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1、(10)申请公布号 CN 102603831 A (43)申请公布日 2012.07.25 C N 1 0 2 6 0 3 8 3 1 A *CN102603831A* (21)申请号 201110026199.1 (22)申请日 2011.01.25 C07H 17/07(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人苏州宝泽堂医药科技有限公司 地址 215125 江苏省苏州市工业园区星湖街 218号纳米科技园A2栋101室 (72)发明人李法庆 刘东锋 (54) 发明名称 一种高含量三叶豆苷的制备方法 (57) 摘要 一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在 于将罗布。
2、麻叶用3060低碳醇提取，提取液经 超滤膜系统超滤，透过液调碱，再用纳滤膜浓缩， 浓缩液调酸沉淀，滤出沉淀物用碱性乙醇溶液溶 解，再次调酸沉淀，滤出沉淀物水洗，用乙醇溶解， 加入活性炭脱色，脱色液注入ODS色谱柱层析，用 混合溶剂系统洗脱，采用薄层监测，收集高浓度流 分，合并，回收溶剂至小体积，静置结晶即得产品。 该制备方法操作简单，制得产品含量高，硅胶柱可 再生利用，适合小规模制备。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1页 2 1.一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于包含。
3、以下步骤： 1)提取：将罗布麻叶药材粉碎，加入312倍量3060低碳醇提取24次，过 滤，得提取液； 2)膜浓缩：将上述提取液加入超滤膜系统超滤，透过液加碱调至pH89.5，再经纳滤 膜浓缩，得浓缩液； 酸碱除杂：将上述浓缩液用酸调节至pH46沉淀，用pH810的碱液溶解，再加酸调 节至pH46，滤出沉淀加水洗涤，得沉淀物： 3)柱层析：将上述沉淀物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保温5080脱色，过滤，滤液 采用ODS中压柱层析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶剂系统洗脱，采用薄层监测，收集高浓 度流分，合并，回收溶剂至小体积，放置结晶即得产品。 2.如权利要求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特。
4、征在于所述步骤1)中低 碳醇洗用甲醇或乙醇，提取方法可采用回流提取、冷浸提取、超声提取中的一种。 3.如权利要求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的 超滤膜是截留分子量40010000的管式复合膜，纳滤膜的截留分子量是100200。 4.如权利要求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于所述步骤2)和 3)中的酸可选用盐酸、硫酸、甲酸、醋酸等有机酸或无机酸中的一种，碱可以选用氢氧化钠、 氢氧化钾、碳酸钠中的一种。 5.如权利要求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的 活性炭加入量为沉淀物的28，水浴保温2050min。 6.如权利要。
5、求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的 ODS中压柱为：硅胶为200400目，径高比为1(815)。 7.如权利要求1所述的一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在干所述步骤4)中的 洗脱液是甲醇-水或乙腈-水(2736)混合溶剂系统，用量是615BV。 权 利 要 求 书CN 102603831 A 1/4页 3 一种高含量三叶豆苷的制备方法 技术领域 ： 0001 本发明属于天然植物有效成分提取技术领域，特别是涉及一种以罗布麻叶为原料 制备三叶豆苷的方法。 背景技术 ： 0002 罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶，夏季采收。
6、，除去 杂质，干燥。罗布麻叶性凉，味甘、苦，归肝经。据药典记载，其有平肝安神，清热利水的作用， 可用于肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少；高血压，神经衰弱，肾炎浮肿等症。现代药理研究结 果表明，罗布麻叶提取物具有调节血压、降低血脂的作用，其黄酮有效部位对大鼠早期实验 性动脉粥样硬化有抑制作用。 0003 三叶豆苷(Trifolin)是罗布麻叶的黄酮类成分，分子式：C 21 H 20 O 11 ，分子量： 448.39，黄色针状结晶(甲醇)，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯及碱性水溶液，难溶于中性、酸 性水溶液。 0004 三叶豆苷具有降低血清胆固醇和升高血清高密度蛋白的效果，专利“三叶豆苷的 用途”(专利。
7、号：201010223716.X)，该专利采用三叶豆苷作为唯一活性成分用于治疗高血脂 疾病，取得了显著效果，该发明研究明确了三叶豆苷用于高血脂疾病的优势，且其在应用于 急性高血脂疾病具有同样显著的效果。 0005 近年来，随着人们的生活水平不断提高，饮食结构及生活方式的变化，人们的血脂 水平总体在逐年升高。据统计，我国20世纪90年代初期比80年代的人群血脂水平明显增 加，估计约有3040的人患有不同程度的高血脂。三叶豆苷以其良好的降低血清胆固 醇和升高血清高密度蛋白的效果，而具有广阔的研究前景。 0006 目前罗布麻叶有效成分的研究主要停留在罗布麻叶总黄酮的提取分离上，单一 黄酮类成分的提取。
8、分离较少，大多是对罗布麻叶中黄酮类成分进行化学结构鉴定的微量 分析。程秀丽等公开的“罗布麻叶中黄酮类化合物研究”，该文献采用水提，大孔树脂、聚 酰胺树脂、凝胶树脂反复上柱分离纯化得到三叶豆苷，该法制得三叶豆苷量少，损失大。 如张语迟等采用70乙醇回流提取，大孔树脂分离纯化得总黄酮苷，再采用HPLC-MS进 行结构鉴定。现有专利“罗布麻属植物罗布麻叶总黄酮提取物、其制备及应用” (专利号 200510123187.5)，该专利采用乙醇回流提取，浓缩，沸水溶解除杂，上聚酰胺树脂柱，通过 不同浓度乙醇洗脱得到罗布麻叶总黄酮，该方法未得到单一三叶豆苷成分。 发明内容 ： 0007 本发明的目的是为了解。
9、决上述现有技术所存在的问题，提供一种高含量三叶豆苷 的制备方法。该工艺采用膜浓缩结合酸碱除杂的方法得到罗布麻叶总黄酮，再通过加压硅 胶柱层析得到高纯度的三叶豆苷。 0008 本发明是通过以下技术方案实现的： 0009 一种高含量三叶豆苷的制备方法，其特征在于包含以下步骤： 说 明 书CN 102603831 A 2/4页 4 0010 1)提取：将罗布麻叶药材粉碎，加入312倍量3060低碳醇提取24次， 过滤，得提取液； 0011 2)膜浓缩：将上述提取液加入超滤膜系统超滤，透过液加碱调至pH89.5，再经 纳滤膜浓缩，得浓缩液； 0012 3)酸碱除杂：将上述浓缩液用酸调节至pH46沉淀，。
10、用pH810的碱液溶解， 再加酸调节至pH46，滤出沉淀加水洗涤，得沉淀物； 0013 4)柱层析：将上述沉淀物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保温5080脱色，过滤， 滤液采用ODS中压柱层析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶剂系统洗脱，采用薄层监测，收集 高浓度流分，合并，回收溶剂至小体积，放置结晶即得产品。 0014 所述步骤1)中低碳醇选用甲醇或乙醇，提取方法可采用回流提取，冷浸提取，超 声提取中的一种。 0015 所述步骤2)中的超滤膜是截留分子量400010000的管式复合膜，纳滤膜的截 留分子量是100200。 0016 所述步骤2)、3)中的酸可选用盐酸、硫酸、甲酸、醋酸等有机酸或无机酸中。
11、的一 种，碱可以选用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种。 0017 所述步骤4)中的活性炭加入量为沉淀物的28，水浴保温2050min。 0018 所述步骤4)中的ODS中压柱为：硅胶为200400目，径高比为1(815)。 0019 所述步骤4)中的洗脱液是甲醇-水或乙腈-水(2736)混合溶剂系统， 用量是615BV。 0020 综上所述，本发明具有以下优点： 0021 1.膜浓缩：采用膜浓缩，有效降低能耗； 0022 2.酸碱除杂：通过三叶豆苷在酸碱溶液中溶解度的差异得到罗布麻叶总黄酮，操 作简单，产品损失少； 0023 3.柱层析：采用ODS加压柱层析，ODS硅胶具有疏水性，对极性产品。
12、的分离效果较 好：采用加压的方式保证了洗脱剂的流速，加强了分离效果。 0024 下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。 具体实施方式 ： 0025 下述实施实例中三叶豆苷有效成分的监测采用薄层监测法(参照魏锦萍等“大叶 白麻叶化学成分的研究”文献)，具体方法如下： 0026 展开剂：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6331) 0027 薄层板：硅胶或者硅胶HF 254 0028 显色剂：AlCl 3 乙醇溶液 0029 将样品以及对照品的供试液进行层析展开，通过AlCl 3 乙醇溶液显色或者直接置 254nm荧光灯下观察与对照品色谱相应的位置上有相同。
13、颜色的单一斑点。 0030 实施例1： 0031 将罗布麻叶药材粉碎，称取1Kg，加入12L40乙醇冷浸16h，过滤，滤渣按上述条 件再提取一次，过滤，合并滤液，加入截留分子量6000的管式复合超滤膜系统超滤，透过液 说 明 书CN 102603831 A 3/4页 5 加氢氧化钠溶液调节至pH9，加入截留分子量100的纳滤膜中浓缩，得浓缩液，向浓缩液中 加入盐酸调节至pH4，过滤，沉淀再用pH10的氢氧化钠溶液溶解，过滤，弃去不溶物，滤液加 盐酸调节至pH4，过滤，滤饼加450ml水洗涤，得罗布麻叶总黄酮21g。将总黄酮用乙醇溶 解，加入1g活性炭水浴60保温脱色20min，过滤得脱色液，取。
14、500g300目的ODS硅胶，装 柱(径高比18)，脱色液过色谱柱加压层析，用8BV的甲醇-水(23)溶剂系统洗脱， 采用薄层监测，收集高浓度流分，合并，回收试剂至小体积，放置结晶得三叶豆苷0.96g，含 量98.7。 0032 实施例2： 0033 将罗布麻叶药材粉碎，称取1Kg，加入3L30甲醇超声提取1h，过滤，滤渣按上述 条件再提取两次，过滤，合并滤液，加入截留分子量4000的管式复合超滤膜系统超滤，透过 液加氢氧化钾溶液调节至pH8，加入截留分子量200的纳滤膜浓缩，得浓缩液，向浓缩液中 加入硫酸调节至pH6，过滤，沉淀再用pH8的氢氧化钾溶液溶解，过滤，弃去不溶物，滤液加 硫酸调节。
15、至pH4，过滤，滤饼加500ml水洗涤，得罗布麻叶总黄酮19g。将总黄酮用乙醇溶解， 加入0.5g活性炭水浴50保温脱色30min，过滤得脱色液，取400g400目的ODS硅胶，装柱 (径高比110)，脱色液过色谱柱加压层析，用10BV乙腈-水(56)溶剂系统洗脱，采 用薄层监测，收集高浓度流分，合并，回收试剂至小体积，放置结晶得三叶豆苷1.19g，含量 98.1。 0034 实施例3： 0035 将罗布麻叶药材粉碎，称取1Kg，加入8L50乙醇回流提取2h，过滤，滤渣按上述 条件再提取一次，过滤，合并滤液，加入截留分子量10000的管式复合超滤膜系统超滤，透 过液加碳酸钠溶液调节至pH9.5。
16、，加入截留分子量100的纳滤膜浓缩，得浓缩液，向浓缩液 中加入醋酸调节至pH5，过滤，沉淀再用pH10的碳酸钠溶液溶解，过滤，弃去不溶物，滤液加 醋酸调节至pH5，过滤，滤饼加550ml水洗涤，得罗布麻叶总黄酮22.3g。将总黄酮用乙醇溶 解，加入1.5g活性炭水浴70保温脱色40min，过滤得脱色液，取550g200目的ODS硅胶， 装柱(径高比112)，脱色液过色谱柱加压层析，用12BV甲醇水(35)溶剂系统洗脱， 采用薄层监测，收集高浓度流分，合并，回收试剂至小体积，放置结晶得三叶豆苷1.11g，含 量98.3。 0036 实施例4： 0037 将罗布麻叶药材粉碎，称取5Kg，加入18L。
17、30乙醇回流提取1.5h，过滤，滤渣按上 述条件再提取一次，过滤，合并滤液，加入截留分子量8000的管式复合超滤膜系统超滤，透 过液加氢氧化钠溶液调节至pH8.5，加入截留分子量200的纳滤膜浓缩，得浓缩液，向浓缩 液中加入盐酸调节至pH5.5，过滤，沉淀再用pH9的氢氧化钠溶液溶解，过滤，弃去不溶物， 滤液加盐酸调节至pH5，过滤，滤饼加3L水洗涤，得罗布麻叶总黄酮118g。将总黄酮用乙醇 溶解，加入2.5g活性炭水浴65保温脱色50min，过滤得脱色液，取2.8Kg400目的ODS硅 胶，装柱(径高比18)，脱色液过色谱柱加压层析，用10BV乙腈-水(54)溶剂系统洗 脱，采用薄层监测，收。
18、集高浓度流分，合并，回收试剂至小体积，放置结晶得三叶豆苷5.68g， 含量97.9。 0038 实施例5： 0039 将罗布麻叶药材粉碎，称取10Kg，加入50L60乙醇冷浸20h，过滤，滤渣按上述条 说 明 书CN 102603831 A 4/4页 6 件再提取一次，过滤，合并滤液，加入截留分子量10000的管式复合超滤膜系统超滤，透过 液加氢氧化钾溶液调节至pH9.5，加入截留分子量200的纳滤膜浓缩，得浓缩液，向浓缩液 中加入硫酸调节至pH4，过滤，沉淀再用pH9.5的氢氧化钾溶液溶解，过滤，弃去不溶物，滤 液加硫酸调节至pH4.5，过滤，滤饼加3L水洗涤，得罗布麻叶总黄酮190g。将总黄酮用乙醇 溶解，加入11g活性炭水浴55保温脱色40min，过滤得脱色液，取4Kg300目的ODS硅胶， 装柱(径高比110)，脱色液过色谱柱加压层析，用6BV甲醇-水(75)溶剂系统洗脱， 采用薄层监测，收集高浓度流分，合并，回收试剂至小体积，放置结晶得三叶豆苷10.1g，含 量98.2。 说 明 书CN 102603831 A 。