化的载体， 所述载体包含带有 ZmDBP3 基因的 5’ 非翻译 区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达， 并观察到该启动子与低温 诱导相关的高水平活性。
本发明提供一种获得的玉米低温诱导型启动子序列， 包含相对于 SEQ ID NO ： 1的 转录起始位点的 -1bp 至 -1151bp 区 ( 见序列表 ) 的 DNA 核苷酸序列， 低温可以在植物中诱 导本发明所述的启动子的高水平活性。
获得的玉米低温诱导型启动子序列源自玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3。
一种克隆得到的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区包含相对 于 SEQ ID NO ： 1 的转录起始位点的 +1bp 至 +255bp 区 ( 见序列表 ) 的 DNA 核苷酸序列， 本 发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区能通过增强导入植物中 的目标外源基因的翻译效力， 而诱导目标基因的高水平表达。
为实现另一个目的， 本发明提供一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载 体， 所述植物表达载体包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区。
上述用于玉米转化的低温诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基 因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含 T-DNA( 转移 DNA) 的 RB( 右边界序列 ) 和 LB( 左边界序列 )， 能够在根癌农杆菌 (Agrobaterium tumefaciens)Ti 质粒存在下转化 植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体， 例如 pCAMBIA1301 载体、 pBI121 载体。
一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚， 包含玉米低温诱导型启动子序列 和玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区。
本发明提供 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 的 PCR 引物， 适于扩增包含 SEQ ID NO ： 1 的序列 DNA 片段。
关于本发明所述的用于植物的诱导型载体 (pCAMBIA1301)， 所述的玉米 DRE 响应 元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前 面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子 和 5’ 非翻译区 至含有 GUS 报告基因的载体中而构建的 pCAMBIA1301。但是， 所述 GUS 报告 基因是外源基因， 并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。
本发明提供一种应用低温诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。
植物能通过使用根癌农杆菌 (An， G.1987， Plant Physiology) 或粒子轰击方法 (Lacorte 等， 1997， Plant Cell Reports) 将上述植物低温诱导型启动子二元载体进行转
化。 本发明提供来自玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子和 5’ 非翻译区， 根据本发明的启动子和 5’ 非翻译区使得能够在植物中进行低温诱导表达。
本发明的有益效果在于可用于启动抗低温基因的高效表达， 应用于不耐低温的植 物中使植株获得抗低温的性状， 对于解决低温地区粮食危机、 生态恶化等问题都有积极意 义。
附图说明
图 1 为玉米 (B73) 基因组电泳图
图 2 为 ZmDBP3-pro PCR 电泳图
图 3 为 ZmDBP3-pro 连 T 载酶切鉴定电泳图
图 4 为 ZmDBP3-pro 连 pCAMBIA-1301PCR 鉴定电泳图
图 5 为 ZmDBP3-pro 连 pCAMBIA-1301 酶切鉴定电泳图
图 6 为 pCAMBIA 1301::ZmDBP3-Pro 转农杆菌 PCR 鉴定电泳图
图 1 至图 6 中 ： Maker 从 大 到 小 依 次 为 1849bp ； 1470bp ； 1090bp ； 738bp ； 424bp ； 280bp
图 7 为植物表达载体构建示意图
图 8 为 ZmDBP3 启动子的 GUS 检测 ( 背面 ) 照片
图 9 为 ZmDBP3 启动子的 GUS 检测 ( 正面 ) 照片
图8和9中： ZmDBP3(a) ： 4℃处理 ； ZmDBP3(b) ： 未处理 ； 35S ： 应用最广泛的组成型 启动子 具体实施方式
下面结合附图介绍具体实施步骤， 将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实 施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述， 但是以下 描述的目的是示例性的， 而不是限制本发明的范围。
实施例 1 ： 玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子的克隆
玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子 ( 启动子序列包含相对于 SEQ ID NO ： 1 的转录起始位点的 -1bp 至 -1151bp 区的 DNA 核苷酸序列 )， 在玉米 ZmDBP3 基因的 5’ 区序列中得到鉴定。
玉 米 DRE 响 应 元 件 结 合 蛋 白 基 因 ZmDBP3 登 录 在 NCBI GenBank( 登 录 号 ： FJ805751.1)， 序列表显示本发明上述基因的植物低温诱导型启动子和 5’ 非翻译区的 DNA 序列。在本文件的启动子序列表中， 转录起始位点的碱基 C 用 +1 示出。并用启动子分析网 站分析了启动子的核心元件。
启动子分析网站 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/。
以玉米基因组 DNA( 图 1) 为模板， 扩增得到目的片段， 经 1％琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为 1406bp 的条带 ( 图 2)， 并进行回收。回收片段与 pMD18-T 载体连接得到重组 质粒 pMD18-T::ZmDBP3Pro， 提取质粒并进行酶切验证 ( 图 3)， 并测序。更具体地说， 通过 PCR 扩增克隆的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动 子和 255bp 的 5’ 非翻译区 ( 见序列表 )， 上述 PCR 所用引物详细显示在表 1 中。对于 PCR 扩增， 反应程序 ： 95℃ 3min ； 95℃ 30S， 58.5℃ 30S， 72℃ 2min， 32 个循环 ； 72℃ 10min ；
表1： 引物
上游引物 下游引物
5’ CCGGAATTCCTGTTCAAAAGCGGCGTTT 3’ 5’ CATGCCATGGCTTTGTTCTGGATCACCTGT 3’ SEQ ID NO ： 2 SEQ ID NO ： 3实施例 2 ： 植物低温诱导型载体的构建
将在实施例 1 中所克隆的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型 启动子和 255bp 的 5’ 非翻译区 ZmDBP3Pro( 见序列表 ) 插入到载体中， 从而构建植物低温 诱导型载体。
更具体地说， 是将植物表达载体 pCAMBIA 1301 及重组质粒 pMD18-T::ZmDBP3Pro 用 EcoRI 和 NcoI 分别进行酶切， 然后将它们插入载体 pCAMBIA1301 的 EcoRI 和 NcoI 酶切位 点。该载体被称作 pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro， 用于驱动 GUS 基因的表达， 经 PCR 鉴定 ( 图 4) 和酶切鉴定 ( 图 5) 获得启动子与载体的重组质粒。
在图 7 中， 以编码 β- 葡糖酸醛酶的基因 GUS 为报告基因， 选择标记为潮霉素抗性 基因， 此外 35s-pro 代表 HPTII 的启动子， 而 35s-ter 代表 HPTII 的终止子， ZmDBP3Pro 代 表 GUS 的启动子， 而 Nos-ter 代表 GUS 的终止子。
实施例 3 ： 鉴定玉米低温诱导型启动子的活性
通过电激转化法， 将在实施例 2 中构建的载体 pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro 转移到 根癌农杆菌 EHA105 中， 提取质粒并进行 PCR 鉴定 ( 图 6)。
为鉴定启动子的低温诱导活性， 利用 Jefferson 等 (EMBO J， 1987) 的方法将玉米 的胚低温 (4℃ ) 处理再检测 GUS 的活性。
更具体地说， 是将玉米种子浸泡催芽， 然后将种子纵切成两半， 4℃诱导培养 24h， 将玉米种子在 GUS 检测液中于 37℃过夜， GUS 检测液 ： 1mg/ml X-gluc(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -β-D- 葡糖苷酸 )、 50mM 磷酸钠缓冲溶液 (PH ＝ 7.0)， 10mM EDTA， 0.5mM 铁氰化钾、 0.5mM 亚铁氰化钾、 0.1％ TritonX-100， 20％甲醇。如图 8 和图 9 所示， 经过 4℃诱导的玉米胚显 示出高水平的 GUS 活性， 而未经诱导的玉米胚显示出低水平的 GUS 活性。
工业实用性
如上所述， 本发明提供玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动 子和 5’ 非翻译区。
本发明提供分别将玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译 区插入至 pCAMBIA1301 而制得的植物表达载体。
经使用所述的植物表达载体进行鉴定， 本发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白 基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译区能够在低温诱导后启动下游基因的表达。因此， 本发 明可用于提高耐低温基因的启动活性， 最终获得能用于生产的耐低温粮食作物或植被。
SEQ ID NO.1 的序列 ( 带功能元件标记 )
(i) 序列特征 ： (A) 长度 ： -1bp 至 -1151bp ； +1bp 至 +255bp ； (B) 类型 ： 核苷酸 ； (C) 链性 ： 单链。
(ii) 分子类型 ： 核苷酸(iii) 序列描述 ： SEQ ID NO.1 -1151 CTGTTCAAAA GCGGCGTTTT GTCCGGTTGC CCGGGAACTC GGACTCGGTC -1101 CGTAGCAAGC AAGCGGGCGT CCTCGTCGTT TTGGGCAGG AAGCG-1051 -1001 -951CAT-box TCAAGCGCAA GTGGTATCGG GACACTGCGG CGACGCGTTC GCCGCACGCG GTTCTGGTGC GGGAGCCTCC CAGCTGCTGC CCGCTCTGTG ATACCGATAC CGTGGG ARE CAGT CGGCTCA CAAT-box GCTGA CGTCA-motif TCGCGAGC
CAAT-box -801 CAG AA TATA-box AGGTGTATA-box GCCCT AATCACTCTC AACTCTCTTG Skn-1 motif-751CTTCA AGACCTTTAG TTTGCCAAACGTACC
TATA-box -651 -601 -551 TTCAGCAC TGCATCTTT CATCGTTGTA G TGTC ACACGA AACATGATAT CTACGGTAAT AGATAGG TCGTGCCGCC ATTAGGACAA AACTTGCAGC GCCAGGATA AGTCAGG AGCGCC-501 -451ABRE GCN4-motif CTAGAGGGCG GGGCCGAGCG GTTGGTCGAT CTATGAGGGC GAGTTTGAAA ACTCACATCC TCTCCAGAGT TGGAGAGG AGAGAA ATG CAAT-box AT-401 -351TTACTCCTCG ATCCCCTCAA CGAACTGGCA TCTTTCATAA AAGT HSE GTAAGT AGTTGAAAGT CAAAGGCAGA AGTAAGATAC-301TAT CAAT-boxTT GTACTAGAAG AAAAGATGTT TTTGGT TATA-boxGAGTA7102399783 A CN 102399782
说TAAGT C TTTATG CAAT-box明AC书CG GAAAAA TCA ARE ACTGGTCCC TATA-box6/6 页-251G-201GTAGA TTAACCAAAG AAGACCATGT-151 -101AACTCAGACA GTACATGTTC CAAGG AACTTAA CAAT-box TTATTGTA GAAAAATAGATGTTACTG A ACGCAT CTTTTTTT AACAAT-box AGGAAG TGCCATTTTT A T AACAAGAGCG-51CACATTTT
5UTR Py-rich stretch +50 TAGCGGAAGC TTGTGGTTAC GCTTCCGCCA TA AGC AT TA
背景技术 中国是一个人口众多的农业大国， 粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温 伤害 ( 包括冷害和冻害 ) 是影响我国大部分地区的严重气象灾害， 尤其是东北和黄淮海地 区， 如东北地区在 1969 年、 1972 年和 1976 年发生了 3 次严重的低温冷害， 每次均使粮食减 产 50 亿千克以上。由于我国幅员辽阔， 地形多样， 低温冷冻害发生范围非常广， 从亚热带、 暖温带、 中温带一直到寒温带都有冷冻害发生， 如 2008 年初发生在我国南方大部分地区的 雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达 11 亿多元。目前， 冷冻害对农业生产造成 的损失人们还没有太好的办法。 对于蔬菜等相对小规模的农业生产， 人们采用了温室栽培， 可以一定程度上抵御冷冻害对生产造成的损失， 但温室的建设无疑增加了生产成本， 用过 的塑料等也容易造成污染。而对于小麦等需要大面积种植的粮食作物， 利用温室栽培显然 不现实， 人们只能根据气象专家对气候的预测来避开低温时期， 但由于气候的多变性， 预测 的准确性很低， 对生产指导意义不大。因此， 科学研究者只能转而培育抗低温的品种。
自转基因技术成熟以来， 科学家们已经得到了很多转基因品种。 然而， 由于转入的 基因大多数是由组成型启动子驱动表达的， 组成型启动子具有高效表达、 且在植物整个生 长期都表达的特点， 这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点， 不利于植物的正 常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下， 能够快速有效地诱导基 因的转录， 来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特 定的组织器官、 环境下诱导基因转录， 解决组成型启动子面对的问题。 ， 解决组成型启动子 面对的问题。迄今为止， 从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。
目前， 分离和鉴定的低温诱导型启动子并不多， 主要有油菜的 bn115、 拟南芥 rd29A、 cor15a 和 adh、 小麦 wes 120 和玉米 mlip 15 等基因启动子。其中拟南芥 Columbia 品种的基因组中分离得到 cor15a 基因的启动子， 片段大小为 900bp， 并构建了与 GUS 基因 融合表达载体， 转入马铃薯， 进行 GUS 活性检测。转基因马铃薯经过低温处理之后， 可检测 GUS 的活性， 反之， 则检测不到 GUS 的活性， 说明该启动子受低温诱导。 美国康涅狄格大学的 Mariya K 等构建了 cor15a 基因的启动子驱动 FAD7 基因的质粒， 将其整合到烟草的基因组 中， 使烟草获得了抗低温的特性。
利用低温诱导型启动子驱动抗低温基因的高效表达， 从而改良作物的耐低温性成 为目前研究的热点。然而， 目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此， 对于 新的抗 低温相关启动子的克隆、 顺式作用元件具体序列的确定、 各元件之间的相互作用， 以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
发明内容 本发明的一个目的是提供一种低温诱导型启动子序列， 该启动子序列能够诱导目 的基因高水平表达， 而且该启动子来源于玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3。
本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温诱导型启动子真核表达载 体， 该载体指导高水平表达目的基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子序列和 5’ 非翻译区。
本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚， 该转基因玉 米胚能反映启动子诱导活性的高低。
为实现上述目的， 本发明克隆了玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱 导型启动子区， 并构建了用于植物转化的载体， 所述载体包含带有 ZmDBP3 基因的 5’ 非翻译 区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达， 并观察到该启动子与低温 诱导相关的高水平活性。
本发明提供一种获得的玉米低温诱导型启动子序列， 包含相对于 SEQ ID NO ： 1的 转录起始位点的 -1bp 至 -1151bp 区 ( 见序列表 ) 的 DNA 核苷酸序列， 低温可以在植物中诱 导本发明所述的启动子的高水平活性。
获得的玉米低温诱导型启动子序列源自玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3。
一种克隆得到的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区包含相对 于 SEQ ID NO ： 1 的转录起始位点的 +1bp 至 +255bp 区 ( 见序列表 ) 的 DNA 核苷酸序列， 本 发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区能通过增强导入植物中 的目标外源基因的翻译效力， 而诱导目标基因的高水平表达。
为实现另一个目的， 本发明提供一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载 体， 所述植物表达载体包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区。
上述用于玉米转化的低温诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基 因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含 T-DNA( 转移 DNA) 的 RB( 右边界序列 ) 和 LB( 左边界序列 )， 能够在根癌农杆菌 (Agrobaterium tumefaciens)Ti 质粒存在下转化 植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体， 例如 pCAMBIA1301 载体、 pBI121 载体。
一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚， 包含玉米低温诱导型启动子序列 和玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的 5’ 非翻译区。
本发明提供 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 的 PCR 引物， 适于扩增包含 SEQ ID NO ： 1 的序列 DNA 片段。
关于本发明所述的用于植物的诱导型载体 (pCAMBIA1301)， 所述的玉米 DRE 响应 元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前 面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子 和 5’ 非翻译区 至含有 GUS 报告基因的载体中而构建的 pCAMBIA1301。但是， 所述 GUS 报告 基因是外源基因， 并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。
本发明提供一种应用低温诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。
植物能通过使用根癌农杆菌 (An， G.1987， Plant Physiology) 或粒子轰击方法 (Lacorte 等， 1997， Plant Cell Reports) 将上述植物低温诱导型启动子二元载体进行转
化。 本发明提供来自玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子和 5’ 非翻译区， 根据本发明的启动子和 5’ 非翻译区使得能够在植物中进行低温诱导表达。
本发明的有益效果在于可用于启动抗低温基因的高效表达， 应用于不耐低温的植 物中使植株获得抗低温的性状， 对于解决低温地区粮食危机、 生态恶化等问题都有积极意 义。
附图说明
图 1 为玉米 (B73) 基因组电泳图
图 2 为 ZmDBP3-pro PCR 电泳图
图 3 为 ZmDBP3-pro 连 T 载酶切鉴定电泳图
图 4 为 ZmDBP3-pro 连 pCAMBIA-1301PCR 鉴定电泳图
图 5 为 ZmDBP3-pro 连 pCAMBIA-1301 酶切鉴定电泳图
图 6 为 pCAMBIA 1301::ZmDBP3-Pro 转农杆菌 PCR 鉴定电泳图
图 1 至图 6 中 ： Maker 从 大 到 小 依 次 为 1849bp ； 1470bp ； 1090bp ； 738bp ； 424bp ； 280bp
图 7 为植物表达载体构建示意图
图 8 为 ZmDBP3 启动子的 GUS 检测 ( 背面 ) 照片
图 9 为 ZmDBP3 启动子的 GUS 检测 ( 正面 ) 照片
图8和9中： ZmDBP3(a) ： 4℃处理 ； ZmDBP3(b) ： 未处理 ； 35S ： 应用最广泛的组成型 启动子 具体实施方式
下面结合附图介绍具体实施步骤， 将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实 施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式来对本发明进行了描述， 但是以下 描述的目的是示例性的， 而不是限制本发明的范围。
实施例 1 ： 玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动子的克隆
玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子 ( 启动子序列包含相对于 SEQ ID NO ： 1 的转录起始位点的 -1bp 至 -1151bp 区的 DNA 核苷酸序列 )， 在玉米 ZmDBP3 基因的 5’ 区序列中得到鉴定。
玉 米 DRE 响 应 元 件 结 合 蛋 白 基 因 ZmDBP3 登 录 在 NCBI GenBank( 登 录 号 ： FJ805751.1)， 序列表显示本发明上述基因的植物低温诱导型启动子和 5’ 非翻译区的 DNA 序列。在本文件的启动子序列表中， 转录起始位点的碱基 C 用 +1 示出。并用启动子分析网 站分析了启动子的核心元件。
启动子分析网站 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/。
以玉米基因组 DNA( 图 1) 为模板， 扩增得到目的片段， 经 1％琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为 1406bp 的条带 ( 图 2)， 并进行回收。回收片段与 pMD18-T 载体连接得到重组 质粒 pMD18-T::ZmDBP3Pro， 提取质粒并进行酶切验证 ( 图 3)， 并测序。更具体地说， 通过 PCR 扩增克隆的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动 子和 255bp 的 5’ 非翻译区 ( 见序列表 )， 上述 PCR 所用引物详细显示在表 1 中。对于 PCR 扩增， 反应程序 ： 95℃ 3min ； 95℃ 30S， 58.5℃ 30S， 72℃ 2min， 32 个循环 ； 72℃ 10min ；
表1： 引物
上游引物 下游引物
5’ CCGGAATTCCTGTTCAAAAGCGGCGTTT 3’ 5’ CATGCCATGGCTTTGTTCTGGATCACCTGT 3’ SEQ ID NO ： 2 SEQ ID NO ： 3实施例 2 ： 植物低温诱导型载体的构建
将在实施例 1 中所克隆的玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型 启动子和 255bp 的 5’ 非翻译区 ZmDBP3Pro( 见序列表 ) 插入到载体中， 从而构建植物低温 诱导型载体。
更具体地说， 是将植物表达载体 pCAMBIA 1301 及重组质粒 pMD18-T::ZmDBP3Pro 用 EcoRI 和 NcoI 分别进行酶切， 然后将它们插入载体 pCAMBIA1301 的 EcoRI 和 NcoI 酶切位 点。该载体被称作 pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro， 用于驱动 GUS 基因的表达， 经 PCR 鉴定 ( 图 4) 和酶切鉴定 ( 图 5) 获得启动子与载体的重组质粒。
在图 7 中， 以编码 β- 葡糖酸醛酶的基因 GUS 为报告基因， 选择标记为潮霉素抗性 基因， 此外 35s-pro 代表 HPTII 的启动子， 而 35s-ter 代表 HPTII 的终止子， ZmDBP3Pro 代 表 GUS 的启动子， 而 Nos-ter 代表 GUS 的终止子。
实施例 3 ： 鉴定玉米低温诱导型启动子的活性
通过电激转化法， 将在实施例 2 中构建的载体 pCAMBIA 1301::ZmDBP3Pro 转移到 根癌农杆菌 EHA105 中， 提取质粒并进行 PCR 鉴定 ( 图 6)。
为鉴定启动子的低温诱导活性， 利用 Jefferson 等 (EMBO J， 1987) 的方法将玉米 的胚低温 (4℃ ) 处理再检测 GUS 的活性。
更具体地说， 是将玉米种子浸泡催芽， 然后将种子纵切成两半， 4℃诱导培养 24h， 将玉米种子在 GUS 检测液中于 37℃过夜， GUS 检测液 ： 1mg/ml X-gluc(5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 -β-D- 葡糖苷酸 )、 50mM 磷酸钠缓冲溶液 (PH ＝ 7.0)， 10mM EDTA， 0.5mM 铁氰化钾、 0.5mM 亚铁氰化钾、 0.1％ TritonX-100， 20％甲醇。如图 8 和图 9 所示， 经过 4℃诱导的玉米胚显 示出高水平的 GUS 活性， 而未经诱导的玉米胚显示出低水平的 GUS 活性。
工业实用性
如上所述， 本发明提供玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的低温诱导型启动 子和 5’ 非翻译区。
本发明提供分别将玉米 DRE 响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译 区插入至 pCAMBIA1301 而制得的植物表达载体。
经使用所述的植物表达载体进行鉴定， 本发明所述的玉米 DRE 响应元件结合蛋白 基因 ZmDBP3 的启动子和 5’ 非翻译区能够在低温诱导后启动下游基因的表达。因此， 本发 明可用于提高耐低温基因的启动活性， 最终获得能用于生产的耐低温粮食作物或植被。
SEQ ID NO.1 的序列 ( 带功能元件标记 )
(i) 序列特征 ： (A) 长度 ： -1bp 至 -1151bp ； +1bp 至 +255bp ； (B) 类型 ： 核苷酸 ； (C) 链性 ： 单链。
(ii) 分子类型 ： 核苷酸(iii) 序列描述 ： SEQ ID NO.1 -1151 CTGTTCAAAA GCGGCGTTTT GTCCGGTTGC CCGGGAACTC GGACTCGGTC -1101 CGTAGCAAGC AAGCGGGCGT CCTCGTCGTT TTGGGCAGG AAGCG-1051 -1001 -951CAT-box TCAAGCGCAA GTGGTATCGG GACACTGCGG CGACGCGTTC GCCGCACGCG GTTCTGGTGC GGGAGCCTCC CAGCTGCTGC CCGCTCTGTG ATACCGATAC CGTGGG ARE CAGT CGGCTCA CAAT-box GCTGA CGTCA-motif TCGCGAGC
CAAT-box -801 CAG AA TATA-box AGGTGTATA-box GCCCT AATCACTCTC AACTCTCTTG Skn-1 motif-751CTTCA AGACCTTTAG TTTGCCAAACGTACC
TATA-box -651 -601 -551 TTCAGCAC TGCATCTTT CATCGTTGTA G TGTC ACACGA AACATGATAT CTACGGTAAT AGATAGG TCGTGCCGCC ATTAGGACAA AACTTGCAGC GCCAGGATA AGTCAGG AGCGCC-501 -451ABRE GCN4-motif CTAGAGGGCG GGGCCGAGCG GTTGGTCGAT CTATGAGGGC GAGTTTGAAA ACTCACATCC TCTCCAGAGT TGGAGAGG AGAGAA ATG CAAT-box AT-401 -351TTACTCCTCG ATCCCCTCAA CGAACTGGCA TCTTTCATAA AAGT HSE GTAAGT AGTTGAAAGT CAAAGGCAGA AGTAAGATAC-301TAT CAAT-boxTT GTACTAGAAG AAAAGATGTT TTTGGT TATA-boxGAGTA7102399783 A CN 102399782
说TAAGT C TTTATG CAAT-box明AC书CG GAAAAA TCA ARE ACTGGTCCC TATA-box6/6 页-251G-201GTAGA TTAACCAAAG AAGACCATGT-151 -101AACTCAGACA GTACATGTTC CAAGG AACTTAA CAAT-box TTATTGTA GAAAAATAGATGTTACTG A ACGCAT CTTTTTTT AACAAT-box AGGAAG TGCCATTTTT A T AACAAGAGCG-51CACATTTT
5UTR Py-rich stretch +50 TAGCGGAAGC TTGTGGTTAC GCTTCCGCCA TA AGC AT TA
ARE +200 +250 ACAAAG。CAAT-box02-siteCACTCTA CTACTCGAGA GCTAAGAAAT CGTTCAACAG GTGATCCAGA8102399783 A CN 102399782
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