花生耐盐相关基因Rab7及其在提高耐盐性中的应用技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生耐盐相关基因Rab7(AhRab7)及其在提高耐盐性中的应用。
背景技术
花生是重要的油料作物和经济作物，在我国农业生产乃至整个国民经济中具有重要地位。盐胁迫抑制了花生的生长，导致植株萎蔫、荚果增大减缓、小果显著增多、产量降低，同时使荚果品质变劣，商品价值明显降低。随着环境的不断恶化，培育具有耐盐性的作物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。当前发展迅速的基因工程技术为植物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。因此，发掘重要的耐盐基因资源，将为花生的耐盐遗传改良奠定坚实基础。
Rab蛋白是小GTP结合蛋白家族最大的亚族，作为囊泡运输的分子开关，它不断在GDP和GTP结合状态之间转换，在囊泡的形成、转运、粘附和融合过程中起着重要作用。Rab蛋白不仅调节着激酶的活性，而且进一步影响细胞的生长、分化和凋亡，它调节着植物的生长发育、形态建成，参与植物对细菌病原应答中抗菌化合物的极性分泌过程。当植物受外界因子如干旱、盐碱、病害胁迫时，也有许多Rab蛋白被诱导表达。在Rab亚家族中，Rab7蛋白主要调节早期内体-晚期内体-溶酶体和液泡的物质运输，它能将高盐离子运输到液泡中并排出体外，减少盐离子对植物体的损伤，它还能清除逆境胁迫产生的活性氧，保护和修复内膜系统，提高植物的抗逆性。但目前在花生中还未见Rab7基因克隆及其功能研究的报道。
发明内容
本发明提供了花生耐盐相关基因AhRab7及其在耐盐性中的应用，本发明通过将AhRab7基因分别转入花生和大肠杆菌中，可以显著提高它们的耐盐性。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
花生耐盐相关基因AhRab7，其序列表如SEQ ID No:1所示。
所述AhRab7基因有7个外显子，分别对应的碱基为173-225，554-580，743-842，1611-1757，1860-1940，2099-2244，3167-3249。
克隆所述花生AhRab7基因的引物名称与序列如下：
P1：5- TGCTTTGATTTGAGGAGGAC-3；
P2：5- ATATCTCAGCATTCACAACC -3，
所述P1和P2分别与Rab7基因第1-20碱基、第3235-3254碱基对应。
本发明还提供了含有所述的花生耐盐相关基因AhRab7的载体。
本发明还提供了所述的花生耐盐相关基因AhRab7编码的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述氨基酸序列中有GTP结合结构域/水解结构域。
本发明还提供了所述的花生耐盐相关基因AhRab7在提高耐盐性的应用，所述花生Rab7基因可提高花生和大肠杆菌的耐盐性。
将花生AhRab7基因在花生中超量表达，花生转基因幼苗的耐盐浓度为12‰ NaCl。
将花生AhRab7基因转入大肠杆菌，表达产物为23KDa，大肠杆菌的耐盐浓度为15% NaCl。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、本发明从花生中克隆了AhRab7基因（测序结果表明该基因有7个外显子， 分别对应的碱基为173-225，554-580，743-842，1611-1757，1860-1940，2099-2244，3167-3249；氨基酸序列中有GTP结合结构域/水解结构域，分别对应的氨基酸残基为15-22，62-66，124-128，156-160。
2、转AhRab7基因花生植株形态发育正常，转基因花生苗抗12‰NaCl的胁迫；本发明将AhRab7基因在花生过量表达可显著提高其耐盐性。
3、AhRab7基因转化大肠杆菌，重组菌可以抗15% NaCl的胁迫。
4、转化体系非常有效。在较短的时间内(6w)可以获得大量抗性苗，这是获得大量转基因苗并从中筛选出耐盐性明显提高的转基因植株的重要前提。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1是本发明中花生遗传转化，a: 共培养3d的子叶外植体；b: 培养2w的子叶外植体；c: 添加100 mg /L卡那霉素培养基上筛选的抗性芽（培养4w）；d: 150 mg /L卡那霉素培养基上筛选的抗性苗（培养6w）。
图2是本发明中T1转基因植株叶片经200 mM的NaCl处理后的结果，
a:未转化植株 (WT)和转化植株(T) 的叶片经水(对照)处理7d后的结果；
b:未转化植株和转化植株的叶片经200 mM的NaCl处理7d后的结果；
c:未转化植株和转化植株的叶片经200 mM的NaCl处理后的叶绿素含量的变化。
图3是本发明中T1转基因植株经12‰的NaCl处理后的结果，a: 处理前; b: 12‰的NaCl处理7d后。
图4是本发明中用IPTG诱导AhRab7基因在大肠杆菌中表达，M: 蛋白marker；1: 对照BL21(pET28a)诱导8h；2-4: BL21 (pET28a-AhRab7) 诱导8h。箭头指诱导的AhRab7蛋白。
图5是本发明中pET28a-AhRab7经IPTG诱导后在盐溶液的生长情况，a:对照BL21(pET28a)在不同浓度盐溶液的生长情况; b: BL21(pET28a-AhRab7) 在不同浓度盐溶液的生长情况; c: PET28a和pET28a-AhRab7在15%盐溶液的生长情况 (*P<0.05, ** P<0.01) 。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。
实施例1：花生Rab7基因及其在提高花生耐盐性中的应用
一、实验材料
1.基因、菌种与水稻品种
本发明克隆了花生Rab7基因(AhRab7)，大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存、根癌农杆菌菌株EHA105（购自北京天恩泽基因科技有限公司），转基因的受体材料为花生品种 “徐州68-4” （青岛农业大学遗传研究室实验室提供）。
2.植物培养基
花生转化中采用的培养基有：
基本培养基：为MS无机盐+B5有机成分（简称MSB5），添加3%蔗糖、0.8%琼脂，pH=5.8，在121℃、105Kpa条件下灭菌20min；
SIM诱导培养基：MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4-D；
SEM芽伸长培养基：MSB5+5 mg/L BAP。
二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤：
1、AhRab7基因植物表达载体的构建
(1)扩增AhRab7基因
克隆所述花生AhRab7基因的引物名称与序列如下：
P1 (5- TGCTTTGATTTGAGGAGGAC-3)（SEQ ID No:4）；
P2 (5- ATATCTCAGCATTCACAACC -3)（SEQ ID No:5），
P1和P2分别与AhRab7基因第1-20碱基、第3235-3254碱基对应。
花生品种“徐州68-4” 由青岛农业大学遗传研究室实验室提供，通过RT-PCR扩增了AhRab7基因的编码区（其序列表如SEQ ID No:3所示）。
P3 (5-GGTACCCATGCCTTCCAGAAGAAGAAC-3) (KpnI) （SEQ ID No:6）；
P4 (5-GAGCTCATCTCAGCATTCACAACCTGT-3) (SacI) （SEQ ID No:7）；
上述引物序列分别与AhRab7基因第1-20碱基、第3235-3254碱基对应。
将AhRab7基因克隆后，测序结果表明该基因有7个外显子， 分别对应的碱基为173-225，554-580，743-842，1611-1757，1860-1940，2099-2244，3167-3249；该基因编码产生的氨基酸序列中有GTP结合结构域/水解结构域，分别对应的氨基酸残基为15-22，62-66，124-128，156-160。
(2) AhRab7基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接
回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含AhRab7基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhRab7。
3、将表达载体转化花生，包括以下步骤：
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pBI121-AhRab7重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB（利福平 50mg/L，卡那霉素 50mg/L）液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600=0.5~0.8时，取2mL菌液转移到50mL YEB（利福平50mg/L，卡那霉素 50mg/L）培养基中，培养到OD600=0.6~0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MSB5悬浮备用。
b、花生胚小叶外植体的分离：选取饱满的花生种子，在70%酒精中浸泡1min，0.1%升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴，将每片子叶纵向切成2半。
c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250 mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。
将形成丛生芽的外植体转移外到250 mg/L头孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。
培养2w后，切下不定芽部分转移到250 mg/L头孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次（如图1所示）。
4、转基因植株的PCR检测
提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhRab7基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，56℃、50s，72℃、1 min，30个循环；72℃、10min。转基因植株PCR阳性率达到20.1%。
5、转基因阳性植株的嫁接移栽
以12-15d苗龄的“花育23”无菌实生苗为砧木，切除距子叶节约 2cm 以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约 0.5-1cm。当T0代转基因植株幼苗长到约2-3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约 0.5-1cm 的 V形伤口，切口平整。将接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于MSB5培养基中无菌培养3-4d；然后移栽于灭菌的育苗基质中（包括蛭石、草炭土和珍珠岩）进行驯化3w，之后移栽到田间。转基因植株在田间生长情况表现正常。
6、T1代转基因植株耐盐性筛选
取T1代种子，进行催芽壮苗处理获得T1代幼苗。处理方法是：先在37℃条件下催芽3d；出完芽后进行壮苗，在24℃，14h光照∕10h黑暗的条件下培养15d。取T1代幼苗叶片，浸在200mM的NaCl溶液中处理1w，以未转基因的徐州68-4幼苗叶片为对照。对照叶片萎蔫变黄，叶绿素含量下降明显；部分转基因植株叶片较绿，叶绿素含量变化不大（如图2所示）。
为进一步分析转基因植株的耐盐性，将得到的 T1代幼苗先用3-5‰的NaCl溶液处理，逐渐提高NaCl溶液浓度，最后用12‰的NaCl溶液处理，进行耐盐性筛选时以未转基因的徐州68-4为对照。有3个独立来源的转植株幼苗在12‰的NaCl溶液处理下生长基本正常，而对照植株萎蔫（如图3所示），所以这3个转基因植株的抗盐浓度为12‰或以上。
实施例2、花生Rab7基因在提高大肠杆菌耐盐性中的应用
一、实验材料
1、菌种与水稻品种
大肠杆菌BL21、大肠杆菌菌株pET-28a由青岛农业大学遗传研究室实验室保存。
2、植物培养基
采用的培养基为LB培养基。
二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤：
1、AhRab7基因原核表达载体的构建
以携带AhRab7基因的pUC18重组的质粒为模板，通过PCR扩增AhRab7基因，所用引物为：
P5 (5-CATATGATGCCTTCCAGAAGAAGAAC-3) (NdeⅠ) （SEQ ID No:8）；
P6 (5-AAGCTTTCATCTCAGCATTCACAACCTGT-3) (HindⅢ) （SEQ ID No:9）；
回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收含AhRab7基因的酶切片段，并克隆到原核表达载体pET-28a的对应位点中，获得该基因的原核表达载体pET-28a- AhRab7。
2、AhRab7基因在大肠杆菌中的诱导表达
挑取携带pET-28a-AhRab7的单菌落接种于含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm培养16h，按1：30的比例转接过夜菌液(约340μL)转到10mL含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃摇床250rpm活化2-3h。当菌液OD600达到0.6-0.8时，加入100mM IPTG使终浓度达1mM，于37℃摇床250rpm诱导培养8h。含pET-28a的大肠杆菌BL21在IPTG诱导8h后的产物作为对照。取诱导后的菌夜1.5mL，12000rpm离心2min，弃上清加入60μL磷酸缓冲液以充分悬浮菌体，加入等体积的上样缓冲液混匀，室温放置5min，100 ℃煮沸5min后冷却至室温，12000rpm离心2min，取分离物在5%的浓缩胶、12%的分离胶上进行SDS-PAGE分析。pET-28a-AhRab7重组菌经诱导后，得到了大小约为23KDa的特异条带产物，而对照pET-28a经诱导后没有这条条带（如图4所示）。
3、pET-28a-AhRab7重组菌的耐盐性测定
按1：100取经IPTG诱导的重组菌和对照菌株，将其分别置于10mL含0、1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0% NaCl的液体LB中（含100μg/mL卡那霉素），分别取培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的培养物于600nm测其吸光度，重复3次，根据实验结果绘制其生长曲线，实验结果进行统计分析。pET-28a-AhRab7重组菌在15% NaCl溶液中还能生长，而对照菌的生长受到严重抑制（如图5所示）。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 花生耐盐相关基因Rab7及其在提高耐盐性中的应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3254
<212> DNA
<213> 花生
<400> 1
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tttgctgaga ctctcaacag aaagcggtta cacctttttc cgatctctct aacagaacaa 120
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cagaagaaga actctattga aggtcatcat tctcggtgac agcgggtaag ttacttttcg 240
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cacgatttcc gtttttctgc cacctactta gctcaattcg atcgaatttt ttttctccct 360
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tactgacata ataataataa taataataag gcgggcatcc ttgaatagtt gactactcat 2520
tattaaacct tgaagttaca ttagatagta ccaccgcact ttaaagttac attggatata 2580
gtggttccag tttatataat cataccctgc aaatgagtat aaccgattct tttaagttag 2640
ctcttcgatt catttttttc ttgatttagt taccagatat taggctgtgt tcagttctga 2700
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gttgtatttt gtttgatgat aaattaaata taagaaagaa taaattatga aagtctaatt 2820
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agatacctac ccgacacaat tgatgttgga accagcagtc agcaacgggc aacaggttgt 3240
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<212> PRT
<213> 花生
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20 25 30
Phe Ser Asn Gln Tyr Lys Ala Thr Ile Gly Ala Asp Phe Leu Thr Lys
35 40 45
Glu Val Gln Phe Glu Asp Arg Leu Phe Thr Leu Gln Ile Trp Asp Thr
50 55 60
Ala Gly Gln Glu Arg Phe Gln Ser Leu Gly Val Ala Phe Tyr Arg Gly
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Ala Asp Cys Cys Val Leu Val Tyr Asp Val Asn Ser Met Lys Ser Phe
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Asp Asn Leu Asn Asn Trp Arg Glu Glu Phe Leu Ile Gln Ala Ser Pro
100 105 110
Ser Asp Pro Glu Asn Phe Pro Phe Val Val Ile Gly Asn Lys Val Asp
115 120 125
Ile Asp Gly Gly Asn Ser Arg Val Val Ser Glu Lys Lys Ala Arg Ala
130 135 140
Trp Cys Ala Ser Lys Gly Asn Ile Pro Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Lys
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Glu Gly Ile Asn Val Glu Glu Ala Phe Gln Cys Ile Ala Lys Asn Ala
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Leu Lys Ser Gly Glu Glu Glu Glu Leu Tyr Leu Pro Asp Thr Ile Asp
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Val Gly Thr Ser Ser Gln Gln Arg Ala Thr Gly Cys Glu Cys
195 200 205
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<213> 花生
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agatttggga tacagctggt caggaaagat tccaaagcct aggagttgct ttctaccgtg 240
gggctgattg ctgtgttctt gtatatgatg ttaattcaat gaaatcattc gacaacctta 300
acaactggag ggaggaattt ctgattcagg ctagtccttc cgatccagag aattttcctt 360
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