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1、(10)申请公布号 CN 102399247 A (43)申请公布日 2012.04.04 C N 1 0 2 3 9 9 2 4 7 A *CN102399247A* (21)申请号 201010286175.5 (22)申请日 2010.09.19 C07H 15/14(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人上海中医药大学 地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路1200 号 (72)发明人李医明 谢智勇 王瑞 王铮涛 (74)专利代理机构上海海颂知识产权代理事务 所(普通合伙) 31258 代理人何葆芳 (54) 发明名称 一种分离板蓝根中芥子苷类化合物的。
2、方法 (57) 摘要 本发明公开了一种分离板蓝根中主要芥子苷 类化合物：原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫 甙的方法。所述方法是首先用醇水溶剂回流提取 板蓝根药材粉末，再将提取物经酸性氧化铝柱层 析，然后用ODS-BP反相硅胶柱分离而得。用本发 明方法分离得到的原告依春、表原告依春及3-丁 烯基硫甙的纯度均可达到98%，且重现性好、产率 高、经济且环保，及操作简单方便、周期短、可规模 化生产，解决了现有技术无法高效、经济及高纯度 分离原告依春和表原告依春这类羟基脂肪族芥子 苷的一对手性立体异构体的难题，对研究板蓝根 的有效成分及其药理作用具有深远意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民。
3、共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 102399246 A 1/1页 2 1.一种分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤： a) 用醇水溶剂回流提取板蓝根药材粉末； b) 将上述提取液在3560减压浓缩到无醇溶剂； c) 将上述浓缩液加入到用蒸馏水平衡的酸性氧化铝柱中； d) 分别用29个柱体积的蒸馏水和26个柱体积的0.010.5mol/L的硝酸钾 水溶液淋洗柱子，以每0.252个柱体积收集为一个流份； e) 合并含有芥子苷类化合物的所有流份，在3560减压浓缩至干； f) 用甲醇对总芥子苷类化合物进行脱。
4、盐，并将得到的甲醇滤液在3560减压浓缩 到无甲醇溶剂； g) 用蒸馏水溶解总芥子苷类化合物，在-50冻干，得总芥子苷类化合物的固体粉 末； h) 将所得到的总芥子苷类化合物的固体粉末用洗脱液配制成溶液后，加入到用洗脱 液平衡的ODS-BP柱中；用110个柱体积的洗脱液淋洗柱子，即可分别收集到原告依春 (progoitrin)、表原告依春(epiprogoitrin)及3-丁烯基硫甙（gluconapin）的流份；所述 洗脱液为蒸馏水或0.010.5mol/L的硝酸钾水溶液； i) 当步骤h)中所用洗脱液为蒸馏水时，将收集到的progoitrin、epiprogoitrin及 gluconap。
5、in的流份分别在40减压浓缩至无溶剂滴出，然后在-50冻干；当步骤h)中所 用洗脱液为0.010.5mol/L的硝酸钾水溶液时，将收集到的progoitrin、epiprogoitrin 及gluconapin的流份分别按步骤e)、f)、g)所述操作进行后处理； j) 重复步骤h)至步骤i)，即可分离得到progoitrin、epiprogoitrin及gluconapin 的3个纯品的固体粉末。 2.根据权利要求1所述的分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，步骤a) 中用于提取板蓝根药材粉末的醇水溶剂是体积百分比为50%95%的乙醇水溶液或体积百 分比为50%100%的甲醇水溶液。 。
6、3.根据权利要求1所述的分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，步骤a) 中用于提取板蓝根药材粉末的醇水溶剂的体积（ml）为板蓝根药材粉末重量(g)的512 倍。 4.根据权利要求1所述的分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，步骤c) 中所述的酸性氧化铝的粒径为100200目或200300目。 5.根据权利要求1所述的分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，步骤c) 中所述的酸性氧化铝的重量与浓缩液所用药材的重量之比为202:1。 6.根据权利要求1所述的分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，其特征在于，步骤h) 中所述的ODS-BP柱的填料重量与总芥子苷类化合物的固体粉末的重。
7、量之比为10010:1。 权 利 要 求 书CN 102399247 A CN 102399246 A 1/6页 3 一种分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法 技术领域 0001 本发明涉及板蓝根中芥子苷类化合物的分离，具体说，是涉及一种分离板蓝根中 主要芥子苷类化合物：原告依春(2(R)-羟基-3-丁烯基硫甙)，progoitrin、表原告依春 (2(S)-羟基-3-丁烯基硫甙)，epiprogoitrin及3-丁烯基硫甙(gluconapin)的方法。 背景技术 0002 研究表明：板蓝根中的芥子苷类化合物主要为epiprogoitrin，progoitrin， gluconapin 和glu。
8、coraphenin，它们在总芥子苷类部位中的百分比依次为：56，21， 17，3；表原告依春(epiprogoitrin)的降解产物表告依春(epigoitrin)是一种生物 碱，具有抗流感病毒的作用；但原告依春(progoitrin)的降解产物告依春(goitrin)是一 种甲状腺毒素，具有造成甲状腺肿大的作用；2010版中国药典已将RS-告依春作为板蓝根 抗病毒药效的质量控制成分。 0003 由于表告依春和告依春的生理作用具有较大差异，并且目前还没有对RS-告依春 进行规模化手性分离纯化的工艺，以致严重限制了板蓝根药材的应用，因此，迫切需求能够 大规模从板蓝根中手性分离RS-原告依春的方。
9、法，以满足对板蓝根中有效成分表告依春的 获取、质量控制及其用途的研究需求。 0004 但芥子苷是一种具有各种侧链R的(Z)-D-葡萄糖硫苷-N-肟基硫酸盐，根据 侧链R的不同，通常分为脂肪族芥子苷、芳香族芥子苷和吲哚族芥子苷。由于硫酸基团的 强极性及侧链R基团的相似性，芥子苷的分离十分困难。与芳香族芥子苷或吲哚族芥子苷 相比，脂肪族芥子苷在ODS C18柱上因有更小的保留时间而选择性很差，这是因为脂肪族 芥子苷侧链R基团的极性很大，尤其是侧链R基团中羟基的加入使得一些脂肪族芥子苷 几乎不产生保留行为，而原告依春和表原告依春就为这类羟基脂肪族芥子苷的一对手性 立体异构体，由本领域的公知常识可知，。
10、将原告依春和表原告依春进行有效手性分离的难 度非常大，更不用说，进行高效、经济、高纯度分离这对手性异构体，也因此，目前还未见关 于从板蓝根中有效分离主要芥子苷类化合物：原告依春(2(R)-羟基-3-丁烯基硫甙)， progoitrin、表原告依春(2(S)-羟基-3-丁烯基硫甙)，epiprogoitrin及3-丁烯基硫 甙(gluconapin)的方法报道。 发明内容 0005 本发明为了解决上述技术难题，提供了一种能从板蓝根中高效、经济、高纯度分离 主要芥子苷类化合物：原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫甙的方法。 0006 为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下： 0007 一种。
11、分离板蓝根中芥子苷类化合物的方法，包括如下具体步骤： 0008 a)用醇水溶剂回流提取板蓝根药材粉末； 0009 b)将上述提取液在3560减压浓缩到无醇溶剂； 0010 c)将上述浓缩液加入到用蒸馏水平衡的酸性氧化铝柱中； 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 2/6页 4 0011 d)分别用29个柱体积的蒸馏水和26个柱体积的0.010.5mol/L的硝酸 钾水溶液淋洗柱子，以每0.252个柱体积收集为一个流份； 0012 e)合并含有芥子苷类化合物的所有流份，在3560减压浓缩至干； 0013 f)用甲醇对总芥子苷类化合物进行脱盐，并将得到的甲醇滤液在3。
12、560减压 浓缩到无甲醇溶剂； 0014 g)用蒸馏水溶解总芥子苷类化合物，在-50冻干，得总芥子苷类化合物的固体 粉末； 0015 h)将所得到的总芥子苷类化合物的固体粉末用洗脱液配制成溶液后，加入到用洗 脱液平衡的ODS-BP柱中；用110个柱体积的洗脱液淋洗柱子，即可分别收集到原告依春 (progoitrin)、表原告依春(epiprogoitrin)及3-丁烯基硫甙(gluconapin)的流份；所述 洗脱液为蒸馏水或0.010.5mol/L的硝酸钾水溶液； 0016 i)当步骤h)中所用洗脱液为蒸馏水时，将收集到的progoitrin、epiprogoitrin 及gluconapi。
13、n的流份分别在40减压浓缩至无溶剂滴出，然后在-50冻干；当步 骤h)中所用洗脱液为0.010.5mol/L的硝酸钾水溶液时，将收集到的progoitrin、 epiprogoitrin及gluconapin的流份分别按步骤e)、f)、g)所述操作进行后处理； 0017 j)重复步骤h)至步骤i)，即可分离得到progoitrin、epiprogoitrin及 gluconapin的3个纯品的固体粉末。 0018 步骤a)中用于提取板蓝根药材粉末的醇水溶剂优选体积百分比为5095的 乙醇水溶液或体积百分比为50100的甲醇水溶液；所用醇水溶剂的体积(ml)优选为 板蓝根药材粉末重量(g)的51。
14、2倍。 0019 步骤c)中所述的酸性氧化铝的粒径优选为100200目或200300目；所述酸 性氧化铝的重量与浓缩液所用药材的重量之比优选为2021。 0020 步骤h)中所述的ODS-BP柱的填料重量与总芥子苷类化合物的固体粉末的重量之 比优选为100101。 0021 与现有技术相比，本发明的有益效果主要有以下几点： 0022 1、样品纯度高，分离得到的原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫甙的纯度均可达 到98。 0023 2、操作简单方便，周期短，可规模化生产。 0024 3、重现性好，产率高，经济且环保。 附图说明 0025 图1是实施例1分离得到的progoitrin样品的HPLC谱。
15、图； 0026 图2是实施例1分离得到的epiprogoitrin样品的HPLC谱图； 0027 图3是实施例1分离得到的gluconapin样品的HPLC谱图； 0028 图4是化合物progoitrin的化学结构式图； 0029 图5是化合物epiprogoitrin的化学结构式图； 0030 图6是化合物gluconapin的化学结构式图。 具体实施方式 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 3/6页 5 0031 下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明；实施例中 0032 所采用的HPLC的检测方法为：色谱柱为Ultimate XB-C 18 (。
16、250mm4.6mm，5m)， 检测波长为229nm，温度为30，流速为1.0ml/min，进样量为10l，分析时间为30min，流 动相为乙腈-0.02磷酸水溶液，洗脱梯度为(乙腈)，0min，0；5min，0；25min，20； 28min，0；30min，0； 0033 所采用的TLC的检测方法为：薄层层析色谱板为硅胶GF 254 板，展开剂为氯仿-甲 醇-水15151，显色剂为碘蒸气。 0034 实施例1 0035 将3kg板蓝根药材粉末用体积百分比为70的乙醇水溶液在80提取3次，每次 30min，3次所用的溶剂体积分别为30L，29L，29L；合并3次提取液，在5055减压浓缩 到。
17、无乙醇溶剂，得到3.5L浓缩液。 0036 15kg酸性氧化铝柱，其柱体积为15L，用蒸馏水平衡，然后将3.5L浓缩液加入到柱 顶端；待上样完成后，分别用75L蒸馏水和45L 0.1mol/L的硝酸钾水溶液淋洗柱子，每0.5 个柱体积收集为一个流份；以黑芥子苷(sinigrin)为准标样，采用所述的HPLC和TLC的检 测方法，合并Fr.1213的含有芥子苷类化合物的所有流份，在50减压浓缩至干；用1L 甲醇对总芥子苷类化合物进行脱盐，将得到的甲醇滤液在40减压浓缩到无甲醇溶剂；用 适量体积的蒸馏水溶解总芥子苷类化合物，在-50冻干，即得15g总芥子苷类化合物的固 体粉末，产率为0.5。 00。
18、37 200g ODS-BP柱，其柱体积为400ml，用0.05mol/L的硝酸钾水溶液平衡，取10g总 芥子苷类化合物的固体粉末，用适量0.05mol/L的硝酸钾水溶液溶解，上样；在加压下，用 2400ml 0.05mol/L的硝酸钾水溶液淋洗柱子，所收集流份的体积有200ml，100ml和50ml； 同样采用上述的HPLC和TLC的检测方法，合并含有相同芥子苷的流份，在40减压浓缩至 干；用适量甲醇对各芥子苷类化合物进行脱盐，将得到的甲醇滤液在40减压浓缩至干； 用适量蒸馏水溶解各芥子苷，在-50冻干，即得progoitrin，epiprogoitrin，gluconapin 各芥子苷类化。
19、合物的固体粉末。 0038 重复上述ODS-BP柱的分离过程，最后，从10g总芥子苷类化合物中，分离得到了 progoitrin 1040mg，epiprogoitrin 3310mg，gluconapin 1050mg，且纯度均为98.0；分 离得到的progoitrin、epiprogoitrin及gluconapin样品的HPLC谱图分别见图1、图2、图 3所示。 0039 实施例2 0040 将10g板蓝根药材粉末用体积百分比为95的乙醇水溶液在80提取3次，每次 30min，每次所用的溶剂体积为100ml；合并3次提取液，在40减压浓缩到无乙醇溶剂，得 到9ml浓缩液。 0041 5。
20、0g酸性氧化铝柱，其柱体积为50ml，用蒸馏水平衡，然后将9ml浓缩液加入到柱 顶端；待上样完成后，分别用250ml蒸馏水和150ml 0.1mol/L的硝酸钾水溶液淋洗柱子，每 0.5个柱体积收集为一个流份；以黑芥子苷(sinigrin)为准标样，采用所述的HPLC和TLC 的检测方法，合并Fr.1215的含有芥子苷类化合物的所有流份，在40减压浓缩至干； 用1015ml甲醇对总芥子苷类化合物进行脱盐，将得到的甲醇滤液在40减压浓缩到无 甲醇溶剂；用适量体积的蒸馏水溶解总芥子苷类化合物，在-50冻干，即得80mg总芥子苷 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 。
21、4/6页 6 类化合物的固体粉末，产率为0.8。 0042 20g ODS-BP柱，其柱体积为40ml，用0.1mol/L的硝酸钾水溶液平衡，取80mg总 芥子苷类化合物的固体粉末，用适量0.1mol/L的硝酸钾水溶液溶解，上样；在加压下，用 240ml 0.1mol/L的硝酸钾水溶液淋洗柱子，所收集流份的体积有20ml，10ml和5ml；同样采 用上述的HPLC和TLC的检测方法，合并含有相同芥子苷的流份，在40减压浓缩至干；用 适量甲醇对各芥子苷类化合物进行脱盐，将得到的甲醇滤液在40减压浓缩至干；用适量 蒸馏水溶解各芥子苷，在-50冻干，即得progoitrin，epiprogoitri。
22、n，gluconapin各芥子 苷类化合物的固体粉末。 0043 重复上述ODS-BP柱的分离过程，最后，从80mg总芥子苷类化合物中，分离得到了 progoitrin 6mg，epiprogoitrin 20mg，gluconapin 8mg，且纯度均为98.0。 0044 实施例3 0045 将10g板蓝根药材粉末用甲醇在70提取3次，每次30min，每次100ml；合并3次 提取液，在40减压浓缩到无溶剂，再用9ml蒸馏水溶解。 0046 50g酸性氧化铝柱，其柱体积为50ml，用蒸馏水平衡，然后将9ml水溶液加入到柱 顶端；待上样完成后，分别用250ml蒸馏水和150ml 0.1mol。
23、/L的硝酸钾水溶液淋洗柱子，每 0.5个柱体积收集为一个流份；以黑芥子苷(sinigrin)为准标样，采用所述的HPLC和TLC 的检测方法，合并Fr.1216的含有芥子苷类化合物的所有流份，在40减压浓缩至干； 用1015ml甲醇对总芥子苷类化合物进行脱盐，将得到的甲醇滤液在40减压浓缩到无 甲醇溶剂；用适量体积的蒸馏水溶解总芥子苷类化合物，在-50冻干，即得90mg总芥子苷 类化合物的固体粉末，产率为0.9。 0047 20g ODS-BP柱，其柱体积为40ml，用蒸馏水平衡，取90mg总芥子苷类化合物的固 体粉末，用适量蒸馏水溶解，上样；在加压下，用240ml蒸馏水淋洗柱子，所收集流份的。
24、体 积有20ml，10ml和5ml；同样采用上述的HPLC和TLC的检测方法，合并含有相同芥子苷的 流份，在40减压浓缩至无溶剂滴出；在-50冻干，即得progoitrin，epiprogoitrin， gluconapin各芥子苷类化合物的固体粉末。 0048 重复上述ODS-BP柱的分离过程，最后，从90mg总芥子苷类化合物中，分离得到了 progoitrin 5mg，epiprogoitrin 15mg，gluconapin 9mg，且纯度均为98.0。 0049 经检测分析得知：用本发明的分离方法得到的progoitrin、epiprogoitrin和 gluconapin样品的ESI。
25、-MSM-H-分别为388、388、372，都拥有很强的碎片峰m/z 259；三 者的氢谱数据见表1所示；三者的碳谱数据见表2所示。 0050 表1氢谱数据(400MHz，D 2 O，ppm) 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 5/6页 7 0051 0052 表2碳谱数据(100MHz，D 2 O，ppm) 0053 No. progoitrin epiprogoltrin gluconapin 0 159.67 159.38 162.77 1 38.23 38.37 30.45 2 68.00 68.12 29.03 3 137.31 137.28 13。
26、5.72 4 115.22 115.36 114.93 1 80.92 80.81 80.71 2 70.88 70.98 70.90 3 75.96 76.00 76.01 4 68.68 68.78 68.08 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 6/6页 8 5 78.95 79.17 79.03 6 59.49 59.66 59.55 说 明 书CN 102399247 A CN 102399246 A 1/2页 9 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102399247 A CN 102399246 A 2/2页 10 图3 图4 图5 图6 说 明 书 附 图CN 102399247 A 。