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使用 HER3 反义寡核苷酸治疗癌症的方法
    1. 相关申请的交叉引用
     本申请要求 2009 年 4 月 14 日提交的美国临时专利申请序列 No.61/169,093 的优 先权， 在此将其全文并入作为参考。
     2. 背景技术
     HER3 属于受体酪氨酸激酶的 ErbB 家族， 其包括四种不同的受体 ： ErbB-1(EGFR、 HER1)、 ErbB-2(neu、 HER2)、 ErbB-3(HER3) 和 ErbB-4(HER4)(Yarden 等 人， Nat.Rev.Mol. Cell.Biol， 2001， 2(2) ： 127-137)。这个家族的受体蛋白由细胞外配体结合区域、 单疏水跨 膜区域和细胞质的含酪氨酸激酶的区域组成。在结合一个或多个 ErbB 受体且影响受体均 二聚或异二聚的 EGF 家族中存在至少 12 个生长因素。二聚触发结合配体的受体以及下游 的细胞内信号通路的内化和再循环 ( 或其降解 )， 上述通路特别调节细胞存活、 凋亡和增殖 活性。本领域技术人员可理解 HER3(ErbB3) 缺乏酪氨酸激酶活性。 EGFR、 HER2 和近来的 HER3 已经与肿瘤形成相关联。近来的研究已经表明， 当与它 们的正常组织对应物相比较时， EGFR 在许多恶性的人组织中过表达。编码 EGFR 的基因的 过表达、 扩增、 删除和结构重排的高发生率已经在乳腺、 肺、 卵巢和肾脏肿瘤中发现。例如， EGFR 在 80％的头部和颈部癌症中过表达， 在约 50％胶质母细胞瘤中由于扩增和 / 或突变 而被激活， 以及在西方 10-15％非小细胞肺癌 (NSCLC) 中和亚洲 30-50％ NSCLC 中由于突变 而被激活 (Frederick， L， Wang， XY， Eley， G， James， CD(2000)Cancer Res 60 ： 1383-1387 ； Riely 等人 (2006)Clin.Cancer Res.12(24) ： 7232-7241)。在多形性胶质母细胞瘤肿瘤 中 EGFR 基因的扩增是已知的最一致的遗传学改变之一。还应注意在许多非小细胞肺癌中 EGFR 过表达。在约 25-30％乳腺癌 (breast cancer) 中 HER2 扩增或过表达 (Slamon 等人 (1989)Science 244 ： 707-712)。HER3 mRNA 水平的提高已经在人乳腺癌中检测到。
     Bennett 等人的美国专利 No.6,277,640 公开了抑制 HER3 的表达的反义化合物、 组 合物和方法。
     若干蛋白酪氨酸激酶 (“PTK” ) 抑制剂已获批准为其中蛋白酪氨酸激酶表达失调 的某些癌症的选择性疗法。2001 年最初批准的 Gleevec ( 伊马替尼 (imatinib))， 已获批 准用于治疗成人和儿童的某些类型的白血病， 侵袭性系统性肥大细胞增生症， 嗜酸性粒细 胞增多综合征， 转移性隆突性皮纤维肉瘤， 和某些类型的转移性恶性胃肠道间质肿瘤。在 铂和多西紫杉醇疗法失效后， 小分子 PTK 抑制剂 Iressa ( 吉非替尼 (Gefitinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。TarcevaTM( 埃罗替尼 (erlotinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌的单药疗法或者与吉西他宾组合用于治疗 局部晚期、 不可切除性或转移性胰腺癌。然而， 这些疗法的功效受到限制， 这是因为对抑制 剂的耐受性随时间而产生。Arora 等人 (2005)J.Pharmacol.and Exp.Therapies 315(3) ： 971-971-979。近来， 已经表明， 使用蛋白酪氨酸激酶抑制剂对 HER2 和 EGFR 酪氨酸激酶活 性的抑制作用显示对 HER2 驱动的乳腺癌作用有限， 因为 HER3 的表达的代偿性提高和随后 通过 PI3K/Akt 途径的信号转导 (Sergina 等人， Nature， 2007， 445 ： 437-441)。
     存在对能够有效抑制癌症中 HER3 作用的药物的需要， 所述癌症对用蛋白酪氨酸 激酶抑制剂的治疗产生耐受性或不太有反应和 / 或对用 HER2 抑制剂的治疗已变得有耐受 性或不太有反应。
     3. 概述
     在一个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过磷酸 酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中 所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列 (best-aligned) 靶区域的反向补体至少 80％ 相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制剂和 / 或 HER2 通 路抑制剂治疗。所述耐受性可能与作为使用寡聚物降低 HER3 的表达的结果至少部分地相 反。相关的变异包括同时施用 HER3 反义寡聚物和蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制 剂和 / 或 HER2 通路抑制剂从而使寡聚物和所述抑制剂的各自抑制作用在时间上重叠。以 这种方式， 本发明提供了治疗至少部分地防止对癌症的这种抑制剂的耐受性产生 ( 如果尚 未产生 ) 或至少部分地使癌症的这种抑制剂的耐受性逆转 ( 如果已产生 )。 寡聚物可以例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列。 癌症可以例如是耐受用吉非替尼治 疗的癌症。
     在一些实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由序列 5’ -TsAsGscscstsgstscsascststsMeCsTsMeC-3’ (SE Q ID NO ： 180) 构成， 其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， Me 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基， C 表示含有 5- 甲基胞嘧啶碱基的 β-D- 氧基 -LNA 单 体， 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如但不限于吉非替尼或拉帕替尼 (lapitinib) 的治疗。
     在多个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物的缀合物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体 通过磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一 区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳 动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。
     在某些实施方案中， 本发明提供了抑制哺乳动物癌细胞增殖的方法， 该方法包括 使细胞与有效量的寡聚物接触， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过 磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其 中哺乳动物癌细胞的增殖不受蛋白酪氨酸激酶抑制剂抑制。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (PTKI) 例如但不限于吉非替尼 (gefitinb) 或本文所描述的那些中的任意一种治疗哺乳动 物。所述寡聚物和 PTKI 可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 PTKI 一起在对于哺乳
     动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可 以是对用 PTKI 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以是对一种或多种 PTKI 从未产生耐受性的癌症。癌症可以例如是至少最初耐受用一种或多种 PTKI 治疗的癌 症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。当癌症没有基本上耐受用 PTKI 治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的方法中的任意一种降低 HER3 的表达而 至少部分地防止对 PTKI 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症如乳腺癌 中与 PTKI 例如但不限于吉非替尼同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一 种降低 HER3 的表达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物用于治疗哺乳动物例如人的 PTKI 耐受性癌症， 例如 PTKI 耐受性人乳腺癌患者。 本发明的其它实施方案提供了用至少一 种 PTKI 例如但不限于吉非替尼治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其中的改 进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文所描述 的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。至少一种 PTKI 可 以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最初耐受 PTKI 的癌症， 例 如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 在一些实施方案中， 在与未经治疗的相同类型细胞的增殖相比时， 哺乳动物癌细 胞的增殖被抑制至少 50％。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 治疗哺乳动物。 所述寡聚物和 HER2 抑制剂可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂一起在对于哺乳动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或 每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可以是对用 HER2 抑制剂， 例如结合抗体或结合其 片段的 HER2 如曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或帕妥珠单抗 (pertuzumab)， 或者 HER2 通路抑 制剂例如拉帕替尼 (lapatinib) 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以 是对 HER2 抑制剂从未产生耐受性的癌症。 癌症可以例如是至少最初耐受 HER2 抑制或 HER2 通路抑制的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 当癌症没有基 本上耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的 方法中的任意一种降低 HER3 的表达而至少部分地防止对 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症中与至少 一种 HER2 抑制剂同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一种降低 HER3 的表 达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物在哺乳动物例如人类， 例如对用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂的治疗变得有耐受性或不太有反应的具有乳腺癌的人类之间用于治疗对 用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂， 例如但不限于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗， 或 HER2 通路 抑制剂例如拉帕替尼的治疗变得有耐受性或不太有反应的癌症。 本发明的其它实施方案提 供了用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其 中的改进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文
     所描述的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。HER2 抑制剂 或 HER2 通路抑制剂可以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最 初对 HER2 或 HER2 通路的抑制有响应的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中 的任意一种。
     对于上述实施方案及其变化形式中的任意一种， 一种或多种降低 HER3 的表达的 反义寡聚物可以例如是在每个 5’ 和 3’ 端具有末端 LNA 单体， 例如在每个端部的 1、 2、 3或 4 接邻 LNA 单体的缺口聚物， 其连接 DNA 单体的中心部分。至少一些， 例如所有的单体间连 接基可以是硫代磷酸酯连接基。
     本发明的另外的特征、 优点和实施方案可以给出或考虑到下面的详述、 附图和权 利要求显而易见。此外， 应当理解的是前述发明概述和下面的详述是示例性的并且意欲提 供进一步解释而并不如所要求的限制本发明的范围。
     4. 附图简述
     图1： 分别由具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 序列的寡聚物所靶向的 HER3 靶序列 以粗体和下划线显示， 表明它们在 HER3 转录产物中的位置 (GenBank 登记号 NM 001982-SEQ ID NO ： 197)。
     图2： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图3： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 EGFR mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图4： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER-2 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图5： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 180-194。
     图6： 数据显示了细胞凋亡， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH7 细 胞中， 在不同的时间点的活化的 Caspase 3/7( 半胱氨酸蛋白酶 3/7) 而测定。结果相对于 用具有 SEQ ID NO ： 235 的乱序对照的寡核苷酸治疗的细胞模拟 (cells mock) 而绘出。
     图7： 数据显示了活细胞， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH-7 细 胞中， 在不同的时间点使用 MTS 实验测定 OD490 值而测定。SEQ ID NO ： 235 是乱序对照的 寡核苷酸。
     图 8A ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中肿瘤体积的改变百分比。盐水处理的小鼠用作对 照。
     图 8B ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中的 HER 3mRNA 表达。结果相对于 GAPDH 进行归一 化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图9： 数据显示了在连续三天用 1 或 5mg/kg 具有 SEQ ID NO ： 180 或 SEQ ID NO ： 234 中所示序列的寡核苷酸静脉注射治疗之后小鼠肝脏中的 HER 3mRNA 的表达。结果相对 于 GAPDH 进行归一化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图 10 ： 数据显示了耐受高达 10μm 浓度的吉非替尼的 HCC827 人肺腺癌细胞的产 生。
     图 11 ： 数据显示了磷酸化 EFGR 的水平在耐受吉非替尼的 HCC827 细胞中比在对母 系 HCC827 吉非替尼敏感的细胞中低得多。图 12 ： 数据显示了与在未经治疗的 (“-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平相比， 在存在 (“+” ) 或缺乏 (“-” ) 吉非替尼时， 非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平 在 HCC827 吉非替尼耐受性克隆体中显著降低。相反地， 还涉及 EGFR 信号通路的 ErbB3 或 MET 的水平相比于母细胞在耐受性克隆体中没有显著降低。
     图 13 ： 数据显示了用 1μm 具有 SEQ ID NO ： 180 的寡核苷酸治疗 10 天时间段对抑 制耐受吉非替尼的 HCC827 细胞的生长具有较大的影响 ( 与未治疗的对照相比在生长方面 降低大于 80％ ) 与对吉非替尼敏感的 HCC827 细胞相比。
     图 14 ： 数据显示了降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物， 但不是曲妥珠单抗， 能够在 三种人类癌细胞系中通过拉帕替尼防止 HER3 和对 HER3 表达的反馈上调。
     图 15 ： 数据显示了拉帕替尼和降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物的组合与拉帕替 尼和曲妥珠单抗的组合相比， 三种人类癌细胞系中凋亡的协同促进作用更大。
     图 16 ： 数据显示了反义 HER3 抑制剂 SEQ ID NO ： 180 抑制了人体非小细胞肺癌的 小鼠体内异种移植模型中的肿瘤生长。
     5. 详述
     在某些实施方案中， 本发明提供了调节细胞中 HER3( 和 / 或 EGFR 和 / 或 HER2) 的 表达的方法， 所述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。 在一些实施方案中， 耐受性细胞 是癌细胞。在多个实施方案中， 提供了通过施用在胞内条件下特异地与核酸编码杂交的寡 核苷酸 ( 寡聚物 )， 来治疗或防止与 HER3 过表达有关的疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的癌症的方法。在一些实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3 的表达。在其它实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 的表达。 术语 “HER3” 与术语 “ErbB3” 在本文中互换使用。
     5.1. 方法
     在多个实施方案中， 本发明包括在细胞中抑制 HER3 的表达和 / 或活性的方法， 所 述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括使 所述细胞与有效量的寡聚化合物 ( 或其缀合物 ) 接触以在细胞中实现 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 表达和 / 或活性的抑制 ( 例如下调 )。在某些实施方案中， 抑制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 )mRNA 的表达。 在其它实施方案中， 抑 制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 蛋白质的表达。在多个实施方案中， 所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。
     在某些实施方案中， 在体外发生所述接触。 在其它实施方案中， 通过向哺乳动物施 用本文所描述的组合物而在体内实现所述接触。在多个实施方案中， 本发明提供了在细胞 中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及 HER2 蛋白质和 / 或 mRNA 的 表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列显示为 SEQ ID NO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明 提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及在细胞中 EGFR 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它 实施方案中， 本发明提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或 蛋白的表达的方法。
     如本文中所互换使用的， 术语 “蛋白酪氨酸激酶抑制剂” “PTK 抑制剂” 和 “酪氨酸激
     酶抑制剂” 是指结合并抑制一个或多个酪氨酸激酶区的活性的分子。蛋白酪氨酸激酶抑制 剂不是如下文所描述靶向 HER3 的寡聚物。在一些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是单 克隆抗体。在其它实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是具有小于 1000Da， 例如 300-700Da 的分子量的小分子。
     在某些实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一个或多个 EGFR 家族成员的酪氨酸激酶。 在多个实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一种或多种蛋白质的酪氨酸激酶， 所述蛋白质与一 个或多个 EGFR 家族成员相互作用或受一个或多个 EGFR 家族成员调节， 所述 EGFR 家族成员 是例如涉及一个或多个由一个或多个 EGFR 家族成员发出的信号级联的蛋白质。在一些实 施方案中， 酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶， 即是具有细胞外配体结合区域且通过结合一个 或多个配体而活化的较大蛋白质的细胞内区域。在某些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶是非 受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶在一个或多个信号通路中调节其它蛋白质的活性， 其通过使 它们磷酸化来进行调节。
     如本文所使用的， 耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞是指在与蛋白酪氨酸 激酶抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。如本文所使用的， 在与 PTK 抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 PTK 抑制剂治疗， 与相同类型的没有与 PTK 抑制 剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性细胞是内在地耐受用 PTK 抑制剂治疗的 那些。在一些实施方案中， 耐受性细胞是从先前暴露于 PTK 抑制剂而获得耐受性的细胞， 所述暴露是作为单药疗法或者作为与一种或多种另外的药物例如化疗药物或反义寡核苷 酸组合治疗的一部分。类似地， 如本文所使用的， 耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治 疗的细胞通常是指在与这些抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。 如本 文所使用的， 在与所述抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑 制剂治疗， 与相同类型的没有与所述抑制剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相 比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性 细胞是内在地耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗的那些。在一些实施方案中， 耐 受性细胞是从先前暴露于 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂获得耐受性的细胞。
     在一些实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非 TM 替 尼 (ZD-1839， Iressa )， 伊 马 替 尼 (Gleevec )， 埃 罗 替 尼 (OSI-1774， Tarceva )， 卡 纽替尼 (canertinib)(CI-1033)， 凡德他尼 (vandetanib)(ZD6474， Zactima )， 酪氨酸磷 酸化抑制剂 (tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)， 拉帕替尼 (GW-572016)， 索拉非尼 (sorafenib)(BAY43-9006)， AG-494(CAS 133550-35-3)， RG-13022(CAS 149286-90-8)， RG-14620(CAS 136831-49-7)， BIBW 2992(Tovok)，酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 9(CAS 136831-49-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 23(CAS 118409-57-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 25(CAS 118409-58-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 46(CAS 122520-85-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 47(CAS 122520-86-9)， 酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 53(CAS 122520-90-5)， 紫 铆 因 (butein)(1-(2， 4- 二羟基苯基 )-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 丙烯 -1- 酮， 2’ ， 3， 4， 4’ - 四羟基查耳酮 ； CAS 487-52-5)， 姜黄色素 ((E， E)-1， 7- 双 (4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 )-1， 6- 庚二烯 -3， 5- 二酮 ； CAS 458-37-7)， N4-(1- 苄基 -1H- 吲唑 -5- 基 )-N6， N6- 二甲基 - 吡啶 -[3， 4-d]- 嘧啶 -4， 6- 二胺 (202272-68-2)， AG-1478， AG-879， 环丙烷羧酸 -(3-(6-(3- 三氟甲基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 )- 苯基 )- 酰胺 (CAS 879127-07-8)， N8-(3- 氯 -4- 氟苯基 )-N2-(1- 甲基哌 啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， 2HCl(CAS 196612-93-8)， 4-(4- 苄氧基苯氨 基 )-6， 7- 二甲氧基喹唑啉 (CAS 179248-61-4)， N-(4-((3- 氯 -4- 氟苯基 ) 氨基 ) 吡啶并 [3， 4-d] 嘧啶 -6- 基 )2- 丁炔酰胺 (CAS 881001-19-0)， EKB-569， HKI-272 和 HKI-357。
     在多个实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非替 尼， 伊马替尼， 埃罗替尼， 拉帕替尼， 卡纽替尼和索拉非尼。在一个变化形式中， 细胞在暴露 于吉非替尼后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 细胞在暴露于 HER2 抑制剂例如 HER2 结合和抑制的抗体或结 合和抑制的抗体片段后获得耐受性。在一个变化形式中， 细胞在暴露于曲妥珠单抗和 / 或 帕妥珠单抗后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗患者疾病的方法， 其中所述疾病耐受用 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括向所需患者施用包含有效量的至 少一种寡聚物或其缀合物， 和药物可接受的赋形剂的药物组合物。如本文所使用的， 术语 “进行治疗” 和 “治疗” 是指现有疾病 ( 例如， 下文涉及的疾病或病症 ) 的治疗， 或防止疾病， 即预防。 在某些实施方案中， 本发明的方法用于抑制耐受 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 和 / 或 HER2 通路抑制剂的细胞的增殖。在多个实施方案中， 与未经治疗的细胞样本相比， 抗增殖 作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在其它实施方案中， 与用小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞样本相比， 抗增殖作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至 少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。在一些 实施方案中， 所述癌细胞选自乳腺癌细胞、 前列腺癌细胞、 肺癌细胞和上皮癌细胞。
     因此， 本发明的方法用于治疗过度增殖疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂 治疗和 / 或耐受用 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗的癌症。 在一些实施方案中， 耐受治疗的癌 症选自淋巴瘤及白血病 ( 例如非霍奇金淋巴瘤、 霍奇金淋巴瘤、 急性白血病、 急性淋巴细胞 白血病、 急性髓细胞性白血病、 慢性粒细胞白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 多发性骨髓瘤 )， 结肠癌， 直肠癌， 上皮癌， 胰腺癌， 乳腺癌癌， 卵巢癌， 肾细胞癌， 前列腺癌， 肝癌， 胆管细胞 癌， 绒毛膜癌， 宫颈癌， 睾丸癌， 肺癌， 膀胱癌， 黑色素瘤， 头颈部肿瘤， 脑肿瘤， 不明原发部位 癌症， 肿瘤， 癌症周围神经系统， 中枢神经系统， 纤维肉瘤， 粘液肉瘤， 脂肪肉瘤， 软骨肉瘤， 骨肉瘤， 脊索瘤， 血管肉瘤， 内皮肉瘤， 淋巴管肉瘤， 淋巴管内皮肉瘤， 滑膜瘤， 间皮瘤， 尤因 氏瘤， 平滑肌肉瘤， 横纹肌肉瘤， 鳞状细胞癌， 癌基底细胞癌， 腺癌， 汗腺癌， 皮脂腺癌， 乳头 状癌， 乳头状例腺癌， 囊腺癌， 髓质癌， 支气管癌， 精原细胞瘤， 胚胎癌， 肾母细胞瘤， 小细胞 肺癌， 上皮细胞癌， 神经胶质瘤， 星形细胞瘤， 髓母细胞瘤， 颅咽管瘤， 室管膜瘤， 松果体瘤， 血管母细胞瘤， 听神经瘤， 少突， 脑膜瘤， 神经母细胞瘤， 和视网膜母细胞瘤， 重链病， 转移， 或以不受控制的或异常的细胞生长为特征的任何疾病或病症。
     在某些实施方案中， 耐受性癌症选自肺癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 结肠癌， 上 皮癌， 胃癌。
     在某些其它实施方案中， 肺癌是非小细胞肺癌。本发明的一个这种实施方案提供
     了用于治疗非小细胞肺癌的方法， 该方法包括向哺乳动物例如需要治疗所述癌症的人类患 者施用治疗有效量的至少一种反义寡聚物或其缀合物， 所述反义寡聚物或其缀合物降低 HER3 以及任选地 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂中的一种或多种的表达。 在一个变化形式 中， 至少一种寡聚物或其缀合物包括或是 SEQ ID NO ： 180 或其缀合物。
     在某些实施方案中， 本发明还提供了用于药物制造的本文所描述的化合物或缀合 物的用途， 所述药物用于本文提及的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑 制剂耐受性的病症的治疗， 或者还提供了治疗本文称作病症的方法。
     在多个实施方案中， 根据本发明的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑制剂耐受性病症的治疗可以与一种或多种其它抗癌治疗， 例如放射治疗、 化学治疗 或免疫治疗组合。
     在某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 基因 ( 和 / 或 HER2 基因和 / 或 EGFR 基因 )、 或其蛋白质产物与 HER3 相关或与相互作用的基因的突变相关。在一些实施方 案中， 突变基因由于酪氨酸激酶区域中的突变而对蛋白质进行编码。 在多个实施方案中， 酪 氨酸激酶区域中的突变是在小分子 PTK 抑制剂的结合位置和 / 或 ATP 结合位置中。因此， 在多种实施方式中， 靶 mRNA 是 HER3( 和 / 或 HER2 和 / 或 EGFR) 序列的突变的形式 ； 例如， 它包含一个或多个单点突变， 例如与癌症相关的 SNPs。
     在某些实施方案中 PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的突变形式的异常水平相关。 在 某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的野生型形式的异常水平相关。本发明的 一方面涉及治疗患有或易遭受与 HER3 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 该方法包括 向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡 聚物包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗患有或易遭受与 HER2 的突变形式的异常水 平， 或 HER2 的野生型形式的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋 白酪氨酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选 地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物 包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在仍其它实施方案中， 本发明治疗患有或易遭受与突变 EGFR 的异常水平， 或野生 型 EGFR 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗， 该方法包括向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中 的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物包含一个或多个下 文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本文所描述的本发明包括防止或治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法包括向需要这种治疗的人施用治疗有效量的 HER3 调节 寡聚物 ( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物。
     在多种实施方案中， 该寡聚物或其缀合物， 通过例如氢键合至靶核酸， 在人体内引 起所需的治疗效果。该寡聚物通过氢键合 ( 例如杂交 ) 至靶的 mRNA 导致基因表达减少， 引 起靶的表达减少 ( 例如抑制 )。
     高度优选是， 本发明的化合物能够通过 Watson-Crick 碱基配对与靶核酸例如 HER3 mRNA 杂交。5.2. 寡聚物
     在第一方面， 提供了寡聚化合物 ( 本文称作寡聚物 )， 其例如用于调节编码哺乳动 物 HER3 的核酸分子， 例如 SEQ ID NO ： 197 中所示的 HER3 核酸、 以及编码哺乳动物 HER3 的 这种核酸分子的天然存在的等位基因变体的功能。所述寡聚物由共价连接的单体组成。
     术语 “单体” 包括在核酸中天然存在且不含有改性的糖类或改性的核碱基的核苷 和脱氧核苷二者 ( 统称为 “核苷” )， 所述即改性的糖类或改性的核碱基是其中核糖或脱氧 核糖共价键合至自然存在的、 未改性的核碱基 ( 碱基 ) 部分 ( 即嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤、 鸟 嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶或脲嘧啶 ) 的化合物和 “核苷类似物” ， 所述核苷类似物是在核酸中 天然存在的或不在核酸中天然存在的核苷， 其中糖部分是除核糖或脱氧核糖外 ( 例如二环 糖类或 2’ 改性的糖类如 2’ 取代的糖类 )， 或碱基部分是改性的 ( 例如， 5- 甲基胞嘧啶 )， 或 这二者。
     “RNA 单体” 是含有核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “DNA 单体” 是含有脱氧核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “锁核酸单体” “锁单体” 或 “LNA 单体” 是具有如下文进一步描述的二环糖的核苷 类似物。
     术语 “相应的核苷类似物” 和 “相应的核苷” 表示核苷类似物中的碱基部分和核苷 中的碱基部分相同。例如， 当 “核苷” 含有连接至腺嘌呤的 2- 脱氧核糖时， “相应的核苷类 似物” 含有例如连接至腺嘌呤碱基部分的改性的糖。
     术语 “寡聚物” 、 “寡聚化合物” 和 “寡核苷酸” 在本文所描述的方法的上下文中互换 使用， 并且是指通过例如磷酸酯基团 ( 在核苷之间形成磷酸二酯连接基 ) 或硫代磷酸酯基 ( 在核苷之间形成硫代磷酸酯连接基 )， 由两个或更多个连续单体的共价连接形成的分子。 所述寡聚物由 10-50 单体， 例如 10-30 单体组成或包含 10-50 单体， 例如 10-30 单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含本文提及的核苷或核苷类似物， 或它们的混合物。 “LNA 寡聚物” 或 “LNA 寡核苷酸” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡核苷酸。
     任选包括在寡聚物内的核苷类似物可以起到类似于相应核苷的作用， 或可以具有 特异的改进功能。 其中一些或全部单体是核苷类似物的寡聚物相对于天然形式常常是优选 的， 因为这样的寡聚物具有一些期望的性质， 例如， 穿透细胞膜的能力、 对细胞外和 / 或细 胞内核酸酶的良好耐受性， 以及对核酸靶的高亲和力和特异性。 例如， 为了赋予若干上述性 能， LNA 单体的特别优选的。
     在多个实施方案中， 存在于寡聚物内的一种或多种核苷类似物在功能上是 “沉默” 或 “等价” 于相应的天然核苷， 即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影 响。这样的 “等价” 核苷类似物可以仍然是有用的， 如果例如， 它们更容易或更便宜地制造， 或在保存或制备条件下更为稳定， 或者可纳入标签或标记。然而， 典型地， 所述类似物将对 寡聚物抑制表达的作用方式具有功能性影响 ； 例如， 通过产生对靶核酸的靶区域的提高的 亲和力， 和 / 或对细胞内核酸酶的提高的耐受性， 和 / 或更方便地转运到细胞中。
     因此， 在多个实施方案中， 用于本发明方法的寡聚物包含核苷单体和至少一个核 苷类似物单体， 例如 LNA 单体或其它核苷类似物单体。
     术语 “至少一个 ( 一种 )” 包含大于或等于 1 的整数， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 等等。在多个实施方案中， 例如当涉及本发明的化合物的核酸或蛋白质靶时， 术语 “至少一个 ( 一种 )” 包括术语 “至少两个 ( 种 )” 和 “至少三 个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。同样， 在一些实施方案中， 术语 “至少两个 ( 种 )” 包含术 语 “至少三个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-50 个连续单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个连续单体组成。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-25 个单体， 优选 10-16 个单体， 和更优选 12-16 个单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-25 个连续单体， 10-24 个 连续单体， 12-25 或 12-24 或 10-22 个连续单体， 例如 12-18 个连续单体， 例如 13-17 或 12-16 个连续单体， 例如 13、 14、 15、 16 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-22 个连续单体， 或 10-18， 例如 12-18 或 13-17 或 12-16， 例如 13、 14、 15 或 16 个连续单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体或由 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体组成。在其它实施方案中， 寡聚物包含 14-18 或 14-16 个连 续单体或由 14-18 或 14-16 个连续单体组成。 在多个实施方案中， 寡聚物包含 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体或由 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物由不超过 22 个连续单体， 例如不超过 20 个连续单体， 例如不超过 18 个连续单体， 例如 15、 16 或 17 个连续单体组成。在某些实施方案中， 寡聚物 包含小于 20 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物不包含 RNA 单体。
     优选地， 用于本文所述方法的寡聚物是线性分子或在合成时呈线性。在这样的实 施方案中， 寡聚物是单链的分子， 典型地不包含与相同寡聚物内的另一区域互补的例如至 少 3、 4 或 5 个连续单体的短区， 使得所述寡聚物形成内双螺旋。在多个实施方案中， 所述寡 聚物基本上不是双链的， 即不是 siRNA。
     在一些实施方案中， 寡聚物由连续伸长的单体组成， 其序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定 ( 参见例如表 1-4)。在其它实施方案中， 寡聚物包含第一区域 ( 该区域由 连续伸长的单体组成 )， 和一个或多个另外的区域 ( 其由至少一个另外的单体组成 )。在一 些实施方案中， 第一区域的序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定。
     5.3. 缺口聚物 (gapmer) 设计
     典型地， 用于本发明方法的寡聚物是缺口聚物。
     “缺口聚物” 是包含连续伸长的单体的寡聚物， 所述单体能够募集如下文进一步描 述的 RNAse( 例如 RNAseH)， 例如至少 6 或 7 个 DNA 单体的区域 ( 本文中称作 B 区 )， 其中 B 区的 5’ 和 3’ 的侧翼分别称作 A 区和 C 区， A 区和 C 区各自包含以下或由以下组成 ： 核苷类 似物， 例如增强亲和力的核苷类似物， 如 1-6 个核苷类似物。
     通 常， 所 述 缺 口 聚 物 包 含 以 下 的 5’至 3’的 区 域 ： A-B-C， 或 任 选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ： A 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体 ； B 区由以下组成或包含以下 ： 至少 5 个能够募集 RNAse( 当 与靶 RNA 分子的互补靶区域， 如 mRNA 靶形成双螺旋时 ) 的连续单体， 例如 DNA 单体 ； C 区由
     以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体， 和； D 区， 当存在时由以下组成或包含以下 ： 1， 2 或 3 个单体， 例如 DNA 单体。
     在多种实施方案中， A 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单 体； 和 / 或 C 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类 似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单体。
     在某些实施方案中， B 区由以下组成或包含以下 ： 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 12 个能募 集 RNAse 的连续单体， 或 6-10， 或 7-9， 如 8 个能募集 RNAse 的连续单体。在某些实施方案 中， B 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个 DNA 单体， 如 1-12 个 DNA 单体， 优选 4-12 个 DNA 单体， 更优选 6-10 个 DNA 单体， 如 7-10 个 DNA 单体， 最优选 8， 9 或 10 个 DNA 单体。
     在某些实施方案中， A 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， B 区由 7， 8， 9 或 10 个 DNA 单体组成， 且 C 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成。这些设 计 包 括 (A-B-C)3-10-3， 3-10-4， 4-10-3， 3-9-3， 3-9-4， 4-9-3， 3-8-3， 3-8-4， 4-8-3， 3-7-3， 3-7-4， 4-7-3， 且可以进一步包括 D 区， 其可具有 1 个或 2 个单体， 如 DNA 单体。
     其它缺口聚物设计公开于 WO 2004/046160， 在此将其并入本文作为参考。 美国临时申请 60/977,409( 将其并入本文作为参考 ) 涉及 “短聚物 (shortmer)” 缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中， 此处给出的寡聚物可以是这类短聚物缺口聚物。
     在某些实施方案中， 该寡聚物由 10， 11， 12， 13 或 14 个连续单体组成， 其中寡聚物 区具有形式 (5’ -3’ )， A-B-C， 或任选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ； A 区由 1， 2 或 3 个核苷类 似物单体 ( 如 LNA 单体 ) 组成 ； B 区由 7， 8 或 9 个连续单体组成， 当与互补 RNA 分子 ( 如 mRNA 靶 ) 形成双螺旋时， 所述连续单体能够募集 RNAse ； 且 C 区由 1， 2 或 3 个核苷类似物单 体 ( 如 LNA 单体 ) 组成。当存在时， D 区由单一 DNA 单体组成。
     在某些实施方案中， A 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 7 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B区 由 8 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 9 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含 1-9 个 DNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7 或 8 个 DNA 单体。在某些实施方案中， B 区由 DNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L 构型的 LNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8 或 9 个 α-L- 构型的 LNA 单体。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L- 氧基 LNA 单 体。在某些实施方案中， B 区中所有 α-L- 构型的 LNA 单体是 α-L- 氧基 LNA 单体。在某些 实施方案中， 寡聚物的 A-B-C 区中存在的单体数选自 ( 核苷类似物单体 -B 区 - 核苷类似物 单 体 )： 1-8-1， 1-8-2， 2-8-1， 2-8-2， 3-8-3， 2-8-3， 3-8-2， 4-8-1， 4-8-2， 1-8-4， 2-8-4，或 ； 1-9-1， 1-9-2， 2-9-1， 2-9-2， 2-9-3， 3-9-2， 1-9-3， 3-9-1， 4-9-1， 1-9-4， 或； 1-10-1， 1-10-2， 2-10-1， 2-10-2， 1-10-3 和 3-10-1。在某些实施方案中， 本文所述寡聚物的 A-B-C 区中存在 的单体数选自 ： 2-7-1， 1-7-2， 2-7-2， 3-7-3， 2-7-3， 3-7-2， 3-7-4 和 4-7-3。 在某些实施方案 中， A 区和 C 区各自都由两个 LNA 单体组成， 且 B 区由 8 或 9 个核苷酸单体， 优选 DNA 单体 组成。
     在多个实施方案中， 其它缺口聚物设计包括以下那些 ： 其中 A 区和 / 或 C 区由 3， 4，
     5 或 6 个核苷类似物组成， 如含有 2’ -O- 甲氧基乙基 -RNA(2’ MOE) 的单体或含有 2’ - 氟 -DNA 的单体的核苷类似物， 且 B 区由 8， 9， 10， 11 或 12 个核苷， 如 DNA 单体组成， 其中 A-B-C 区具 有 5-10-5 和 4-12-4 个单体。其它缺口聚物设计公开于 WO 2007/146511A2 中， 在此将其并 入本文作为参考。
     5.4. 连接基
     本文所述寡聚物的单体通过连接基联结在一起。合适地， 各单体通过连接基连接 至 3’ 邻近的单体。
     术语 “连接基” 或 “核苷间连接 (internucleotide linkage)” 是指能够将两个连 续单体共价联结在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸基 ( 在邻近的核苷单体之间形 成磷酸二酯 ) 和硫代磷酸酯基 ( 在邻近的核苷单体之间硫代磷酸酯连接基 )。
     合适的连接基包括列于 WO 2007/031091 的那些， 例如列于 WO2007/031091 的第 34 页第一段的连接基 ( 在此将其并入本文作为参考 )。
     也就是说， 在多种实施方案中， 优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸 酶攻击更有耐受性的基团， 如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 这两个可被 RNase H 裂解， 也允许靶基因表达的 RNAse 调变反义抑制。
     在一些优选实施方案中， 优选本文所提供的合适含硫 (S) 连接基。在多个实施方 案中， 硫代磷酸酯连接基是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口 (gap) 区 (B)。在某些实施方 案中， 硫代磷酸酯连接用于将侧翼区 (A 和 C) 中的单体连接在一起。在多个实施方案中， 硫 代磷酸酯连接用于将 A 或 C 区连接至 D 区， 并且用于将 D 区内的单体连接在一起。
     在多个实施方案中， A、 B 和 C 区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基， 如磷酸二酯 连接， 特别地， 例如当使用核苷类似物防止 A 和 C 区内的连接基进行内切核酸酶降解 - 如当 A 和 C 区包含 LNA 单体时。
     在多个实施方案中， 邻近的寡聚物单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。
     应认识到将磷酸二酯连接， 如一个或两个连接， 与硫代磷酸酯一起纳入寡聚物， 特 别是与介于核苷类似物单体之间或相邻于核苷类似物单元 ( 典型地在 A 区和 / 或 C 区 ) 的 硫代磷酸酯一起， 可修饰寡聚物的生物利用度和 / 或生物分布 - 参见 WO 2008/053314， 在此 将其并入本文作为参考。
     在一些实施方案中， 如上述实施方案， 其中适当且非特异表明， 所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯， 或它们的混合物。
     在一些实施方案中， 所有核苷间连接基是硫代磷酸酯。
     当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列， 例如本文提供的那些， 应理解在多种实施 方案中， 当该连接为硫代磷酸酯连接时， 可以使用如那些本文公开的其它连接， 例如可使用 磷酸酯 ( 磷酸二酯 ) 连接， 特别是用于核苷类似物， 如 LNA 单体之间的连接。
     5.5. 靶核酸
     术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 在本文中可互换使用， 并且定义为通过两个或更多个 如上所述单体的共价连接形成的分子。包括 2 个或更多个单体， “核酸” 可以具有任意长度， 并且该术语一般是指 “寡聚物” ， 其具有本文所述的长度。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 包括 单链、 双链断裂、 部分双链断裂， 和环状的分子。
     在多个实施方案中， 本文使用的术语 “靶核酸” 是指编码哺乳动物 HER3 多肽的核 酸 ( 如 DNA 或 RNA)， 所 述 HER3 多 肽 例 如 是 具 有 SEQ ID NO 197 中 的 序 列 的 人 HER3 mRNA， 或者具有以下序列的哺乳动物 mRNAs ： GenBank 编号 NM_001005915， NM_001982 与交 替 剪 接 形 式 NP_001973.2 和 NP_001005915.1( 人 ) ； NM_017218( 大 鼠 ) ； NM_010153( 小 鼠)； NM_001103105( 牛 ) ； 或具有 GenBank 编号的 XM_001491896( 马 )、 XM_001169469 和 XM_509131( 黑猩猩 ) 的预测 mRNA 序列。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动物 HER2 多肽的核酸 ( 例如， 具 有以下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_001005862 和 NM_004448( 人 ) ； NM_017003 和 NM_017218( 大鼠 ) ； NM_001003817( 小鼠 ) ； NM_001003217( 狗 ) ； 和 NM_001048163( 猫 ))。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动 EGFR 多肽的核酸 ( 例如， 具有以 下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_201284， NM_201283， NM_201282 和 NM_005228( 人 ) ； NM_007912 和 NM_207655( 小鼠 ) ； NM_031507( 大鼠 ) ； 和 NM_214007( 猪 ))。
     应认识到上述公开的 GenBank 编号是指 cDNA 序列而非 mRNA 序列本身。成熟 mRNA 的序列可以直接源自相应的 cDNA 序列， 胸腺嘧啶碱基 (T) 被尿嘧啶碱基 (U) 替代。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码核酸或其天然存 在的变体， 以及由其衍生的 RNA 核酸， 优选 mRNA， 例如 pre-mRNA， 尽管优选成熟 mRNA。在多 种实施方式中， 例如， 当在研究或诊断中使用时， 所述 “靶核酸” 源自上述 DNA 或 RNA 靶核酸 的 cDNA 或合成的寡核苷酸。本文所述的寡聚物通常能够与靶核酸杂交。
     术语 “其天然存在的变体” 是指 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 多肽或核酸序列的变体， 其 在规定的分类群， 例如哺乳动物， 例如小鼠、 猴和优选人中天然地存在。 一般地， 当涉及多核 苷酸的 “天然存在的变体” 时， 该术语还可涵盖 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码基因组 DNA( 在 染色体 Chr 12 ： 54.76-54.78Mb 处通过染色体转位或复制存在的 )， 以及 RNA( 例如， 由此衍 生的 mRNA) 的任何等位变体。当提及具体多肽序列时， 例如， 该术语还包括天然存在形式的 蛋白质， 因此其可被加工， 例如， 通过其翻译时或翻译后修饰， 例如信号肽裂解、 蛋白酶裂解 (proteolytic cleavage)、 糖基化等等。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 通 过 Watson-Crick 碱 基 配 对、 Hoogsteen 氢 键 或 反 向 的 Hoogsteen 氢键， 在寡聚物的单体和靶核酸的单体之间， 本文所描述的寡聚物结合至靶核酸 的区域 (“靶区域” )。这样的结合也称作 “杂交” 。除非另外指明， 连接是通过互补碱基的 Watson-Crick 配对 ( 即腺嘌呤与胸腺嘧啶 (DNA) 或尿嘧啶 (RNA)， 和鸟嘌呤与胞嘧啶 )， 并 且寡聚物结合至靶区域， 这是因为该寡聚物的序列等同于， 或部分等同于靶区域的反向补 体的序列 ； 就本文而言， 寡聚物被认为是与靶区域 “互补” 或 “部分互补” ， 并且寡聚物序列相 对于靶区域序列的 “互补性” 百分数是相对于靶区域序列的反向补体的 “特性” 百分数。
     除非本文另外明确澄清， 本文的 “靶区域” 将是具有如下序列的靶核酸区域， 所述 序列是使用对位排列程序和下文所描述的参数， 与特定寡聚物的序列的反向补体 ( 或其区 域 ) 最佳对位排列。
     在确定用于本文所述方法的寡聚物 ( 或其区域 ) 和编码哺乳动物 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如本文公开的那些 ) 的靶区域之间的 “互补性” 程度中， “互补性” (也 是 “同源性” ) 的程度表示为寡聚物 ( 或其区域 ) 的序列和与其最佳对位排列的靶区域序列 的反向补体之间的相同性百分数。通过计算与 2 个序列之间相同的对位排列碱基的数目， 除以寡聚物中连续单体的总数， 并乘以 100 来计算百分数。在这样的比较中， 如果存在缺口(gap)， 优选是这些缺口仅仅是错配而不是一些下述区域， 其中缺口内单体数量在寡聚物和 靶区域之间不同。
     氨基酸和多核苷酸排列、 序列相同性百分数和互补度就本发明而言可以使用标准 设置的 ClustalW 算法确定 ： 参见 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html， 方 法： EMBOSS:: 水 ( 局部 ) ： 缺口产生 (Gap Open) ＝ 10.0， 缺口延伸 (Gap extend) ＝ 0.5， 使 用 Blosum 62( 蛋白质 )， 或用于核苷酸 / 核碱基序列的 DNAfull。
     如应理解的是， 取决于上下文， “错配” 是指序列的不相同性 ( 如， 例如在寡聚物的 核碱基序列和结合至它的靶区域的反向补体之间 ； 如， 例如在两个对位排列的编码核酸的 HER3 的碱基序列之间 )， 或是指序列的不互补性 ( 如， 例如， 在寡聚物和结合至它的靶区域 之间 )。
     合适地， 寡聚物 ( 或缀合物， 如以下进一步描述 ) 能够抑制 ( 例如通过下调 ) HER3( 或 HER2 或 EGFR) 基因的表达。
     在多个实施方式中， 与正常的表达水平相比， 本文所述寡聚物产生至少 10 ％， 至 少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 表达抑制作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的抑制。在多个实施方式中， 与正常的表达 水平相比， 所述寡聚物产生至少 10％， 至少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 蛋白质表达抑制 作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％ 的抑制。在一些实施方案中， 当使用 1nM 所述寡聚物或缀合物用于本发明的方法时可看到 这种抑制。在多个实施方案中， 当使用 25nM 所述寡聚物或缀合物时可看到这种抑制。
     在多个实施方案中， mRNA 表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如 低于 98％的抑制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。 在多 个实施方案中， 蛋白质表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如低于 98％的抑 制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。
     或者， 表达水平的调节可以通过测量 mRNA 的水平， 例如通过 RNA 印迹或定量 RT-PCR 来确定。当通过 mRNA 水平测量时， 在使用合适的剂量， 1 和 25nM 浓度时， 在多种实 施方式中， 抑制的水平一般达到不存在所述化合物的情况下正常水平的 10-20％的水平。
     表达水平的调节 ( 即抑制或提高 ) 还可以通过测量蛋白水平来确定， 例如， 通过例 如 SDS-PAGE 随后使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白质印迹的方法。
     在一些实施方案中， 本发明提供了抑制 ( 例如下调 ) 一个或多个交替剪接的同 种型 HER3 mRNA 和 / 或由其衍生的蛋白质的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 本发明 提供了抑制一个或多个交替剪接的蛋白质同种型 HER3(GenBank 编号 No.NP_001973.2 和 NP_001005915.1) 的表达和 / 或编码 HER3 蛋白质同种型 (GenBank 编号 No.NM_001982 和 NM_001005915.1) 的核酸的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 的 mRNA 是靶核酸。在其它实施方案中， 编码 HER3 同种型 2 的 mRNA 是靶核酸。在某些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 和 HER3 同种型 2 的核酸都是靶核酸， 例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列 的寡聚物。
     在多个实施方案中， 寡聚物或其第一区域具有与 HER3 核酸中靶区域的序列互补 的碱基序列， 该寡聚物下调 HER3 mRNA 和 / 或 HER3 蛋白质表达并且下调一个或多个其它 ErbB 受体酪氨酸激酶家族成员， 例如 HER2 和 / 或 EGFR 的 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。有效地结合至二个不同的 ErbB 受体家族核酸的靶区域 ( 例如 HER2 和 HER3 mRNA) 且下调两个 靶的 mRNA 和 / 或蛋白质表达的寡聚物或其第一区域被称为 “双特异性的” 。结合至三个不 同的 ErbB 受体家族成员的靶区域且能够有效地下调所有三个基因的寡聚物或其第一区域 被称为 “三特异性的” 。 在多个实施方案中， 反义寡核苷酸可以呈多特异性， 即能够结合至受 体酪氨酸激酶的 ErbB 家族的多个成员的靶核酸的靶区域且下调它们的表达。如本文所使 用的， 术语 “双特异性” 和 “三特异性” 不以任何方式理解为是限制性的。举例来说， “双特 异性寡聚物” 可能对第三靶核酸具有某些效果， 而 “三特异性寡聚物” 可能对它的 3 个靶核 酸之一具有非常弱的因而不明显的效果。
     在多个实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 核酸中的靶 区域和 HER2 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 和 HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在某些实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 HER2 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达下调至相同程度。 在其它优选实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能 够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域和 EGFR 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在多个实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。在仍其它实 施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域， 和结合至 受体酪氨酸激酶靶核酸的两个其它 ErbB 家族中的靶区域并且有效地下调受体酪氨酸激酶 的 ErbB 家族的两个其它成员的 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个优选的实施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达， HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达， 以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个实施方案中， 三特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质， HER2 mRNA 和 / 或蛋白 质以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。
     在多个实施方案中， 本发明因此提供了抑制 ( 例如通过下调 ) 癌细胞中 HER3 蛋白 质和 / 或 mRNA 的表达的方法， 所述癌细胞表达 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 且耐受用蛋白酪氨 酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括使所述细胞与本文所述有效抑制 ( 例如下调 ) 所述细胞中 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的量的寡聚物或缀合物接触。合适地， 所述细胞是哺乳动 物细胞， 例如人细胞。在某些实施方式中， 可以在体外进行给药。在其它实施方案中， 可以 通过将本文所述的化合物或缀合物给药到哺乳动物， 在体外实施接触。 在多个实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 HER2 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列 显示为 SEQIDNO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 EGFR 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或蛋白的表达的方法。
     本文所述的寡聚物通常结合至人 HER3 和 / 或人 HER2 和 / 或人 EGFR mRNA 的靶 区域， 且因此， 包含以下或由以下组成 ： 具有与例如 SEQ ID NO 197、 SEQ ID NO ： 198 和 / 或 SEQ ID NO ： 199 的碱基序列互补或部分互补的碱基序列的区域。在某些实施方案中， 当与 SEQ ID NO ： 197、 198 或 199 的最佳对准靶区域的序列相比时， 本文所述寡聚物的序列可以任选包含 1、 2、 3、 4 或更多个碱基错配。
     在一些实施方案中， 本文所述的寡聚物具有与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相同的序列 ( 参见下文表 1)。在其它实施方案中， 当与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相比时， 所述寡聚物具有 1、 2 或 3 个碱基不同的序列。 在一些实施方案中， 所述寡聚物由 10-16 个连续单体组成或包含 10-16 个连续单体。由 16 个连续单体构成的寡聚物的序列的实例为 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140。较短序列可由其 衍生， 例如， 较短寡聚物的序列可以等同地存在于选自具有 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的碱基序列的那些的寡聚物的区域中。 较长寡聚物可以包括具有至少 10 个连续单 体的序列的区域， 所述连续单体等同地存在于 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 中。
     还提供了含有靶区域的靶核酸 ( 例如编码 HER3 的 DNA 或 mRNA)， 所述靶区域与 SEQ ID NO ： 1-140 的寡聚物中的一种或多种互补或部分 - 互补， 其中所述寡聚物能够抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质或 mRNA 的表达。例如， 在图 1 中显示了人 HER3 mRNA 的与具 有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的反义寡聚物互补的靶区域 ( 粗体和下划线的， 具有上 文所述的相应的寡聚物 SEQ ID NO)。
     在多个实施方案中， 寡聚物具有 SEQ ID NO ： 141-168 中所示的碱基序列。 在某些实 施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如， 具有 SEQ ID NO ： 169-196 和 234 的序列的那些， 特别 是具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 的碱基序列的那些。在多个实施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 172、 174、 175、 176 和 179 的碱基序列的那些。在一些实施方案中， 寡聚物或其区域由 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的碱基序列组成或包含 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所 示的碱基序列。在一些实施方案中， 缀合物包括具有 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的 碱基序列的寡聚物。
     在某些实施方案中， 本文所述寡聚物可以合适地包含具有特定序列， 例如选自 SEQ ID NO ： 200-227， 即等同地存在于较短寡聚物中的序列的区域。 优选地， 所述区域包含 10-16 个单体。例如， 具有 SEQ ID NO ： 200-227 的碱基序列的寡聚物各自包含如下区域， 其中所 述区域的序列分别等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的较短寡聚物中。 在一些实施方案中， 具有比 16 个更少的单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 或 15 个单体的寡聚 物， 具有至少 8、 至少 9、 至少 10、 至少 11、 至少 12、 至少 13、 至少 14 或 15 个区域， 所述序列 的连续单体的等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 的序列的寡聚物中。因此， 在 多个实施方案中， 较短寡聚物的序列源于较长寡聚物的序列。 在一些实施方案中， 具有本文 公开的 SEQ ID NO 的寡聚物的序列， 或其至少 10 个连续单体的序列， 都等同地存在于较长 寡聚物中。通常， 寡聚物包含具有等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的序列的第 一区域， 如果与等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的第一区域相比， 所述寡聚物更长， 则所述寡聚物的侧翼区具有与在靶核酸的靶区域的侧翼的序列互补的序列。两种这 样的寡聚物是 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 54。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含或由这样的单体序列构成， 所述单体序列与编码 哺乳动物 HER3 的靶核酸的靶区域完全互补 ( 完美互补 )。
     然而， 在一些实施方案中， 寡聚物的序列在与 HER3 靶核酸的最佳对位排列靶区域 相比时包括 1、 2、 3 或 4 个 ( 或更多个 ) 错配， 并且仍充分地结合到靶区域以实现 HER3 mRNA 或蛋白质表达的抑制。错配对 Watson-Crick 氢键结合双螺旋的失稳效应可以例如通过增 加寡聚物的程度和 / 或增加寡聚物内存在的核苷类似物 ( 例如 LNA 单体 ) 的数目得到弥补。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物碱基序列包含相对于 ( 例如编码哺乳动物 HER3 的 靶核酸的 ) 最佳对位排列靶区域碱基序列不超过 3 个， 例如不超过 2 个的错配。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列至少 80％相同， 例如至少 85％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％相 同， 甚至 100％相同。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与 SEQ ID NO ： 197、 198 和 / 或 199 中存在的靶区域的序列至少 80 ％互补， 例如至少 85 ％、 至少 90 ％、 至 少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％互补， 甚至 100％互补。 在多个实施方案中， 寡聚物的序列 ( 或其第一区域 ) 选自 SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或者选自 SEQ ID NOs ： 200-227， 1-140 和 228-233 的至少 10 个连续单体。 在其它实施方案中， 寡聚物的序列或其第一区域任选包含 1、 2 或 3 个碱基部分， 当与所述选 定序列或其区域最佳对位排列时， 该碱基部分不同于具有如下序列的寡聚物中的那些 ： SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或其至少 10 个连续单体的序列。
     在某些实施方案中， 单体区域由以下构成 ： 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 或 29 个连续单体， 例如 10-15， 12-25， 12-22， 例如 12-18 个单体。 合适地， 在多个实施方案中， 所述区域与寡聚物具有相同的长度。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 或 3’ 端包含另外的单体， 例如， 独立地， 1， 2， 3， 4 或 5 个另外的寡聚物单体 5’ 末端和 / 或 3’ 末端， 其与靶区域的序列呈非互补性。在多个实 施方案中， 寡聚物包含与所述靶互补的区域， 该区域通过另外的单体在 5’ 和 / 或 3’ 侧翼。 在多种实施方式中， 所述区域的 3’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单元。3’ DNA 单体常 常在寡聚物的固态合成期间使用。 在多种实施方式中， 其可以是相同的或不同的， 所述寡聚 物的 5’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单体。在某些实施方式中， 附加的 5’ 或 3’ 单体 是天然存在的核苷， 例如 DNA 或 RNA 单体。在多种实施方式中， 5’ 或 3’ 单体可以代表如本 文缺口聚物寡聚物的上下文中所涉及的 D 区。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 200 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 201 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据
     SEQ ID NO ： 202 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 203 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 204 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 205 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 206 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 207 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 208 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 209 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 210 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 211 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 212 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 213 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 214 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 215 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 216 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 217 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 218 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 219 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 220 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 221 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 222 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 223 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 224 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 225 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 226 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 227 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     序列比对 ( 例如上述那些 ) 也可以用于鉴定编码来自人和一个或多个不同哺乳动 物物种如猴、 小鼠和 / 或大鼠的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的区域， 其中该区域在所述 物种两者或多者之间具有足够长度的核酸一致度 (identity)， 以允许设计同时靶向 ( 即， 其与足够的特异性结合以抑制 ) 人 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 靶核酸和不同哺乳动物物种中 存在的相应核酸的寡核苷酸。
     在一些实施方案中， 这样的寡聚物由由以下区域组成或包含以下区域 ： 至少 10 个、 例如至少 12 个、 例如至少 14 个、 例如至少 16 个、 例如至少 18 个， 例如 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17 或 18 个连续单体， 所述连续单体与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的靶区域序列 100％序列互 补。
     在一些实施方式中， 用于本发明方法的寡聚物包含连续连续单体区域或由连续单 体区域组成， 所述连续单体区域的序列与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如编码 HER3 的小鼠 核酸 ) 的靶区域序列至少 80％、 例如至少 85％、 例如至少 90％、 例如至少 95％、 例如至少 98％、 例如至少 99％、 或 100％互补。优选是， 所述寡聚物的连续核碱基序列与人 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 的靶区域 100％互补。
     在一些实施方案中， 本文描述的寡聚物结合到 HER3 靶核酸的靶区域并且下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在多个实施方案中， 结合到 HER3 核酸靶区域的本文所述 寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169-196 和 234 中所示的序列。
     在一些实施方案中， 本文描述的双特异寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶 区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 HER2 核酸的靶区域， 所述寡聚物下调 HER3 和 HER2 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同程度下调 HER3 和 HER2 的表达。在一些 实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同的。 在多个实施方案中， 寡聚物的第一区 域和第二区域重叠。在某些实施方案中， 与 HER3 核酸的靶区域和 HER2 核酸的靶区域结合 的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 177 和 178 中所示的序列。在仍其它实施方案中， 双 特异寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域， 并且下调 HER3 和 EGFR 的表 达。在一些实施方案中， 结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 171 和 173 中所示的序列。在一些实施方案中， 本文所述双特异寡聚 物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同 程度下调 HER3 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同 的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域重叠。在还其它实施方案中， 本文述 的三特异性寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域， 结合到 HER2 核酸的靶区域， 结合到 EGFR 核 酸的靶区域， 并且下调所有三个基因的表达。 在一些实施方案中， 结合到 HER3、 HER2 和 EGFR 的三特异性寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169、 170、 172、 174-176 和 179 中所示的序列。在 一些实施方案中， 三特异性寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物 的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物的第三区域结合到 HER2 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 三特异性寡聚 物以不同程度下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和 第三区域是相同的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和第三区域重叠。在多个实施 方案中， 双特异或三特异性寡聚物在与例如靶核酸的最佳对位排列靶区域相比时具有 1、 2、 3、 4、 5 或更多个错配， 所述靶核酸具有例如 SEQ ID NO ： 197， 198 和 / 或 199 中所示的序列。
     5.6. 核苷和核苷类似物
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个单体是包含修饰碱基的核苷类 似物， 所述碱基例如选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿 嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤、 2- 氯 -6- 氨基嘌呤、 黄嘌呤和次黄嘌呤。
     在多个实施方案中， 寡聚物中存在的单体中的至少一个是含有修饰糖的核苷类似 物。
     在一些实施方案中， 寡聚物的至少 2 个连续单体之间的连接基是除磷酸二酯连接 基外。
     在某些实施方案中， 寡聚物包括至少一个具有修饰碱基的单体， 至少一个具有修 饰糖的单体 ( 它们可以是相同的单体 ) 和至少一个非天然产生的单体内连接基。
     用于本文所述寡聚物核苷类似物的具体实例由例如 Freier & Altmann ； Nucl。 Acid Res.， 1997， 25， 4429-4443 和 Uhlmann ； Curr。Opinion in Drug Development， 2000， 3(2)， 293-213 中以及方案 1( 其中一些核苷类似物以核苷进行显示 ) 中所描述 ：
     方案 1
     因此寡聚物可以包含或由以下构成 ： 单序列的核苷 - 优选 DNA 单体， 但是还可能是 RNA 单体， 或者核苷和一种或多种核苷类似物的组合。在一些实施方案中， 这样的核苷类似 物合宜地提高寡聚物对靶核酸的靶区域的亲和性。
     适合的和优选核苷酸类似物的实例在 WO2007/031091 中描述， 因而在此引用作为 参考， 或参考其中的内容。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖部分， 该糖部分经修饰以提供 2’ - 取代基， 例如 2’ -O- 烷基 - 核糖、 2’ - 氨基 - 脱氧核糖和 2’ - 氟 - 脱氧核糖。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖， 在该糖中存在产生双环糖 (LNA) 的桥接 结构， 其提高结合亲和性并且还可以提供一些提高的核酸酶耐受性。在多个实施方案中， LNA 单体选自氧 -LNA( 例如 β-D- 氧基 -LNA， 和 α-L- 氧基 -LNA)， 和 / 或氨基 -LNA( 例如 β-D- 氨基 -LNA 和 α-L- 氨基 -LNA) 和 / 或硫基 -LNA( 例如 β-D- 硫基 -LNA 和 α-L- 硫 基 -LNA) 和 / 或 ENA( 例如 β-D-ENA 和 α-L-ENA)。在某些实施方式中， 所述 LNA 单体是
     β-D- 氧基 -LNA。下面进一步描述了 LNA 单体。
     在多个实施方案中， 在寡聚物中纳入增强亲和性的核苷类似物， 例如 LNA 单体或 含 2’ - 取代糖的单体， 或者纳入修饰的连接基， 提供了提高的核酸酶耐受性。在多个实施方 案中， 纳入这样的增强亲和性的核苷类似物允许降低寡聚物的大小， 并且在发生非特异性 或异常结合之前还降低上限至寡聚物的大小。
     在某些实施方式中， 所述寡聚物包含至少 2 个核苷酸类似物。在一些实施方式中， 所述寡聚物包含 3-8 个核苷酸类似物， 例如 6 个或 7 个核苷酸类似物。在优选实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物是锁核酸 (LNA) 单体 ； 例如， 至少 3 或至少 4、 或至少 5、 或至少 6、 或至少 7、 或 8 个核苷酸类似物是 LNA 单体。在一些实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。
     可认识到， 当提及优选的寡聚物碱基序列时， 在某些实施方案中所述寡聚物包含 相应的核苷类似物， 例如相应的 LNA 单体或其它相应的核苷类似物， 这提高了寡聚物 / 靶区 域双螺旋 ( 即增强亲和性的核苷类似物 ) 的双螺旋稳定性 (Tm)。
     在多个优选实施方案中， 寡聚物的碱基序列和靶区域的碱基序列之间的任何错配 ( 即， 非互补性 )， 如果存在， 位于除含增强亲和性的核苷类似物的寡聚物区域 ( 例如区域 A 或 C) 外的区域， 例如在本文提及的区域 B 中， 和 / 或在本文提及的区域 D 中， 和 / 或在 5’ 或 3’ 连接到与靶区域互补的寡聚物区域的区域中。 在一些实施方案中， 寡聚物内 ( 例如在本文提及的区域 A 和 C 中 ) 存在的核苷 类似物独立地选自例如 ： 含 2’ -O- 烷基 - 核糖的单体， 含 2’ - 氨基 - 脱氧核糖的单体， 含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的单体， LNA 单体， 含树胶醛醣的单体 (“ANA 单体” )， 含 2’ - 氟 - 树胶醛 醣的单体， 含 d- 阿拉伯糖基 - 己糖醇糖的单体 ( “HNA 单体” )， Christensen， Nucl。Acids. Res.30 ： 4918-4925(2002) 中定义的插层 (intercalating) 单体 ( 将其并入本文作为参 考 )， 和含 2’ MOE 糖的单体。在某些实施方案中， 寡聚物或其区域中仅存在一种上述类型的 核苷类似物。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 核 苷 类 似 物 含 有 2’ -O- 甲 氧 基 乙 基 - 核 糖 (2’ MOE)， 或 2’ - 氟 - 脱氧核糖或 LNA 糖， 因此本发明的寡核苷酸 (oligonucleotide) 可以包含独立地 选自这三种类型的核苷类似物。在某些含核苷类似物的寡聚物实施方式中， 至少一个所述 核苷类似物含有 2’ -MOE- 核糖， 例如含 2’ -MOE- 核糖的 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 或 10 核苷类似 物。在某些实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物含有 2’ - 氟 - 脱氧核糖， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的苷酸类似物。
     在多种实施方式中， 本文所述寡聚物包含至少一个锁核酸 (LNA) 单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8 个 LNA 单体， 例如 3-7 个或 4-8 个 LNA 单体， 或 3、 4、 5、 6 或 7 个 LNA 单体。在 多种实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物同时包 含 β-D- 氧基 -LNA 单体以及一种或多种以下的 LNA 单体元 ： β-D 或 α-L 构型的硫基 -LNA 单体、 氨基 -LNA 单体、 氧基 -LNA 和 / 或 ENA 或其组合。在某些实施方案中， 寡聚物中所有 LNA 单体的胞嘧啶碱基部分是 5- 甲基胞嘧啶。在本发明的某些实施方式中， 寡聚物同时包 含 LNA 和 DNA 单体。典型地， LNA 和 DNA 单体的组合的总数是 10-25 个， 优选 10-20 个， 再 更优选 12-16 个。在本发明的某些实施方案中， 寡聚物或其区域包括至少一个 LNA 单体， 其 余单体是 DAN 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物仅包含 LNA 单体和核苷 ( 例如 RNA 或
     DNA 单体， 最优选 DNA 单体 )， 任选与改性连接基例如例如硫代磷酸酯连接。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个核苷类似物具有修饰的碱基， 其选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤和 2- 氯 -6- 氨基嘌呤。
     5.7.LNA
     术语 “LNA” 是指含二环糖 (“LNA 糖” ) 的核苷酸类似物。术语 “LNA 寡核苷酸” 和 “LNA 寡聚物” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡聚物。
     本 发 明 的 寡 核 苷 酸 化 合 物 中 使 用 的 LNA 优 选 具 有 通 式 I 的 结 构， 及其碱盐 (basicsalts) 和酸加成盐。
     其中 X 选自 -O-、 -S-、 -N(RN*)-、 -C(R6R6*)- ；
     B 选自氢、 任选取代的 C1-4- 烷氧基、 任选取代的 C1-4- 烷基、 任选取代的 C1-4- 酰基氧 基、 核碱基、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基 (report group) 和 配体 ；
     P 表示与在后的单体之间的核苷酸间连接 (internucleotide linkage) 的基团位 置， 或 5’ - 末端基团， 该核苷酸间连接或 5’ - 末端基团任选包括取代基 R5 或等同适用取代 基 R5* ；
     P* 表示与在前的单体的核苷酸间连接， 或 3’ - 末端基团 ； 4* 2*
     R 和 R 一 起 表 示 由 1-4 个 选 自 下 列 的 基 团 / 原 子 组 成 的 二 价 基 团 (biradical) ： -C(RaRb)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-、 -C(Ra) ＝ N-、 -O-、 -Si(Ra)2-、 -S-、 -SO2-、 -N(Ra)和＞ C ＝ Z，
     其中 Z 选自 -O-、 -S- 和 -N(Ra)-， 且 Ra 和 Rb 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷 基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰 基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰 基氧基、 磺基 (sulphono)、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体， 其中芳基 a b 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的 (geminal) 取代基 R 和 R 一起可表示任选取代 的亚甲基 ( ＝ CH2)， 以及存在的取代基 R1*、 R2、 R3、 R5、 R5*、 R6 和 R6* 各自独立地选自氢、 任选取 代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷 氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧
     基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷 基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲 基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体、 其中芳基 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、 硫代、 亚氨基或任选取 代的亚甲基， 或一起可形成由 1-5 个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团， 所述亚烷基链 任选插入一个或多个杂原子 / 基团和 / 或被一个或多个杂原子 / 基团终止， 所述杂原子 / N N 基团选自 -O-、 -S- 和 -(NR )-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基， 且其中两个相邻的 ( 非成对的 ) N* 取代基可表示另一键， 导致形成双键 ； 且R ， 当存在且不涉及二价基团时， 选自氢和 C1-4- 烷 基； 以及它们的碱性盐和酸加成盐。
     在多种实施方案中， R5* 选自 H， -CH3， -CH2-CH3， -CH2-O-CH3 和 -CH ＝ CH2。 4* 2*
     在多种实施方案中， R 和 R 一起表示二价基团， 其选自 -C(RaRb)-O-、 -C(RaRb)-C(R c d R )-O-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、 -C(RaRb) -C(RcRd)-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-、 -C(RaRb)-C (RcRd)-N(Re)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-O- 和 -C(RaRb)-S-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-， 其中 Ra、 Rb、 Rc、 Rd、 Re 和 Rf 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔 基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷 基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂 芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨 基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫 基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 a b 信息基和配体， 其中芳基和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基 R 和 R 一起可 表示任选取代的亚甲基 ( ＝ CH2)，
     在其它实施方案中， R4* 和 R2* 一起表示二价基团， 其选自 -CH2-O-、 -CH2-S-、 -CH2-NH -、 -CH2-N(CH3)-、 -CH2-CH2-O-、 -CH2-CH(CH3)-、 -CH2-CH2-S-、 -CH2-CH2-NH-、 -CH2-CH2-CH2-、 -CH2-C H2-CH2-O-、 -CH2-CH2-CH(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH2-O-CH2-O-、 -CH2-NH-O-、 -CH2-N(CH3)-O-、 -CH2-O-CH2-、 -CH(CH3)-O-、 -CH(CH2-O-CH3)-O-。
     对于所有手性中心， 不对称的基团可为 R 或 S 取向。
     优选地， 本发明的寡聚物中使用的 LNA 包括至少一个根据任一下式的 LNA 单元
     其中 Y 为 -O-、 -O-CH2-、 -S-、 -NH- 或 N(RH) ； Z 和 Z* 独立地选自核苷酸间连接基、 末端基团或保护基 ； B 构成天然或非天然核酸的未修饰碱基部分或修饰碱基部分， 以及 RH选自氢和 C1-4- 烷基。
     特别优选的 LNA 单元示于方案 2 ：
     术语″硫基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 选自 S 或 -CH2-S- 的 LNA 单体。硫 基 -LNA 可为 β-D 和 α-L- 构型。
     术 语 ″ 氨 基 -LNA ″ 是 指 其 中 上 述 通 式 中 的 Y 选 自 -N(H)-、 N(R)-、 CH2-N(H)- 和 -CH2-N(R)-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基的 LNA 单体。氨基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″氧基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 表示 -O- 或 -CH2-O- 的 LNA 单体。氨 基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″ ENA″是指其中上述通式中的 Y 为 -CH2-O-( 其中 -CH2-O- 的氧原子连接至 相对碱基 B 的 2’ - 位 ) 的 LNA 单体。
     在优选实施方案中， LNA 单体选自 β-D- 氧基 -LNA 单体， α-L- 氧基 -LNA 单体， β-D- 氨基 -LNA 单体， β-D- 硫基 -LNA 单体， 特别是 β-D- 氧基 -LNA 单体。
     在本文中， 术语″ C1-4- 烷基″是指直链或支链的饱和烃链， 其中该链具有 1 至 4 个碳原子， 如甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基。
     5.8.RNAse H 募集
     在一些实施方案中， 寡聚物通过靶 mRNA 的非 RNase 调变降解发挥作用， 例如通过 翻译的空间阻碍或者其它机制 ； 然而， 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物能够募集核糖核
     酸内切酶 (RNase)， 例如 RNase H。
     典型地， 寡聚物包含至少 6 个， 例如至少 7 个连续单体， 例如至少 8 或至少 9 个连续 单体的区域， 包括 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15 或 16 个连续单体的区域， 其在与靶 RNA 的靶 区域形成双螺旋时能够募集 RNase。能募集 RNAse 的寡聚物区域可为本文所述的缺口聚物 (gapmer) 涉及的 B 区。在某些实施方案中， 能募集 RNAse 的寡聚物区域 ( 如 B 区 ) 由 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19 或 20 个单体构成。
     EP 1222309 提 供 了 体 外 测 定 RNaseH 活 性 的 方 法， 其可用于测定寡聚物募集 RNaseH 的能力。使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当与 RNA 靶的互补靶区 域接触时， 具有的初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为至少 1％， 如至少 5％， 如至少 10％或 少于 20％寡核苷酸具有相同的碱基序列， 但是仅含有 DNA 单体， 没有 2’ 取代， 且在寡核苷酸 中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H， 将所述文献并入 作为参考。
     在多种实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 少于使用寡核苷 酸所测定的初始速率的 1％， 如少于 5％， 如少于 10％或少于 20％， 所述寡核苷酸具有相同 的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷 酸酯连接基， 则认为该寡聚物基本不能募集 RNase H。
     在其它实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为使用寡核苷酸 所测定的初始速率的至少 20％， 如至少 40％， 如至少 60％， 如至少 80％， 所述寡核苷酸具有 相同的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫 代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H。
     典型地， 与靶 RNA 的互补靶区域形成双螺旋并且能够募集 RNase 的寡聚物区域， 含有 DNA 单体和 LNA 单体并且与所述靶区域形成类似双螺旋的 DNA/RNA。LNA 单体优选为 α-L 构型， 特别优选为 -L- 氧基 LNA。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含核苷和核苷类似物二者， 并且为如上所定义的缺 口聚物 (gapmer)、 头聚物 (headmer) 或混合聚物 (mixmer) 的形式。
     “头聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部 (5’ -most) 单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物， 第二区域包含 RNAse 可识别和断开的连续伸长的 ( 例如至少 7 个连 续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体。
     “尾聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含 RNAse 可识别和断开的连续 伸长的 ( 例如至少 7 个连续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体， 第二区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物。
     其它 “嵌合” 寡聚物， 称为 “混合聚物” ， 其由下述交替组分构成 ： i) 可由 RNAse 识 别和裂解的 DNA 单体或核苷酸类似物单体， 和 ii) 非 - 募集 RNase 的核苷酸类似物单体。
     在一些实施方案中， 除提高寡聚物对靶区域的亲和性外， 一些核苷类似物也调变 RNase( 例如， RNase H) 结合和断裂。因为 α-L-LNA 单体募集 RNase 活性至一定程度， 在一些实施方案中， 含 α-L-LNA 单体的寡聚物的缺口区域 ( 例如， 在下文也称作区域 B) 由较少 RNase 可识别和断裂的单体构成， 并且在混合聚物的结构中引入更大灵活性。
     5.9. 缀合物
     在本发明的上下文中， 如本文中所示， 术语 “缀合物” 是指通过将寡聚物共价连接 ( 缀合 ) 到一个或多个本身不为核酸或单体的部分 (“缀合部分” ) 的化合物。这样的缀合 部分的实例包括大分子化合物如蛋白质、 脂肪酸链、 糖残基、 糖蛋白、 聚合物或其组合。 典型 的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。WO2007/031091 提供了合适的部 分和缀合物， 其在此引入作为参考。
     因此， 本文提供了包含本文所述寡聚物和至少一个缀合部分的缀合物， 所述缀合 部分不是核酸或单体， 并且共价连接到所述寡聚物。因此， 在某些实施方案中， 如本文中所 公开， 在寡聚物由具有规定碱基序列的连续单体构成时， 缀合物还可以包含至少一个共价 连接到所述寡聚物的缀合部分。
     在某些实施方案中， 寡聚物缀合到可提高寡聚化合物的细胞吸收的部分。
     在多个实施方案中个， 缀合物可增强本文所述寡聚物的活性、 细胞分布或细胞 吸收。这些部分包括， 但不限于， 抗体、 多肽、 脂质部分如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己 基 -s- 三苯甲基硫醇、 硫胆固醇 (thiocholesterol)、 脂肪链， 例如， 十二烷二醇或十一烷基 残基、 磷脂， 例如， 二 - 十六烷基 -rac- 甘油或 1， 2- 二 -o- 十六烷基 -rac- 甘油 -3-h- 膦酸 三乙基铵、 聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 十八烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 氧 基胆固醇部分。 在某些实施方案中， 寡聚物缀合至活性药物， 例如， 阿司匹林， 布洛芬， 磺胺药物， 抗糖尿药， 抗菌药或抗生素。
     在某些实施方案中， 该缀合的部分为固醇， 如胆固醇。
     在多种实施方案中， 该缀合的部分包含或由以下组成 ： 带正电荷的聚合物， 如带 正电荷的肽， 例如长度为 1-50， 如 2-20 如 3-10 个氨基酸残基， 和 / 或聚环氧烷如聚乙二 醇 (PEG) 或聚丙二醇 - 参见 WO 2008/034123， 在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚 合物， 如聚环氧烷可通过连接基连接至寡聚物， 如描述于 WO 2008/034123 的可释放的连接 基。
     5.10. 活化的寡聚物
     本文所用的术语 “活化的寡聚物” ， 是指本文所述共价连接 ( 即， 官能化 ) 至至少 一个官能部分 (functional moiety) 的本发明的寡聚物， 该官能部分允许寡聚物共价连 接至一个或多个缀合的部分 ( 即本身不为核酸或单体的部分 )， 以形成本文描述的缀合 物。典型地， 官能部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团 ： 例如， 3’ -羟 在一些实施方案中是亲水性间隔基 (spacer) 和能结合至 基或腺嘌呤碱基的环外 NH2 基， 缀合的部分的末端基团 ( 例如， 氨基、 巯基或羟基 )。在一些实施方案中， 末端基团未被 保护， 例如， 为 NH2 基团。在其它实施方案中， 末端基团被保护， 例如， 被任何合适的保护 基， 如描述于 Theodora WGreene 和 Peter G M Wuts， 第三版 (John Wiley&Sons， 1999) 的 “ProtectiveGroups in Organic Synthesis” 的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括 酯如乙酸酯， 芳烷基如苄基， 二苯基甲基， 或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基 的实例包括苄基， α- 甲基苄基， 二苯基甲基， 三苯基甲基， 苄基氧基羰基， 叔丁氧基羰基和
     酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
     在一些实施方案中， 该官能部分是自裂解的 (self-cleaving)。在其它实施方案 中， 该官能部分为生物可降解的。 参见例如， 美国专利号 7,087,229， 其以其整体在此引入作 为参考。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 端官能化以使缀合的部分共价连接至寡聚物的 5’ 端。在其它实施方案中， 寡聚物可在 3’ 端官能化。在其它实施方案中， 寡聚物可沿着主 链或在杂环碱基部分上官能化。 在其它实施方案中， 寡聚物可在多于一个位置官能化， 所述 位置独立地选自 5’ 端、 3’ 端、 主链和碱基。
     在一些实施方案中， 本文所述的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个 共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中， 活化的寡聚物使用未被官能化的 单体合成， 且该寡聚物在合成完成后立即官能化。
     在一些实施方案中， 该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化， 其中该烷 基部分具有式 (CH2)w， 其中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直 链或支链的， 且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 连接至寡聚物。
     在其它实施方案中， 该寡聚物使用含 (CH2)w- 巯基 (SH) 连接基的位阻酯官能化， 其 中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的， 且其中该官 能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wSH) 连接至寡聚物。在一些实施方案中， 巯基 - 活化的寡核 苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 ( 通过二硫键的形成 )。
     可通过本领域已知的任何方法合成与至少一个功能部分连接的活化寡聚物， 所 述方法特别是公开于美国专利公开 No.2004/0235773( 将其全文并入本文作为参考 ) 以 及 Zhao 等 (2007)J.Controlled Release 119 ： 143-152 ； 和 Zhao 等 (2005)Bioconjugate Chem.16 ： 758-766 中的方法。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物通过使用官能化试剂向寡聚物引入巯基、 氨基或羟基而官能化， 该官能化试剂基本上描述于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210， 即， 为基本上链状的试剂， 其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite) 通过亲水性间隔基 链连接至相对的端， 该相对的端包含保护的或未保护的巯基、 氨基或羟基。 这些试剂主要与 寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的 5’ - 羟基。在其它实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至 3’ - 羟基。在其它 实施方案中， 活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方 案中， 寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化， 该官能化试剂描述于美国专利号 4,962,029 以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡 和 4,914,210 中， 聚物的方法公开于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210。
     在一些实施方案中， 固相结合的寡聚物的 5’ - 端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化， 然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过 Diels-Alder 环加成反应而缀合。
     在多种实施方案中， 将含 2’ - 糖修饰的单体， 如 2’ - 氨基甲酸酯取代的糖或 2’ -(O- 戊基 -N- 邻苯二甲酰亚氨基 )- 脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物 的糖的共价连接。在其它实施方案中， 一个或多个单体的 2’ - 位具有含氨基的连接基的寡 聚物使用以下试剂制备 ： 例如， 5’ - 二甲氧基三苯甲基 -2’ -O-(e- 邻苯二甲酰亚氨基氨基 戊基 )-2’ - 脱氧腺苷 -3’ -N， N- 二异丙基 - 氰基乙氧基亚磷酰胺。参见， 例如， Manoharan，等人， Tetrahedron Letters， 1991， 34， 7171。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分， 包括 在 N6 嘌呤氨基上， 在鸟嘌呤的环外 N2 上， 或在胞嘧啶的 N4 或 5 位上。在一些实施方案中， 该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。
     一 些 官 能 部 分 是 可 商 购 的， 例 如， 异 双 官 能 (heterobifunctional) 和 同 双 官 能 (homobifunctional) 连接部分可购自 Pierce Co.(Rockford， Ill.)。其它可商购的 连 接 基 为 5’ - 氨 基 - 修 饰 体 (Modifier)C6 和 3’ - 氨 基 - 修 饰 体 试 剂， 均 可 购 自 Glen Research Corporation(Sterling， Va.)。5’ - 氨基 - 修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI(Applied Biosystems Inc.， Foster City， Calif.)， 且 3’ - 氨基 - 修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto， Calif.)。
     5.11. 组合物
     在多个实施方案中， 本文所述的寡聚物以药物制剂或组合物使用。合适地， 该组 合物包含药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。WO2007/031091( 并入本文作为参考 ) 提 供了适宜和优选的药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。合适的剂量、 制剂、 给药途径、 组合物、 剂型、 与其它治疗剂的组合， 前药制剂也提供于 WO2007/031091- 其也在此引入 作为参考。配制和施用的技术细节还可以在最新版的 “REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES” (Maack Publishing Co， Easton Pa.) 中找到。
     在一些实施方案中， 本文所述寡聚物共价连接到缀合部分以有助于将寡聚物贯穿 细胞膜进行输送。有助于将寡聚物贯穿细胞膜进行输送的缀合部分的实例是亲脂性部分， 例如胆固醇。 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物用形成脂质体的脂质制剂进行配制， 所述 脂质体例如 Lipofectamine 2000 或 Lipofectamine RNAiMAX， 其均可商购自 Invitrogen。 在一些实施方案中， 本文所述寡聚物用一种或多种脂质状非天然小分子的混合物 (“脂 质体分子库” ) 进行配制。脂质体分子库可以通过共价合成化学方法进行合成， 并且可以 尝试各种量和组合的脂质体分子库以开发按照所选给药路径有效将特定尺寸的寡聚物递 送到靶组织的载体。合适的脂质体分子库和组合可例如在 Akinc 人等的 (2008)Nature Biotechnol. 中 找 到， 其 获 得 自 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/ abs/nbt1402.html， 将其并入本文作为参考。
     如本文所述， 术语″药学可接受的盐″是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示可接受水平的不希望有的有毒作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机 氨基酸形成， 以及与金属阳离子形成的碱加成盐， 该金属阳离子如锌、 钙、 铋、 钡、 镁、 铝、 铜、 钴、 镍、 镉、 钠、 钾等， 或与由氨形成的阳离子， N， N’ - 二苄基乙二胺， D- 葡糖胺， 四乙基铵， 或 乙二胺形成的碱加成盐 ； 或 (a) 和 (b) 的 (c) 组合 ； 例如， 鞣酸锌盐等。
     有效用于治疗或防止可耐受用 PTK 抑制剂治疗的疾病的至少一种寡聚物的量可 通过标准临床技术加以确定。通常， 剂量范围可以基于在体外和体内动物模型中发现有效 的 EC50 来确立。所使用的精确剂量还将取决于， 例如， 给药途径和疾病的严重程度， 并且可 根据从业者和 / 或每个患者的状况的判断加以确定。在它的其它实例中， 将尤其必须取决 于如下加以变化 ： 进行治疗的患者的体重和身体状况 ( 例如， 肝肾功能 )， 治疗的痛苦性， 症 状的严重性， 用药间隔频率， 和任何有害副作用的存在。
     在多个实施方案中， 寡聚物的剂量为约 0.01μg- 约 1g/kg 体重， 并且可以每天、 每周、 每月或每年给予一次或多次， 或甚至没 2-10 年给予一次， 或者连续灌输数小时一直到 数月。在某些实施方案中， 用药的重复速率可基于所测得的活性剂在体液或组织内的停留 时间和浓度进行确定， 患者可用 HER3 靶向疗法进行维持治疗以防止疾病状态的复发。
     5.12. 与其它反义寡聚物和化学治疗剂的组合
     在一些实施方案中， 使本文所述寡聚物靶向 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 核酸。因此， 在一些实施方案中， 本发明涉及通过向靶向的两种或所有三种靶核酸施用多于一种寡聚物 来治疗疾病的方法， 所述疾病耐受用 PTK 抑制剂治疗。 在多个实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 EGFR 或 HER2 的第二寡聚物一起施用。在多个其它实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 HER2 的第二寡聚物以及靶向 EGFR 的第三寡聚物一起施用。在本文所述方法中， 这样的寡聚物可以同时或相继施用。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 HER2 表达的其它治疗剂 ( 例如靶向 HER2 mRNA 的反 义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在其它可以相同或不同的实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的 方法， 其通过施用包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 EGFR 表达的其它治疗剂 ( 例如靶 向 EGFR mRNA 的反义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在一些实施方案中， 靶向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有相同的设计 ( 例如， 缺口聚物， 头聚物， 尾聚物 )。在多个实施方案中， 靶 向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有不同的设计。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 一种或多种本文所述寡聚物与一种或多种另外化学治疗剂， 包括但不限于， 烷化剂， 抗代谢 物， 表鬼臼毒素， 蒽环类， 常春藤生物碱， 植物碱和萜类化合物， 单克隆抗体， 紫杉醇类， 拓扑 异构酶抑制剂， 和铂化合物。
     5.13. 试剂盒
     本发明还通了治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法使用 包含第一组分和第二组分的试剂盒。在多个实施方案中， 所述第一组分包含能够抑制 ( 例 如， 通过下调 )HER3 的表达的本文所述寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。在其它 实施方案中， 第二组分包含第二活性成分。在一些实施方案中， 第二组分是作为本文所述 寡核苷酸的治疗剂。在其它实施方案中， 治疗剂是除寡核苷酸外 ( 例如， 小分子治疗剂如 taxol)。在一些实施方案中， 本文所述试剂盒用于过度增生性病症 ( 例如耐受用 PTK 抑制 剂治疗的癌症 ) 的治疗方法， 其包括包含向患者按需要施用有效量的试剂盒第一组分和第 二组分。在多个实施方案中， 同时施用第一和第二组分。在其它实施方案中， 相继地或按任 何顺序施用第一和第二组分。
     在一些实施方案中， 试剂盒包含的第一组分和第二组分， 所述第一组分含有能够 抑制 ( 例如， 通过下调 )HER3 的表达的寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物， 所述第二 组分是如本文所述能够抑制 ( 例如， 通过下调 )HER2 表达和 / 或 EGFR 表达的反义寡核苷酸， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。 6. 实施例6.1. 实施例 1 ： 单体合成
     LNA 单体构造块及其衍生物根据公开操作进行制备。参见 WO07/031081 和本文所 引用的参考文献。
     6.2. 实施例 2 ： 寡核苷酸合成
     寡核苷酸根据 WO07/031081 中描述的方法来合成。表 1 显示了本发明的反义寡核 苷酸基序的实例。
     6.3. 实施例 3 ： 寡核苷酸的设计
     根 据 本 发 明， 设 计 一 系 列 不 同 的 寡 核 苷 酸 除 了 人 HER3(GenBank 登 记 号 NM_001982， SEQ ID NO ： 197) 之外还靶向人 EGFR(GenBank 登记号 NM 005228， SEQ ID NO ： 198) 和人 HER2(GenBank 登记号 NM 004448， SEQ ID NO ： 199) 的不同区域。
     在表 1 中所示的序列中， SEQ ID NO ： 1-50、 53、 139 和 140 设计为除了靶向人 HER3 之外还靶向人 EGFR 和人 HER2。显示了与 HER3、 EGFR 和 HER2 的序列同源性的百分比。所 述寡聚物在相比于 EGFR 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 0 到 2 个错配， 在相比于 HER2 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 1 到 2 个错配。
     在表 2 中， 黑体字母表示表 1 中所示的较短序列。在表 3 中所示的 SEQ ID NOs ： 141-168 中， 大写字母表示核苷类似物单体， 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基。小写字母表示 DNA 单体。单体 ( 如果有一些的话 ) 之间不存在 “s” 表示连接磷酸二酯基。
     6.4. 实施例 4 ： 体外模型 ： 细胞培养 反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试， 条件是该靶核酸以可检测的水平存在。 靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染 或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用， 例如， RNA 印迹分析、 实时 PCR、 核 糖核酸酶保护测试而确定。为了例示， 提供以下细胞类型， 但可常规使用其它细胞类型， 条 件是该靶在所选的细胞类型中表达。
     细胞如下所述在合适的培养基中培养， 并保持在 37℃和 95-98％湿度和 5％ CO2 下。细胞每周常规传代 2-3 次。
     15PC3 ： 人 前 列 腺 癌 细 胞 株 15PC3 在 DMEM(Sigma)+10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)+2mM Glutamax I+ 庆大霉素 (25μg/ml) 中培养。
     HUH7 ： 人肝癌细胞株在 DMEM(Sigma)+10％胎牛血清 (FBS)+2mMGlutamax I+ 庆大 霉素 (25μg/ml)+1x 非必需氨基酸中培养。
     6.5. 实施例 5 ： 体外模型 ： 用反义寡核苷酸处理
     将细胞用寡核苷酸处理， 使用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作 为转染载体。将细胞接种于 6- 孔细胞培养板 (NUNC) 并当铺满 80-90％时进行处理。寡核 苷酸浓度范围为 1nM 至 25nM 终浓度。寡聚物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的 进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚物的培养基来停止处理。清洗细胞且添加含血 清的培养基。寡核苷酸处理后， 使细胞恢复 20 小时， 然后将其收集用于 RNA 分析。
     6.6. 实施例 6 ： 体外模型 ： RNA 的提取和 cDNA 合成
     使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 (Qiagen cat.no.74104) 根据厂家的说明书从如上所 述转染的细胞提取总 RNA。根据厂家的说明书使用来自 Ambion 的逆转录酶试剂 (Reverse Transcriptase reagents) 进行第一链合成。
     对于每个样品， 使用无 RNase H2O 将 0.5μg 总 RNA 调节到 10.8μl， 并与 2μl 十碱 基的随机引物 (random decamers)(50μM) 和 4μl dNTP 混合物 ( 每种 dNTP 2.5mM) 混合， 加热到 70℃保持 3 分钟， 在这之后样品在冰上快速冷却。在冰上冷却样品之后， 将 2μl10x 缓冲液 RT、 1μl 的 MMLV 逆转录酶 (100U/μl) 和 0.25μl RNase 抑制剂 (10U/μl) 添加到 各样品中， 随后在 42℃孵育 60 分钟， 酶在 95℃加热灭活 10 分钟， 然后将样品冷却到 4℃。
     6.7. 实施例 7 ： 体外模型 ： 通过实时 PCR 分析 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的寡核苷酸 抑制作用
     HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义调节可以以本领域已知的多种方式分析。举例来 说， HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平可以通过例如 RNA 印迹分析、 竞争性聚合酶链式反应 (PCR) 或实时 PCR 来定量。实时定量 PCR 当前是优选。可以对总细胞 RNA 或 mRNA 进行 RNA 分析。 RNA 分离和 RNA 分析的方法例如 RNA 印迹分析是本领域常规的， 在例如 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley 和 Sons 中教导了。
     实时定量的 (PCR) 可以使用可从 Applied Biosystems 商业上获得的 Multi-Color Real Time PCR 检测系统方便地实现。
     HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平的实时定量 PCR 分析
     人 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的 样 品 含 量 使 用 人 HER3、 EGFR 和 HER2AB I Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents(Applied Biosystemscat.no.Hs00951444_ m1(HER3)、 Hs00193306_m1(EGFR) 和 Hs00170433_m1(HER2) 根据厂家的说明书来定量。甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH)mRNA 的量用作内源对照用于标准化样品制备中 的任何变化。人 GAPDH mRNA 的样品含量使用人 GAPDH ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.4310884E) 根据厂家的说明书来定量。
     实时定量 PCR 是本领域公知的技术， 在例如 Heid 等人的 Real time quantitative PCR， Genome Research(1996)， 6： 986-994 中教导了。
     实时 PCR
     将来自第一链合成的 cDNA( 如实施例 5 中描述进行的 ) 稀释 2-20 倍， 通过使用 来自 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 或 7900FAST 的实时定量 PCR 来分析。将 引物和探针与 2×Taqman Fast Universal PCR 主混合物 (master mix)(2×)(Applied Biosystems Cat.#4364103) 混合， 添加到 4μlcDNA 中至 10μl 的终体积。 一式两份分析每 种样品。测试 2 倍稀释的 cDNA 得到该测试的标准曲线， 该 cDNA 从表达感兴趣的 RNA 的细 胞株纯化的物质制备。使用无菌的 H2O 代替 cDNA 用于无模板对照。PCR 程序 ： 95℃ 30 秒， 然后进行 40 个循环， 95℃ 3 秒， 60℃ 20-30 秒。使用 Applied BiosystemsFast System SDS 软件版本 1.3.1.21. 或 SDS 软件版本 2.3 根据计算的阈值循环测定靶 mRNA 的相对数量。
     6.8. 实施例 8 ： 体外分析 ： 寡核苷酸化合物对人 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义抑 制
     评估表 4 中呈现的寡核苷酸在 1、 5 和 25nM 浓度下在 15PC3 细胞 ( 或如 * 所指示 的 Huh-7) 中下调 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的潜力 ( 参见附图 2、 3、 4 和 5)。SEQ ID NO ： 235 和 236 用作乱序 (scrambled) 对照。
     表 4 中的数据被表示为在 25nM 下相对于模拟品转染的细胞的 mRNA 下调百分比。 小写字母表示 DNA 单体， 粗体大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体。LNA 单体中的所有胞嘧 啶是 5- 甲基胞嘧啶。下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接。
     如在表 4 中所示， 在这些实验中在 15PC3 细胞中， 具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 中所示序列的寡核苷酸在 25nM 展 现了的 85％或更大的对 HER3 mRNA 表达抑制。
     同样优选的是， 基于列举的反义寡聚物序列的寡核苷酸， 例如， 改变长度 ( 更短或更长 ) 和 / 或单体含量 ( 例如， 核苷类似物单体的类型和 / 或比例 )， 其也提供了
     对 HER3 表达的良好的抑制。
     6.9. 实施例 9 ： LNA 寡核苷酸的细胞凋亡诱导
     在转染的前一天， 将 HUH7 细胞以 2.5×105 个细胞 / 孔的密度接种在 6 孔培养平板 (NUNC) 中。当 75-90％汇合时利用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。 使用的寡聚物浓度是 5nM 和 25nM( 反应孔中的终浓度 )。 寡聚 物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/ mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用 Optimem 洗涤之后， 将 300μl 的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加 3ml HUH7 培养基来灭活胰蛋白酶， 通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物 EQ ID NO ： 235 用作对照。
     在 这 之 后， 将 100μl 的 细 胞 悬 浮 液 添 加 到 来 自 Nunc 的 白 色 96 孔 平 板 (cat#136101)) 的每个孔中 ( 制备四个平板， 用于在不同时间点测量 )。 然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     半胱氨酸蛋白酶分析 ： 细胞凋亡特异性半胱氨酸蛋白酶 3 和 7 的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7- 底物分析 ( 来自 Promega 的 Cat#G8091) 来测量。要分析的平板平衡到 室温保持 15 分钟。Caspase-3/7 缓冲液与 Caspase-3/7 底物混合以形成 Caspase- 工作溶 液， 将其平衡到室温。 然后， 将 100μl 的 Caspase- 工作溶液小心地添加到 96 孔平板的每个 孔的培养基中 ( 避免气泡和孔之间的污染 )。平板小心地振摇 1 分钟， 在这之后， 将它在室 温避光孵育 1 小时。 半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent 仪器 (Thermo Labsystems) 中的每秒的相对光单元 (RLU/s) 来测量。相对于被设置为 1 的模拟品 (mock) 的平均值将 数据进行相关和绘图。参见图 6。
     6.10. 实施例 10 ： 使用 LNA 寡核苷酸对增殖的体外抑制
     如实施例 9 中所述， 转染 HUH7 细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO ： 235 充当 乱序的对照。
     在收集之后， 将 100μl 的细胞悬浮液添加到 96 孔平板 (” OrangeScientific” )的 每个孔中用于 MTS 实验 ( 制备四个平板， 用于在不同的时间点测量 )。然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     增殖的活细胞的测定 (MTS 分析 )
     对于增殖分析， 将 10μl CellTiter AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega， G3582) 添加到 96 孔平板的每个孔的培养基中， 小心地振摇平板， 并在测量 前在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 孵育 1 小时。在分光光度计中测量 490nm 处的吸光度， 减去 从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。 490nm 处的吸光度与活细胞的数量成比例， 对模拟 品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参见图 7。
     6.11. 实施例 11 ： 靶 mRNA 敲减的体内评估
     为了评估 HER3 寡聚化合物的体内敲减 (knockdown) 效力， 带有 15PC3 异种移植物 6 的雌性裸小鼠 ( 通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×10 个细胞 / 小鼠得到 )， 在多种剂量和注 射方案 ( 即， 单剂量、 每天 (qd)、 每 3 天 (q3d)、 每 4 天 (q4d)) 下用寡聚物静脉内注射。 乱序 的寡聚物 EQ ID NO ： 236 充当阴性对照。最后注射后 24 小时， 小鼠被麻醉， 将肝脏和肿瘤组 织采集在 RNAlater 溶液 (Ambion) 中。从组织纯化总 RNA， 使用 QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒 (Cat# ： 204443 ； Qiagen) 的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR) 测定 HER3 mRNA 的水平。 GAPDH mRNA 充当内部对照。
     小鼠 ErbB3 ： 探针 ： cca cac ctg gtc ata gcg gtg a(SEQ ID NO 237)， 引物 -1 ： ctg ttt agg cca agc aga gg(SEQ ID NO 238)， 引物 -2 ： att ctg aat cct gcg tcc ac。
     人 ErbB3 ： 探针 ： cat tgc cca acc tcc gcg tg， 引物 -1 ： tgc agt gga ttc gag aag tg， 引物 -2 ： ggc aaa ctt ccc atc gta ga。
     人 GAPDH ： 探针 ： act ggc gct gcc aag gct gt， 引物 -1 ： cca ccc aga aga ctg tgg at， 引物 -2 ： ttc agc tca ggg atg acc tt。
     小鼠 GAPDH ： 探针 ： agc tgt ggc gtg atg gcc gt， 引物 -1 ： aac ttt ggc att gtg gaa gg， 引物 -2 ： gga tgc agg gat gat gtt ct。通过使用包括软件的 ABI-7500PCR Fast System 进行数据分析。参见表 5。
     表 5 中的数据表示为， 在按照指定的剂量用寡核苷酸连续 5 天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中， 相对于盐水治疗的对照 HER3 mRNA 水平的％。
     6.12. 实施例 12 ： 肿瘤生长抑制的评估
     ErbB3 特异性 LNA 抑制体内肿瘤生长的能力在带有 15PC3 异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3 人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×106 个细胞 / 小鼠来 构建。 肿瘤体积将通过卡尺测量 2 个方向来测定， 并使用下式来计算 ： 肿瘤体积＝ ( 长度 × 2 3 宽度 )/2)。当肿瘤达到 70-100mm 的平均体积时， 将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以 q3d x10 的方案， 小鼠分别静脉注射 25 和 50mg/kg 的 SEQ ID NO ： 180。盐水或具有 SEQ ID NO ： 236 的乱序寡核苷酸充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过 临床观察、 临床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例 11 描述的 QPCR 测量肿 瘤 HER3 mRNA。参见附图 8A 和 8B。
     6.13. 实施例 13 ： 小鼠肝脏中 HER3 mRNA 的抑制
     连续三天以 1 或 5mg/kg 寡核苷酸对 NMRI 小鼠静脉给药 ( 每组 5 只小鼠 )。 反义寡 核苷酸 (SEQ ID NO ： 180 和 SEQ ID NO ： 234) 溶于 0.9％盐水 (NaCl) 中。 在最后的给药后 24 小时处死动物， 采样肝脏组织， 并保存在 RNA later(Ambion) 中直到 RNA 提取和 QPCR 分析。 提提取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_ m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。 取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。结果对小鼠 GAPDH(cat.no.4352339E， Applied Biosystems) 进行归一化， 相对于盐水处理的对照绘图 ( 参见附图 9)。
     6.14. 实施例 14 ： 具有聚乙二醇的寡聚物的缀合物的制备
     具有 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 所示序列的寡聚物， 通过利用常规的亚磷 酰胺化学作用将用阻断基团例如 Fmoc 阻断的氨基烷基基团例如己烷 -1- 胺连接到寡聚物 的 5’ 磷酸基团， 来在 5’ 末端功能化， 氧化产生的化合物， 将它脱保护， 纯化来得到分别具有 式 (IA) 或 (IB) 的功能化的寡聚物 ：
     其中粗体大写字母表示核苷类似物单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示硫 代磷酸酯连接基。 。
     活化的 PEG 的方案， 例如在式 (IV) 中所示的一种 ：
     其中 PEG 部分具有 12,000Da 的平均分子量， 且式 (IA) 或 (IB) 的每个化合物在 PBS 缓冲液中在室温下搅动 12 小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次， 合并的有机层用硫酸 镁干燥， 并过滤， 溶剂减压蒸发。将所得残余物溶于双蒸水， 并加载到阴离子交换柱上。
     未反应的 PEG 连接基 (linker) 用水洗脱， 产物用 NH4HCO3 溶液洗脱。收集含有纯 产物的级分， 冻干得到式 (IIIA) 或 (IIIB) 分别所示的缀合物 ： SEQ ID NO ： 141 和 152 ：
     其中 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12,000 平均分子量的 PEG 聚合物上。
     可使用本文所述方法由具有 SEQ ID NOs ： 169， 180 和 234 中所示序列的寡聚物制 得 PEG 聚合物缀合物的化学结构， 分别在式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中加以显示。
     其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示 Me 硫代磷酸酯连接基， 以及 C 表示 5- 甲基胞嘧啶碱基。
     在该方法中可用于分别制备式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中所示缀合物的活化寡聚物 具有式 (VA)、 (VB) 和 (VC) 所示的化学结构。
     6.15. 实施例 15 ： 使用不同的给药周期评估靶 mRNA 体内敲减 使用与上文实施例 11 中描述的类似方案， 在带有来自 15PC3 细胞或 A549 细胞(NSCLC) 或 N87 细胞 ( 胃癌 ) 的异种移植肿瘤的裸小鼠中， 体内评估寡聚物的敲减效力。寡 聚物通过每三天 2-4 剂注射给药。在最后的注射后 3 或 4 天收集组织。
     表 6 和 7 中的数据表示为相对于盐水治疗的对照， 在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后， 在肝脏和肿瘤样品中 HER3 mRNA 或 HIF-1αmRNA 水平的％。
     观察到的具有 SEQ ID NO ： 169 和 SEQ ID NO ： 180 的序列的寡聚物的敲减效果不是 对 15PC3 肿瘤细胞独特的， 因为在来自 A549(NSCLC) 和 N87( 胃癌 ) 细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见下表 7。
     6.16. 实例 16 ： 耐受吉非替尼的细胞系的产生
     HCC827 肺腺癌细胞 (ATCC CRL-2868) 在 5 ％ CO2 和 95 ％空气的增湿气氛下于 RPMI 介质中维持在 37℃， 所述介质补充有 10％胎牛血清。为了产生吉非替尼耐受性， 用逐 渐增加量的吉非替尼 ( 一直到 500nM) 处理细胞 3 个月的时段。在 3 个月时段结束时， 使 用 MTT((3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 分析相对于母系细胞和 HCC827R 吉非替尼耐受性细胞测试细胞增殖。结果显示， HCC827R 细胞耐受甚至所测最高浓 度 (10μM) 的吉非替尼。( 图 10)
     6.17. 实施例 17 ： 耐受吉非替尼的细胞系的表征
     使用 RTK 抗体分析试剂盒 (R&D Systems， Inc.， Minneapolis， MN) 描绘 HCC827 和 耐受吉非替尼的细胞即 HCC827R 中受体酪氨酸激酶 (“RTK” ) 的表达水平和磷酸化状态。 简言之， 将细胞溶解在溶菌缓冲液中并且测定细胞溶菌的总蛋白质浓度。将 500ug 中蛋白 质在孵育缓冲液中进行稀释， 用分析膜 (assay membrane) 进行孵育， 并根据制造商提供的 方案进行处理。最终图像结果 ( 图 11) 显示 HCC827R 细胞中的磷酸化 EGFR 水平比母系中 的那些低很多。
     Western blot 分析
     HCC827 和 耐 受 吉 非 替 尼 的 克 隆 体 (R2、 R3 和 R5) 在 具 有 (“+” ) 或不具有 (“-” )1μM 吉非替尼的介质中培养 24h。然后制备细胞溶菌并测定总蛋白质浓度。使约 15μg/lane 蛋白质在 8％ SDS-PAGE 凝胶中进行电泳并且使用 BioRad 液体转移设备将其转
     移到 PVDF。用合适的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体 (Transduction Labs) 和增强的化 学发光试剂 (SuperSignal， Pierce) 进行 western 分析。所使用的一级抗体 (Abs) 包括 ： 抗 -Met 单克隆 Ab(25H2)， 抗 - 磷 -Met(Y1234) 兔单克隆 Ab(D26)， 和抗 - 磷 -ErbB3(Y1289) 兔单克隆 Ab(21D3)， 来自 Cell Signaling ； 来自 Santa Crutz 的抗 -ErbB3 Ab(sc285) ； 抗 - 磷 -Met(Y1349)Ab(Ab47606R)， 抗 - 磷 -EGFR 兔单克隆 Ab(Ab40815)， 和抗 -EGFR Ab， 来 自 Abcam ； 以及用于负载对照品的缀合辣根过氧化物酶的抗 - 微管蛋白 Ab。
     数据显示， 相比于未处理 ( “-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化 EGFR 的水平， 非磷 酸化和磷酸化 EGFR 的水平在 HCC827 耐受吉非替尼的克隆体中得到显著降低， 无论是存在 (“+” ) 或存在 (“-” ) 吉非替尼。形成对照的是， 与母系细胞相比， ErbB3 或 MET( 其也涉 及 EGFR 信号发出通路 ) 的水平在耐受性克隆体中没有得到显著降低。这些发现表明， EGFR 的下调可能是一些癌细胞获得对吉非替尼的耐受性的机制所在。
     6.18. 实例 18 ： 寡聚物对耐受吉非替尼的细胞的作用
     将 HCC287 和 HCC287R 细胞以副本配制在 6- 孔板的 200 细胞 / 孔上并且孵育 24 小 时。用 1μM 的 ON180(SEQ ID NO ： 180) 处理细胞并孵育 10 天， 之后使细胞染有 MTT 并数计 菌落的数目。就 HCC827 和 HCC727R 细胞计算对照品的百分数。图 13 中所示的结果显示， 与在下调 HCC287 吉非替尼敏感细胞的生长方面相比 ( 与未处理的对照品相比细胞生长减 少约 50％ )， 寡核苷酸 ON180 在下调耐受吉非替尼的细胞方面显著更为有效 ( 与未处理的 对照品相比细胞生长减少大于 80％ )。
     结合图 14-16 来说明本发明的仍其它方面和实施方案。
     图 14 显示， 在三个人乳腺癌细胞系、 BT474、 SKBR3 和 MDA453 中， 降低 HER3 表达的 LNA 寡聚物， 虽然没有曲妥珠单抗， 但是能够防止 HER3 和 P-HER3 表达由于拉帕替尼而反馈 下调。如就仅拉帕替尼治疗的细胞 (1)， 拉帕替尼加上曲妥珠单抗治疗的细胞 (2)， 拉帕替 尼加上 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (3) 和仅 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (4) 所示。在 0， 1， 4， 24 和 48 小时显示了 HER3， P-HER3(Y1197) 和 P-HER3(Y1289) 的表达水平。拉帕替尼 以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓 度使用。
     同样优选的是， 基于列举的反义寡聚物序列的寡核苷酸， 例如， 改变长度 ( 更短或更长 ) 和 / 或单体含量 ( 例如， 核苷类似物单体的类型和 / 或比例 )， 其也提供了
     对 HER3 表达的良好的抑制。
     6.9. 实施例 9 ： LNA 寡核苷酸的细胞凋亡诱导
     在转染的前一天， 将 HUH7 细胞以 2.5×105 个细胞 / 孔的密度接种在 6 孔培养平板 (NUNC) 中。当 75-90％汇合时利用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。 使用的寡聚物浓度是 5nM 和 25nM( 反应孔中的终浓度 )。 寡聚 物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/ mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用 Optimem 洗涤之后， 将 300μl 的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加 3ml HUH7 培养基来灭活胰蛋白酶， 通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物 EQ ID NO ： 235 用作对照。
     在 这 之 后， 将 100μl 的 细 胞 悬 浮 液 添 加 到 来 自 Nunc 的 白 色 96 孔 平 板 (cat#136101)) 的每个孔中 ( 制备四个平板， 用于在不同时间点测量 )。 然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     半胱氨酸蛋白酶分析 ： 细胞凋亡特异性半胱氨酸蛋白酶 3 和 7 的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7- 底物分析 ( 来自 Promega 的 Cat#G8091) 来测量。要分析的平板平衡到 室温保持 15 分钟。Caspase-3/7 缓冲液与 Caspase-3/7 底物混合以形成 Caspase- 工作溶 液， 将其平衡到室温。 然后， 将 100μl 的 Caspase- 工作溶液小心地添加到 96 孔平板的每个 孔的培养基中 ( 避免气泡和孔之间的污染 )。平板小心地振摇 1 分钟， 在这之后， 将它在室 温避光孵育 1 小时。 半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent 仪器 (Thermo Labsystems) 中的每秒的相对光单元 (RLU/s) 来测量。相对于被设置为 1 的模拟品 (mock) 的平均值将 数据进行相关和绘图。参见图 6。
     6.10. 实施例 10 ： 使用 LNA 寡核苷酸对增殖的体外抑制
     如实施例 9 中所述， 转染 HUH7 细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO ： 235 充当 乱序的对照。
     在收集之后， 将 100μl 的细胞悬浮液添加到 96 孔平板 (” OrangeScientific” )的 每个孔中用于 MTS 实验 ( 制备四个平板， 用于在不同的时间点测量 )。然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     增殖的活细胞的测定 (MTS 分析 )
     对于增殖分析， 将 10μl CellTiter AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega， G3582) 添加到 96 孔平板的每个孔的培养基中， 小心地振摇平板， 并在测量 前在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 孵育 1 小时。在分光光度计中测量 490nm 处的吸光度， 减去 从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。 490nm 处的吸光度与活细胞的数量成比例， 对模拟 品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参见图 7。
     6.11. 实施例 11 ： 靶 mRNA 敲减的体内评估
     为了评估 HER3 寡聚化合物的体内敲减 (knockdown) 效力， 带有 15PC3 异种移植物 6 的雌性裸小鼠 ( 通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×10 个细胞 / 小鼠得到 )， 在多种剂量和注 射方案 ( 即， 单剂量、 每天 (qd)、 每 3 天 (q3d)、 每 4 天 (q4d)) 下用寡聚物静脉内注射。 乱序 的寡聚物 EQ ID NO ： 236 充当阴性对照。最后注射后 24 小时， 小鼠被麻醉， 将肝脏和肿瘤组 织采集在 RNAlater 溶液 (Ambion) 中。从组织纯化总 RNA， 使用 QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒 (Cat# ： 204443 ； Qiagen) 的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR) 测定 HER3 mRNA 的水平。 GAPDH mRNA 充当内部对照。
     小鼠 ErbB3 ： 探针 ： cca cac ctg gtc ata gcg gtg a(SEQ ID NO 237)， 引物 -1 ： ctg ttt agg cca agc aga gg(SEQ ID NO 238)， 引物 -2 ： att ctg aat cct gcg tcc ac。
     人 ErbB3 ： 探针 ： cat tgc cca acc tcc gcg tg， 引物 -1 ： tgc agt gga ttc gag aag tg， 引物 -2 ： ggc aaa ctt ccc atc gta ga。
     人 GAPDH ： 探针 ： act ggc gct gcc aag gct gt， 引物 -1 ： cca ccc aga aga ctg tgg at， 引物 -2 ： ttc agc tca ggg atg acc tt。
     小鼠 GAPDH ： 探针 ： agc tgt ggc gtg atg gcc gt， 引物 -1 ： aac ttt ggc att gtg gaa gg， 引物 -2 ： gga tgc agg gat gat gtt ct。通过使用包括软件的 ABI-7500PCR Fast System 进行数据分析。参见表 5。
     表 5 中的数据表示为， 在按照指定的剂量用寡核苷酸连续 5 天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中， 相对于盐水治疗的对照 HER3 mRNA 水平的％。
    6.12. 实施例 12 ： 肿瘤生长抑制的评估
     ErbB3 特异性 LNA 抑制体内肿瘤生长的能力在带有 15PC3 异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3 人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×106 个细胞 / 小鼠来 构建。 肿瘤体积将通过卡尺测量 2 个方向来测定， 并使用下式来计算 ： 肿瘤体积＝ ( 长度 × 2 3 宽度 )/2)。当肿瘤达到 70-100mm 的平均体积时， 将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以 q3d x10 的方案， 小鼠分别静脉注射 25 和 50mg/kg 的 SEQ ID NO ： 180。盐水或具有 SEQ ID NO ： 236 的乱序寡核苷酸充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过 临床观察、 临床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例 11 描述的 QPCR 测量肿 瘤 HER3 mRNA。参见附图 8A 和 8B。
     6.13. 实施例 13 ： 小鼠肝脏中 HER3 mRNA 的抑制
     连续三天以 1 或 5mg/kg 寡核苷酸对 NMRI 小鼠静脉给药 ( 每组 5 只小鼠 )。 反义寡 核苷酸 (SEQ ID NO ： 180 和 SEQ ID NO ： 234) 溶于 0.9％盐水 (NaCl) 中。 在最后的给药后 24 小时处死动物， 采样肝脏组织， 并保存在 RNA later(Ambion) 中直到 RNA 提取和 QPCR 分析。 提提取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_ m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。 取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。结果对小鼠 GAPDH(cat.no.4352339E， Applied Biosystems) 进行归一化， 相对于盐水处理的对照绘图 ( 参见附图 9)。
     6.14. 实施例 14 ： 具有聚乙二醇的寡聚物的缀合物的制备
     具有 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 所示序列的寡聚物， 通过利用常规的亚磷 酰胺化学作用将用阻断基团例如 Fmoc 阻断的氨基烷基基团例如己烷 -1- 胺连接到寡聚物 的 5’ 磷酸基团， 来在 5’ 末端功能化， 氧化产生的化合物， 将它脱保护， 纯化来得到分别具有 式 (IA) 或 (IB) 的功能化的寡聚物 ：
    其中粗体大写字母表示核苷类似物单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示硫 代磷酸酯连接基。 。
     活化的 PEG 的方案， 例如在式 (IV) 中所示的一种 ：
    
    其中 PEG 部分具有 12,000Da 的平均分子量， 且式 (IA) 或 (IB) 的每个化合物在 PBS 缓冲液中在室温下搅动 12 小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次， 合并的有机层用硫酸 镁干燥， 并过滤， 溶剂减压蒸发。将所得残余物溶于双蒸水， 并加载到阴离子交换柱上。
     未反应的 PEG 连接基 (linker) 用水洗脱， 产物用 NH4HCO3 溶液洗脱。收集含有纯 产物的级分， 冻干得到式 (IIIA) 或 (IIIB) 分别所示的缀合物 ： SEQ ID NO ： 141 和 152 ：
    
    其中 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12,000 平均分子量的 PEG 聚合物上。
     可使用本文所述方法由具有 SEQ ID NOs ： 169， 180 和 234 中所示序列的寡聚物制 得 PEG 聚合物缀合物的化学结构， 分别在式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中加以显示。
    
    其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示 Me 硫代磷酸酯连接基， 以及 C 表示 5- 甲基胞嘧啶碱基。
     在该方法中可用于分别制备式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中所示缀合物的活化寡聚物 具有式 (VA)、 (VB) 和 (VC) 所示的化学结构。
    
    
    6.15. 实施例 15 ： 使用不同的给药周期评估靶 mRNA 体内敲减 使用与上文实施例 11 中描述的类似方案， 在带有来自 15PC3 细胞或 A549 细胞(NSCLC) 或 N87 细胞 ( 胃癌 ) 的异种移植肿瘤的裸小鼠中， 体内评估寡聚物的敲减效力。寡 聚物通过每三天 2-4 剂注射给药。在最后的注射后 3 或 4 天收集组织。
     表 6 和 7 中的数据表示为相对于盐水治疗的对照， 在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后， 在肝脏和肿瘤样品中 HER3 mRNA 或 HIF-1αmRNA 水平的％。
    观察到的具有 SEQ ID NO ： 169 和 SEQ ID NO ： 180 的序列的寡聚物的敲减效果不是 对 15PC3 肿瘤细胞独特的， 因为在来自 A549(NSCLC) 和 N87( 胃癌 ) 细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见下表 7。
    6.16. 实例 16 ： 耐受吉非替尼的细胞系的产生
     HCC827 肺腺癌细胞 (ATCC CRL-2868) 在 5 ％ CO2 和 95 ％空气的增湿气氛下于 RPMI 介质中维持在 37℃， 所述介质补充有 10％胎牛血清。为了产生吉非替尼耐受性， 用逐 渐增加量的吉非替尼 ( 一直到 500nM) 处理细胞 3 个月的时段。在 3 个月时段结束时， 使 用 MTT((3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 分析相对于母系细胞和 HCC827R 吉非替尼耐受性细胞测试细胞增殖。结果显示， HCC827R 细胞耐受甚至所测最高浓 度 (10μM) 的吉非替尼。( 图 10)
     6.17. 实施例 17 ： 耐受吉非替尼的细胞系的表征
    使用 RTK 抗体分析试剂盒 (R&D Systems， Inc.， Minneapolis， MN) 描绘 HCC827 和 耐受吉非替尼的细胞即 HCC827R 中受体酪氨酸激酶 (“RTK” ) 的表达水平和磷酸化状态。 简言之， 将细胞溶解在溶菌缓冲液中并且测定细胞溶菌的总蛋白质浓度。将 500ug 中蛋白 质在孵育缓冲液中进行稀释， 用分析膜 (assay membrane) 进行孵育， 并根据制造商提供的 方案进行处理。最终图像结果 ( 图 11) 显示 HCC827R 细胞中的磷酸化 EGFR 水平比母系中 的那些低很多。
     Western blot 分析
     HCC827 和 耐 受 吉 非 替 尼 的 克 隆 体 (R2、 R3 和 R5) 在 具 有 (“+” ) 或不具有 (“-” )1μM 吉非替尼的介质中培养 24h。然后制备细胞溶菌并测定总蛋白质浓度。使约 15μg/lane 蛋白质在 8％ SDS-PAGE 凝胶中进行电泳并且使用 BioRad 液体转移设备将其转
     移到 PVDF。用合适的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体 (Transduction Labs) 和增强的化 学发光试剂 (SuperSignal， Pierce) 进行 western 分析。所使用的一级抗体 (Abs) 包括 ： 抗 -Met 单克隆 Ab(25H2)， 抗 - 磷 -Met(Y1234) 兔单克隆 Ab(D26)， 和抗 - 磷 -ErbB3(Y1289) 兔单克隆 Ab(21D3)， 来自 Cell Signaling ； 来自 Santa Crutz 的抗 -ErbB3 Ab(sc285) ； 抗 - 磷 -Met(Y1349)Ab(Ab47606R)， 抗 - 磷 -EGFR 兔单克隆 Ab(Ab40815)， 和抗 -EGFR Ab， 来 自 Abcam ； 以及用于负载对照品的缀合辣根过氧化物酶的抗 - 微管蛋白 Ab。
     数据显示， 相比于未处理 ( “-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化 EGFR 的水平， 非磷 酸化和磷酸化 EGFR 的水平在 HCC827 耐受吉非替尼的克隆体中得到显著降低， 无论是存在 (“+” ) 或存在 (“-” ) 吉非替尼。形成对照的是， 与母系细胞相比， ErbB3 或 MET( 其也涉 及 EGFR 信号发出通路 ) 的水平在耐受性克隆体中没有得到显著降低。这些发现表明， EGFR 的下调可能是一些癌细胞获得对吉非替尼的耐受性的机制所在。
     6.18. 实例 18 ： 寡聚物对耐受吉非替尼的细胞的作用
     将 HCC287 和 HCC287R 细胞以副本配制在 6- 孔板的 200 细胞 / 孔上并且孵育 24 小 时。用 1μM 的 ON180(SEQ ID NO ： 180) 处理细胞并孵育 10 天， 之后使细胞染有 MTT 并数计 菌落的数目。就 HCC827 和 HCC727R 细胞计算对照品的百分数。图 13 中所示的结果显示， 与在下调 HCC287 吉非替尼敏感细胞的生长方面相比 ( 与未处理的对照品相比细胞生长减 少约 50％ )， 寡核苷酸 ON180 在下调耐受吉非替尼的细胞方面显著更为有效 ( 与未处理的 对照品相比细胞生长减少大于 80％ )。
     结合图 14-16 来说明本发明的仍其它方面和实施方案。
     图 14 显示， 在三个人乳腺癌细胞系、 BT474、 SKBR3 和 MDA453 中， 降低 HER3 表达的 LNA 寡聚物， 虽然没有曲妥珠单抗， 但是能够防止 HER3 和 P-HER3 表达由于拉帕替尼而反馈 下调。如就仅拉帕替尼治疗的细胞 (1)， 拉帕替尼加上曲妥珠单抗治疗的细胞 (2)， 拉帕替 尼加上 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (3) 和仅 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (4) 所示。在 0， 1， 4， 24 和 48 小时显示了 HER3， P-HER3(Y1197) 和 P-HER3(Y1289) 的表达水平。拉帕替尼 以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓 度使用。
     图 15 显示， 3 个人乳腺癌细胞系的细胞凋亡协同促进大于拉帕替尼与降低 HER3 表 达的 LNA 寡聚物的组合， 后者大于拉帕替尼与曲妥珠单抗的组合。该图显示了就每个三细 胞系 ( 与图 14 中相同的系 ) 所进行的 ApoBrdU 细胞凋亡的结果。 用拉帕替尼和 / 或曲妥珠 单抗治疗细胞 48 小时。在 72 小时， 细胞呈血清饥饿并且用 SEQ ID NO ： 180 或随机化对照 寡聚物进行治疗。对于每个细胞系， 治疗是 ： 仅随机化寡核苷酸对照品 (1)， 仅 SEQ ID NO ： 180， 仅曲妥珠单抗 (3)， 仅拉帕替尼 (4)， 拉帕替尼加上 SEQ ID NO ： 180(5)， 以及拉帕替尼 加上曲妥珠单抗 (6)。拉帕替尼以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓度使用。
     图 16 显示， SEQ ID NO ： 180 抑制使用 HCC827 人细胞系的人非小细胞肺癌体内小 鼠异种移植模型中肿瘤的生长。对于用 30mg/kg SEQ ID NO ： 180(i.v)( 静脉内 ) 治疗， 在 大约 31 天时平均肿瘤体积相对于盐水对照品降低 65.5％， 对于用 45mg/kg SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗， 在大约 31 天时相对于盐水对照品降低 81.3％。N ＝ 6。
     具体实施方案， 参考文献的引用本发明不受本文所述具体实施方案的范围的限制。 实际上， 除本文描述的那些外， 在本发明的范围内的各自修饰对于本领域技术人员而言由前述描述和附图将变得明显。 此 外， 结合本发明一个实施方案所述的特征也可以与其它实施方案相结合， 即使上文没有明 确指出。
     本申请要求 2009 年 4 月 14 日提交的美国临时专利申请序列 No.61/169,093 的优 先权， 在此将其全文并入作为参考。
    2. 背景技术
     HER3 属于受体酪氨酸激酶的 ErbB 家族， 其包括四种不同的受体 ： ErbB-1(EGFR、 HER1)、 ErbB-2(neu、 HER2)、 ErbB-3(HER3) 和 ErbB-4(HER4)(Yarden 等 人， Nat.Rev.Mol. Cell.Biol， 2001， 2(2) ： 127-137)。这个家族的受体蛋白由细胞外配体结合区域、 单疏水跨 膜区域和细胞质的含酪氨酸激酶的区域组成。在结合一个或多个 ErbB 受体且影响受体均 二聚或异二聚的 EGF 家族中存在至少 12 个生长因素。二聚触发结合配体的受体以及下游 的细胞内信号通路的内化和再循环 ( 或其降解 )， 上述通路特别调节细胞存活、 凋亡和增殖 活性。本领域技术人员可理解 HER3(ErbB3) 缺乏酪氨酸激酶活性。 EGFR、 HER2 和近来的 HER3 已经与肿瘤形成相关联。近来的研究已经表明， 当与它 们的正常组织对应物相比较时， EGFR 在许多恶性的人组织中过表达。编码 EGFR 的基因的 过表达、 扩增、 删除和结构重排的高发生率已经在乳腺、 肺、 卵巢和肾脏肿瘤中发现。例如， EGFR 在 80％的头部和颈部癌症中过表达， 在约 50％胶质母细胞瘤中由于扩增和 / 或突变 而被激活， 以及在西方 10-15％非小细胞肺癌 (NSCLC) 中和亚洲 30-50％ NSCLC 中由于突变 而被激活 (Frederick， L， Wang， XY， Eley， G， James， CD(2000)Cancer Res 60 ： 1383-1387 ； Riely 等人 (2006)Clin.Cancer Res.12(24) ： 7232-7241)。在多形性胶质母细胞瘤肿瘤 中 EGFR 基因的扩增是已知的最一致的遗传学改变之一。还应注意在许多非小细胞肺癌中 EGFR 过表达。在约 25-30％乳腺癌 (breast cancer) 中 HER2 扩增或过表达 (Slamon 等人 (1989)Science 244 ： 707-712)。HER3 mRNA 水平的提高已经在人乳腺癌中检测到。
     Bennett 等人的美国专利 No.6,277,640 公开了抑制 HER3 的表达的反义化合物、 组 合物和方法。
     若干蛋白酪氨酸激酶 (“PTK” ) 抑制剂已获批准为其中蛋白酪氨酸激酶表达失调 的某些癌症的选择性疗法。2001 年最初批准的 Gleevec ( 伊马替尼 (imatinib))， 已获批 准用于治疗成人和儿童的某些类型的白血病， 侵袭性系统性肥大细胞增生症， 嗜酸性粒细 胞增多综合征， 转移性隆突性皮纤维肉瘤， 和某些类型的转移性恶性胃肠道间质肿瘤。在 铂和多西紫杉醇疗法失效后， 小分子 PTK 抑制剂 Iressa ( 吉非替尼 (Gefitinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。TarcevaTM( 埃罗替尼 (erlotinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌的单药疗法或者与吉西他宾组合用于治疗 局部晚期、 不可切除性或转移性胰腺癌。然而， 这些疗法的功效受到限制， 这是因为对抑制 剂的耐受性随时间而产生。Arora 等人 (2005)J.Pharmacol.and Exp.Therapies 315(3) ： 971-971-979。近来， 已经表明， 使用蛋白酪氨酸激酶抑制剂对 HER2 和 EGFR 酪氨酸激酶活 性的抑制作用显示对 HER2 驱动的乳腺癌作用有限， 因为 HER3 的表达的代偿性提高和随后 通过 PI3K/Akt 途径的信号转导 (Sergina 等人， Nature， 2007， 445 ： 437-441)。
     Bennett 等人的美国专利 No.6,277,640 公开了抑制 HER3 的表达的反义化合物、 组 合物和方法。
     若干蛋白酪氨酸激酶 (“PTK” ) 抑制剂已获批准为其中蛋白酪氨酸激酶表达失调 的某些癌症的选择性疗法。2001 年最初批准的 Gleevec ( 伊马替尼 (imatinib))， 已获批 准用于治疗成人和儿童的某些类型的白血病， 侵袭性系统性肥大细胞增生症， 嗜酸性粒细 胞增多综合征， 转移性隆突性皮纤维肉瘤， 和某些类型的转移性恶性胃肠道间质肿瘤。在 铂和多西紫杉醇疗法失效后， 小分子 PTK 抑制剂 Iressa ( 吉非替尼 (Gefitinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。TarcevaTM( 埃罗替尼 (erlotinib)) 已获 批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌的单药疗法或者与吉西他宾组合用于治疗 局部晚期、 不可切除性或转移性胰腺癌。然而， 这些疗法的功效受到限制， 这是因为对抑制 剂的耐受性随时间而产生。Arora 等人 (2005)J.Pharmacol.and Exp.Therapies 315(3) ： 971-971-979。近来， 已经表明， 使用蛋白酪氨酸激酶抑制剂对 HER2 和 EGFR 酪氨酸激酶活 性的抑制作用显示对 HER2 驱动的乳腺癌作用有限， 因为 HER3 的表达的代偿性提高和随后 通过 PI3K/Akt 途径的信号转导 (Sergina 等人， Nature， 2007， 445 ： 437-441)。
     存在对能够有效抑制癌症中 HER3 作用的药物的需要， 所述癌症对用蛋白酪氨酸 激酶抑制剂的治疗产生耐受性或不太有反应和 / 或对用 HER2 抑制剂的治疗已变得有耐受 性或不太有反应。
     3. 概述
     在一个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过磷酸 酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中 所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列 (best-aligned) 靶区域的反向补体至少 80％ 相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制剂和 / 或 HER2 通 路抑制剂治疗。所述耐受性可能与作为使用寡聚物降低 HER3 的表达的结果至少部分地相 反。相关的变异包括同时施用 HER3 反义寡聚物和蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制 剂和 / 或 HER2 通路抑制剂从而使寡聚物和所述抑制剂的各自抑制作用在时间上重叠。以 这种方式， 本发明提供了治疗至少部分地防止对癌症的这种抑制剂的耐受性产生 ( 如果尚 未产生 ) 或至少部分地使癌症的这种抑制剂的耐受性逆转 ( 如果已产生 )。 寡聚物可以例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列。 癌症可以例如是耐受用吉非替尼治 疗的癌症。
     在一些实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由序列 5’ -TsAsGscscstsgstscsascststsMeCsTsMeC-3’ (SE Q ID NO ： 180) 构成， 其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， Me 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基， C 表示含有 5- 甲基胞嘧啶碱基的 β-D- 氧基 -LNA 单 体， 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如但不限于吉非替尼或拉帕替尼 (lapitinib) 的治疗。
     在多个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物的缀合物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体 通过磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一 区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳 动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。
     在某些实施方案中， 本发明提供了抑制哺乳动物癌细胞增殖的方法， 该方法包括 使细胞与有效量的寡聚物接触， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过 磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其 中哺乳动物癌细胞的增殖不受蛋白酪氨酸激酶抑制剂抑制。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (PTKI) 例如但不限于吉非替尼 (gefitinb) 或本文所描述的那些中的任意一种治疗哺乳动 物。所述寡聚物和 PTKI 可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 PTKI 一起在对于哺乳
     动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可 以是对用 PTKI 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以是对一种或多种 PTKI 从未产生耐受性的癌症。癌症可以例如是至少最初耐受用一种或多种 PTKI 治疗的癌 症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。当癌症没有基本上耐受用 PTKI 治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的方法中的任意一种降低 HER3 的表达而 至少部分地防止对 PTKI 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症如乳腺癌 中与 PTKI 例如但不限于吉非替尼同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一 种降低 HER3 的表达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物用于治疗哺乳动物例如人的 PTKI 耐受性癌症， 例如 PTKI 耐受性人乳腺癌患者。 本发明的其它实施方案提供了用至少一 种 PTKI 例如但不限于吉非替尼治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其中的改 进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文所描述 的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。至少一种 PTKI 可 以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最初耐受 PTKI 的癌症， 例 如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 在一些实施方案中， 在与未经治疗的相同类型细胞的增殖相比时， 哺乳动物癌细 胞的增殖被抑制至少 50％。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 治疗哺乳动物。 所述寡聚物和 HER2 抑制剂可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂一起在对于哺乳动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或 每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可以是对用 HER2 抑制剂， 例如结合抗体或结合其 片段的 HER2 如曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或帕妥珠单抗 (pertuzumab)， 或者 HER2 通路抑 制剂例如拉帕替尼 (lapatinib) 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以 是对 HER2 抑制剂从未产生耐受性的癌症。 癌症可以例如是至少最初耐受 HER2 抑制或 HER2 通路抑制的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 当癌症没有基 本上耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的 方法中的任意一种降低 HER3 的表达而至少部分地防止对 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症中与至少 一种 HER2 抑制剂同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一种降低 HER3 的表 达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物在哺乳动物例如人类， 例如对用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂的治疗变得有耐受性或不太有反应的具有乳腺癌的人类之间用于治疗对 用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂， 例如但不限于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗， 或 HER2 通路 抑制剂例如拉帕替尼的治疗变得有耐受性或不太有反应的癌症。 本发明的其它实施方案提 供了用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其 中的改进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文
     所描述的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。HER2 抑制剂 或 HER2 通路抑制剂可以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最 初对 HER2 或 HER2 通路的抑制有响应的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中 的任意一种。
     对于上述实施方案及其变化形式中的任意一种， 一种或多种降低 HER3 的表达的 反义寡聚物可以例如是在每个 5’ 和 3’ 端具有末端 LNA 单体， 例如在每个端部的 1、 2、 3或 4 接邻 LNA 单体的缺口聚物， 其连接 DNA 单体的中心部分。至少一些， 例如所有的单体间连 接基可以是硫代磷酸酯连接基。
     本发明的另外的特征、 优点和实施方案可以给出或考虑到下面的详述、 附图和权 利要求显而易见。此外， 应当理解的是前述发明概述和下面的详述是示例性的并且意欲提 供进一步解释而并不如所要求的限制本发明的范围。
     4. 附图简述
     图1： 分别由具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 序列的寡聚物所靶向的 HER3 靶序列 以粗体和下划线显示， 表明它们在 HER3 转录产物中的位置 (GenBank 登记号 NM 001982-SEQ ID NO ： 197)。
     图2： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图3： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 EGFR mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图4： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER-2 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图5： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 180-194。
     图6： 数据显示了细胞凋亡， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH7 细 胞中， 在不同的时间点的活化的 Caspase 3/7( 半胱氨酸蛋白酶 3/7) 而测定。结果相对于 用具有 SEQ ID NO ： 235 的乱序对照的寡核苷酸治疗的细胞模拟 (cells mock) 而绘出。
     图7： 数据显示了活细胞， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH-7 细 胞中， 在不同的时间点使用 MTS 实验测定 OD490 值而测定。SEQ ID NO ： 235 是乱序对照的 寡核苷酸。
     图 8A ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中肿瘤体积的改变百分比。盐水处理的小鼠用作对 照。
     图 8B ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中的 HER 3mRNA 表达。结果相对于 GAPDH 进行归一 化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图9： 数据显示了在连续三天用 1 或 5mg/kg 具有 SEQ ID NO ： 180 或 SEQ ID NO ： 234 中所示序列的寡核苷酸静脉注射治疗之后小鼠肝脏中的 HER 3mRNA 的表达。结果相对 于 GAPDH 进行归一化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图 10 ： 数据显示了耐受高达 10μm 浓度的吉非替尼的 HCC827 人肺腺癌细胞的产 生。
     图 11 ： 数据显示了磷酸化 EFGR 的水平在耐受吉非替尼的 HCC827 细胞中比在对母 系 HCC827 吉非替尼敏感的细胞中低得多。图 12 ： 数据显示了与在未经治疗的 (“-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平相比， 在存在 (“+” ) 或缺乏 (“-” ) 吉非替尼时， 非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平 在 HCC827 吉非替尼耐受性克隆体中显著降低。相反地， 还涉及 EGFR 信号通路的 ErbB3 或 MET 的水平相比于母细胞在耐受性克隆体中没有显著降低。
     图 13 ： 数据显示了用 1μm 具有 SEQ ID NO ： 180 的寡核苷酸治疗 10 天时间段对抑 制耐受吉非替尼的 HCC827 细胞的生长具有较大的影响 ( 与未治疗的对照相比在生长方面 降低大于 80％ ) 与对吉非替尼敏感的 HCC827 细胞相比。
     图 14 ： 数据显示了降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物， 但不是曲妥珠单抗， 能够在 三种人类癌细胞系中通过拉帕替尼防止 HER3 和对 HER3 表达的反馈上调。
     图 15 ： 数据显示了拉帕替尼和降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物的组合与拉帕替 尼和曲妥珠单抗的组合相比， 三种人类癌细胞系中凋亡的协同促进作用更大。
     图 16 ： 数据显示了反义 HER3 抑制剂 SEQ ID NO ： 180 抑制了人体非小细胞肺癌的 小鼠体内异种移植模型中的肿瘤生长。
     5. 详述
     在某些实施方案中， 本发明提供了调节细胞中 HER3( 和 / 或 EGFR 和 / 或 HER2) 的 表达的方法， 所述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。 在一些实施方案中， 耐受性细胞 是癌细胞。在多个实施方案中， 提供了通过施用在胞内条件下特异地与核酸编码杂交的寡 核苷酸 ( 寡聚物 )， 来治疗或防止与 HER3 过表达有关的疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的癌症的方法。在一些实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3 的表达。在其它实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 的表达。 术语 “HER3” 与术语 “ErbB3” 在本文中互换使用。
     5.1. 方法
     在多个实施方案中， 本发明包括在细胞中抑制 HER3 的表达和 / 或活性的方法， 所 述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括使 所述细胞与有效量的寡聚化合物 ( 或其缀合物 ) 接触以在细胞中实现 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 表达和 / 或活性的抑制 ( 例如下调 )。在某些实施方案中， 抑制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 )mRNA 的表达。 在其它实施方案中， 抑 制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 蛋白质的表达。在多个实施方案中， 所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。
     在某些实施方案中， 在体外发生所述接触。 在其它实施方案中， 通过向哺乳动物施 用本文所描述的组合物而在体内实现所述接触。在多个实施方案中， 本发明提供了在细胞 中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及 HER2 蛋白质和 / 或 mRNA 的 表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列显示为 SEQ ID NO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明 提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及在细胞中 EGFR 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它 实施方案中， 本发明提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或 蛋白的表达的方法。
     如本文中所互换使用的， 术语 “蛋白酪氨酸激酶抑制剂” “PTK 抑制剂” 和 “酪氨酸激
     酶抑制剂” 是指结合并抑制一个或多个酪氨酸激酶区的活性的分子。蛋白酪氨酸激酶抑制 剂不是如下文所描述靶向 HER3 的寡聚物。在一些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是单 克隆抗体。在其它实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是具有小于 1000Da， 例如 300-700Da 的分子量的小分子。
     在某些实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一个或多个 EGFR 家族成员的酪氨酸激酶。 在多个实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一种或多种蛋白质的酪氨酸激酶， 所述蛋白质与一 个或多个 EGFR 家族成员相互作用或受一个或多个 EGFR 家族成员调节， 所述 EGFR 家族成员 是例如涉及一个或多个由一个或多个 EGFR 家族成员发出的信号级联的蛋白质。在一些实 施方案中， 酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶， 即是具有细胞外配体结合区域且通过结合一个 或多个配体而活化的较大蛋白质的细胞内区域。在某些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶是非 受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶在一个或多个信号通路中调节其它蛋白质的活性， 其通过使 它们磷酸化来进行调节。
     如本文所使用的， 耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞是指在与蛋白酪氨酸 激酶抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。如本文所使用的， 在与 PTK 抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 PTK 抑制剂治疗， 与相同类型的没有与 PTK 抑制 剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性细胞是内在地耐受用 PTK 抑制剂治疗的 那些。在一些实施方案中， 耐受性细胞是从先前暴露于 PTK 抑制剂而获得耐受性的细胞， 所述暴露是作为单药疗法或者作为与一种或多种另外的药物例如化疗药物或反义寡核苷 酸组合治疗的一部分。类似地， 如本文所使用的， 耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治 疗的细胞通常是指在与这些抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。 如本 文所使用的， 在与所述抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑 制剂治疗， 与相同类型的没有与所述抑制剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相 比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性 细胞是内在地耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗的那些。在一些实施方案中， 耐 受性细胞是从先前暴露于 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂获得耐受性的细胞。
     在一些实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非 TM 替 尼 (ZD-1839， Iressa )， 伊 马 替 尼 (Gleevec )， 埃 罗 替 尼 (OSI-1774， Tarceva )， 卡 纽替尼 (canertinib)(CI-1033)， 凡德他尼 (vandetanib)(ZD6474， Zactima )， 酪氨酸磷 酸化抑制剂 (tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)， 拉帕替尼 (GW-572016)， 索拉非尼 (sorafenib)(BAY43-9006)， AG-494(CAS 133550-35-3)， RG-13022(CAS 149286-90-8)， RG-14620(CAS 136831-49-7)， BIBW 2992(Tovok)，酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 9(CAS 136831-49-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 23(CAS 118409-57-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 25(CAS 118409-58-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 46(CAS 122520-85-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 47(CAS 122520-86-9)， 酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 53(CAS 122520-90-5)， 紫 铆 因 (butein)(1-(2， 4- 二羟基苯基 )-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 丙烯 -1- 酮， 2’ ， 3， 4， 4’ - 四羟基查耳酮 ； CAS 487-52-5)， 姜黄色素 ((E， E)-1， 7- 双 (4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 )-1， 6- 庚二烯 -3， 5- 二酮 ； CAS 458-37-7)， N4-(1- 苄基 -1H- 吲唑 -5- 基 )-N6， N6- 二甲基 - 吡啶 -[3， 4-d]- 嘧啶 -4， 6- 二胺 (202272-68-2)， AG-1478， AG-879， 环丙烷羧酸 -(3-(6-(3- 三氟甲基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 )- 苯基 )- 酰胺 (CAS 879127-07-8)， N8-(3- 氯 -4- 氟苯基 )-N2-(1- 甲基哌 啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， 2HCl(CAS 196612-93-8)， 4-(4- 苄氧基苯氨 基 )-6， 7- 二甲氧基喹唑啉 (CAS 179248-61-4)， N-(4-((3- 氯 -4- 氟苯基 ) 氨基 ) 吡啶并 [3， 4-d] 嘧啶 -6- 基 )2- 丁炔酰胺 (CAS 881001-19-0)， EKB-569， HKI-272 和 HKI-357。
     在多个实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非替 尼， 伊马替尼， 埃罗替尼， 拉帕替尼， 卡纽替尼和索拉非尼。在一个变化形式中， 细胞在暴露 于吉非替尼后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 细胞在暴露于 HER2 抑制剂例如 HER2 结合和抑制的抗体或结 合和抑制的抗体片段后获得耐受性。在一个变化形式中， 细胞在暴露于曲妥珠单抗和 / 或 帕妥珠单抗后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗患者疾病的方法， 其中所述疾病耐受用 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括向所需患者施用包含有效量的至 少一种寡聚物或其缀合物， 和药物可接受的赋形剂的药物组合物。如本文所使用的， 术语 “进行治疗” 和 “治疗” 是指现有疾病 ( 例如， 下文涉及的疾病或病症 ) 的治疗， 或防止疾病， 即预防。 在某些实施方案中， 本发明的方法用于抑制耐受 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 和 / 或 HER2 通路抑制剂的细胞的增殖。在多个实施方案中， 与未经治疗的细胞样本相比， 抗增殖 作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在其它实施方案中， 与用小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞样本相比， 抗增殖作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至 少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。在一些 实施方案中， 所述癌细胞选自乳腺癌细胞、 前列腺癌细胞、 肺癌细胞和上皮癌细胞。
     因此， 本发明的方法用于治疗过度增殖疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂 治疗和 / 或耐受用 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗的癌症。 在一些实施方案中， 耐受治疗的癌 症选自淋巴瘤及白血病 ( 例如非霍奇金淋巴瘤、 霍奇金淋巴瘤、 急性白血病、 急性淋巴细胞 白血病、 急性髓细胞性白血病、 慢性粒细胞白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 多发性骨髓瘤 )， 结肠癌， 直肠癌， 上皮癌， 胰腺癌， 乳腺癌癌， 卵巢癌， 肾细胞癌， 前列腺癌， 肝癌， 胆管细胞 癌， 绒毛膜癌， 宫颈癌， 睾丸癌， 肺癌， 膀胱癌， 黑色素瘤， 头颈部肿瘤， 脑肿瘤， 不明原发部位 癌症， 肿瘤， 癌症周围神经系统， 中枢神经系统， 纤维肉瘤， 粘液肉瘤， 脂肪肉瘤， 软骨肉瘤， 骨肉瘤， 脊索瘤， 血管肉瘤， 内皮肉瘤， 淋巴管肉瘤， 淋巴管内皮肉瘤， 滑膜瘤， 间皮瘤， 尤因 氏瘤， 平滑肌肉瘤， 横纹肌肉瘤， 鳞状细胞癌， 癌基底细胞癌， 腺癌， 汗腺癌， 皮脂腺癌， 乳头 状癌， 乳头状例腺癌， 囊腺癌， 髓质癌， 支气管癌， 精原细胞瘤， 胚胎癌， 肾母细胞瘤， 小细胞 肺癌， 上皮细胞癌， 神经胶质瘤， 星形细胞瘤， 髓母细胞瘤， 颅咽管瘤， 室管膜瘤， 松果体瘤， 血管母细胞瘤， 听神经瘤， 少突， 脑膜瘤， 神经母细胞瘤， 和视网膜母细胞瘤， 重链病， 转移， 或以不受控制的或异常的细胞生长为特征的任何疾病或病症。
     在某些实施方案中， 耐受性癌症选自肺癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 结肠癌， 上 皮癌， 胃癌。
     在某些其它实施方案中， 肺癌是非小细胞肺癌。本发明的一个这种实施方案提供
     了用于治疗非小细胞肺癌的方法， 该方法包括向哺乳动物例如需要治疗所述癌症的人类患 者施用治疗有效量的至少一种反义寡聚物或其缀合物， 所述反义寡聚物或其缀合物降低 HER3 以及任选地 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂中的一种或多种的表达。 在一个变化形式 中， 至少一种寡聚物或其缀合物包括或是 SEQ ID NO ： 180 或其缀合物。
     在某些实施方案中， 本发明还提供了用于药物制造的本文所描述的化合物或缀合 物的用途， 所述药物用于本文提及的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑 制剂耐受性的病症的治疗， 或者还提供了治疗本文称作病症的方法。
     在多个实施方案中， 根据本发明的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑制剂耐受性病症的治疗可以与一种或多种其它抗癌治疗， 例如放射治疗、 化学治疗 或免疫治疗组合。
     在某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 基因 ( 和 / 或 HER2 基因和 / 或 EGFR 基因 )、 或其蛋白质产物与 HER3 相关或与相互作用的基因的突变相关。在一些实施方 案中， 突变基因由于酪氨酸激酶区域中的突变而对蛋白质进行编码。 在多个实施方案中， 酪 氨酸激酶区域中的突变是在小分子 PTK 抑制剂的结合位置和 / 或 ATP 结合位置中。因此， 在多种实施方式中， 靶 mRNA 是 HER3( 和 / 或 HER2 和 / 或 EGFR) 序列的突变的形式 ； 例如， 它包含一个或多个单点突变， 例如与癌症相关的 SNPs。
     在某些实施方案中 PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的突变形式的异常水平相关。 在 某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的野生型形式的异常水平相关。本发明的 一方面涉及治疗患有或易遭受与 HER3 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 该方法包括 向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡 聚物包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗患有或易遭受与 HER2 的突变形式的异常水 平， 或 HER2 的野生型形式的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋 白酪氨酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选 地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物 包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在仍其它实施方案中， 本发明治疗患有或易遭受与突变 EGFR 的异常水平， 或野生 型 EGFR 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗， 该方法包括向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中 的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物包含一个或多个下 文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本文所描述的本发明包括防止或治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法包括向需要这种治疗的人施用治疗有效量的 HER3 调节 寡聚物 ( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物。
     在多种实施方案中， 该寡聚物或其缀合物， 通过例如氢键合至靶核酸， 在人体内引 起所需的治疗效果。该寡聚物通过氢键合 ( 例如杂交 ) 至靶的 mRNA 导致基因表达减少， 引 起靶的表达减少 ( 例如抑制 )。
     高度优选是， 本发明的化合物能够通过 Watson-Crick 碱基配对与靶核酸例如 HER3 mRNA 杂交。5.2. 寡聚物
     在第一方面， 提供了寡聚化合物 ( 本文称作寡聚物 )， 其例如用于调节编码哺乳动 物 HER3 的核酸分子， 例如 SEQ ID NO ： 197 中所示的 HER3 核酸、 以及编码哺乳动物 HER3 的 这种核酸分子的天然存在的等位基因变体的功能。所述寡聚物由共价连接的单体组成。
     术语 “单体” 包括在核酸中天然存在且不含有改性的糖类或改性的核碱基的核苷 和脱氧核苷二者 ( 统称为 “核苷” )， 所述即改性的糖类或改性的核碱基是其中核糖或脱氧 核糖共价键合至自然存在的、 未改性的核碱基 ( 碱基 ) 部分 ( 即嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤、 鸟 嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶或脲嘧啶 ) 的化合物和 “核苷类似物” ， 所述核苷类似物是在核酸中 天然存在的或不在核酸中天然存在的核苷， 其中糖部分是除核糖或脱氧核糖外 ( 例如二环 糖类或 2’ 改性的糖类如 2’ 取代的糖类 )， 或碱基部分是改性的 ( 例如， 5- 甲基胞嘧啶 )， 或 这二者。
     “RNA 单体” 是含有核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “DNA 单体” 是含有脱氧核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “锁核酸单体” “锁单体” 或 “LNA 单体” 是具有如下文进一步描述的二环糖的核苷 类似物。
     术语 “相应的核苷类似物” 和 “相应的核苷” 表示核苷类似物中的碱基部分和核苷 中的碱基部分相同。例如， 当 “核苷” 含有连接至腺嘌呤的 2- 脱氧核糖时， “相应的核苷类 似物” 含有例如连接至腺嘌呤碱基部分的改性的糖。
     术语 “寡聚物” 、 “寡聚化合物” 和 “寡核苷酸” 在本文所描述的方法的上下文中互换 使用， 并且是指通过例如磷酸酯基团 ( 在核苷之间形成磷酸二酯连接基 ) 或硫代磷酸酯基 ( 在核苷之间形成硫代磷酸酯连接基 )， 由两个或更多个连续单体的共价连接形成的分子。 所述寡聚物由 10-50 单体， 例如 10-30 单体组成或包含 10-50 单体， 例如 10-30 单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含本文提及的核苷或核苷类似物， 或它们的混合物。 “LNA 寡聚物” 或 “LNA 寡核苷酸” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡核苷酸。
     任选包括在寡聚物内的核苷类似物可以起到类似于相应核苷的作用， 或可以具有 特异的改进功能。 其中一些或全部单体是核苷类似物的寡聚物相对于天然形式常常是优选 的， 因为这样的寡聚物具有一些期望的性质， 例如， 穿透细胞膜的能力、 对细胞外和 / 或细 胞内核酸酶的良好耐受性， 以及对核酸靶的高亲和力和特异性。 例如， 为了赋予若干上述性 能， LNA 单体的特别优选的。
     在多个实施方案中， 存在于寡聚物内的一种或多种核苷类似物在功能上是 “沉默” 或 “等价” 于相应的天然核苷， 即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影 响。这样的 “等价” 核苷类似物可以仍然是有用的， 如果例如， 它们更容易或更便宜地制造， 或在保存或制备条件下更为稳定， 或者可纳入标签或标记。然而， 典型地， 所述类似物将对 寡聚物抑制表达的作用方式具有功能性影响 ； 例如， 通过产生对靶核酸的靶区域的提高的 亲和力， 和 / 或对细胞内核酸酶的提高的耐受性， 和 / 或更方便地转运到细胞中。
     因此， 在多个实施方案中， 用于本发明方法的寡聚物包含核苷单体和至少一个核 苷类似物单体， 例如 LNA 单体或其它核苷类似物单体。
     术语 “至少一个 ( 一种 )” 包含大于或等于 1 的整数， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 等等。在多个实施方案中， 例如当涉及本发明的化合物的核酸或蛋白质靶时， 术语 “至少一个 ( 一种 )” 包括术语 “至少两个 ( 种 )” 和 “至少三 个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。同样， 在一些实施方案中， 术语 “至少两个 ( 种 )” 包含术 语 “至少三个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-50 个连续单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个连续单体组成。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-25 个单体， 优选 10-16 个单体， 和更优选 12-16 个单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-25 个连续单体， 10-24 个 连续单体， 12-25 或 12-24 或 10-22 个连续单体， 例如 12-18 个连续单体， 例如 13-17 或 12-16 个连续单体， 例如 13、 14、 15、 16 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-22 个连续单体， 或 10-18， 例如 12-18 或 13-17 或 12-16， 例如 13、 14、 15 或 16 个连续单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体或由 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体组成。在其它实施方案中， 寡聚物包含 14-18 或 14-16 个连 续单体或由 14-18 或 14-16 个连续单体组成。 在多个实施方案中， 寡聚物包含 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体或由 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物由不超过 22 个连续单体， 例如不超过 20 个连续单体， 例如不超过 18 个连续单体， 例如 15、 16 或 17 个连续单体组成。在某些实施方案中， 寡聚物 包含小于 20 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物不包含 RNA 单体。
     优选地， 用于本文所述方法的寡聚物是线性分子或在合成时呈线性。在这样的实 施方案中， 寡聚物是单链的分子， 典型地不包含与相同寡聚物内的另一区域互补的例如至 少 3、 4 或 5 个连续单体的短区， 使得所述寡聚物形成内双螺旋。在多个实施方案中， 所述寡 聚物基本上不是双链的， 即不是 siRNA。
     在一些实施方案中， 寡聚物由连续伸长的单体组成， 其序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定 ( 参见例如表 1-4)。在其它实施方案中， 寡聚物包含第一区域 ( 该区域由 连续伸长的单体组成 )， 和一个或多个另外的区域 ( 其由至少一个另外的单体组成 )。在一 些实施方案中， 第一区域的序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定。
     5.3. 缺口聚物 (gapmer) 设计
     典型地， 用于本发明方法的寡聚物是缺口聚物。
     “缺口聚物” 是包含连续伸长的单体的寡聚物， 所述单体能够募集如下文进一步描 述的 RNAse( 例如 RNAseH)， 例如至少 6 或 7 个 DNA 单体的区域 ( 本文中称作 B 区 )， 其中 B 区的 5’ 和 3’ 的侧翼分别称作 A 区和 C 区， A 区和 C 区各自包含以下或由以下组成 ： 核苷类 似物， 例如增强亲和力的核苷类似物， 如 1-6 个核苷类似物。
     通 常， 所 述 缺 口 聚 物 包 含 以 下 的 5’至 3’的 区 域 ： A-B-C， 或 任 选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ： A 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体 ； B 区由以下组成或包含以下 ： 至少 5 个能够募集 RNAse( 当 与靶 RNA 分子的互补靶区域， 如 mRNA 靶形成双螺旋时 ) 的连续单体， 例如 DNA 单体 ； C 区由
     以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体， 和； D 区， 当存在时由以下组成或包含以下 ： 1， 2 或 3 个单体， 例如 DNA 单体。
     在多种实施方案中， A 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单 体； 和 / 或 C 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类 似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单体。
     在某些实施方案中， B 区由以下组成或包含以下 ： 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 12 个能募 集 RNAse 的连续单体， 或 6-10， 或 7-9， 如 8 个能募集 RNAse 的连续单体。在某些实施方案 中， B 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个 DNA 单体， 如 1-12 个 DNA 单体， 优选 4-12 个 DNA 单体， 更优选 6-10 个 DNA 单体， 如 7-10 个 DNA 单体， 最优选 8， 9 或 10 个 DNA 单体。
     在某些实施方案中， A 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， B 区由 7， 8， 9 或 10 个 DNA 单体组成， 且 C 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成。这些设 计 包 括 (A-B-C)3-10-3， 3-10-4， 4-10-3， 3-9-3， 3-9-4， 4-9-3， 3-8-3， 3-8-4， 4-8-3， 3-7-3， 3-7-4， 4-7-3， 且可以进一步包括 D 区， 其可具有 1 个或 2 个单体， 如 DNA 单体。
     其它缺口聚物设计公开于 WO 2004/046160， 在此将其并入本文作为参考。 美国临时申请 60/977,409( 将其并入本文作为参考 ) 涉及 “短聚物 (shortmer)” 缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中， 此处给出的寡聚物可以是这类短聚物缺口聚物。
     在某些实施方案中， 该寡聚物由 10， 11， 12， 13 或 14 个连续单体组成， 其中寡聚物 区具有形式 (5’ -3’ )， A-B-C， 或任选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ； A 区由 1， 2 或 3 个核苷类 似物单体 ( 如 LNA 单体 ) 组成 ； B 区由 7， 8 或 9 个连续单体组成， 当与互补 RNA 分子 ( 如 mRNA 靶 ) 形成双螺旋时， 所述连续单体能够募集 RNAse ； 且 C 区由 1， 2 或 3 个核苷类似物单 体 ( 如 LNA 单体 ) 组成。当存在时， D 区由单一 DNA 单体组成。
     在某些实施方案中， A 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 7 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B区 由 8 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 9 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含 1-9 个 DNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7 或 8 个 DNA 单体。在某些实施方案中， B 区由 DNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L 构型的 LNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8 或 9 个 α-L- 构型的 LNA 单体。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L- 氧基 LNA 单 体。在某些实施方案中， B 区中所有 α-L- 构型的 LNA 单体是 α-L- 氧基 LNA 单体。在某些 实施方案中， 寡聚物的 A-B-C 区中存在的单体数选自 ( 核苷类似物单体 -B 区 - 核苷类似物 单 体 )： 1-8-1， 1-8-2， 2-8-1， 2-8-2， 3-8-3， 2-8-3， 3-8-2， 4-8-1， 4-8-2， 1-8-4， 2-8-4，或 ； 1-9-1， 1-9-2， 2-9-1， 2-9-2， 2-9-3， 3-9-2， 1-9-3， 3-9-1， 4-9-1， 1-9-4， 或； 1-10-1， 1-10-2， 2-10-1， 2-10-2， 1-10-3 和 3-10-1。在某些实施方案中， 本文所述寡聚物的 A-B-C 区中存在 的单体数选自 ： 2-7-1， 1-7-2， 2-7-2， 3-7-3， 2-7-3， 3-7-2， 3-7-4 和 4-7-3。 在某些实施方案 中， A 区和 C 区各自都由两个 LNA 单体组成， 且 B 区由 8 或 9 个核苷酸单体， 优选 DNA 单体 组成。
     在多个实施方案中， 其它缺口聚物设计包括以下那些 ： 其中 A 区和 / 或 C 区由 3， 4，
     5 或 6 个核苷类似物组成， 如含有 2’ -O- 甲氧基乙基 -RNA(2’ MOE) 的单体或含有 2’ - 氟 -DNA 的单体的核苷类似物， 且 B 区由 8， 9， 10， 11 或 12 个核苷， 如 DNA 单体组成， 其中 A-B-C 区具 有 5-10-5 和 4-12-4 个单体。其它缺口聚物设计公开于 WO 2007/146511A2 中， 在此将其并 入本文作为参考。
     5.4. 连接基
     本文所述寡聚物的单体通过连接基联结在一起。合适地， 各单体通过连接基连接 至 3’ 邻近的单体。
     术语 “连接基” 或 “核苷间连接 (internucleotide linkage)” 是指能够将两个连 续单体共价联结在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸基 ( 在邻近的核苷单体之间形 成磷酸二酯 ) 和硫代磷酸酯基 ( 在邻近的核苷单体之间硫代磷酸酯连接基 )。
     合适的连接基包括列于 WO 2007/031091 的那些， 例如列于 WO2007/031091 的第 34 页第一段的连接基 ( 在此将其并入本文作为参考 )。
     也就是说， 在多种实施方案中， 优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸 酶攻击更有耐受性的基团， 如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 这两个可被 RNase H 裂解， 也允许靶基因表达的 RNAse 调变反义抑制。
     在一些优选实施方案中， 优选本文所提供的合适含硫 (S) 连接基。在多个实施方 案中， 硫代磷酸酯连接基是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口 (gap) 区 (B)。在某些实施方 案中， 硫代磷酸酯连接用于将侧翼区 (A 和 C) 中的单体连接在一起。在多个实施方案中， 硫 代磷酸酯连接用于将 A 或 C 区连接至 D 区， 并且用于将 D 区内的单体连接在一起。
     在多个实施方案中， A、 B 和 C 区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基， 如磷酸二酯 连接， 特别地， 例如当使用核苷类似物防止 A 和 C 区内的连接基进行内切核酸酶降解 - 如当 A 和 C 区包含 LNA 单体时。
     在多个实施方案中， 邻近的寡聚物单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。
     应认识到将磷酸二酯连接， 如一个或两个连接， 与硫代磷酸酯一起纳入寡聚物， 特 别是与介于核苷类似物单体之间或相邻于核苷类似物单元 ( 典型地在 A 区和 / 或 C 区 ) 的 硫代磷酸酯一起， 可修饰寡聚物的生物利用度和 / 或生物分布 - 参见 WO 2008/053314， 在此 将其并入本文作为参考。
     在一些实施方案中， 如上述实施方案， 其中适当且非特异表明， 所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯， 或它们的混合物。
     在一些实施方案中， 所有核苷间连接基是硫代磷酸酯。
     当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列， 例如本文提供的那些， 应理解在多种实施 方案中， 当该连接为硫代磷酸酯连接时， 可以使用如那些本文公开的其它连接， 例如可使用 磷酸酯 ( 磷酸二酯 ) 连接， 特别是用于核苷类似物， 如 LNA 单体之间的连接。
     5.5. 靶核酸
     术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 在本文中可互换使用， 并且定义为通过两个或更多个 如上所述单体的共价连接形成的分子。包括 2 个或更多个单体， “核酸” 可以具有任意长度， 并且该术语一般是指 “寡聚物” ， 其具有本文所述的长度。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 包括 单链、 双链断裂、 部分双链断裂， 和环状的分子。
     在多个实施方案中， 本文使用的术语 “靶核酸” 是指编码哺乳动物 HER3 多肽的核 酸 ( 如 DNA 或 RNA)， 所 述 HER3 多 肽 例 如 是 具 有 SEQ ID NO 197 中 的 序 列 的 人 HER3 mRNA， 或者具有以下序列的哺乳动物 mRNAs ： GenBank 编号 NM_001005915， NM_001982 与交 替 剪 接 形 式 NP_001973.2 和 NP_001005915.1( 人 ) ； NM_017218( 大 鼠 ) ； NM_010153( 小 鼠)； NM_001103105( 牛 ) ； 或具有 GenBank 编号的 XM_001491896( 马 )、 XM_001169469 和 XM_509131( 黑猩猩 ) 的预测 mRNA 序列。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动物 HER2 多肽的核酸 ( 例如， 具 有以下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_001005862 和 NM_004448( 人 ) ； NM_017003 和 NM_017218( 大鼠 ) ； NM_001003817( 小鼠 ) ； NM_001003217( 狗 ) ； 和 NM_001048163( 猫 ))。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动 EGFR 多肽的核酸 ( 例如， 具有以 下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_201284， NM_201283， NM_201282 和 NM_005228( 人 ) ； NM_007912 和 NM_207655( 小鼠 ) ； NM_031507( 大鼠 ) ； 和 NM_214007( 猪 ))。
     应认识到上述公开的 GenBank 编号是指 cDNA 序列而非 mRNA 序列本身。成熟 mRNA 的序列可以直接源自相应的 cDNA 序列， 胸腺嘧啶碱基 (T) 被尿嘧啶碱基 (U) 替代。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码核酸或其天然存 在的变体， 以及由其衍生的 RNA 核酸， 优选 mRNA， 例如 pre-mRNA， 尽管优选成熟 mRNA。在多 种实施方式中， 例如， 当在研究或诊断中使用时， 所述 “靶核酸” 源自上述 DNA 或 RNA 靶核酸 的 cDNA 或合成的寡核苷酸。本文所述的寡聚物通常能够与靶核酸杂交。
     术语 “其天然存在的变体” 是指 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 多肽或核酸序列的变体， 其 在规定的分类群， 例如哺乳动物， 例如小鼠、 猴和优选人中天然地存在。 一般地， 当涉及多核 苷酸的 “天然存在的变体” 时， 该术语还可涵盖 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码基因组 DNA( 在 染色体 Chr 12 ： 54.76-54.78Mb 处通过染色体转位或复制存在的 )， 以及 RNA( 例如， 由此衍 生的 mRNA) 的任何等位变体。当提及具体多肽序列时， 例如， 该术语还包括天然存在形式的 蛋白质， 因此其可被加工， 例如， 通过其翻译时或翻译后修饰， 例如信号肽裂解、 蛋白酶裂解 (proteolytic cleavage)、 糖基化等等。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 通 过 Watson-Crick 碱 基 配 对、 Hoogsteen 氢 键 或 反 向 的 Hoogsteen 氢键， 在寡聚物的单体和靶核酸的单体之间， 本文所描述的寡聚物结合至靶核酸 的区域 (“靶区域” )。这样的结合也称作 “杂交” 。除非另外指明， 连接是通过互补碱基的 Watson-Crick 配对 ( 即腺嘌呤与胸腺嘧啶 (DNA) 或尿嘧啶 (RNA)， 和鸟嘌呤与胞嘧啶 )， 并 且寡聚物结合至靶区域， 这是因为该寡聚物的序列等同于， 或部分等同于靶区域的反向补 体的序列 ； 就本文而言， 寡聚物被认为是与靶区域 “互补” 或 “部分互补” ， 并且寡聚物序列相 对于靶区域序列的 “互补性” 百分数是相对于靶区域序列的反向补体的 “特性” 百分数。
     除非本文另外明确澄清， 本文的 “靶区域” 将是具有如下序列的靶核酸区域， 所述 序列是使用对位排列程序和下文所描述的参数， 与特定寡聚物的序列的反向补体 ( 或其区 域 ) 最佳对位排列。
     在确定用于本文所述方法的寡聚物 ( 或其区域 ) 和编码哺乳动物 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如本文公开的那些 ) 的靶区域之间的 “互补性” 程度中， “互补性” (也 是 “同源性” ) 的程度表示为寡聚物 ( 或其区域 ) 的序列和与其最佳对位排列的靶区域序列 的反向补体之间的相同性百分数。通过计算与 2 个序列之间相同的对位排列碱基的数目， 除以寡聚物中连续单体的总数， 并乘以 100 来计算百分数。在这样的比较中， 如果存在缺口(gap)， 优选是这些缺口仅仅是错配而不是一些下述区域， 其中缺口内单体数量在寡聚物和 靶区域之间不同。
     氨基酸和多核苷酸排列、 序列相同性百分数和互补度就本发明而言可以使用标准 设置的 ClustalW 算法确定 ： 参见 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html， 方 法： EMBOSS:: 水 ( 局部 ) ： 缺口产生 (Gap Open) ＝ 10.0， 缺口延伸 (Gap extend) ＝ 0.5， 使 用 Blosum 62( 蛋白质 )， 或用于核苷酸 / 核碱基序列的 DNAfull。
     如应理解的是， 取决于上下文， “错配” 是指序列的不相同性 ( 如， 例如在寡聚物的 核碱基序列和结合至它的靶区域的反向补体之间 ； 如， 例如在两个对位排列的编码核酸的 HER3 的碱基序列之间 )， 或是指序列的不互补性 ( 如， 例如， 在寡聚物和结合至它的靶区域 之间 )。
     合适地， 寡聚物 ( 或缀合物， 如以下进一步描述 ) 能够抑制 ( 例如通过下调 ) HER3( 或 HER2 或 EGFR) 基因的表达。
     在多个实施方式中， 与正常的表达水平相比， 本文所述寡聚物产生至少 10 ％， 至 少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 表达抑制作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的抑制。在多个实施方式中， 与正常的表达 水平相比， 所述寡聚物产生至少 10％， 至少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 蛋白质表达抑制 作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％ 的抑制。在一些实施方案中， 当使用 1nM 所述寡聚物或缀合物用于本发明的方法时可看到 这种抑制。在多个实施方案中， 当使用 25nM 所述寡聚物或缀合物时可看到这种抑制。
     在多个实施方案中， mRNA 表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如 低于 98％的抑制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。 在多 个实施方案中， 蛋白质表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如低于 98％的抑 制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。
     或者， 表达水平的调节可以通过测量 mRNA 的水平， 例如通过 RNA 印迹或定量 RT-PCR 来确定。当通过 mRNA 水平测量时， 在使用合适的剂量， 1 和 25nM 浓度时， 在多种实 施方式中， 抑制的水平一般达到不存在所述化合物的情况下正常水平的 10-20％的水平。
     表达水平的调节 ( 即抑制或提高 ) 还可以通过测量蛋白水平来确定， 例如， 通过例 如 SDS-PAGE 随后使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白质印迹的方法。
     在一些实施方案中， 本发明提供了抑制 ( 例如下调 ) 一个或多个交替剪接的同 种型 HER3 mRNA 和 / 或由其衍生的蛋白质的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 本发明 提供了抑制一个或多个交替剪接的蛋白质同种型 HER3(GenBank 编号 No.NP_001973.2 和 NP_001005915.1) 的表达和 / 或编码 HER3 蛋白质同种型 (GenBank 编号 No.NM_001982 和 NM_001005915.1) 的核酸的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 的 mRNA 是靶核酸。在其它实施方案中， 编码 HER3 同种型 2 的 mRNA 是靶核酸。在某些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 和 HER3 同种型 2 的核酸都是靶核酸， 例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列 的寡聚物。
     在多个实施方案中， 寡聚物或其第一区域具有与 HER3 核酸中靶区域的序列互补 的碱基序列， 该寡聚物下调 HER3 mRNA 和 / 或 HER3 蛋白质表达并且下调一个或多个其它 ErbB 受体酪氨酸激酶家族成员， 例如 HER2 和 / 或 EGFR 的 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。有效地结合至二个不同的 ErbB 受体家族核酸的靶区域 ( 例如 HER2 和 HER3 mRNA) 且下调两个 靶的 mRNA 和 / 或蛋白质表达的寡聚物或其第一区域被称为 “双特异性的” 。结合至三个不 同的 ErbB 受体家族成员的靶区域且能够有效地下调所有三个基因的寡聚物或其第一区域 被称为 “三特异性的” 。 在多个实施方案中， 反义寡核苷酸可以呈多特异性， 即能够结合至受 体酪氨酸激酶的 ErbB 家族的多个成员的靶核酸的靶区域且下调它们的表达。如本文所使 用的， 术语 “双特异性” 和 “三特异性” 不以任何方式理解为是限制性的。举例来说， “双特 异性寡聚物” 可能对第三靶核酸具有某些效果， 而 “三特异性寡聚物” 可能对它的 3 个靶核 酸之一具有非常弱的因而不明显的效果。
     在多个实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 核酸中的靶 区域和 HER2 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 和 HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在某些实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 HER2 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达下调至相同程度。 在其它优选实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能 够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域和 EGFR 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在多个实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。在仍其它实 施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域， 和结合至 受体酪氨酸激酶靶核酸的两个其它 ErbB 家族中的靶区域并且有效地下调受体酪氨酸激酶 的 ErbB 家族的两个其它成员的 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个优选的实施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达， HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达， 以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个实施方案中， 三特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质， HER2 mRNA 和 / 或蛋白 质以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。
     在多个实施方案中， 本发明因此提供了抑制 ( 例如通过下调 ) 癌细胞中 HER3 蛋白 质和 / 或 mRNA 的表达的方法， 所述癌细胞表达 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 且耐受用蛋白酪氨 酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括使所述细胞与本文所述有效抑制 ( 例如下调 ) 所述细胞中 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的量的寡聚物或缀合物接触。合适地， 所述细胞是哺乳动 物细胞， 例如人细胞。在某些实施方式中， 可以在体外进行给药。在其它实施方案中， 可以 通过将本文所述的化合物或缀合物给药到哺乳动物， 在体外实施接触。 在多个实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 HER2 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列 显示为 SEQIDNO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 EGFR 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或蛋白的表达的方法。
     本文所述的寡聚物通常结合至人 HER3 和 / 或人 HER2 和 / 或人 EGFR mRNA 的靶 区域， 且因此， 包含以下或由以下组成 ： 具有与例如 SEQ ID NO 197、 SEQ ID NO ： 198 和 / 或 SEQ ID NO ： 199 的碱基序列互补或部分互补的碱基序列的区域。在某些实施方案中， 当与 SEQ ID NO ： 197、 198 或 199 的最佳对准靶区域的序列相比时， 本文所述寡聚物的序列可以任选包含 1、 2、 3、 4 或更多个碱基错配。
     在一些实施方案中， 本文所述的寡聚物具有与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相同的序列 ( 参见下文表 1)。在其它实施方案中， 当与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相比时， 所述寡聚物具有 1、 2 或 3 个碱基不同的序列。 在一些实施方案中， 所述寡聚物由 10-16 个连续单体组成或包含 10-16 个连续单体。由 16 个连续单体构成的寡聚物的序列的实例为 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140。较短序列可由其 衍生， 例如， 较短寡聚物的序列可以等同地存在于选自具有 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的碱基序列的那些的寡聚物的区域中。 较长寡聚物可以包括具有至少 10 个连续单 体的序列的区域， 所述连续单体等同地存在于 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 中。
     还提供了含有靶区域的靶核酸 ( 例如编码 HER3 的 DNA 或 mRNA)， 所述靶区域与 SEQ ID NO ： 1-140 的寡聚物中的一种或多种互补或部分 - 互补， 其中所述寡聚物能够抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质或 mRNA 的表达。例如， 在图 1 中显示了人 HER3 mRNA 的与具 有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的反义寡聚物互补的靶区域 ( 粗体和下划线的， 具有上 文所述的相应的寡聚物 SEQ ID NO)。
     在多个实施方案中， 寡聚物具有 SEQ ID NO ： 141-168 中所示的碱基序列。 在某些实 施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如， 具有 SEQ ID NO ： 169-196 和 234 的序列的那些， 特别 是具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 的碱基序列的那些。在多个实施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 172、 174、 175、 176 和 179 的碱基序列的那些。在一些实施方案中， 寡聚物或其区域由 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的碱基序列组成或包含 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所 示的碱基序列。在一些实施方案中， 缀合物包括具有 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的 碱基序列的寡聚物。
     在某些实施方案中， 本文所述寡聚物可以合适地包含具有特定序列， 例如选自 SEQ ID NO ： 200-227， 即等同地存在于较短寡聚物中的序列的区域。 优选地， 所述区域包含 10-16 个单体。例如， 具有 SEQ ID NO ： 200-227 的碱基序列的寡聚物各自包含如下区域， 其中所 述区域的序列分别等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的较短寡聚物中。 在一些实施方案中， 具有比 16 个更少的单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 或 15 个单体的寡聚 物， 具有至少 8、 至少 9、 至少 10、 至少 11、 至少 12、 至少 13、 至少 14 或 15 个区域， 所述序列 的连续单体的等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 的序列的寡聚物中。因此， 在 多个实施方案中， 较短寡聚物的序列源于较长寡聚物的序列。 在一些实施方案中， 具有本文 公开的 SEQ ID NO 的寡聚物的序列， 或其至少 10 个连续单体的序列， 都等同地存在于较长 寡聚物中。通常， 寡聚物包含具有等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的序列的第 一区域， 如果与等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的第一区域相比， 所述寡聚物更长， 则所述寡聚物的侧翼区具有与在靶核酸的靶区域的侧翼的序列互补的序列。两种这 样的寡聚物是 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 54。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含或由这样的单体序列构成， 所述单体序列与编码 哺乳动物 HER3 的靶核酸的靶区域完全互补 ( 完美互补 )。
     然而， 在一些实施方案中， 寡聚物的序列在与 HER3 靶核酸的最佳对位排列靶区域 相比时包括 1、 2、 3 或 4 个 ( 或更多个 ) 错配， 并且仍充分地结合到靶区域以实现 HER3 mRNA 或蛋白质表达的抑制。错配对 Watson-Crick 氢键结合双螺旋的失稳效应可以例如通过增 加寡聚物的程度和 / 或增加寡聚物内存在的核苷类似物 ( 例如 LNA 单体 ) 的数目得到弥补。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物碱基序列包含相对于 ( 例如编码哺乳动物 HER3 的 靶核酸的 ) 最佳对位排列靶区域碱基序列不超过 3 个， 例如不超过 2 个的错配。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列至少 80％相同， 例如至少 85％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％相 同， 甚至 100％相同。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与 SEQ ID NO ： 197、 198 和 / 或 199 中存在的靶区域的序列至少 80 ％互补， 例如至少 85 ％、 至少 90 ％、 至 少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％互补， 甚至 100％互补。 在多个实施方案中， 寡聚物的序列 ( 或其第一区域 ) 选自 SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或者选自 SEQ ID NOs ： 200-227， 1-140 和 228-233 的至少 10 个连续单体。 在其它实施方案中， 寡聚物的序列或其第一区域任选包含 1、 2 或 3 个碱基部分， 当与所述选 定序列或其区域最佳对位排列时， 该碱基部分不同于具有如下序列的寡聚物中的那些 ： SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或其至少 10 个连续单体的序列。
     在某些实施方案中， 单体区域由以下构成 ： 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 或 29 个连续单体， 例如 10-15， 12-25， 12-22， 例如 12-18 个单体。 合适地， 在多个实施方案中， 所述区域与寡聚物具有相同的长度。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 或 3’ 端包含另外的单体， 例如， 独立地， 1， 2， 3， 4 或 5 个另外的寡聚物单体 5’ 末端和 / 或 3’ 末端， 其与靶区域的序列呈非互补性。在多个实 施方案中， 寡聚物包含与所述靶互补的区域， 该区域通过另外的单体在 5’ 和 / 或 3’ 侧翼。 在多种实施方式中， 所述区域的 3’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单元。3’ DNA 单体常 常在寡聚物的固态合成期间使用。 在多种实施方式中， 其可以是相同的或不同的， 所述寡聚 物的 5’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单体。在某些实施方式中， 附加的 5’ 或 3’ 单体 是天然存在的核苷， 例如 DNA 或 RNA 单体。在多种实施方式中， 5’ 或 3’ 单体可以代表如本 文缺口聚物寡聚物的上下文中所涉及的 D 区。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 200 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 201 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据
     SEQ ID NO ： 202 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 203 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 204 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 205 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 206 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 207 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 208 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 209 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 210 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 211 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 212 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 213 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 214 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 215 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 216 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 217 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 218 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 219 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 220 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 221 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 222 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 223 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 224 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 225 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 226 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 227 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     序列比对 ( 例如上述那些 ) 也可以用于鉴定编码来自人和一个或多个不同哺乳动 物物种如猴、 小鼠和 / 或大鼠的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的区域， 其中该区域在所述 物种两者或多者之间具有足够长度的核酸一致度 (identity)， 以允许设计同时靶向 ( 即， 其与足够的特异性结合以抑制 ) 人 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 靶核酸和不同哺乳动物物种中 存在的相应核酸的寡核苷酸。
     在一些实施方案中， 这样的寡聚物由由以下区域组成或包含以下区域 ： 至少 10 个、 例如至少 12 个、 例如至少 14 个、 例如至少 16 个、 例如至少 18 个， 例如 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17 或 18 个连续单体， 所述连续单体与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的靶区域序列 100％序列互 补。
     在一些实施方式中， 用于本发明方法的寡聚物包含连续连续单体区域或由连续单 体区域组成， 所述连续单体区域的序列与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如编码 HER3 的小鼠 核酸 ) 的靶区域序列至少 80％、 例如至少 85％、 例如至少 90％、 例如至少 95％、 例如至少 98％、 例如至少 99％、 或 100％互补。优选是， 所述寡聚物的连续核碱基序列与人 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 的靶区域 100％互补。
     在一些实施方案中， 本文描述的寡聚物结合到 HER3 靶核酸的靶区域并且下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在多个实施方案中， 结合到 HER3 核酸靶区域的本文所述 寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169-196 和 234 中所示的序列。
     在一些实施方案中， 本文描述的双特异寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶 区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 HER2 核酸的靶区域， 所述寡聚物下调 HER3 和 HER2 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同程度下调 HER3 和 HER2 的表达。在一些 实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同的。 在多个实施方案中， 寡聚物的第一区 域和第二区域重叠。在某些实施方案中， 与 HER3 核酸的靶区域和 HER2 核酸的靶区域结合 的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 177 和 178 中所示的序列。在仍其它实施方案中， 双 特异寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域， 并且下调 HER3 和 EGFR 的表 达。在一些实施方案中， 结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 171 和 173 中所示的序列。在一些实施方案中， 本文所述双特异寡聚 物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同 程度下调 HER3 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同 的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域重叠。在还其它实施方案中， 本文述 的三特异性寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域， 结合到 HER2 核酸的靶区域， 结合到 EGFR 核 酸的靶区域， 并且下调所有三个基因的表达。 在一些实施方案中， 结合到 HER3、 HER2 和 EGFR 的三特异性寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169、 170、 172、 174-176 和 179 中所示的序列。在 一些实施方案中， 三特异性寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物 的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物的第三区域结合到 HER2 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 三特异性寡聚 物以不同程度下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和 第三区域是相同的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和第三区域重叠。在多个实施 方案中， 双特异或三特异性寡聚物在与例如靶核酸的最佳对位排列靶区域相比时具有 1、 2、 3、 4、 5 或更多个错配， 所述靶核酸具有例如 SEQ ID NO ： 197， 198 和 / 或 199 中所示的序列。
     5.6. 核苷和核苷类似物
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个单体是包含修饰碱基的核苷类 似物， 所述碱基例如选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿 嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤、 2- 氯 -6- 氨基嘌呤、 黄嘌呤和次黄嘌呤。
     在多个实施方案中， 寡聚物中存在的单体中的至少一个是含有修饰糖的核苷类似 物。
     在一些实施方案中， 寡聚物的至少 2 个连续单体之间的连接基是除磷酸二酯连接 基外。
     在某些实施方案中， 寡聚物包括至少一个具有修饰碱基的单体， 至少一个具有修 饰糖的单体 ( 它们可以是相同的单体 ) 和至少一个非天然产生的单体内连接基。
     用于本文所述寡聚物核苷类似物的具体实例由例如 Freier & Altmann ； Nucl。 Acid Res.， 1997， 25， 4429-4443 和 Uhlmann ； Curr。Opinion in Drug Development， 2000， 3(2)， 293-213 中以及方案 1( 其中一些核苷类似物以核苷进行显示 ) 中所描述 ：
    方案 1
     因此寡聚物可以包含或由以下构成 ： 单序列的核苷 - 优选 DNA 单体， 但是还可能是 RNA 单体， 或者核苷和一种或多种核苷类似物的组合。在一些实施方案中， 这样的核苷类似 物合宜地提高寡聚物对靶核酸的靶区域的亲和性。
     适合的和优选核苷酸类似物的实例在 WO2007/031091 中描述， 因而在此引用作为 参考， 或参考其中的内容。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖部分， 该糖部分经修饰以提供 2’ - 取代基， 例如 2’ -O- 烷基 - 核糖、 2’ - 氨基 - 脱氧核糖和 2’ - 氟 - 脱氧核糖。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖， 在该糖中存在产生双环糖 (LNA) 的桥接 结构， 其提高结合亲和性并且还可以提供一些提高的核酸酶耐受性。在多个实施方案中， LNA 单体选自氧 -LNA( 例如 β-D- 氧基 -LNA， 和 α-L- 氧基 -LNA)， 和 / 或氨基 -LNA( 例如 β-D- 氨基 -LNA 和 α-L- 氨基 -LNA) 和 / 或硫基 -LNA( 例如 β-D- 硫基 -LNA 和 α-L- 硫 基 -LNA) 和 / 或 ENA( 例如 β-D-ENA 和 α-L-ENA)。在某些实施方式中， 所述 LNA 单体是
     β-D- 氧基 -LNA。下面进一步描述了 LNA 单体。
     在多个实施方案中， 在寡聚物中纳入增强亲和性的核苷类似物， 例如 LNA 单体或 含 2’ - 取代糖的单体， 或者纳入修饰的连接基， 提供了提高的核酸酶耐受性。在多个实施方 案中， 纳入这样的增强亲和性的核苷类似物允许降低寡聚物的大小， 并且在发生非特异性 或异常结合之前还降低上限至寡聚物的大小。
     在某些实施方式中， 所述寡聚物包含至少 2 个核苷酸类似物。在一些实施方式中， 所述寡聚物包含 3-8 个核苷酸类似物， 例如 6 个或 7 个核苷酸类似物。在优选实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物是锁核酸 (LNA) 单体 ； 例如， 至少 3 或至少 4、 或至少 5、 或至少 6、 或至少 7、 或 8 个核苷酸类似物是 LNA 单体。在一些实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。
     可认识到， 当提及优选的寡聚物碱基序列时， 在某些实施方案中所述寡聚物包含 相应的核苷类似物， 例如相应的 LNA 单体或其它相应的核苷类似物， 这提高了寡聚物 / 靶区 域双螺旋 ( 即增强亲和性的核苷类似物 ) 的双螺旋稳定性 (Tm)。
     在多个优选实施方案中， 寡聚物的碱基序列和靶区域的碱基序列之间的任何错配 ( 即， 非互补性 )， 如果存在， 位于除含增强亲和性的核苷类似物的寡聚物区域 ( 例如区域 A 或 C) 外的区域， 例如在本文提及的区域 B 中， 和 / 或在本文提及的区域 D 中， 和 / 或在 5’ 或 3’ 连接到与靶区域互补的寡聚物区域的区域中。 在一些实施方案中， 寡聚物内 ( 例如在本文提及的区域 A 和 C 中 ) 存在的核苷 类似物独立地选自例如 ： 含 2’ -O- 烷基 - 核糖的单体， 含 2’ - 氨基 - 脱氧核糖的单体， 含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的单体， LNA 单体， 含树胶醛醣的单体 (“ANA 单体” )， 含 2’ - 氟 - 树胶醛 醣的单体， 含 d- 阿拉伯糖基 - 己糖醇糖的单体 ( “HNA 单体” )， Christensen， Nucl。Acids. Res.30 ： 4918-4925(2002) 中定义的插层 (intercalating) 单体 ( 将其并入本文作为参 考 )， 和含 2’ MOE 糖的单体。在某些实施方案中， 寡聚物或其区域中仅存在一种上述类型的 核苷类似物。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 核 苷 类 似 物 含 有 2’ -O- 甲 氧 基 乙 基 - 核 糖 (2’ MOE)， 或 2’ - 氟 - 脱氧核糖或 LNA 糖， 因此本发明的寡核苷酸 (oligonucleotide) 可以包含独立地 选自这三种类型的核苷类似物。在某些含核苷类似物的寡聚物实施方式中， 至少一个所述 核苷类似物含有 2’ -MOE- 核糖， 例如含 2’ -MOE- 核糖的 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 或 10 核苷类似 物。在某些实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物含有 2’ - 氟 - 脱氧核糖， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的苷酸类似物。
     在多种实施方式中， 本文所述寡聚物包含至少一个锁核酸 (LNA) 单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8 个 LNA 单体， 例如 3-7 个或 4-8 个 LNA 单体， 或 3、 4、 5、 6 或 7 个 LNA 单体。在 多种实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物同时包 含 β-D- 氧基 -LNA 单体以及一种或多种以下的 LNA 单体元 ： β-D 或 α-L 构型的硫基 -LNA 单体、 氨基 -LNA 单体、 氧基 -LNA 和 / 或 ENA 或其组合。在某些实施方案中， 寡聚物中所有 LNA 单体的胞嘧啶碱基部分是 5- 甲基胞嘧啶。在本发明的某些实施方式中， 寡聚物同时包 含 LNA 和 DNA 单体。典型地， LNA 和 DNA 单体的组合的总数是 10-25 个， 优选 10-20 个， 再 更优选 12-16 个。在本发明的某些实施方案中， 寡聚物或其区域包括至少一个 LNA 单体， 其 余单体是 DAN 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物仅包含 LNA 单体和核苷 ( 例如 RNA 或
     DNA 单体， 最优选 DNA 单体 )， 任选与改性连接基例如例如硫代磷酸酯连接。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个核苷类似物具有修饰的碱基， 其选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤和 2- 氯 -6- 氨基嘌呤。
     5.7.LNA
     术语 “LNA” 是指含二环糖 (“LNA 糖” ) 的核苷酸类似物。术语 “LNA 寡核苷酸” 和 “LNA 寡聚物” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡聚物。
     本 发 明 的 寡 核 苷 酸 化 合 物 中 使 用 的 LNA 优 选 具 有 通 式 I 的 结 构， 及其碱盐 (basicsalts) 和酸加成盐。
    其中 X 选自 -O-、 -S-、 -N(RN*)-、 -C(R6R6*)- ；
     B 选自氢、 任选取代的 C1-4- 烷氧基、 任选取代的 C1-4- 烷基、 任选取代的 C1-4- 酰基氧 基、 核碱基、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基 (report group) 和 配体 ；
     P 表示与在后的单体之间的核苷酸间连接 (internucleotide linkage) 的基团位 置， 或 5’ - 末端基团， 该核苷酸间连接或 5’ - 末端基团任选包括取代基 R5 或等同适用取代 基 R5* ；
     P* 表示与在前的单体的核苷酸间连接， 或 3’ - 末端基团 ； 4* 2*
     R 和 R 一 起 表 示 由 1-4 个 选 自 下 列 的 基 团 / 原 子 组 成 的 二 价 基 团 (biradical) ： -C(RaRb)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-、 -C(Ra) ＝ N-、 -O-、 -Si(Ra)2-、 -S-、 -SO2-、 -N(Ra)和＞ C ＝ Z，
     其中 Z 选自 -O-、 -S- 和 -N(Ra)-， 且 Ra 和 Rb 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷 基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰 基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰 基氧基、 磺基 (sulphono)、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体， 其中芳基 a b 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的 (geminal) 取代基 R 和 R 一起可表示任选取代 的亚甲基 ( ＝ CH2)， 以及存在的取代基 R1*、 R2、 R3、 R5、 R5*、 R6 和 R6* 各自独立地选自氢、 任选取 代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷 氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧
     基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷 基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲 基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体、 其中芳基 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、 硫代、 亚氨基或任选取 代的亚甲基， 或一起可形成由 1-5 个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团， 所述亚烷基链 任选插入一个或多个杂原子 / 基团和 / 或被一个或多个杂原子 / 基团终止， 所述杂原子 / N N 基团选自 -O-、 -S- 和 -(NR )-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基， 且其中两个相邻的 ( 非成对的 ) N* 取代基可表示另一键， 导致形成双键 ； 且R ， 当存在且不涉及二价基团时， 选自氢和 C1-4- 烷 基； 以及它们的碱性盐和酸加成盐。
     在多种实施方案中， R5* 选自 H， -CH3， -CH2-CH3， -CH2-O-CH3 和 -CH ＝ CH2。 4* 2*
     在多种实施方案中， R 和 R 一起表示二价基团， 其选自 -C(RaRb)-O-、 -C(RaRb)-C(R c d R )-O-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、 -C(RaRb) -C(RcRd)-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-、 -C(RaRb)-C (RcRd)-N(Re)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-O- 和 -C(RaRb)-S-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-， 其中 Ra、 Rb、 Rc、 Rd、 Re 和 Rf 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔 基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷 基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂 芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨 基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫 基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 a b 信息基和配体， 其中芳基和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基 R 和 R 一起可 表示任选取代的亚甲基 ( ＝ CH2)，
     在其它实施方案中， R4* 和 R2* 一起表示二价基团， 其选自 -CH2-O-、 -CH2-S-、 -CH2-NH -、 -CH2-N(CH3)-、 -CH2-CH2-O-、 -CH2-CH(CH3)-、 -CH2-CH2-S-、 -CH2-CH2-NH-、 -CH2-CH2-CH2-、 -CH2-C H2-CH2-O-、 -CH2-CH2-CH(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH2-O-CH2-O-、 -CH2-NH-O-、 -CH2-N(CH3)-O-、 -CH2-O-CH2-、 -CH(CH3)-O-、 -CH(CH2-O-CH3)-O-。
     对于所有手性中心， 不对称的基团可为 R 或 S 取向。
     优选地， 本发明的寡聚物中使用的 LNA 包括至少一个根据任一下式的 LNA 单元
    其中 Y 为 -O-、 -O-CH2-、 -S-、 -NH- 或 N(RH) ； Z 和 Z* 独立地选自核苷酸间连接基、 末端基团或保护基 ； B 构成天然或非天然核酸的未修饰碱基部分或修饰碱基部分， 以及 RH选自氢和 C1-4- 烷基。
     特别优选的 LNA 单元示于方案 2 ：
    术语″硫基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 选自 S 或 -CH2-S- 的 LNA 单体。硫 基 -LNA 可为 β-D 和 α-L- 构型。
     术 语 ″ 氨 基 -LNA ″ 是 指 其 中 上 述 通 式 中 的 Y 选 自 -N(H)-、 N(R)-、 CH2-N(H)- 和 -CH2-N(R)-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基的 LNA 单体。氨基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″氧基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 表示 -O- 或 -CH2-O- 的 LNA 单体。氨 基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″ ENA″是指其中上述通式中的 Y 为 -CH2-O-( 其中 -CH2-O- 的氧原子连接至 相对碱基 B 的 2’ - 位 ) 的 LNA 单体。
     在优选实施方案中， LNA 单体选自 β-D- 氧基 -LNA 单体， α-L- 氧基 -LNA 单体， β-D- 氨基 -LNA 单体， β-D- 硫基 -LNA 单体， 特别是 β-D- 氧基 -LNA 单体。
     在本文中， 术语″ C1-4- 烷基″是指直链或支链的饱和烃链， 其中该链具有 1 至 4 个碳原子， 如甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基。
     5.8.RNAse H 募集
     在一些实施方案中， 寡聚物通过靶 mRNA 的非 RNase 调变降解发挥作用， 例如通过 翻译的空间阻碍或者其它机制 ； 然而， 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物能够募集核糖核
     酸内切酶 (RNase)， 例如 RNase H。
     典型地， 寡聚物包含至少 6 个， 例如至少 7 个连续单体， 例如至少 8 或至少 9 个连续 单体的区域， 包括 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15 或 16 个连续单体的区域， 其在与靶 RNA 的靶 区域形成双螺旋时能够募集 RNase。能募集 RNAse 的寡聚物区域可为本文所述的缺口聚物 (gapmer) 涉及的 B 区。在某些实施方案中， 能募集 RNAse 的寡聚物区域 ( 如 B 区 ) 由 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19 或 20 个单体构成。
     EP 1222309 提 供 了 体 外 测 定 RNaseH 活 性 的 方 法， 其可用于测定寡聚物募集 RNaseH 的能力。使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当与 RNA 靶的互补靶区 域接触时， 具有的初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为至少 1％， 如至少 5％， 如至少 10％或 少于 20％寡核苷酸具有相同的碱基序列， 但是仅含有 DNA 单体， 没有 2’ 取代， 且在寡核苷酸 中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H， 将所述文献并入 作为参考。
     在多种实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 少于使用寡核苷 酸所测定的初始速率的 1％， 如少于 5％， 如少于 10％或少于 20％， 所述寡核苷酸具有相同 的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷 酸酯连接基， 则认为该寡聚物基本不能募集 RNase H。
     在其它实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为使用寡核苷酸 所测定的初始速率的至少 20％， 如至少 40％， 如至少 60％， 如至少 80％， 所述寡核苷酸具有 相同的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫 代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H。
     典型地， 与靶 RNA 的互补靶区域形成双螺旋并且能够募集 RNase 的寡聚物区域， 含有 DNA 单体和 LNA 单体并且与所述靶区域形成类似双螺旋的 DNA/RNA。LNA 单体优选为 α-L 构型， 特别优选为 -L- 氧基 LNA。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含核苷和核苷类似物二者， 并且为如上所定义的缺 口聚物 (gapmer)、 头聚物 (headmer) 或混合聚物 (mixmer) 的形式。
     “头聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部 (5’ -most) 单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物， 第二区域包含 RNAse 可识别和断开的连续伸长的 ( 例如至少 7 个连 续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体。
     “尾聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含 RNAse 可识别和断开的连续 伸长的 ( 例如至少 7 个连续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体， 第二区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物。
     其它 “嵌合” 寡聚物， 称为 “混合聚物” ， 其由下述交替组分构成 ： i) 可由 RNAse 识 别和裂解的 DNA 单体或核苷酸类似物单体， 和 ii) 非 - 募集 RNase 的核苷酸类似物单体。
     在一些实施方案中， 除提高寡聚物对靶区域的亲和性外， 一些核苷类似物也调变 RNase( 例如， RNase H) 结合和断裂。因为 α-L-LNA 单体募集 RNase 活性至一定程度， 在一些实施方案中， 含 α-L-LNA 单体的寡聚物的缺口区域 ( 例如， 在下文也称作区域 B) 由较少 RNase 可识别和断裂的单体构成， 并且在混合聚物的结构中引入更大灵活性。
     5.9. 缀合物
     在本发明的上下文中， 如本文中所示， 术语 “缀合物” 是指通过将寡聚物共价连接 ( 缀合 ) 到一个或多个本身不为核酸或单体的部分 (“缀合部分” ) 的化合物。这样的缀合 部分的实例包括大分子化合物如蛋白质、 脂肪酸链、 糖残基、 糖蛋白、 聚合物或其组合。 典型 的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。WO2007/031091 提供了合适的部 分和缀合物， 其在此引入作为参考。
     因此， 本文提供了包含本文所述寡聚物和至少一个缀合部分的缀合物， 所述缀合 部分不是核酸或单体， 并且共价连接到所述寡聚物。因此， 在某些实施方案中， 如本文中所 公开， 在寡聚物由具有规定碱基序列的连续单体构成时， 缀合物还可以包含至少一个共价 连接到所述寡聚物的缀合部分。
     在某些实施方案中， 寡聚物缀合到可提高寡聚化合物的细胞吸收的部分。
     在多个实施方案中个， 缀合物可增强本文所述寡聚物的活性、 细胞分布或细胞 吸收。这些部分包括， 但不限于， 抗体、 多肽、 脂质部分如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己 基 -s- 三苯甲基硫醇、 硫胆固醇 (thiocholesterol)、 脂肪链， 例如， 十二烷二醇或十一烷基 残基、 磷脂， 例如， 二 - 十六烷基 -rac- 甘油或 1， 2- 二 -o- 十六烷基 -rac- 甘油 -3-h- 膦酸 三乙基铵、 聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 十八烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 氧 基胆固醇部分。 在某些实施方案中， 寡聚物缀合至活性药物， 例如， 阿司匹林， 布洛芬， 磺胺药物， 抗糖尿药， 抗菌药或抗生素。
     在某些实施方案中， 该缀合的部分为固醇， 如胆固醇。
     在多种实施方案中， 该缀合的部分包含或由以下组成 ： 带正电荷的聚合物， 如带 正电荷的肽， 例如长度为 1-50， 如 2-20 如 3-10 个氨基酸残基， 和 / 或聚环氧烷如聚乙二 醇 (PEG) 或聚丙二醇 - 参见 WO 2008/034123， 在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚 合物， 如聚环氧烷可通过连接基连接至寡聚物， 如描述于 WO 2008/034123 的可释放的连接 基。
     5.10. 活化的寡聚物
     本文所用的术语 “活化的寡聚物” ， 是指本文所述共价连接 ( 即， 官能化 ) 至至少 一个官能部分 (functional moiety) 的本发明的寡聚物， 该官能部分允许寡聚物共价连 接至一个或多个缀合的部分 ( 即本身不为核酸或单体的部分 )， 以形成本文描述的缀合 物。典型地， 官能部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团 ： 例如， 3’ -羟 在一些实施方案中是亲水性间隔基 (spacer) 和能结合至 基或腺嘌呤碱基的环外 NH2 基， 缀合的部分的末端基团 ( 例如， 氨基、 巯基或羟基 )。在一些实施方案中， 末端基团未被 保护， 例如， 为 NH2 基团。在其它实施方案中， 末端基团被保护， 例如， 被任何合适的保护 基， 如描述于 Theodora WGreene 和 Peter G M Wuts， 第三版 (John Wiley&Sons， 1999) 的 “ProtectiveGroups in Organic Synthesis” 的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括 酯如乙酸酯， 芳烷基如苄基， 二苯基甲基， 或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基 的实例包括苄基， α- 甲基苄基， 二苯基甲基， 三苯基甲基， 苄基氧基羰基， 叔丁氧基羰基和
     酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
     在一些实施方案中， 该官能部分是自裂解的 (self-cleaving)。在其它实施方案 中， 该官能部分为生物可降解的。 参见例如， 美国专利号 7,087,229， 其以其整体在此引入作 为参考。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 端官能化以使缀合的部分共价连接至寡聚物的 5’ 端。在其它实施方案中， 寡聚物可在 3’ 端官能化。在其它实施方案中， 寡聚物可沿着主 链或在杂环碱基部分上官能化。 在其它实施方案中， 寡聚物可在多于一个位置官能化， 所述 位置独立地选自 5’ 端、 3’ 端、 主链和碱基。
     在一些实施方案中， 本文所述的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个 共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中， 活化的寡聚物使用未被官能化的 单体合成， 且该寡聚物在合成完成后立即官能化。
     在一些实施方案中， 该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化， 其中该烷 基部分具有式 (CH2)w， 其中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直 链或支链的， 且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 连接至寡聚物。
     在其它实施方案中， 该寡聚物使用含 (CH2)w- 巯基 (SH) 连接基的位阻酯官能化， 其 中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的， 且其中该官 能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wSH) 连接至寡聚物。在一些实施方案中， 巯基 - 活化的寡核 苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 ( 通过二硫键的形成 )。
     可通过本领域已知的任何方法合成与至少一个功能部分连接的活化寡聚物， 所 述方法特别是公开于美国专利公开 No.2004/0235773( 将其全文并入本文作为参考 ) 以 及 Zhao 等 (2007)J.Controlled Release 119 ： 143-152 ； 和 Zhao 等 (2005)Bioconjugate Chem.16 ： 758-766 中的方法。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物通过使用官能化试剂向寡聚物引入巯基、 氨基或羟基而官能化， 该官能化试剂基本上描述于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210， 即， 为基本上链状的试剂， 其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite) 通过亲水性间隔基 链连接至相对的端， 该相对的端包含保护的或未保护的巯基、 氨基或羟基。 这些试剂主要与 寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的 5’ - 羟基。在其它实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至 3’ - 羟基。在其它 实施方案中， 活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方 案中， 寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化， 该官能化试剂描述于美国专利号 4,962,029 以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡 和 4,914,210 中， 聚物的方法公开于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210。
     在一些实施方案中， 固相结合的寡聚物的 5’ - 端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化， 然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过 Diels-Alder 环加成反应而缀合。
     在多种实施方案中， 将含 2’ - 糖修饰的单体， 如 2’ - 氨基甲酸酯取代的糖或 2’ -(O- 戊基 -N- 邻苯二甲酰亚氨基 )- 脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物 的糖的共价连接。在其它实施方案中， 一个或多个单体的 2’ - 位具有含氨基的连接基的寡 聚物使用以下试剂制备 ： 例如， 5’ - 二甲氧基三苯甲基 -2’ -O-(e- 邻苯二甲酰亚氨基氨基 戊基 )-2’ - 脱氧腺苷 -3’ -N， N- 二异丙基 - 氰基乙氧基亚磷酰胺。参见， 例如， Manoharan，等人， Tetrahedron Letters， 1991， 34， 7171。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分， 包括 在 N6 嘌呤氨基上， 在鸟嘌呤的环外 N2 上， 或在胞嘧啶的 N4 或 5 位上。在一些实施方案中， 该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。
     一 些 官 能 部 分 是 可 商 购 的， 例 如， 异 双 官 能 (heterobifunctional) 和 同 双 官 能 (homobifunctional) 连接部分可购自 Pierce Co.(Rockford， Ill.)。其它可商购的 连 接 基 为 5’ - 氨 基 - 修 饰 体 (Modifier)C6 和 3’ - 氨 基 - 修 饰 体 试 剂， 均 可 购 自 Glen Research Corporation(Sterling， Va.)。5’ - 氨基 - 修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI(Applied Biosystems Inc.， Foster City， Calif.)， 且 3’ - 氨基 - 修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto， Calif.)。
     5.11. 组合物
     在多个实施方案中， 本文所述的寡聚物以药物制剂或组合物使用。合适地， 该组 合物包含药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。WO2007/031091( 并入本文作为参考 ) 提 供了适宜和优选的药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。合适的剂量、 制剂、 给药途径、 组合物、 剂型、 与其它治疗剂的组合， 前药制剂也提供于 WO2007/031091- 其也在此引入 作为参考。配制和施用的技术细节还可以在最新版的 “REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES” (Maack Publishing Co， Easton Pa.) 中找到。
     在一些实施方案中， 本文所述寡聚物共价连接到缀合部分以有助于将寡聚物贯穿 细胞膜进行输送。有助于将寡聚物贯穿细胞膜进行输送的缀合部分的实例是亲脂性部分， 例如胆固醇。 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物用形成脂质体的脂质制剂进行配制， 所述 脂质体例如 Lipofectamine 2000 或 Lipofectamine RNAiMAX， 其均可商购自 Invitrogen。 在一些实施方案中， 本文所述寡聚物用一种或多种脂质状非天然小分子的混合物 (“脂 质体分子库” ) 进行配制。脂质体分子库可以通过共价合成化学方法进行合成， 并且可以 尝试各种量和组合的脂质体分子库以开发按照所选给药路径有效将特定尺寸的寡聚物递 送到靶组织的载体。合适的脂质体分子库和组合可例如在 Akinc 人等的 (2008)Nature Biotechnol. 中 找 到， 其 获 得 自 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/ abs/nbt1402.html， 将其并入本文作为参考。
     如本文所述， 术语″药学可接受的盐″是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示可接受水平的不希望有的有毒作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机 氨基酸形成， 以及与金属阳离子形成的碱加成盐， 该金属阳离子如锌、 钙、 铋、 钡、 镁、 铝、 铜、 钴、 镍、 镉、 钠、 钾等， 或与由氨形成的阳离子， N， N’ - 二苄基乙二胺， D- 葡糖胺， 四乙基铵， 或 乙二胺形成的碱加成盐 ； 或 (a) 和 (b) 的 (c) 组合 ； 例如， 鞣酸锌盐等。
     有效用于治疗或防止可耐受用 PTK 抑制剂治疗的疾病的至少一种寡聚物的量可 通过标准临床技术加以确定。通常， 剂量范围可以基于在体外和体内动物模型中发现有效 的 EC50 来确立。所使用的精确剂量还将取决于， 例如， 给药途径和疾病的严重程度， 并且可 根据从业者和 / 或每个患者的状况的判断加以确定。在它的其它实例中， 将尤其必须取决 于如下加以变化 ： 进行治疗的患者的体重和身体状况 ( 例如， 肝肾功能 )， 治疗的痛苦性， 症 状的严重性， 用药间隔频率， 和任何有害副作用的存在。
     在多个实施方案中， 寡聚物的剂量为约 0.01μg- 约 1g/kg 体重， 并且可以每天、 每周、 每月或每年给予一次或多次， 或甚至没 2-10 年给予一次， 或者连续灌输数小时一直到 数月。在某些实施方案中， 用药的重复速率可基于所测得的活性剂在体液或组织内的停留 时间和浓度进行确定， 患者可用 HER3 靶向疗法进行维持治疗以防止疾病状态的复发。
     5.12. 与其它反义寡聚物和化学治疗剂的组合
     在一些实施方案中， 使本文所述寡聚物靶向 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 核酸。因此， 在一些实施方案中， 本发明涉及通过向靶向的两种或所有三种靶核酸施用多于一种寡聚物 来治疗疾病的方法， 所述疾病耐受用 PTK 抑制剂治疗。 在多个实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 EGFR 或 HER2 的第二寡聚物一起施用。在多个其它实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 HER2 的第二寡聚物以及靶向 EGFR 的第三寡聚物一起施用。在本文所述方法中， 这样的寡聚物可以同时或相继施用。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 HER2 表达的其它治疗剂 ( 例如靶向 HER2 mRNA 的反 义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在其它可以相同或不同的实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的 方法， 其通过施用包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 EGFR 表达的其它治疗剂 ( 例如靶 向 EGFR mRNA 的反义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在一些实施方案中， 靶向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有相同的设计 ( 例如， 缺口聚物， 头聚物， 尾聚物 )。在多个实施方案中， 靶 向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有不同的设计。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 一种或多种本文所述寡聚物与一种或多种另外化学治疗剂， 包括但不限于， 烷化剂， 抗代谢 物， 表鬼臼毒素， 蒽环类， 常春藤生物碱， 植物碱和萜类化合物， 单克隆抗体， 紫杉醇类， 拓扑 异构酶抑制剂， 和铂化合物。
     5.13. 试剂盒
     本发明还通了治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法使用 包含第一组分和第二组分的试剂盒。在多个实施方案中， 所述第一组分包含能够抑制 ( 例 如， 通过下调 )HER3 的表达的本文所述寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。在其它 实施方案中， 第二组分包含第二活性成分。在一些实施方案中， 第二组分是作为本文所述 寡核苷酸的治疗剂。在其它实施方案中， 治疗剂是除寡核苷酸外 ( 例如， 小分子治疗剂如 taxol)。在一些实施方案中， 本文所述试剂盒用于过度增生性病症 ( 例如耐受用 PTK 抑制 剂治疗的癌症 ) 的治疗方法， 其包括包含向患者按需要施用有效量的试剂盒第一组分和第 二组分。在多个实施方案中， 同时施用第一和第二组分。在其它实施方案中， 相继地或按任 何顺序施用第一和第二组分。
     在一些实施方案中， 试剂盒包含的第一组分和第二组分， 所述第一组分含有能够 抑制 ( 例如， 通过下调 )HER3 的表达的寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物， 所述第二 组分是如本文所述能够抑制 ( 例如， 通过下调 )HER2 表达和 / 或 EGFR 表达的反义寡核苷酸， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。 6. 实施例6.1. 实施例 1 ： 单体合成
     LNA 单体构造块及其衍生物根据公开操作进行制备。参见 WO07/031081 和本文所 引用的参考文献。
     6.2. 实施例 2 ： 寡核苷酸合成
     寡核苷酸根据 WO07/031081 中描述的方法来合成。表 1 显示了本发明的反义寡核 苷酸基序的实例。
     6.3. 实施例 3 ： 寡核苷酸的设计
     根 据 本 发 明， 设 计 一 系 列 不 同 的 寡 核 苷 酸 除 了 人 HER3(GenBank 登 记 号 NM_001982， SEQ ID NO ： 197) 之外还靶向人 EGFR(GenBank 登记号 NM 005228， SEQ ID NO ： 198) 和人 HER2(GenBank 登记号 NM 004448， SEQ ID NO ： 199) 的不同区域。
     在表 1 中所示的序列中， SEQ ID NO ： 1-50、 53、 139 和 140 设计为除了靶向人 HER3 之外还靶向人 EGFR 和人 HER2。显示了与 HER3、 EGFR 和 HER2 的序列同源性的百分比。所 述寡聚物在相比于 EGFR 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 0 到 2 个错配， 在相比于 HER2 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 1 到 2 个错配。
    
    
    
    
    在表 2 中， 黑体字母表示表 1 中所示的较短序列。在表 3 中所示的 SEQ ID NOs ： 141-168 中， 大写字母表示核苷类似物单体， 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基。小写字母表示 DNA 单体。单体 ( 如果有一些的话 ) 之间不存在 “s” 表示连接磷酸二酯基。
    
    
    
    6.4. 实施例 4 ： 体外模型 ： 细胞培养 反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试， 条件是该靶核酸以可检测的水平存在。 靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染 或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用， 例如， RNA 印迹分析、 实时 PCR、 核 糖核酸酶保护测试而确定。为了例示， 提供以下细胞类型， 但可常规使用其它细胞类型， 条 件是该靶在所选的细胞类型中表达。
     细胞如下所述在合适的培养基中培养， 并保持在 37℃和 95-98％湿度和 5％ CO2 下。细胞每周常规传代 2-3 次。
     15PC3 ： 人 前 列 腺 癌 细 胞 株 15PC3 在 DMEM(Sigma)+10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)+2mM Glutamax I+ 庆大霉素 (25μg/ml) 中培养。
     HUH7 ： 人肝癌细胞株在 DMEM(Sigma)+10％胎牛血清 (FBS)+2mMGlutamax I+ 庆大 霉素 (25μg/ml)+1x 非必需氨基酸中培养。
     6.5. 实施例 5 ： 体外模型 ： 用反义寡核苷酸处理
     将细胞用寡核苷酸处理， 使用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作 为转染载体。将细胞接种于 6- 孔细胞培养板 (NUNC) 并当铺满 80-90％时进行处理。寡核 苷酸浓度范围为 1nM 至 25nM 终浓度。寡聚物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的 进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚物的培养基来停止处理。清洗细胞且添加含血 清的培养基。寡核苷酸处理后， 使细胞恢复 20 小时， 然后将其收集用于 RNA 分析。
     6.6. 实施例 6 ： 体外模型 ： RNA 的提取和 cDNA 合成
     使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 (Qiagen cat.no.74104) 根据厂家的说明书从如上所 述转染的细胞提取总 RNA。根据厂家的说明书使用来自 Ambion 的逆转录酶试剂 (Reverse Transcriptase reagents) 进行第一链合成。
     对于每个样品， 使用无 RNase H2O 将 0.5μg 总 RNA 调节到 10.8μl， 并与 2μl 十碱 基的随机引物 (random decamers)(50μM) 和 4μl dNTP 混合物 ( 每种 dNTP 2.5mM) 混合， 加热到 70℃保持 3 分钟， 在这之后样品在冰上快速冷却。在冰上冷却样品之后， 将 2μl10x 缓冲液 RT、 1μl 的 MMLV 逆转录酶 (100U/μl) 和 0.25μl RNase 抑制剂 (10U/μl) 添加到 各样品中， 随后在 42℃孵育 60 分钟， 酶在 95℃加热灭活 10 分钟， 然后将样品冷却到 4℃。
     6.7. 实施例 7 ： 体外模型 ： 通过实时 PCR 分析 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的寡核苷酸 抑制作用
     HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义调节可以以本领域已知的多种方式分析。举例来 说， HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平可以通过例如 RNA 印迹分析、 竞争性聚合酶链式反应 (PCR) 或实时 PCR 来定量。实时定量 PCR 当前是优选。可以对总细胞 RNA 或 mRNA 进行 RNA 分析。 RNA 分离和 RNA 分析的方法例如 RNA 印迹分析是本领域常规的， 在例如 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley 和 Sons 中教导了。
     实时定量的 (PCR) 可以使用可从 Applied Biosystems 商业上获得的 Multi-Color Real Time PCR 检测系统方便地实现。
     HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平的实时定量 PCR 分析
     人 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的 样 品 含 量 使 用 人 HER3、 EGFR 和 HER2AB I Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents(Applied Biosystemscat.no.Hs00951444_ m1(HER3)、 Hs00193306_m1(EGFR) 和 Hs00170433_m1(HER2) 根据厂家的说明书来定量。甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH)mRNA 的量用作内源对照用于标准化样品制备中 的任何变化。人 GAPDH mRNA 的样品含量使用人 GAPDH ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.4310884E) 根据厂家的说明书来定量。
     实时定量 PCR 是本领域公知的技术， 在例如 Heid 等人的 Real time quantitative PCR， Genome Research(1996)， 6： 986-994 中教导了。
     实时 PCR
     将来自第一链合成的 cDNA( 如实施例 5 中描述进行的 ) 稀释 2-20 倍， 通过使用 来自 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 或 7900FAST 的实时定量 PCR 来分析。将 引物和探针与 2×Taqman Fast Universal PCR 主混合物 (master mix)(2×)(Applied Biosystems Cat.#4364103) 混合， 添加到 4μlcDNA 中至 10μl 的终体积。 一式两份分析每 种样品。测试 2 倍稀释的 cDNA 得到该测试的标准曲线， 该 cDNA 从表达感兴趣的 RNA 的细 胞株纯化的物质制备。使用无菌的 H2O 代替 cDNA 用于无模板对照。PCR 程序 ： 95℃ 30 秒， 然后进行 40 个循环， 95℃ 3 秒， 60℃ 20-30 秒。使用 Applied BiosystemsFast System SDS 软件版本 1.3.1.21. 或 SDS 软件版本 2.3 根据计算的阈值循环测定靶 mRNA 的相对数量。
     6.8. 实施例 8 ： 体外分析 ： 寡核苷酸化合物对人 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义抑 制
     评估表 4 中呈现的寡核苷酸在 1、 5 和 25nM 浓度下在 15PC3 细胞 ( 或如 * 所指示 的 Huh-7) 中下调 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的潜力 ( 参见附图 2、 3、 4 和 5)。SEQ ID NO ： 235 和 236 用作乱序 (scrambled) 对照。
     表 4 中的数据被表示为在 25nM 下相对于模拟品转染的细胞的 mRNA 下调百分比。 小写字母表示 DNA 单体， 粗体大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体。LNA 单体中的所有胞嘧 啶是 5- 甲基胞嘧啶。下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接。
    如在表 4 中所示， 在这些实验中在 15PC3 细胞中， 具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 中所示序列的寡核苷酸在 25nM 展 现了的 85％或更大的对 HER3 mRNA 表达抑制。
     同样优选的是， 基于列举的反义寡聚物序列的寡核苷酸， 例如， 改变长度 ( 更短或更长 ) 和 / 或单体含量 ( 例如， 核苷类似物单体的类型和 / 或比例 )， 其也提供了
     对 HER3 表达的良好的抑制。
     6.9. 实施例 9 ： LNA 寡核苷酸的细胞凋亡诱导
     在转染的前一天， 将 HUH7 细胞以 2.5×105 个细胞 / 孔的密度接种在 6 孔培养平板 (NUNC) 中。当 75-90％汇合时利用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。 使用的寡聚物浓度是 5nM 和 25nM( 反应孔中的终浓度 )。 寡聚 物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/ mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用 Optimem 洗涤之后， 将 300μl 的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加 3ml HUH7 培养基来灭活胰蛋白酶， 通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物 EQ ID NO ： 235 用作对照。
     在 这 之 后， 将 100μl 的 细 胞 悬 浮 液 添 加 到 来 自 Nunc 的 白 色 96 孔 平 板 (cat#136101)) 的每个孔中 ( 制备四个平板， 用于在不同时间点测量 )。 然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     半胱氨酸蛋白酶分析 ： 细胞凋亡特异性半胱氨酸蛋白酶 3 和 7 的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7- 底物分析 ( 来自 Promega 的 Cat#G8091) 来测量。要分析的平板平衡到 室温保持 15 分钟。Caspase-3/7 缓冲液与 Caspase-3/7 底物混合以形成 Caspase- 工作溶 液， 将其平衡到室温。 然后， 将 100μl 的 Caspase- 工作溶液小心地添加到 96 孔平板的每个 孔的培养基中 ( 避免气泡和孔之间的污染 )。平板小心地振摇 1 分钟， 在这之后， 将它在室 温避光孵育 1 小时。 半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent 仪器 (Thermo Labsystems) 中的每秒的相对光单元 (RLU/s) 来测量。相对于被设置为 1 的模拟品 (mock) 的平均值将 数据进行相关和绘图。参见图 6。
     6.10. 实施例 10 ： 使用 LNA 寡核苷酸对增殖的体外抑制
     如实施例 9 中所述， 转染 HUH7 细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO ： 235 充当 乱序的对照。
     在收集之后， 将 100μl 的细胞悬浮液添加到 96 孔平板 (” OrangeScientific” )的 每个孔中用于 MTS 实验 ( 制备四个平板， 用于在不同的时间点测量 )。然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     增殖的活细胞的测定 (MTS 分析 )
     对于增殖分析， 将 10μl CellTiter AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega， G3582) 添加到 96 孔平板的每个孔的培养基中， 小心地振摇平板， 并在测量 前在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 孵育 1 小时。在分光光度计中测量 490nm 处的吸光度， 减去 从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。 490nm 处的吸光度与活细胞的数量成比例， 对模拟 品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参见图 7。
     6.11. 实施例 11 ： 靶 mRNA 敲减的体内评估
     为了评估 HER3 寡聚化合物的体内敲减 (knockdown) 效力， 带有 15PC3 异种移植物 6 的雌性裸小鼠 ( 通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×10 个细胞 / 小鼠得到 )， 在多种剂量和注 射方案 ( 即， 单剂量、 每天 (qd)、 每 3 天 (q3d)、 每 4 天 (q4d)) 下用寡聚物静脉内注射。 乱序 的寡聚物 EQ ID NO ： 236 充当阴性对照。最后注射后 24 小时， 小鼠被麻醉， 将肝脏和肿瘤组 织采集在 RNAlater 溶液 (Ambion) 中。从组织纯化总 RNA， 使用 QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒 (Cat# ： 204443 ； Qiagen) 的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR) 测定 HER3 mRNA 的水平。 GAPDH mRNA 充当内部对照。
     小鼠 ErbB3 ： 探针 ： cca cac ctg gtc ata gcg gtg a(SEQ ID NO 237)， 引物 -1 ： ctg ttt agg cca agc aga gg(SEQ ID NO 238)， 引物 -2 ： att ctg aat cct gcg tcc ac。
     人 ErbB3 ： 探针 ： cat tgc cca acc tcc gcg tg， 引物 -1 ： tgc agt gga ttc gag aag tg， 引物 -2 ： ggc aaa ctt ccc atc gta ga。
     人 GAPDH ： 探针 ： act ggc gct gcc aag gct gt， 引物 -1 ： cca ccc aga aga ctg tgg at， 引物 -2 ： ttc agc tca ggg atg acc tt。
     小鼠 GAPDH ： 探针 ： agc tgt ggc gtg atg gcc gt， 引物 -1 ： aac ttt ggc att gtg gaa gg， 引物 -2 ： gga tgc agg gat gat gtt ct。通过使用包括软件的 ABI-7500PCR Fast System 进行数据分析。参见表 5。
     表 5 中的数据表示为， 在按照指定的剂量用寡核苷酸连续 5 天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中， 相对于盐水治疗的对照 HER3 mRNA 水平的％。
    6.12. 实施例 12 ： 肿瘤生长抑制的评估
     ErbB3 特异性 LNA 抑制体内肿瘤生长的能力在带有 15PC3 异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3 人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×106 个细胞 / 小鼠来 构建。 肿瘤体积将通过卡尺测量 2 个方向来测定， 并使用下式来计算 ： 肿瘤体积＝ ( 长度 × 2 3 宽度 )/2)。当肿瘤达到 70-100mm 的平均体积时， 将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以 q3d x10 的方案， 小鼠分别静脉注射 25 和 50mg/kg 的 SEQ ID NO ： 180。盐水或具有 SEQ ID NO ： 236 的乱序寡核苷酸充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过 临床观察、 临床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例 11 描述的 QPCR 测量肿 瘤 HER3 mRNA。参见附图 8A 和 8B。
     6.13. 实施例 13 ： 小鼠肝脏中 HER3 mRNA 的抑制
     连续三天以 1 或 5mg/kg 寡核苷酸对 NMRI 小鼠静脉给药 ( 每组 5 只小鼠 )。 反义寡 核苷酸 (SEQ ID NO ： 180 和 SEQ ID NO ： 234) 溶于 0.9％盐水 (NaCl) 中。 在最后的给药后 24 小时处死动物， 采样肝脏组织， 并保存在 RNA later(Ambion) 中直到 RNA 提取和 QPCR 分析。 提提取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_ m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。 取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。结果对小鼠 GAPDH(cat.no.4352339E， Applied Biosystems) 进行归一化， 相对于盐水处理的对照绘图 ( 参见附图 9)。
     6.14. 实施例 14 ： 具有聚乙二醇的寡聚物的缀合物的制备
     具有 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 所示序列的寡聚物， 通过利用常规的亚磷 酰胺化学作用将用阻断基团例如 Fmoc 阻断的氨基烷基基团例如己烷 -1- 胺连接到寡聚物 的 5’ 磷酸基团， 来在 5’ 末端功能化， 氧化产生的化合物， 将它脱保护， 纯化来得到分别具有 式 (IA) 或 (IB) 的功能化的寡聚物 ：
    其中粗体大写字母表示核苷类似物单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示硫 代磷酸酯连接基。 。
     活化的 PEG 的方案， 例如在式 (IV) 中所示的一种 ：
    
    其中 PEG 部分具有 12,000Da 的平均分子量， 且式 (IA) 或 (IB) 的每个化合物在 PBS 缓冲液中在室温下搅动 12 小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次， 合并的有机层用硫酸 镁干燥， 并过滤， 溶剂减压蒸发。将所得残余物溶于双蒸水， 并加载到阴离子交换柱上。
     未反应的 PEG 连接基 (linker) 用水洗脱， 产物用 NH4HCO3 溶液洗脱。收集含有纯 产物的级分， 冻干得到式 (IIIA) 或 (IIIB) 分别所示的缀合物 ： SEQ ID NO ： 141 和 152 ：
    
    其中 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12,000 平均分子量的 PEG 聚合物上。
     可使用本文所述方法由具有 SEQ ID NOs ： 169， 180 和 234 中所示序列的寡聚物制 得 PEG 聚合物缀合物的化学结构， 分别在式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中加以显示。
    
    其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示 Me 硫代磷酸酯连接基， 以及 C 表示 5- 甲基胞嘧啶碱基。
     在该方法中可用于分别制备式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中所示缀合物的活化寡聚物 具有式 (VA)、 (VB) 和 (VC) 所示的化学结构。
    
    
    6.15. 实施例 15 ： 使用不同的给药周期评估靶 mRNA 体内敲减 使用与上文实施例 11 中描述的类似方案， 在带有来自 15PC3 细胞或 A549 细胞(NSCLC) 或 N87 细胞 ( 胃癌 ) 的异种移植肿瘤的裸小鼠中， 体内评估寡聚物的敲减效力。寡 聚物通过每三天 2-4 剂注射给药。在最后的注射后 3 或 4 天收集组织。
     表 6 和 7 中的数据表示为相对于盐水治疗的对照， 在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后， 在肝脏和肿瘤样品中 HER3 mRNA 或 HIF-1αmRNA 水平的％。
    观察到的具有 SEQ ID NO ： 169 和 SEQ ID NO ： 180 的序列的寡聚物的敲减效果不是 对 15PC3 肿瘤细胞独特的， 因为在来自 A549(NSCLC) 和 N87( 胃癌 ) 细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见下表 7。
    6.16. 实例 16 ： 耐受吉非替尼的细胞系的产生
     HCC827 肺腺癌细胞 (ATCC CRL-2868) 在 5 ％ CO2 和 95 ％空气的增湿气氛下于 RPMI 介质中维持在 37℃， 所述介质补充有 10％胎牛血清。为了产生吉非替尼耐受性， 用逐 渐增加量的吉非替尼 ( 一直到 500nM) 处理细胞 3 个月的时段。在 3 个月时段结束时， 使 用 MTT((3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 分析相对于母系细胞和 HCC827R 吉非替尼耐受性细胞测试细胞增殖。结果显示， HCC827R 细胞耐受甚至所测最高浓 度 (10μM) 的吉非替尼。( 图 10)
     6.17. 实施例 17 ： 耐受吉非替尼的细胞系的表征
    使用 RTK 抗体分析试剂盒 (R&D Systems， Inc.， Minneapolis， MN) 描绘 HCC827 和 耐受吉非替尼的细胞即 HCC827R 中受体酪氨酸激酶 (“RTK” ) 的表达水平和磷酸化状态。 简言之， 将细胞溶解在溶菌缓冲液中并且测定细胞溶菌的总蛋白质浓度。将 500ug 中蛋白 质在孵育缓冲液中进行稀释， 用分析膜 (assay membrane) 进行孵育， 并根据制造商提供的 方案进行处理。最终图像结果 ( 图 11) 显示 HCC827R 细胞中的磷酸化 EGFR 水平比母系中 的那些低很多。
     Western blot 分析
     HCC827 和 耐 受 吉 非 替 尼 的 克 隆 体 (R2、 R3 和 R5) 在 具 有 (“+” ) 或不具有 (“-” )1μM 吉非替尼的介质中培养 24h。然后制备细胞溶菌并测定总蛋白质浓度。使约 15μg/lane 蛋白质在 8％ SDS-PAGE 凝胶中进行电泳并且使用 BioRad 液体转移设备将其转
     移到 PVDF。用合适的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体 (Transduction Labs) 和增强的化 学发光试剂 (SuperSignal， Pierce) 进行 western 分析。所使用的一级抗体 (Abs) 包括 ： 抗 -Met 单克隆 Ab(25H2)， 抗 - 磷 -Met(Y1234) 兔单克隆 Ab(D26)， 和抗 - 磷 -ErbB3(Y1289) 兔单克隆 Ab(21D3)， 来自 Cell Signaling ； 来自 Santa Crutz 的抗 -ErbB3 Ab(sc285) ； 抗 - 磷 -Met(Y1349)Ab(Ab47606R)， 抗 - 磷 -EGFR 兔单克隆 Ab(Ab40815)， 和抗 -EGFR Ab， 来 自 Abcam ； 以及用于负载对照品的缀合辣根过氧化物酶的抗 - 微管蛋白 Ab。
     数据显示， 相比于未处理 ( “-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化 EGFR 的水平， 非磷 酸化和磷酸化 EGFR 的水平在 HCC827 耐受吉非替尼的克隆体中得到显著降低， 无论是存在 (“+” ) 或存在 (“-” ) 吉非替尼。形成对照的是， 与母系细胞相比， ErbB3 或 MET( 其也涉 及 EGFR 信号发出通路 ) 的水平在耐受性克隆体中没有得到显著降低。这些发现表明， EGFR 的下调可能是一些癌细胞获得对吉非替尼的耐受性的机制所在。
     6.18. 实例 18 ： 寡聚物对耐受吉非替尼的细胞的作用
     将 HCC287 和 HCC287R 细胞以副本配制在 6- 孔板的 200 细胞 / 孔上并且孵育 24 小 时。用 1μM 的 ON180(SEQ ID NO ： 180) 处理细胞并孵育 10 天， 之后使细胞染有 MTT 并数计 菌落的数目。就 HCC827 和 HCC727R 细胞计算对照品的百分数。图 13 中所示的结果显示， 与在下调 HCC287 吉非替尼敏感细胞的生长方面相比 ( 与未处理的对照品相比细胞生长减 少约 50％ )， 寡核苷酸 ON180 在下调耐受吉非替尼的细胞方面显著更为有效 ( 与未处理的 对照品相比细胞生长减少大于 80％ )。
     结合图 14-16 来说明本发明的仍其它方面和实施方案。
     图 14 显示， 在三个人乳腺癌细胞系、 BT474、 SKBR3 和 MDA453 中， 降低 HER3 表达的 LNA 寡聚物， 虽然没有曲妥珠单抗， 但是能够防止 HER3 和 P-HER3 表达由于拉帕替尼而反馈 下调。如就仅拉帕替尼治疗的细胞 (1)， 拉帕替尼加上曲妥珠单抗治疗的细胞 (2)， 拉帕替 尼加上 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (3) 和仅 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (4) 所示。在 0， 1， 4， 24 和 48 小时显示了 HER3， P-HER3(Y1197) 和 P-HER3(Y1289) 的表达水平。拉帕替尼 以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓 度使用。
     图 15 显示， 3 个人乳腺癌细胞系的细胞凋亡协同促进大于拉帕替尼与降低 HER3 表 达的 LNA 寡聚物的组合， 后者大于拉帕替尼与曲妥珠单抗的组合。该图显示了就每个三细 胞系 ( 与图 14 中相同的系 ) 所进行的 ApoBrdU 细胞凋亡的结果。 用拉帕替尼和 / 或曲妥珠 单抗治疗细胞 48 小时。在 72 小时， 细胞呈血清饥饿并且用 SEQ ID NO ： 180 或随机化对照 寡聚物进行治疗。对于每个细胞系， 治疗是 ： 仅随机化寡核苷酸对照品 (1)， 仅 SEQ ID NO ： 180， 仅曲妥珠单抗 (3)， 仅拉帕替尼 (4)， 拉帕替尼加上 SEQ ID NO ： 180(5)， 以及拉帕替尼 加上曲妥珠单抗 (6)。拉帕替尼以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓度使用。
     图 16 显示， SEQ ID NO ： 180 抑制使用 HCC827 人细胞系的人非小细胞肺癌体内小 鼠异种移植模型中肿瘤的生长。对于用 30mg/kg SEQ ID NO ： 180(i.v)( 静脉内 ) 治疗， 在 大约 31 天时平均肿瘤体积相对于盐水对照品降低 65.5％， 对于用 45mg/kg SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗， 在大约 31 天时相对于盐水对照品降低 81.3％。N ＝ 6。
     具体实施方案， 参考文献的引用本发明不受本文所述具体实施方案的范围的限制。 实际上， 除本文描述的那些外， 在本发明的范围内的各自修饰对于本领域技术人员而言由前述描述和附图将变得明显。 此 外， 结合本发明一个实施方案所述的特征也可以与其它实施方案相结合， 即使上文没有明 确指出。
     本文引用的多个参考文献， 包括专利申请、 专利和科学文献 ； 这些文献各自的公开 内容以其全部并入本文作为参考。58102395374 A CN 102395383
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     3. 概述
     在一个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过磷酸 酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中 所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列 (best-aligned) 靶区域的反向补体至少 80％ 相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制剂和 / 或 HER2 通 路抑制剂治疗。所述耐受性可能与作为使用寡聚物降低 HER3 的表达的结果至少部分地相 反。相关的变异包括同时施用 HER3 反义寡聚物和蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 抑制 剂和 / 或 HER2 通路抑制剂从而使寡聚物和所述抑制剂的各自抑制作用在时间上重叠。以 这种方式， 本发明提供了治疗至少部分地防止对癌症的这种抑制剂的耐受性产生 ( 如果尚 未产生 ) 或至少部分地使癌症的这种抑制剂的耐受性逆转 ( 如果已产生 )。 寡聚物可以例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列。 癌症可以例如是耐受用吉非替尼治 疗的癌症。
     在一些实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由序列 5’ -TsAsGscscstsgstscsascststsMeCsTsMeC-3’ (SE Q ID NO ： 180) 构成， 其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， Me 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基， C 表示含有 5- 甲基胞嘧啶碱基的 β-D- 氧基 -LNA 单 体， 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如但不限于吉非替尼或拉帕替尼 (lapitinib) 的治疗。
     在多个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物的缀合物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体 通过磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一 区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳 动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。
     在某些实施方案中， 本发明提供了抑制哺乳动物癌细胞增殖的方法， 该方法包括 使细胞与有效量的寡聚物接触， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过 磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其 中哺乳动物癌细胞的增殖不受蛋白酪氨酸激酶抑制剂抑制。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (PTKI) 例如但不限于吉非替尼 (gefitinb) 或本文所描述的那些中的任意一种治疗哺乳动 物。所述寡聚物和 PTKI 可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 PTKI 一起在对于哺乳
     在一些实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物， 所述寡聚物由序列 5’ -TsAsGscscstsgstscsascststsMeCsTsMeC-3’ (SE Q ID NO ： 180) 构成， 其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， Me 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基， C 表示含有 5- 甲基胞嘧啶碱基的 β-D- 氧基 -LNA 单 体， 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂例如但不限于吉非替尼或拉帕替尼 (lapitinib) 的治疗。
     在多个实施方案中， 本发明提供了治疗哺乳动物癌症的方法， 该方法包括向哺乳 动物施用有效量的寡聚物的缀合物， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体 通过磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一 区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳 动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其中所述癌症耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。
     在某些实施方案中， 本发明提供了抑制哺乳动物癌细胞增殖的方法， 该方法包括 使细胞与有效量的寡聚物接触， 所述寡聚物由 10-50 个连续单体构成， 其中相邻单体通过 磷酸酯基或硫代磷酸酯基共价连接， 其中所述寡聚物包含至少 10 个连续单体的第一区域 ； 其中所述第一区域的至少一个单体是核苷类似物 ； 其中所述第一区域的序列与哺乳动物 HER3 基因或哺乳动物 HER3 mRNA 的最佳对位排列靶区域的反向补体至少 80％相同 ； 并且其 中哺乳动物癌细胞的增殖不受蛋白酪氨酸激酶抑制剂抑制。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (PTKI) 例如但不限于吉非替尼 (gefitinb) 或本文所描述的那些中的任意一种治疗哺乳动 物。所述寡聚物和 PTKI 可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 PTKI 一起在对于哺乳
     动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可 以是对用 PTKI 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以是对一种或多种 PTKI 从未产生耐受性的癌症。癌症可以例如是至少最初耐受用一种或多种 PTKI 治疗的癌 症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。当癌症没有基本上耐受用 PTKI 治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的方法中的任意一种降低 HER3 的表达而 至少部分地防止对 PTKI 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症如乳腺癌 中与 PTKI 例如但不限于吉非替尼同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一 种降低 HER3 的表达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物用于治疗哺乳动物例如人的 PTKI 耐受性癌症， 例如 PTKI 耐受性人乳腺癌患者。 本发明的其它实施方案提供了用至少一 种 PTKI 例如但不限于吉非替尼治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其中的改 进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文所描述 的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。至少一种 PTKI 可 以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最初耐受 PTKI 的癌症， 例 如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 在一些实施方案中， 在与未经治疗的相同类型细胞的增殖相比时， 哺乳动物癌细 胞的增殖被抑制至少 50％。
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 治疗哺乳动物。 所述寡聚物和 HER2 抑制剂可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂一起在对于哺乳动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或 每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可以是对用 HER2 抑制剂， 例如结合抗体或结合其 片段的 HER2 如曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或帕妥珠单抗 (pertuzumab)， 或者 HER2 通路抑 制剂例如拉帕替尼 (lapatinib) 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以 是对 HER2 抑制剂从未产生耐受性的癌症。 癌症可以例如是至少最初耐受 HER2 抑制或 HER2 通路抑制的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 当癌症没有基 本上耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的 方法中的任意一种降低 HER3 的表达而至少部分地防止对 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症中与至少 一种 HER2 抑制剂同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一种降低 HER3 的表 达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物在哺乳动物例如人类， 例如对用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂的治疗变得有耐受性或不太有反应的具有乳腺癌的人类之间用于治疗对 用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂， 例如但不限于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗， 或 HER2 通路 抑制剂例如拉帕替尼的治疗变得有耐受性或不太有反应的癌症。 本发明的其它实施方案提 供了用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其 中的改进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文
     本发明的还另一个实施方案提供了通过以下治疗哺乳动物癌症的方法 ： 施用下调 HER3 的表达的反义寡聚物， 并同时或相结合地用至少一种 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 治疗哺乳动物。 所述寡聚物和 HER2 抑制剂可以或不可以共同给药 ； 重要的是寡聚物和 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂一起在对于哺乳动物患者同时治疗有效量方面具有活性和 / 或 每个的各自抑制作用在时间上重叠。癌症可以是对用 HER2 抑制剂， 例如结合抗体或结合其 片段的 HER2 如曲妥珠单抗 (trastuzumab) 或帕妥珠单抗 (pertuzumab)， 或者 HER2 通路抑 制剂例如拉帕替尼 (lapatinib) 治疗已变得有耐受性或不太有反应的那些， 或者它们可以 是对 HER2 抑制剂从未产生耐受性的癌症。 癌症可以例如是至少最初耐受 HER2 抑制或 HER2 通路抑制的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中的任意一种。 当癌症没有基 本上耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗时， 一个实施方案提供了通过以所描述的 方法中的任意一种降低 HER3 的表达而至少部分地防止对 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂 的耐受性 ( 或其它耐受性 )。
     相关的实施方案提供了至少一种下调 ( 降低 )HER3 的表达的反义寡聚物的用途， 所述反义寡聚物如本文所述用于制备在治疗哺乳动物癌症， 例如人类患者的癌症中与至少 一种 HER2 抑制剂同时或结合使用的药物。另一个实施方案提供了至少一种降低 HER3 的表 达的寡聚物在药物制备中的用途， 所述药物在哺乳动物例如人类， 例如对用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂的治疗变得有耐受性或不太有反应的具有乳腺癌的人类之间用于治疗对 用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂， 例如但不限于曲妥珠单抗或帕妥珠单抗， 或 HER2 通路 抑制剂例如拉帕替尼的治疗变得有耐受性或不太有反应的癌症。 本发明的其它实施方案提 供了用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗哺乳动物例如人类患者的癌症的改进方法， 其 中的改进包括例如通过向哺乳动物施用至少一种下调 HER3 的表达的反义寡聚物例如本文
     所描述的那些， 同时抑制哺乳动物 ( 例如哺乳动物的癌细胞 ) 的 HER3 的表达。HER2 抑制剂 或 HER2 通路抑制剂可以例如是本文所描述的那些中的任意一种。癌症可以例如是至少最 初对 HER2 或 HER2 通路的抑制有响应的癌症， 例如乳腺癌， 或者可以是本文所描述的癌症中 的任意一种。
     对于上述实施方案及其变化形式中的任意一种， 一种或多种降低 HER3 的表达的 反义寡聚物可以例如是在每个 5’ 和 3’ 端具有末端 LNA 单体， 例如在每个端部的 1、 2、 3或 4 接邻 LNA 单体的缺口聚物， 其连接 DNA 单体的中心部分。至少一些， 例如所有的单体间连 接基可以是硫代磷酸酯连接基。
     本发明的另外的特征、 优点和实施方案可以给出或考虑到下面的详述、 附图和权 利要求显而易见。此外， 应当理解的是前述发明概述和下面的详述是示例性的并且意欲提 供进一步解释而并不如所要求的限制本发明的范围。
     4. 附图简述
     图1： 分别由具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 序列的寡聚物所靶向的 HER3 靶序列 以粗体和下划线显示， 表明它们在 HER3 转录产物中的位置 (GenBank 登记号 NM 001982-SEQ ID NO ： 197)。
     图2： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图3： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 EGFR mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图4： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER-2 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 169-179。
     图5： 在转染后 24 小时， 在 15PC3 中的 HER3 mRNA 的表达， SEQ ID NO ： 180-194。
     图6： 数据显示了细胞凋亡， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH7 细 胞中， 在不同的时间点的活化的 Caspase 3/7( 半胱氨酸蛋白酶 3/7) 而测定。结果相对于 用具有 SEQ ID NO ： 235 的乱序对照的寡核苷酸治疗的细胞模拟 (cells mock) 而绘出。
     图7： 数据显示了活细胞， 其通过在用 5 和 25nM 浓度的寡核苷酸转染的 HUH-7 细 胞中， 在不同的时间点使用 MTS 实验测定 OD490 值而测定。SEQ ID NO ： 235 是乱序对照的 寡核苷酸。
     图 8A ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中肿瘤体积的改变百分比。盐水处理的小鼠用作对 照。
     图 8B ： 数据显示了以 25 和 50mg/kg q3dx10 用 SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗的雌 性裸小鼠上移植的 15PC3 异种移植肿瘤中的 HER 3mRNA 表达。结果相对于 GAPDH 进行归一 化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图9： 数据显示了在连续三天用 1 或 5mg/kg 具有 SEQ ID NO ： 180 或 SEQ ID NO ： 234 中所示序列的寡核苷酸静脉注射治疗之后小鼠肝脏中的 HER 3mRNA 的表达。结果相对 于 GAPDH 进行归一化， 以盐水治疗对照的％表示。
     图 10 ： 数据显示了耐受高达 10μm 浓度的吉非替尼的 HCC827 人肺腺癌细胞的产 生。
     图 11 ： 数据显示了磷酸化 EFGR 的水平在耐受吉非替尼的 HCC827 细胞中比在对母 系 HCC827 吉非替尼敏感的细胞中低得多。图 12 ： 数据显示了与在未经治疗的 (“-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平相比， 在存在 (“+” ) 或缺乏 (“-” ) 吉非替尼时， 非磷酸化和磷酸化的 EGFR 的水平 在 HCC827 吉非替尼耐受性克隆体中显著降低。相反地， 还涉及 EGFR 信号通路的 ErbB3 或 MET 的水平相比于母细胞在耐受性克隆体中没有显著降低。
     图 13 ： 数据显示了用 1μm 具有 SEQ ID NO ： 180 的寡核苷酸治疗 10 天时间段对抑 制耐受吉非替尼的 HCC827 细胞的生长具有较大的影响 ( 与未治疗的对照相比在生长方面 降低大于 80％ ) 与对吉非替尼敏感的 HCC827 细胞相比。
     图 14 ： 数据显示了降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物， 但不是曲妥珠单抗， 能够在 三种人类癌细胞系中通过拉帕替尼防止 HER3 和对 HER3 表达的反馈上调。
     图 15 ： 数据显示了拉帕替尼和降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物的组合与拉帕替 尼和曲妥珠单抗的组合相比， 三种人类癌细胞系中凋亡的协同促进作用更大。
     图 16 ： 数据显示了反义 HER3 抑制剂 SEQ ID NO ： 180 抑制了人体非小细胞肺癌的 小鼠体内异种移植模型中的肿瘤生长。
     5. 详述
     在某些实施方案中， 本发明提供了调节细胞中 HER3( 和 / 或 EGFR 和 / 或 HER2) 的 表达的方法， 所述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。 在一些实施方案中， 耐受性细胞 是癌细胞。在多个实施方案中， 提供了通过施用在胞内条件下特异地与核酸编码杂交的寡 核苷酸 ( 寡聚物 )， 来治疗或防止与 HER3 过表达有关的疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的癌症的方法。在一些实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3 的表达。在其它实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 的表达。 术语 “HER3” 与术语 “ErbB3” 在本文中互换使用。
     5.1. 方法
     在多个实施方案中， 本发明包括在细胞中抑制 HER3 的表达和 / 或活性的方法， 所 述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括使 所述细胞与有效量的寡聚化合物 ( 或其缀合物 ) 接触以在细胞中实现 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 表达和 / 或活性的抑制 ( 例如下调 )。在某些实施方案中， 抑制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 )mRNA 的表达。 在其它实施方案中， 抑 制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 蛋白质的表达。在多个实施方案中， 所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。
     在某些实施方案中， 在体外发生所述接触。 在其它实施方案中， 通过向哺乳动物施 用本文所描述的组合物而在体内实现所述接触。在多个实施方案中， 本发明提供了在细胞 中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及 HER2 蛋白质和 / 或 mRNA 的 表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列显示为 SEQ ID NO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明 提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及在细胞中 EGFR 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它 实施方案中， 本发明提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或 蛋白的表达的方法。
     如本文中所互换使用的， 术语 “蛋白酪氨酸激酶抑制剂” “PTK 抑制剂” 和 “酪氨酸激
     酶抑制剂” 是指结合并抑制一个或多个酪氨酸激酶区的活性的分子。蛋白酪氨酸激酶抑制 剂不是如下文所描述靶向 HER3 的寡聚物。在一些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是单 克隆抗体。在其它实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是具有小于 1000Da， 例如 300-700Da 的分子量的小分子。
     在某些实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一个或多个 EGFR 家族成员的酪氨酸激酶。 在多个实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一种或多种蛋白质的酪氨酸激酶， 所述蛋白质与一 个或多个 EGFR 家族成员相互作用或受一个或多个 EGFR 家族成员调节， 所述 EGFR 家族成员 是例如涉及一个或多个由一个或多个 EGFR 家族成员发出的信号级联的蛋白质。在一些实 施方案中， 酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶， 即是具有细胞外配体结合区域且通过结合一个 或多个配体而活化的较大蛋白质的细胞内区域。在某些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶是非 受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶在一个或多个信号通路中调节其它蛋白质的活性， 其通过使 它们磷酸化来进行调节。
     如本文所使用的， 耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞是指在与蛋白酪氨酸 激酶抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。如本文所使用的， 在与 PTK 抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 PTK 抑制剂治疗， 与相同类型的没有与 PTK 抑制 剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性细胞是内在地耐受用 PTK 抑制剂治疗的 那些。在一些实施方案中， 耐受性细胞是从先前暴露于 PTK 抑制剂而获得耐受性的细胞， 所述暴露是作为单药疗法或者作为与一种或多种另外的药物例如化疗药物或反义寡核苷 酸组合治疗的一部分。类似地， 如本文所使用的， 耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治 疗的细胞通常是指在与这些抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。 如本 文所使用的， 在与所述抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑 制剂治疗， 与相同类型的没有与所述抑制剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相 比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性 细胞是内在地耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗的那些。在一些实施方案中， 耐 受性细胞是从先前暴露于 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂获得耐受性的细胞。
     在一些实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非 TM 替 尼 (ZD-1839， Iressa )， 伊 马 替 尼 (Gleevec )， 埃 罗 替 尼 (OSI-1774， Tarceva )， 卡 纽替尼 (canertinib)(CI-1033)， 凡德他尼 (vandetanib)(ZD6474， Zactima )， 酪氨酸磷 酸化抑制剂 (tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)， 拉帕替尼 (GW-572016)， 索拉非尼 (sorafenib)(BAY43-9006)， AG-494(CAS 133550-35-3)， RG-13022(CAS 149286-90-8)， RG-14620(CAS 136831-49-7)， BIBW 2992(Tovok)，酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 9(CAS 136831-49-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 23(CAS 118409-57-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 25(CAS 118409-58-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 46(CAS 122520-85-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 47(CAS 122520-86-9)， 酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 53(CAS 122520-90-5)， 紫 铆 因 (butein)(1-(2， 4- 二羟基苯基 )-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 丙烯 -1- 酮， 2’ ， 3， 4， 4’ - 四羟基查耳酮 ； CAS 487-52-5)， 姜黄色素 ((E， E)-1， 7- 双 (4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 )-1， 6- 庚二烯 -3， 5- 二酮 ； CAS 458-37-7)， N4-(1- 苄基 -1H- 吲唑 -5- 基 )-N6， N6- 二甲基 - 吡啶 -[3， 4-d]- 嘧啶 -4， 6- 二胺 (202272-68-2)， AG-1478， AG-879， 环丙烷羧酸 -(3-(6-(3- 三氟甲基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 )- 苯基 )- 酰胺 (CAS 879127-07-8)， N8-(3- 氯 -4- 氟苯基 )-N2-(1- 甲基哌 啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， 2HCl(CAS 196612-93-8)， 4-(4- 苄氧基苯氨 基 )-6， 7- 二甲氧基喹唑啉 (CAS 179248-61-4)， N-(4-((3- 氯 -4- 氟苯基 ) 氨基 ) 吡啶并 [3， 4-d] 嘧啶 -6- 基 )2- 丁炔酰胺 (CAS 881001-19-0)， EKB-569， HKI-272 和 HKI-357。
     在多个实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非替 尼， 伊马替尼， 埃罗替尼， 拉帕替尼， 卡纽替尼和索拉非尼。在一个变化形式中， 细胞在暴露 于吉非替尼后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 细胞在暴露于 HER2 抑制剂例如 HER2 结合和抑制的抗体或结 合和抑制的抗体片段后获得耐受性。在一个变化形式中， 细胞在暴露于曲妥珠单抗和 / 或 帕妥珠单抗后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗患者疾病的方法， 其中所述疾病耐受用 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括向所需患者施用包含有效量的至 少一种寡聚物或其缀合物， 和药物可接受的赋形剂的药物组合物。如本文所使用的， 术语 “进行治疗” 和 “治疗” 是指现有疾病 ( 例如， 下文涉及的疾病或病症 ) 的治疗， 或防止疾病， 即预防。 在某些实施方案中， 本发明的方法用于抑制耐受 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 和 / 或 HER2 通路抑制剂的细胞的增殖。在多个实施方案中， 与未经治疗的细胞样本相比， 抗增殖 作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在其它实施方案中， 与用小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞样本相比， 抗增殖作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至 少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。在一些 实施方案中， 所述癌细胞选自乳腺癌细胞、 前列腺癌细胞、 肺癌细胞和上皮癌细胞。
     因此， 本发明的方法用于治疗过度增殖疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂 治疗和 / 或耐受用 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗的癌症。 在一些实施方案中， 耐受治疗的癌 症选自淋巴瘤及白血病 ( 例如非霍奇金淋巴瘤、 霍奇金淋巴瘤、 急性白血病、 急性淋巴细胞 白血病、 急性髓细胞性白血病、 慢性粒细胞白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 多发性骨髓瘤 )， 结肠癌， 直肠癌， 上皮癌， 胰腺癌， 乳腺癌癌， 卵巢癌， 肾细胞癌， 前列腺癌， 肝癌， 胆管细胞 癌， 绒毛膜癌， 宫颈癌， 睾丸癌， 肺癌， 膀胱癌， 黑色素瘤， 头颈部肿瘤， 脑肿瘤， 不明原发部位 癌症， 肿瘤， 癌症周围神经系统， 中枢神经系统， 纤维肉瘤， 粘液肉瘤， 脂肪肉瘤， 软骨肉瘤， 骨肉瘤， 脊索瘤， 血管肉瘤， 内皮肉瘤， 淋巴管肉瘤， 淋巴管内皮肉瘤， 滑膜瘤， 间皮瘤， 尤因 氏瘤， 平滑肌肉瘤， 横纹肌肉瘤， 鳞状细胞癌， 癌基底细胞癌， 腺癌， 汗腺癌， 皮脂腺癌， 乳头 状癌， 乳头状例腺癌， 囊腺癌， 髓质癌， 支气管癌， 精原细胞瘤， 胚胎癌， 肾母细胞瘤， 小细胞 肺癌， 上皮细胞癌， 神经胶质瘤， 星形细胞瘤， 髓母细胞瘤， 颅咽管瘤， 室管膜瘤， 松果体瘤， 血管母细胞瘤， 听神经瘤， 少突， 脑膜瘤， 神经母细胞瘤， 和视网膜母细胞瘤， 重链病， 转移， 或以不受控制的或异常的细胞生长为特征的任何疾病或病症。
     在某些实施方案中， 耐受性癌症选自肺癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 结肠癌， 上 皮癌， 胃癌。
     在某些其它实施方案中， 肺癌是非小细胞肺癌。本发明的一个这种实施方案提供
     了用于治疗非小细胞肺癌的方法， 该方法包括向哺乳动物例如需要治疗所述癌症的人类患 者施用治疗有效量的至少一种反义寡聚物或其缀合物， 所述反义寡聚物或其缀合物降低 HER3 以及任选地 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂中的一种或多种的表达。 在一个变化形式 中， 至少一种寡聚物或其缀合物包括或是 SEQ ID NO ： 180 或其缀合物。
     在某些实施方案中， 本发明还提供了用于药物制造的本文所描述的化合物或缀合 物的用途， 所述药物用于本文提及的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑 制剂耐受性的病症的治疗， 或者还提供了治疗本文称作病症的方法。
     在多个实施方案中， 根据本发明的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑制剂耐受性病症的治疗可以与一种或多种其它抗癌治疗， 例如放射治疗、 化学治疗 或免疫治疗组合。
     在某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 基因 ( 和 / 或 HER2 基因和 / 或 EGFR 基因 )、 或其蛋白质产物与 HER3 相关或与相互作用的基因的突变相关。在一些实施方 案中， 突变基因由于酪氨酸激酶区域中的突变而对蛋白质进行编码。 在多个实施方案中， 酪 氨酸激酶区域中的突变是在小分子 PTK 抑制剂的结合位置和 / 或 ATP 结合位置中。因此， 在多种实施方式中， 靶 mRNA 是 HER3( 和 / 或 HER2 和 / 或 EGFR) 序列的突变的形式 ； 例如， 它包含一个或多个单点突变， 例如与癌症相关的 SNPs。
     在某些实施方案中 PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的突变形式的异常水平相关。 在 某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的野生型形式的异常水平相关。本发明的 一方面涉及治疗患有或易遭受与 HER3 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 该方法包括 向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡 聚物包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗患有或易遭受与 HER2 的突变形式的异常水 平， 或 HER2 的野生型形式的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋 白酪氨酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选 地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物 包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在仍其它实施方案中， 本发明治疗患有或易遭受与突变 EGFR 的异常水平， 或野生 型 EGFR 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗， 该方法包括向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中 的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物包含一个或多个下 文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本文所描述的本发明包括防止或治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法包括向需要这种治疗的人施用治疗有效量的 HER3 调节 寡聚物 ( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物。
     在多种实施方案中， 该寡聚物或其缀合物， 通过例如氢键合至靶核酸， 在人体内引 起所需的治疗效果。该寡聚物通过氢键合 ( 例如杂交 ) 至靶的 mRNA 导致基因表达减少， 引 起靶的表达减少 ( 例如抑制 )。
     高度优选是， 本发明的化合物能够通过 Watson-Crick 碱基配对与靶核酸例如 HER3 mRNA 杂交。5.2. 寡聚物
     在第一方面， 提供了寡聚化合物 ( 本文称作寡聚物 )， 其例如用于调节编码哺乳动 物 HER3 的核酸分子， 例如 SEQ ID NO ： 197 中所示的 HER3 核酸、 以及编码哺乳动物 HER3 的 这种核酸分子的天然存在的等位基因变体的功能。所述寡聚物由共价连接的单体组成。
     术语 “单体” 包括在核酸中天然存在且不含有改性的糖类或改性的核碱基的核苷 和脱氧核苷二者 ( 统称为 “核苷” )， 所述即改性的糖类或改性的核碱基是其中核糖或脱氧 核糖共价键合至自然存在的、 未改性的核碱基 ( 碱基 ) 部分 ( 即嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤、 鸟 嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶或脲嘧啶 ) 的化合物和 “核苷类似物” ， 所述核苷类似物是在核酸中 天然存在的或不在核酸中天然存在的核苷， 其中糖部分是除核糖或脱氧核糖外 ( 例如二环 糖类或 2’ 改性的糖类如 2’ 取代的糖类 )， 或碱基部分是改性的 ( 例如， 5- 甲基胞嘧啶 )， 或 这二者。
     “RNA 单体” 是含有核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “DNA 单体” 是含有脱氧核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “锁核酸单体” “锁单体” 或 “LNA 单体” 是具有如下文进一步描述的二环糖的核苷 类似物。
     术语 “相应的核苷类似物” 和 “相应的核苷” 表示核苷类似物中的碱基部分和核苷 中的碱基部分相同。例如， 当 “核苷” 含有连接至腺嘌呤的 2- 脱氧核糖时， “相应的核苷类 似物” 含有例如连接至腺嘌呤碱基部分的改性的糖。
     术语 “寡聚物” 、 “寡聚化合物” 和 “寡核苷酸” 在本文所描述的方法的上下文中互换 使用， 并且是指通过例如磷酸酯基团 ( 在核苷之间形成磷酸二酯连接基 ) 或硫代磷酸酯基 ( 在核苷之间形成硫代磷酸酯连接基 )， 由两个或更多个连续单体的共价连接形成的分子。 所述寡聚物由 10-50 单体， 例如 10-30 单体组成或包含 10-50 单体， 例如 10-30 单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含本文提及的核苷或核苷类似物， 或它们的混合物。 “LNA 寡聚物” 或 “LNA 寡核苷酸” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡核苷酸。
     任选包括在寡聚物内的核苷类似物可以起到类似于相应核苷的作用， 或可以具有 特异的改进功能。 其中一些或全部单体是核苷类似物的寡聚物相对于天然形式常常是优选 的， 因为这样的寡聚物具有一些期望的性质， 例如， 穿透细胞膜的能力、 对细胞外和 / 或细 胞内核酸酶的良好耐受性， 以及对核酸靶的高亲和力和特异性。 例如， 为了赋予若干上述性 能， LNA 单体的特别优选的。
     在多个实施方案中， 存在于寡聚物内的一种或多种核苷类似物在功能上是 “沉默” 或 “等价” 于相应的天然核苷， 即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影 响。这样的 “等价” 核苷类似物可以仍然是有用的， 如果例如， 它们更容易或更便宜地制造， 或在保存或制备条件下更为稳定， 或者可纳入标签或标记。然而， 典型地， 所述类似物将对 寡聚物抑制表达的作用方式具有功能性影响 ； 例如， 通过产生对靶核酸的靶区域的提高的 亲和力， 和 / 或对细胞内核酸酶的提高的耐受性， 和 / 或更方便地转运到细胞中。
     因此， 在多个实施方案中， 用于本发明方法的寡聚物包含核苷单体和至少一个核 苷类似物单体， 例如 LNA 单体或其它核苷类似物单体。
     术语 “至少一个 ( 一种 )” 包含大于或等于 1 的整数， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 等等。在多个实施方案中， 例如当涉及本发明的化合物的核酸或蛋白质靶时， 术语 “至少一个 ( 一种 )” 包括术语 “至少两个 ( 种 )” 和 “至少三 个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。同样， 在一些实施方案中， 术语 “至少两个 ( 种 )” 包含术 语 “至少三个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-50 个连续单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个连续单体组成。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-25 个单体， 优选 10-16 个单体， 和更优选 12-16 个单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-25 个连续单体， 10-24 个 连续单体， 12-25 或 12-24 或 10-22 个连续单体， 例如 12-18 个连续单体， 例如 13-17 或 12-16 个连续单体， 例如 13、 14、 15、 16 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-22 个连续单体， 或 10-18， 例如 12-18 或 13-17 或 12-16， 例如 13、 14、 15 或 16 个连续单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体或由 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体组成。在其它实施方案中， 寡聚物包含 14-18 或 14-16 个连 续单体或由 14-18 或 14-16 个连续单体组成。 在多个实施方案中， 寡聚物包含 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体或由 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物由不超过 22 个连续单体， 例如不超过 20 个连续单体， 例如不超过 18 个连续单体， 例如 15、 16 或 17 个连续单体组成。在某些实施方案中， 寡聚物 包含小于 20 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物不包含 RNA 单体。
     优选地， 用于本文所述方法的寡聚物是线性分子或在合成时呈线性。在这样的实 施方案中， 寡聚物是单链的分子， 典型地不包含与相同寡聚物内的另一区域互补的例如至 少 3、 4 或 5 个连续单体的短区， 使得所述寡聚物形成内双螺旋。在多个实施方案中， 所述寡 聚物基本上不是双链的， 即不是 siRNA。
     在一些实施方案中， 寡聚物由连续伸长的单体组成， 其序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定 ( 参见例如表 1-4)。在其它实施方案中， 寡聚物包含第一区域 ( 该区域由 连续伸长的单体组成 )， 和一个或多个另外的区域 ( 其由至少一个另外的单体组成 )。在一 些实施方案中， 第一区域的序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定。
     5.3. 缺口聚物 (gapmer) 设计
     典型地， 用于本发明方法的寡聚物是缺口聚物。
     “缺口聚物” 是包含连续伸长的单体的寡聚物， 所述单体能够募集如下文进一步描 述的 RNAse( 例如 RNAseH)， 例如至少 6 或 7 个 DNA 单体的区域 ( 本文中称作 B 区 )， 其中 B 区的 5’ 和 3’ 的侧翼分别称作 A 区和 C 区， A 区和 C 区各自包含以下或由以下组成 ： 核苷类 似物， 例如增强亲和力的核苷类似物， 如 1-6 个核苷类似物。
     通 常， 所 述 缺 口 聚 物 包 含 以 下 的 5’至 3’的 区 域 ： A-B-C， 或 任 选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ： A 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体 ； B 区由以下组成或包含以下 ： 至少 5 个能够募集 RNAse( 当 与靶 RNA 分子的互补靶区域， 如 mRNA 靶形成双螺旋时 ) 的连续单体， 例如 DNA 单体 ； C 区由
     以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体， 和； D 区， 当存在时由以下组成或包含以下 ： 1， 2 或 3 个单体， 例如 DNA 单体。
     在多种实施方案中， A 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单 体； 和 / 或 C 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类 似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单体。
     在某些实施方案中， B 区由以下组成或包含以下 ： 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 12 个能募 集 RNAse 的连续单体， 或 6-10， 或 7-9， 如 8 个能募集 RNAse 的连续单体。在某些实施方案 中， B 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个 DNA 单体， 如 1-12 个 DNA 单体， 优选 4-12 个 DNA 单体， 更优选 6-10 个 DNA 单体， 如 7-10 个 DNA 单体， 最优选 8， 9 或 10 个 DNA 单体。
     在某些实施方案中， A 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， B 区由 7， 8， 9 或 10 个 DNA 单体组成， 且 C 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成。这些设 计 包 括 (A-B-C)3-10-3， 3-10-4， 4-10-3， 3-9-3， 3-9-4， 4-9-3， 3-8-3， 3-8-4， 4-8-3， 3-7-3， 3-7-4， 4-7-3， 且可以进一步包括 D 区， 其可具有 1 个或 2 个单体， 如 DNA 单体。
     其它缺口聚物设计公开于 WO 2004/046160， 在此将其并入本文作为参考。 美国临时申请 60/977,409( 将其并入本文作为参考 ) 涉及 “短聚物 (shortmer)” 缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中， 此处给出的寡聚物可以是这类短聚物缺口聚物。
     在某些实施方案中， 该寡聚物由 10， 11， 12， 13 或 14 个连续单体组成， 其中寡聚物 区具有形式 (5’ -3’ )， A-B-C， 或任选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ； A 区由 1， 2 或 3 个核苷类 似物单体 ( 如 LNA 单体 ) 组成 ； B 区由 7， 8 或 9 个连续单体组成， 当与互补 RNA 分子 ( 如 mRNA 靶 ) 形成双螺旋时， 所述连续单体能够募集 RNAse ； 且 C 区由 1， 2 或 3 个核苷类似物单 体 ( 如 LNA 单体 ) 组成。当存在时， D 区由单一 DNA 单体组成。
     在某些实施方案中， A 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 7 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B区 由 8 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 9 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含 1-9 个 DNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7 或 8 个 DNA 单体。在某些实施方案中， B 区由 DNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L 构型的 LNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8 或 9 个 α-L- 构型的 LNA 单体。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L- 氧基 LNA 单 体。在某些实施方案中， B 区中所有 α-L- 构型的 LNA 单体是 α-L- 氧基 LNA 单体。在某些 实施方案中， 寡聚物的 A-B-C 区中存在的单体数选自 ( 核苷类似物单体 -B 区 - 核苷类似物 单 体 )： 1-8-1， 1-8-2， 2-8-1， 2-8-2， 3-8-3， 2-8-3， 3-8-2， 4-8-1， 4-8-2， 1-8-4， 2-8-4，或 ； 1-9-1， 1-9-2， 2-9-1， 2-9-2， 2-9-3， 3-9-2， 1-9-3， 3-9-1， 4-9-1， 1-9-4， 或； 1-10-1， 1-10-2， 2-10-1， 2-10-2， 1-10-3 和 3-10-1。在某些实施方案中， 本文所述寡聚物的 A-B-C 区中存在 的单体数选自 ： 2-7-1， 1-7-2， 2-7-2， 3-7-3， 2-7-3， 3-7-2， 3-7-4 和 4-7-3。 在某些实施方案 中， A 区和 C 区各自都由两个 LNA 单体组成， 且 B 区由 8 或 9 个核苷酸单体， 优选 DNA 单体 组成。
     在多个实施方案中， 其它缺口聚物设计包括以下那些 ： 其中 A 区和 / 或 C 区由 3， 4，
     5 或 6 个核苷类似物组成， 如含有 2’ -O- 甲氧基乙基 -RNA(2’ MOE) 的单体或含有 2’ - 氟 -DNA 的单体的核苷类似物， 且 B 区由 8， 9， 10， 11 或 12 个核苷， 如 DNA 单体组成， 其中 A-B-C 区具 有 5-10-5 和 4-12-4 个单体。其它缺口聚物设计公开于 WO 2007/146511A2 中， 在此将其并 入本文作为参考。
     5.4. 连接基
     本文所述寡聚物的单体通过连接基联结在一起。合适地， 各单体通过连接基连接 至 3’ 邻近的单体。
     术语 “连接基” 或 “核苷间连接 (internucleotide linkage)” 是指能够将两个连 续单体共价联结在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸基 ( 在邻近的核苷单体之间形 成磷酸二酯 ) 和硫代磷酸酯基 ( 在邻近的核苷单体之间硫代磷酸酯连接基 )。
     合适的连接基包括列于 WO 2007/031091 的那些， 例如列于 WO2007/031091 的第 34 页第一段的连接基 ( 在此将其并入本文作为参考 )。
     也就是说， 在多种实施方案中， 优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸 酶攻击更有耐受性的基团， 如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 这两个可被 RNase H 裂解， 也允许靶基因表达的 RNAse 调变反义抑制。
     在一些优选实施方案中， 优选本文所提供的合适含硫 (S) 连接基。在多个实施方 案中， 硫代磷酸酯连接基是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口 (gap) 区 (B)。在某些实施方 案中， 硫代磷酸酯连接用于将侧翼区 (A 和 C) 中的单体连接在一起。在多个实施方案中， 硫 代磷酸酯连接用于将 A 或 C 区连接至 D 区， 并且用于将 D 区内的单体连接在一起。
     在多个实施方案中， A、 B 和 C 区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基， 如磷酸二酯 连接， 特别地， 例如当使用核苷类似物防止 A 和 C 区内的连接基进行内切核酸酶降解 - 如当 A 和 C 区包含 LNA 单体时。
     在多个实施方案中， 邻近的寡聚物单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。
     应认识到将磷酸二酯连接， 如一个或两个连接， 与硫代磷酸酯一起纳入寡聚物， 特 别是与介于核苷类似物单体之间或相邻于核苷类似物单元 ( 典型地在 A 区和 / 或 C 区 ) 的 硫代磷酸酯一起， 可修饰寡聚物的生物利用度和 / 或生物分布 - 参见 WO 2008/053314， 在此 将其并入本文作为参考。
     在一些实施方案中， 如上述实施方案， 其中适当且非特异表明， 所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯， 或它们的混合物。
     在一些实施方案中， 所有核苷间连接基是硫代磷酸酯。
     当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列， 例如本文提供的那些， 应理解在多种实施 方案中， 当该连接为硫代磷酸酯连接时， 可以使用如那些本文公开的其它连接， 例如可使用 磷酸酯 ( 磷酸二酯 ) 连接， 特别是用于核苷类似物， 如 LNA 单体之间的连接。
     5.5. 靶核酸
     术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 在本文中可互换使用， 并且定义为通过两个或更多个 如上所述单体的共价连接形成的分子。包括 2 个或更多个单体， “核酸” 可以具有任意长度， 并且该术语一般是指 “寡聚物” ， 其具有本文所述的长度。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 包括 单链、 双链断裂、 部分双链断裂， 和环状的分子。
     在多个实施方案中， 本文使用的术语 “靶核酸” 是指编码哺乳动物 HER3 多肽的核 酸 ( 如 DNA 或 RNA)， 所 述 HER3 多 肽 例 如 是 具 有 SEQ ID NO 197 中 的 序 列 的 人 HER3 mRNA， 或者具有以下序列的哺乳动物 mRNAs ： GenBank 编号 NM_001005915， NM_001982 与交 替 剪 接 形 式 NP_001973.2 和 NP_001005915.1( 人 ) ； NM_017218( 大 鼠 ) ； NM_010153( 小 鼠)； NM_001103105( 牛 ) ； 或具有 GenBank 编号的 XM_001491896( 马 )、 XM_001169469 和 XM_509131( 黑猩猩 ) 的预测 mRNA 序列。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动物 HER2 多肽的核酸 ( 例如， 具 有以下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_001005862 和 NM_004448( 人 ) ； NM_017003 和 NM_017218( 大鼠 ) ； NM_001003817( 小鼠 ) ； NM_001003217( 狗 ) ； 和 NM_001048163( 猫 ))。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动 EGFR 多肽的核酸 ( 例如， 具有以 下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_201284， NM_201283， NM_201282 和 NM_005228( 人 ) ； NM_007912 和 NM_207655( 小鼠 ) ； NM_031507( 大鼠 ) ； 和 NM_214007( 猪 ))。
     应认识到上述公开的 GenBank 编号是指 cDNA 序列而非 mRNA 序列本身。成熟 mRNA 的序列可以直接源自相应的 cDNA 序列， 胸腺嘧啶碱基 (T) 被尿嘧啶碱基 (U) 替代。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码核酸或其天然存 在的变体， 以及由其衍生的 RNA 核酸， 优选 mRNA， 例如 pre-mRNA， 尽管优选成熟 mRNA。在多 种实施方式中， 例如， 当在研究或诊断中使用时， 所述 “靶核酸” 源自上述 DNA 或 RNA 靶核酸 的 cDNA 或合成的寡核苷酸。本文所述的寡聚物通常能够与靶核酸杂交。
     术语 “其天然存在的变体” 是指 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 多肽或核酸序列的变体， 其 在规定的分类群， 例如哺乳动物， 例如小鼠、 猴和优选人中天然地存在。 一般地， 当涉及多核 苷酸的 “天然存在的变体” 时， 该术语还可涵盖 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码基因组 DNA( 在 染色体 Chr 12 ： 54.76-54.78Mb 处通过染色体转位或复制存在的 )， 以及 RNA( 例如， 由此衍 生的 mRNA) 的任何等位变体。当提及具体多肽序列时， 例如， 该术语还包括天然存在形式的 蛋白质， 因此其可被加工， 例如， 通过其翻译时或翻译后修饰， 例如信号肽裂解、 蛋白酶裂解 (proteolytic cleavage)、 糖基化等等。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 通 过 Watson-Crick 碱 基 配 对、 Hoogsteen 氢 键 或 反 向 的 Hoogsteen 氢键， 在寡聚物的单体和靶核酸的单体之间， 本文所描述的寡聚物结合至靶核酸 的区域 (“靶区域” )。这样的结合也称作 “杂交” 。除非另外指明， 连接是通过互补碱基的 Watson-Crick 配对 ( 即腺嘌呤与胸腺嘧啶 (DNA) 或尿嘧啶 (RNA)， 和鸟嘌呤与胞嘧啶 )， 并 且寡聚物结合至靶区域， 这是因为该寡聚物的序列等同于， 或部分等同于靶区域的反向补 体的序列 ； 就本文而言， 寡聚物被认为是与靶区域 “互补” 或 “部分互补” ， 并且寡聚物序列相 对于靶区域序列的 “互补性” 百分数是相对于靶区域序列的反向补体的 “特性” 百分数。
     除非本文另外明确澄清， 本文的 “靶区域” 将是具有如下序列的靶核酸区域， 所述 序列是使用对位排列程序和下文所描述的参数， 与特定寡聚物的序列的反向补体 ( 或其区 域 ) 最佳对位排列。
     在确定用于本文所述方法的寡聚物 ( 或其区域 ) 和编码哺乳动物 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如本文公开的那些 ) 的靶区域之间的 “互补性” 程度中， “互补性” (也 是 “同源性” ) 的程度表示为寡聚物 ( 或其区域 ) 的序列和与其最佳对位排列的靶区域序列 的反向补体之间的相同性百分数。通过计算与 2 个序列之间相同的对位排列碱基的数目， 除以寡聚物中连续单体的总数， 并乘以 100 来计算百分数。在这样的比较中， 如果存在缺口(gap)， 优选是这些缺口仅仅是错配而不是一些下述区域， 其中缺口内单体数量在寡聚物和 靶区域之间不同。
     氨基酸和多核苷酸排列、 序列相同性百分数和互补度就本发明而言可以使用标准 设置的 ClustalW 算法确定 ： 参见 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html， 方 法： EMBOSS:: 水 ( 局部 ) ： 缺口产生 (Gap Open) ＝ 10.0， 缺口延伸 (Gap extend) ＝ 0.5， 使 用 Blosum 62( 蛋白质 )， 或用于核苷酸 / 核碱基序列的 DNAfull。
     如应理解的是， 取决于上下文， “错配” 是指序列的不相同性 ( 如， 例如在寡聚物的 核碱基序列和结合至它的靶区域的反向补体之间 ； 如， 例如在两个对位排列的编码核酸的 HER3 的碱基序列之间 )， 或是指序列的不互补性 ( 如， 例如， 在寡聚物和结合至它的靶区域 之间 )。
     合适地， 寡聚物 ( 或缀合物， 如以下进一步描述 ) 能够抑制 ( 例如通过下调 ) HER3( 或 HER2 或 EGFR) 基因的表达。
     在多个实施方式中， 与正常的表达水平相比， 本文所述寡聚物产生至少 10 ％， 至 少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 表达抑制作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的抑制。在多个实施方式中， 与正常的表达 水平相比， 所述寡聚物产生至少 10％， 至少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 蛋白质表达抑制 作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％ 的抑制。在一些实施方案中， 当使用 1nM 所述寡聚物或缀合物用于本发明的方法时可看到 这种抑制。在多个实施方案中， 当使用 25nM 所述寡聚物或缀合物时可看到这种抑制。
     在多个实施方案中， mRNA 表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如 低于 98％的抑制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。 在多 个实施方案中， 蛋白质表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如低于 98％的抑 制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。
     或者， 表达水平的调节可以通过测量 mRNA 的水平， 例如通过 RNA 印迹或定量 RT-PCR 来确定。当通过 mRNA 水平测量时， 在使用合适的剂量， 1 和 25nM 浓度时， 在多种实 施方式中， 抑制的水平一般达到不存在所述化合物的情况下正常水平的 10-20％的水平。
     表达水平的调节 ( 即抑制或提高 ) 还可以通过测量蛋白水平来确定， 例如， 通过例 如 SDS-PAGE 随后使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白质印迹的方法。
     在一些实施方案中， 本发明提供了抑制 ( 例如下调 ) 一个或多个交替剪接的同 种型 HER3 mRNA 和 / 或由其衍生的蛋白质的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 本发明 提供了抑制一个或多个交替剪接的蛋白质同种型 HER3(GenBank 编号 No.NP_001973.2 和 NP_001005915.1) 的表达和 / 或编码 HER3 蛋白质同种型 (GenBank 编号 No.NM_001982 和 NM_001005915.1) 的核酸的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 的 mRNA 是靶核酸。在其它实施方案中， 编码 HER3 同种型 2 的 mRNA 是靶核酸。在某些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 和 HER3 同种型 2 的核酸都是靶核酸， 例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列 的寡聚物。
     在多个实施方案中， 寡聚物或其第一区域具有与 HER3 核酸中靶区域的序列互补 的碱基序列， 该寡聚物下调 HER3 mRNA 和 / 或 HER3 蛋白质表达并且下调一个或多个其它 ErbB 受体酪氨酸激酶家族成员， 例如 HER2 和 / 或 EGFR 的 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。有效地结合至二个不同的 ErbB 受体家族核酸的靶区域 ( 例如 HER2 和 HER3 mRNA) 且下调两个 靶的 mRNA 和 / 或蛋白质表达的寡聚物或其第一区域被称为 “双特异性的” 。结合至三个不 同的 ErbB 受体家族成员的靶区域且能够有效地下调所有三个基因的寡聚物或其第一区域 被称为 “三特异性的” 。 在多个实施方案中， 反义寡核苷酸可以呈多特异性， 即能够结合至受 体酪氨酸激酶的 ErbB 家族的多个成员的靶核酸的靶区域且下调它们的表达。如本文所使 用的， 术语 “双特异性” 和 “三特异性” 不以任何方式理解为是限制性的。举例来说， “双特 异性寡聚物” 可能对第三靶核酸具有某些效果， 而 “三特异性寡聚物” 可能对它的 3 个靶核 酸之一具有非常弱的因而不明显的效果。
     在多个实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 核酸中的靶 区域和 HER2 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 和 HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在某些实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 HER2 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达下调至相同程度。 在其它优选实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能 够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域和 EGFR 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在多个实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。在仍其它实 施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域， 和结合至 受体酪氨酸激酶靶核酸的两个其它 ErbB 家族中的靶区域并且有效地下调受体酪氨酸激酶 的 ErbB 家族的两个其它成员的 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个优选的实施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达， HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达， 以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个实施方案中， 三特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质， HER2 mRNA 和 / 或蛋白 质以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。
     在多个实施方案中， 本发明因此提供了抑制 ( 例如通过下调 ) 癌细胞中 HER3 蛋白 质和 / 或 mRNA 的表达的方法， 所述癌细胞表达 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 且耐受用蛋白酪氨 酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括使所述细胞与本文所述有效抑制 ( 例如下调 ) 所述细胞中 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的量的寡聚物或缀合物接触。合适地， 所述细胞是哺乳动 物细胞， 例如人细胞。在某些实施方式中， 可以在体外进行给药。在其它实施方案中， 可以 通过将本文所述的化合物或缀合物给药到哺乳动物， 在体外实施接触。 在多个实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 HER2 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列 显示为 SEQIDNO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 EGFR 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或蛋白的表达的方法。
     本文所述的寡聚物通常结合至人 HER3 和 / 或人 HER2 和 / 或人 EGFR mRNA 的靶 区域， 且因此， 包含以下或由以下组成 ： 具有与例如 SEQ ID NO 197、 SEQ ID NO ： 198 和 / 或 SEQ ID NO ： 199 的碱基序列互补或部分互补的碱基序列的区域。在某些实施方案中， 当与 SEQ ID NO ： 197、 198 或 199 的最佳对准靶区域的序列相比时， 本文所述寡聚物的序列可以任选包含 1、 2、 3、 4 或更多个碱基错配。
     在一些实施方案中， 本文所述的寡聚物具有与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相同的序列 ( 参见下文表 1)。在其它实施方案中， 当与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相比时， 所述寡聚物具有 1、 2 或 3 个碱基不同的序列。 在一些实施方案中， 所述寡聚物由 10-16 个连续单体组成或包含 10-16 个连续单体。由 16 个连续单体构成的寡聚物的序列的实例为 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140。较短序列可由其 衍生， 例如， 较短寡聚物的序列可以等同地存在于选自具有 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的碱基序列的那些的寡聚物的区域中。 较长寡聚物可以包括具有至少 10 个连续单 体的序列的区域， 所述连续单体等同地存在于 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 中。
     还提供了含有靶区域的靶核酸 ( 例如编码 HER3 的 DNA 或 mRNA)， 所述靶区域与 SEQ ID NO ： 1-140 的寡聚物中的一种或多种互补或部分 - 互补， 其中所述寡聚物能够抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质或 mRNA 的表达。例如， 在图 1 中显示了人 HER3 mRNA 的与具 有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的反义寡聚物互补的靶区域 ( 粗体和下划线的， 具有上 文所述的相应的寡聚物 SEQ ID NO)。
     在多个实施方案中， 寡聚物具有 SEQ ID NO ： 141-168 中所示的碱基序列。 在某些实 施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如， 具有 SEQ ID NO ： 169-196 和 234 的序列的那些， 特别 是具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 的碱基序列的那些。在多个实施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 172、 174、 175、 176 和 179 的碱基序列的那些。在一些实施方案中， 寡聚物或其区域由 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的碱基序列组成或包含 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所 示的碱基序列。在一些实施方案中， 缀合物包括具有 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的 碱基序列的寡聚物。
     在某些实施方案中， 本文所述寡聚物可以合适地包含具有特定序列， 例如选自 SEQ ID NO ： 200-227， 即等同地存在于较短寡聚物中的序列的区域。 优选地， 所述区域包含 10-16 个单体。例如， 具有 SEQ ID NO ： 200-227 的碱基序列的寡聚物各自包含如下区域， 其中所 述区域的序列分别等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的较短寡聚物中。 在一些实施方案中， 具有比 16 个更少的单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 或 15 个单体的寡聚 物， 具有至少 8、 至少 9、 至少 10、 至少 11、 至少 12、 至少 13、 至少 14 或 15 个区域， 所述序列 的连续单体的等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 的序列的寡聚物中。因此， 在 多个实施方案中， 较短寡聚物的序列源于较长寡聚物的序列。 在一些实施方案中， 具有本文 公开的 SEQ ID NO 的寡聚物的序列， 或其至少 10 个连续单体的序列， 都等同地存在于较长 寡聚物中。通常， 寡聚物包含具有等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的序列的第 一区域， 如果与等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的第一区域相比， 所述寡聚物更长， 则所述寡聚物的侧翼区具有与在靶核酸的靶区域的侧翼的序列互补的序列。两种这 样的寡聚物是 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 54。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含或由这样的单体序列构成， 所述单体序列与编码 哺乳动物 HER3 的靶核酸的靶区域完全互补 ( 完美互补 )。
     然而， 在一些实施方案中， 寡聚物的序列在与 HER3 靶核酸的最佳对位排列靶区域 相比时包括 1、 2、 3 或 4 个 ( 或更多个 ) 错配， 并且仍充分地结合到靶区域以实现 HER3 mRNA 或蛋白质表达的抑制。错配对 Watson-Crick 氢键结合双螺旋的失稳效应可以例如通过增 加寡聚物的程度和 / 或增加寡聚物内存在的核苷类似物 ( 例如 LNA 单体 ) 的数目得到弥补。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物碱基序列包含相对于 ( 例如编码哺乳动物 HER3 的 靶核酸的 ) 最佳对位排列靶区域碱基序列不超过 3 个， 例如不超过 2 个的错配。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列至少 80％相同， 例如至少 85％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％相 同， 甚至 100％相同。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与 SEQ ID NO ： 197、 198 和 / 或 199 中存在的靶区域的序列至少 80 ％互补， 例如至少 85 ％、 至少 90 ％、 至 少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％互补， 甚至 100％互补。 在多个实施方案中， 寡聚物的序列 ( 或其第一区域 ) 选自 SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或者选自 SEQ ID NOs ： 200-227， 1-140 和 228-233 的至少 10 个连续单体。 在其它实施方案中， 寡聚物的序列或其第一区域任选包含 1、 2 或 3 个碱基部分， 当与所述选 定序列或其区域最佳对位排列时， 该碱基部分不同于具有如下序列的寡聚物中的那些 ： SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或其至少 10 个连续单体的序列。
     在某些实施方案中， 单体区域由以下构成 ： 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 或 29 个连续单体， 例如 10-15， 12-25， 12-22， 例如 12-18 个单体。 合适地， 在多个实施方案中， 所述区域与寡聚物具有相同的长度。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 或 3’ 端包含另外的单体， 例如， 独立地， 1， 2， 3， 4 或 5 个另外的寡聚物单体 5’ 末端和 / 或 3’ 末端， 其与靶区域的序列呈非互补性。在多个实 施方案中， 寡聚物包含与所述靶互补的区域， 该区域通过另外的单体在 5’ 和 / 或 3’ 侧翼。 在多种实施方式中， 所述区域的 3’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单元。3’ DNA 单体常 常在寡聚物的固态合成期间使用。 在多种实施方式中， 其可以是相同的或不同的， 所述寡聚 物的 5’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单体。在某些实施方式中， 附加的 5’ 或 3’ 单体 是天然存在的核苷， 例如 DNA 或 RNA 单体。在多种实施方式中， 5’ 或 3’ 单体可以代表如本 文缺口聚物寡聚物的上下文中所涉及的 D 区。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 200 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 201 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据
     SEQ ID NO ： 202 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 203 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 204 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 205 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 206 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 207 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 208 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 209 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 210 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 211 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 212 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 213 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 214 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 215 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 216 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 217 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 218 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 219 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 220 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 221 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 222 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 223 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 224 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 225 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 226 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 227 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     序列比对 ( 例如上述那些 ) 也可以用于鉴定编码来自人和一个或多个不同哺乳动 物物种如猴、 小鼠和 / 或大鼠的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的区域， 其中该区域在所述 物种两者或多者之间具有足够长度的核酸一致度 (identity)， 以允许设计同时靶向 ( 即， 其与足够的特异性结合以抑制 ) 人 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 靶核酸和不同哺乳动物物种中 存在的相应核酸的寡核苷酸。
     在一些实施方案中， 这样的寡聚物由由以下区域组成或包含以下区域 ： 至少 10 个、 例如至少 12 个、 例如至少 14 个、 例如至少 16 个、 例如至少 18 个， 例如 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17 或 18 个连续单体， 所述连续单体与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的靶区域序列 100％序列互 补。
     在一些实施方式中， 用于本发明方法的寡聚物包含连续连续单体区域或由连续单 体区域组成， 所述连续单体区域的序列与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如编码 HER3 的小鼠 核酸 ) 的靶区域序列至少 80％、 例如至少 85％、 例如至少 90％、 例如至少 95％、 例如至少 98％、 例如至少 99％、 或 100％互补。优选是， 所述寡聚物的连续核碱基序列与人 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 的靶区域 100％互补。
     在一些实施方案中， 本文描述的寡聚物结合到 HER3 靶核酸的靶区域并且下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在多个实施方案中， 结合到 HER3 核酸靶区域的本文所述 寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169-196 和 234 中所示的序列。
     在一些实施方案中， 本文描述的双特异寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶 区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 HER2 核酸的靶区域， 所述寡聚物下调 HER3 和 HER2 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同程度下调 HER3 和 HER2 的表达。在一些 实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同的。 在多个实施方案中， 寡聚物的第一区 域和第二区域重叠。在某些实施方案中， 与 HER3 核酸的靶区域和 HER2 核酸的靶区域结合 的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 177 和 178 中所示的序列。在仍其它实施方案中， 双 特异寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域， 并且下调 HER3 和 EGFR 的表 达。在一些实施方案中， 结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 171 和 173 中所示的序列。在一些实施方案中， 本文所述双特异寡聚 物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同 程度下调 HER3 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同 的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域重叠。在还其它实施方案中， 本文述 的三特异性寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域， 结合到 HER2 核酸的靶区域， 结合到 EGFR 核 酸的靶区域， 并且下调所有三个基因的表达。 在一些实施方案中， 结合到 HER3、 HER2 和 EGFR 的三特异性寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169、 170、 172、 174-176 和 179 中所示的序列。在 一些实施方案中， 三特异性寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物 的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物的第三区域结合到 HER2 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 三特异性寡聚 物以不同程度下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和 第三区域是相同的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和第三区域重叠。在多个实施 方案中， 双特异或三特异性寡聚物在与例如靶核酸的最佳对位排列靶区域相比时具有 1、 2、 3、 4、 5 或更多个错配， 所述靶核酸具有例如 SEQ ID NO ： 197， 198 和 / 或 199 中所示的序列。
     5.6. 核苷和核苷类似物
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个单体是包含修饰碱基的核苷类 似物， 所述碱基例如选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿 嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤、 2- 氯 -6- 氨基嘌呤、 黄嘌呤和次黄嘌呤。
     在多个实施方案中， 寡聚物中存在的单体中的至少一个是含有修饰糖的核苷类似 物。
     在一些实施方案中， 寡聚物的至少 2 个连续单体之间的连接基是除磷酸二酯连接 基外。
     在某些实施方案中， 寡聚物包括至少一个具有修饰碱基的单体， 至少一个具有修 饰糖的单体 ( 它们可以是相同的单体 ) 和至少一个非天然产生的单体内连接基。
     用于本文所述寡聚物核苷类似物的具体实例由例如 Freier & Altmann ； Nucl。 Acid Res.， 1997， 25， 4429-4443 和 Uhlmann ； Curr。Opinion in Drug Development， 2000， 3(2)， 293-213 中以及方案 1( 其中一些核苷类似物以核苷进行显示 ) 中所描述 ：
    方案 1
     因此寡聚物可以包含或由以下构成 ： 单序列的核苷 - 优选 DNA 单体， 但是还可能是 RNA 单体， 或者核苷和一种或多种核苷类似物的组合。在一些实施方案中， 这样的核苷类似 物合宜地提高寡聚物对靶核酸的靶区域的亲和性。
     适合的和优选核苷酸类似物的实例在 WO2007/031091 中描述， 因而在此引用作为 参考， 或参考其中的内容。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖部分， 该糖部分经修饰以提供 2’ - 取代基， 例如 2’ -O- 烷基 - 核糖、 2’ - 氨基 - 脱氧核糖和 2’ - 氟 - 脱氧核糖。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖， 在该糖中存在产生双环糖 (LNA) 的桥接 结构， 其提高结合亲和性并且还可以提供一些提高的核酸酶耐受性。在多个实施方案中， LNA 单体选自氧 -LNA( 例如 β-D- 氧基 -LNA， 和 α-L- 氧基 -LNA)， 和 / 或氨基 -LNA( 例如 β-D- 氨基 -LNA 和 α-L- 氨基 -LNA) 和 / 或硫基 -LNA( 例如 β-D- 硫基 -LNA 和 α-L- 硫 基 -LNA) 和 / 或 ENA( 例如 β-D-ENA 和 α-L-ENA)。在某些实施方式中， 所述 LNA 单体是
     β-D- 氧基 -LNA。下面进一步描述了 LNA 单体。
     在多个实施方案中， 在寡聚物中纳入增强亲和性的核苷类似物， 例如 LNA 单体或 含 2’ - 取代糖的单体， 或者纳入修饰的连接基， 提供了提高的核酸酶耐受性。在多个实施方 案中， 纳入这样的增强亲和性的核苷类似物允许降低寡聚物的大小， 并且在发生非特异性 或异常结合之前还降低上限至寡聚物的大小。
     在某些实施方式中， 所述寡聚物包含至少 2 个核苷酸类似物。在一些实施方式中， 所述寡聚物包含 3-8 个核苷酸类似物， 例如 6 个或 7 个核苷酸类似物。在优选实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物是锁核酸 (LNA) 单体 ； 例如， 至少 3 或至少 4、 或至少 5、 或至少 6、 或至少 7、 或 8 个核苷酸类似物是 LNA 单体。在一些实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。
     可认识到， 当提及优选的寡聚物碱基序列时， 在某些实施方案中所述寡聚物包含 相应的核苷类似物， 例如相应的 LNA 单体或其它相应的核苷类似物， 这提高了寡聚物 / 靶区 域双螺旋 ( 即增强亲和性的核苷类似物 ) 的双螺旋稳定性 (Tm)。
     在多个优选实施方案中， 寡聚物的碱基序列和靶区域的碱基序列之间的任何错配 ( 即， 非互补性 )， 如果存在， 位于除含增强亲和性的核苷类似物的寡聚物区域 ( 例如区域 A 或 C) 外的区域， 例如在本文提及的区域 B 中， 和 / 或在本文提及的区域 D 中， 和 / 或在 5’ 或 3’ 连接到与靶区域互补的寡聚物区域的区域中。 在一些实施方案中， 寡聚物内 ( 例如在本文提及的区域 A 和 C 中 ) 存在的核苷 类似物独立地选自例如 ： 含 2’ -O- 烷基 - 核糖的单体， 含 2’ - 氨基 - 脱氧核糖的单体， 含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的单体， LNA 单体， 含树胶醛醣的单体 (“ANA 单体” )， 含 2’ - 氟 - 树胶醛 醣的单体， 含 d- 阿拉伯糖基 - 己糖醇糖的单体 ( “HNA 单体” )， Christensen， Nucl。Acids. Res.30 ： 4918-4925(2002) 中定义的插层 (intercalating) 单体 ( 将其并入本文作为参 考 )， 和含 2’ MOE 糖的单体。在某些实施方案中， 寡聚物或其区域中仅存在一种上述类型的 核苷类似物。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 核 苷 类 似 物 含 有 2’ -O- 甲 氧 基 乙 基 - 核 糖 (2’ MOE)， 或 2’ - 氟 - 脱氧核糖或 LNA 糖， 因此本发明的寡核苷酸 (oligonucleotide) 可以包含独立地 选自这三种类型的核苷类似物。在某些含核苷类似物的寡聚物实施方式中， 至少一个所述 核苷类似物含有 2’ -MOE- 核糖， 例如含 2’ -MOE- 核糖的 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 或 10 核苷类似 物。在某些实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物含有 2’ - 氟 - 脱氧核糖， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的苷酸类似物。
     在多种实施方式中， 本文所述寡聚物包含至少一个锁核酸 (LNA) 单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8 个 LNA 单体， 例如 3-7 个或 4-8 个 LNA 单体， 或 3、 4、 5、 6 或 7 个 LNA 单体。在 多种实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物同时包 含 β-D- 氧基 -LNA 单体以及一种或多种以下的 LNA 单体元 ： β-D 或 α-L 构型的硫基 -LNA 单体、 氨基 -LNA 单体、 氧基 -LNA 和 / 或 ENA 或其组合。在某些实施方案中， 寡聚物中所有 LNA 单体的胞嘧啶碱基部分是 5- 甲基胞嘧啶。在本发明的某些实施方式中， 寡聚物同时包 含 LNA 和 DNA 单体。典型地， LNA 和 DNA 单体的组合的总数是 10-25 个， 优选 10-20 个， 再 更优选 12-16 个。在本发明的某些实施方案中， 寡聚物或其区域包括至少一个 LNA 单体， 其 余单体是 DAN 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物仅包含 LNA 单体和核苷 ( 例如 RNA 或
     DNA 单体， 最优选 DNA 单体 )， 任选与改性连接基例如例如硫代磷酸酯连接。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个核苷类似物具有修饰的碱基， 其选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤和 2- 氯 -6- 氨基嘌呤。
     5.7.LNA
     术语 “LNA” 是指含二环糖 (“LNA 糖” ) 的核苷酸类似物。术语 “LNA 寡核苷酸” 和 “LNA 寡聚物” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡聚物。
     本 发 明 的 寡 核 苷 酸 化 合 物 中 使 用 的 LNA 优 选 具 有 通 式 I 的 结 构， 及其碱盐 (basicsalts) 和酸加成盐。
    其中 X 选自 -O-、 -S-、 -N(RN*)-、 -C(R6R6*)- ；
     B 选自氢、 任选取代的 C1-4- 烷氧基、 任选取代的 C1-4- 烷基、 任选取代的 C1-4- 酰基氧 基、 核碱基、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基 (report group) 和 配体 ；
     P 表示与在后的单体之间的核苷酸间连接 (internucleotide linkage) 的基团位 置， 或 5’ - 末端基团， 该核苷酸间连接或 5’ - 末端基团任选包括取代基 R5 或等同适用取代 基 R5* ；
     P* 表示与在前的单体的核苷酸间连接， 或 3’ - 末端基团 ； 4* 2*
     R 和 R 一 起 表 示 由 1-4 个 选 自 下 列 的 基 团 / 原 子 组 成 的 二 价 基 团 (biradical) ： -C(RaRb)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-、 -C(Ra) ＝ N-、 -O-、 -Si(Ra)2-、 -S-、 -SO2-、 -N(Ra)和＞ C ＝ Z，
     其中 Z 选自 -O-、 -S- 和 -N(Ra)-， 且 Ra 和 Rb 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷 基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰 基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰 基氧基、 磺基 (sulphono)、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体， 其中芳基 a b 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的 (geminal) 取代基 R 和 R 一起可表示任选取代 的亚甲基 ( ＝ CH2)， 以及存在的取代基 R1*、 R2、 R3、 R5、 R5*、 R6 和 R6* 各自独立地选自氢、 任选取 代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷 氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧
     基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷 基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲 基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体、 其中芳基 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、 硫代、 亚氨基或任选取 代的亚甲基， 或一起可形成由 1-5 个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团， 所述亚烷基链 任选插入一个或多个杂原子 / 基团和 / 或被一个或多个杂原子 / 基团终止， 所述杂原子 / N N 基团选自 -O-、 -S- 和 -(NR )-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基， 且其中两个相邻的 ( 非成对的 ) N* 取代基可表示另一键， 导致形成双键 ； 且R ， 当存在且不涉及二价基团时， 选自氢和 C1-4- 烷 基； 以及它们的碱性盐和酸加成盐。
     在多种实施方案中， R5* 选自 H， -CH3， -CH2-CH3， -CH2-O-CH3 和 -CH ＝ CH2。 4* 2*
     在多种实施方案中， R 和 R 一起表示二价基团， 其选自 -C(RaRb)-O-、 -C(RaRb)-C(R c d R )-O-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、 -C(RaRb) -C(RcRd)-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-、 -C(RaRb)-C (RcRd)-N(Re)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-O- 和 -C(RaRb)-S-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-， 其中 Ra、 Rb、 Rc、 Rd、 Re 和 Rf 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔 基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷 基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂 芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨 基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫 基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 a b 信息基和配体， 其中芳基和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基 R 和 R 一起可 表示任选取代的亚甲基 ( ＝ CH2)，
     在其它实施方案中， R4* 和 R2* 一起表示二价基团， 其选自 -CH2-O-、 -CH2-S-、 -CH2-NH -、 -CH2-N(CH3)-、 -CH2-CH2-O-、 -CH2-CH(CH3)-、 -CH2-CH2-S-、 -CH2-CH2-NH-、 -CH2-CH2-CH2-、 -CH2-C H2-CH2-O-、 -CH2-CH2-CH(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH2-O-CH2-O-、 -CH2-NH-O-、 -CH2-N(CH3)-O-、 -CH2-O-CH2-、 -CH(CH3)-O-、 -CH(CH2-O-CH3)-O-。
     对于所有手性中心， 不对称的基团可为 R 或 S 取向。
     优选地， 本发明的寡聚物中使用的 LNA 包括至少一个根据任一下式的 LNA 单元
    其中 Y 为 -O-、 -O-CH2-、 -S-、 -NH- 或 N(RH) ； Z 和 Z* 独立地选自核苷酸间连接基、 末端基团或保护基 ； B 构成天然或非天然核酸的未修饰碱基部分或修饰碱基部分， 以及 RH选自氢和 C1-4- 烷基。
     特别优选的 LNA 单元示于方案 2 ：
    术语″硫基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 选自 S 或 -CH2-S- 的 LNA 单体。硫 基 -LNA 可为 β-D 和 α-L- 构型。
     术 语 ″ 氨 基 -LNA ″ 是 指 其 中 上 述 通 式 中 的 Y 选 自 -N(H)-、 N(R)-、 CH2-N(H)- 和 -CH2-N(R)-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基的 LNA 单体。氨基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″氧基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 表示 -O- 或 -CH2-O- 的 LNA 单体。氨 基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″ ENA″是指其中上述通式中的 Y 为 -CH2-O-( 其中 -CH2-O- 的氧原子连接至 相对碱基 B 的 2’ - 位 ) 的 LNA 单体。
     在优选实施方案中， LNA 单体选自 β-D- 氧基 -LNA 单体， α-L- 氧基 -LNA 单体， β-D- 氨基 -LNA 单体， β-D- 硫基 -LNA 单体， 特别是 β-D- 氧基 -LNA 单体。
     在本文中， 术语″ C1-4- 烷基″是指直链或支链的饱和烃链， 其中该链具有 1 至 4 个碳原子， 如甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基。
     5.8.RNAse H 募集
     在一些实施方案中， 寡聚物通过靶 mRNA 的非 RNase 调变降解发挥作用， 例如通过 翻译的空间阻碍或者其它机制 ； 然而， 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物能够募集核糖核
     酸内切酶 (RNase)， 例如 RNase H。
     典型地， 寡聚物包含至少 6 个， 例如至少 7 个连续单体， 例如至少 8 或至少 9 个连续 单体的区域， 包括 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15 或 16 个连续单体的区域， 其在与靶 RNA 的靶 区域形成双螺旋时能够募集 RNase。能募集 RNAse 的寡聚物区域可为本文所述的缺口聚物 (gapmer) 涉及的 B 区。在某些实施方案中， 能募集 RNAse 的寡聚物区域 ( 如 B 区 ) 由 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19 或 20 个单体构成。
     EP 1222309 提 供 了 体 外 测 定 RNaseH 活 性 的 方 法， 其可用于测定寡聚物募集 RNaseH 的能力。使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当与 RNA 靶的互补靶区 域接触时， 具有的初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为至少 1％， 如至少 5％， 如至少 10％或 少于 20％寡核苷酸具有相同的碱基序列， 但是仅含有 DNA 单体， 没有 2’ 取代， 且在寡核苷酸 中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H， 将所述文献并入 作为参考。
     在多种实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 少于使用寡核苷 酸所测定的初始速率的 1％， 如少于 5％， 如少于 10％或少于 20％， 所述寡核苷酸具有相同 的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷 酸酯连接基， 则认为该寡聚物基本不能募集 RNase H。
     在其它实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为使用寡核苷酸 所测定的初始速率的至少 20％， 如至少 40％， 如至少 60％， 如至少 80％， 所述寡核苷酸具有 相同的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫 代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H。
     典型地， 与靶 RNA 的互补靶区域形成双螺旋并且能够募集 RNase 的寡聚物区域， 含有 DNA 单体和 LNA 单体并且与所述靶区域形成类似双螺旋的 DNA/RNA。LNA 单体优选为 α-L 构型， 特别优选为 -L- 氧基 LNA。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含核苷和核苷类似物二者， 并且为如上所定义的缺 口聚物 (gapmer)、 头聚物 (headmer) 或混合聚物 (mixmer) 的形式。
     “头聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部 (5’ -most) 单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物， 第二区域包含 RNAse 可识别和断开的连续伸长的 ( 例如至少 7 个连 续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体。
     “尾聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含 RNAse 可识别和断开的连续 伸长的 ( 例如至少 7 个连续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体， 第二区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物。
     其它 “嵌合” 寡聚物， 称为 “混合聚物” ， 其由下述交替组分构成 ： i) 可由 RNAse 识 别和裂解的 DNA 单体或核苷酸类似物单体， 和 ii) 非 - 募集 RNase 的核苷酸类似物单体。
     在一些实施方案中， 除提高寡聚物对靶区域的亲和性外， 一些核苷类似物也调变 RNase( 例如， RNase H) 结合和断裂。因为 α-L-LNA 单体募集 RNase 活性至一定程度， 在一些实施方案中， 含 α-L-LNA 单体的寡聚物的缺口区域 ( 例如， 在下文也称作区域 B) 由较少 RNase 可识别和断裂的单体构成， 并且在混合聚物的结构中引入更大灵活性。
     5.9. 缀合物
     在本发明的上下文中， 如本文中所示， 术语 “缀合物” 是指通过将寡聚物共价连接 ( 缀合 ) 到一个或多个本身不为核酸或单体的部分 (“缀合部分” ) 的化合物。这样的缀合 部分的实例包括大分子化合物如蛋白质、 脂肪酸链、 糖残基、 糖蛋白、 聚合物或其组合。 典型 的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。WO2007/031091 提供了合适的部 分和缀合物， 其在此引入作为参考。
     因此， 本文提供了包含本文所述寡聚物和至少一个缀合部分的缀合物， 所述缀合 部分不是核酸或单体， 并且共价连接到所述寡聚物。因此， 在某些实施方案中， 如本文中所 公开， 在寡聚物由具有规定碱基序列的连续单体构成时， 缀合物还可以包含至少一个共价 连接到所述寡聚物的缀合部分。
     在某些实施方案中， 寡聚物缀合到可提高寡聚化合物的细胞吸收的部分。
     在多个实施方案中个， 缀合物可增强本文所述寡聚物的活性、 细胞分布或细胞 吸收。这些部分包括， 但不限于， 抗体、 多肽、 脂质部分如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己 基 -s- 三苯甲基硫醇、 硫胆固醇 (thiocholesterol)、 脂肪链， 例如， 十二烷二醇或十一烷基 残基、 磷脂， 例如， 二 - 十六烷基 -rac- 甘油或 1， 2- 二 -o- 十六烷基 -rac- 甘油 -3-h- 膦酸 三乙基铵、 聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 十八烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 氧 基胆固醇部分。 在某些实施方案中， 寡聚物缀合至活性药物， 例如， 阿司匹林， 布洛芬， 磺胺药物， 抗糖尿药， 抗菌药或抗生素。
     在某些实施方案中， 该缀合的部分为固醇， 如胆固醇。
     在多种实施方案中， 该缀合的部分包含或由以下组成 ： 带正电荷的聚合物， 如带 正电荷的肽， 例如长度为 1-50， 如 2-20 如 3-10 个氨基酸残基， 和 / 或聚环氧烷如聚乙二 醇 (PEG) 或聚丙二醇 - 参见 WO 2008/034123， 在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚 合物， 如聚环氧烷可通过连接基连接至寡聚物， 如描述于 WO 2008/034123 的可释放的连接 基。
     5.10. 活化的寡聚物
     本文所用的术语 “活化的寡聚物” ， 是指本文所述共价连接 ( 即， 官能化 ) 至至少 一个官能部分 (functional moiety) 的本发明的寡聚物， 该官能部分允许寡聚物共价连 接至一个或多个缀合的部分 ( 即本身不为核酸或单体的部分 )， 以形成本文描述的缀合 物。典型地， 官能部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团 ： 例如， 3’ -羟 在一些实施方案中是亲水性间隔基 (spacer) 和能结合至 基或腺嘌呤碱基的环外 NH2 基， 缀合的部分的末端基团 ( 例如， 氨基、 巯基或羟基 )。在一些实施方案中， 末端基团未被 保护， 例如， 为 NH2 基团。在其它实施方案中， 末端基团被保护， 例如， 被任何合适的保护 基， 如描述于 Theodora WGreene 和 Peter G M Wuts， 第三版 (John Wiley&Sons， 1999) 的 “ProtectiveGroups in Organic Synthesis” 的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括 酯如乙酸酯， 芳烷基如苄基， 二苯基甲基， 或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基 的实例包括苄基， α- 甲基苄基， 二苯基甲基， 三苯基甲基， 苄基氧基羰基， 叔丁氧基羰基和
     酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
     在一些实施方案中， 该官能部分是自裂解的 (self-cleaving)。在其它实施方案 中， 该官能部分为生物可降解的。 参见例如， 美国专利号 7,087,229， 其以其整体在此引入作 为参考。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 端官能化以使缀合的部分共价连接至寡聚物的 5’ 端。在其它实施方案中， 寡聚物可在 3’ 端官能化。在其它实施方案中， 寡聚物可沿着主 链或在杂环碱基部分上官能化。 在其它实施方案中， 寡聚物可在多于一个位置官能化， 所述 位置独立地选自 5’ 端、 3’ 端、 主链和碱基。
     在一些实施方案中， 本文所述的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个 共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中， 活化的寡聚物使用未被官能化的 单体合成， 且该寡聚物在合成完成后立即官能化。
     在一些实施方案中， 该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化， 其中该烷 基部分具有式 (CH2)w， 其中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直 链或支链的， 且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 连接至寡聚物。
     在其它实施方案中， 该寡聚物使用含 (CH2)w- 巯基 (SH) 连接基的位阻酯官能化， 其 中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的， 且其中该官 能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wSH) 连接至寡聚物。在一些实施方案中， 巯基 - 活化的寡核 苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 ( 通过二硫键的形成 )。
     可通过本领域已知的任何方法合成与至少一个功能部分连接的活化寡聚物， 所 述方法特别是公开于美国专利公开 No.2004/0235773( 将其全文并入本文作为参考 ) 以 及 Zhao 等 (2007)J.Controlled Release 119 ： 143-152 ； 和 Zhao 等 (2005)Bioconjugate Chem.16 ： 758-766 中的方法。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物通过使用官能化试剂向寡聚物引入巯基、 氨基或羟基而官能化， 该官能化试剂基本上描述于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210， 即， 为基本上链状的试剂， 其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite) 通过亲水性间隔基 链连接至相对的端， 该相对的端包含保护的或未保护的巯基、 氨基或羟基。 这些试剂主要与 寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的 5’ - 羟基。在其它实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至 3’ - 羟基。在其它 实施方案中， 活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方 案中， 寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化， 该官能化试剂描述于美国专利号 4,962,029 以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡 和 4,914,210 中， 聚物的方法公开于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210。
     在一些实施方案中， 固相结合的寡聚物的 5’ - 端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化， 然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过 Diels-Alder 环加成反应而缀合。
     在多种实施方案中， 将含 2’ - 糖修饰的单体， 如 2’ - 氨基甲酸酯取代的糖或 2’ -(O- 戊基 -N- 邻苯二甲酰亚氨基 )- 脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物 的糖的共价连接。在其它实施方案中， 一个或多个单体的 2’ - 位具有含氨基的连接基的寡 聚物使用以下试剂制备 ： 例如， 5’ - 二甲氧基三苯甲基 -2’ -O-(e- 邻苯二甲酰亚氨基氨基 戊基 )-2’ - 脱氧腺苷 -3’ -N， N- 二异丙基 - 氰基乙氧基亚磷酰胺。参见， 例如， Manoharan，等人， Tetrahedron Letters， 1991， 34， 7171。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分， 包括 在 N6 嘌呤氨基上， 在鸟嘌呤的环外 N2 上， 或在胞嘧啶的 N4 或 5 位上。在一些实施方案中， 该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。
     一 些 官 能 部 分 是 可 商 购 的， 例 如， 异 双 官 能 (heterobifunctional) 和 同 双 官 能 (homobifunctional) 连接部分可购自 Pierce Co.(Rockford， Ill.)。其它可商购的 连 接 基 为 5’ - 氨 基 - 修 饰 体 (Modifier)C6 和 3’ - 氨 基 - 修 饰 体 试 剂， 均 可 购 自 Glen Research Corporation(Sterling， Va.)。5’ - 氨基 - 修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI(Applied Biosystems Inc.， Foster City， Calif.)， 且 3’ - 氨基 - 修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto， Calif.)。
     5.11. 组合物
     在多个实施方案中， 本文所述的寡聚物以药物制剂或组合物使用。合适地， 该组 合物包含药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。WO2007/031091( 并入本文作为参考 ) 提 供了适宜和优选的药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。合适的剂量、 制剂、 给药途径、 组合物、 剂型、 与其它治疗剂的组合， 前药制剂也提供于 WO2007/031091- 其也在此引入 作为参考。配制和施用的技术细节还可以在最新版的 “REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES” (Maack Publishing Co， Easton Pa.) 中找到。
     在一些实施方案中， 本文所述寡聚物共价连接到缀合部分以有助于将寡聚物贯穿 细胞膜进行输送。有助于将寡聚物贯穿细胞膜进行输送的缀合部分的实例是亲脂性部分， 例如胆固醇。 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物用形成脂质体的脂质制剂进行配制， 所述 脂质体例如 Lipofectamine 2000 或 Lipofectamine RNAiMAX， 其均可商购自 Invitrogen。 在一些实施方案中， 本文所述寡聚物用一种或多种脂质状非天然小分子的混合物 (“脂 质体分子库” ) 进行配制。脂质体分子库可以通过共价合成化学方法进行合成， 并且可以 尝试各种量和组合的脂质体分子库以开发按照所选给药路径有效将特定尺寸的寡聚物递 送到靶组织的载体。合适的脂质体分子库和组合可例如在 Akinc 人等的 (2008)Nature Biotechnol. 中 找 到， 其 获 得 自 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/ abs/nbt1402.html， 将其并入本文作为参考。
     如本文所述， 术语″药学可接受的盐″是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示可接受水平的不希望有的有毒作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机 氨基酸形成， 以及与金属阳离子形成的碱加成盐， 该金属阳离子如锌、 钙、 铋、 钡、 镁、 铝、 铜、 钴、 镍、 镉、 钠、 钾等， 或与由氨形成的阳离子， N， N’ - 二苄基乙二胺， D- 葡糖胺， 四乙基铵， 或 乙二胺形成的碱加成盐 ； 或 (a) 和 (b) 的 (c) 组合 ； 例如， 鞣酸锌盐等。
     有效用于治疗或防止可耐受用 PTK 抑制剂治疗的疾病的至少一种寡聚物的量可 通过标准临床技术加以确定。通常， 剂量范围可以基于在体外和体内动物模型中发现有效 的 EC50 来确立。所使用的精确剂量还将取决于， 例如， 给药途径和疾病的严重程度， 并且可 根据从业者和 / 或每个患者的状况的判断加以确定。在它的其它实例中， 将尤其必须取决 于如下加以变化 ： 进行治疗的患者的体重和身体状况 ( 例如， 肝肾功能 )， 治疗的痛苦性， 症 状的严重性， 用药间隔频率， 和任何有害副作用的存在。
     在多个实施方案中， 寡聚物的剂量为约 0.01μg- 约 1g/kg 体重， 并且可以每天、 每周、 每月或每年给予一次或多次， 或甚至没 2-10 年给予一次， 或者连续灌输数小时一直到 数月。在某些实施方案中， 用药的重复速率可基于所测得的活性剂在体液或组织内的停留 时间和浓度进行确定， 患者可用 HER3 靶向疗法进行维持治疗以防止疾病状态的复发。
     5.12. 与其它反义寡聚物和化学治疗剂的组合
     在一些实施方案中， 使本文所述寡聚物靶向 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 核酸。因此， 在一些实施方案中， 本发明涉及通过向靶向的两种或所有三种靶核酸施用多于一种寡聚物 来治疗疾病的方法， 所述疾病耐受用 PTK 抑制剂治疗。 在多个实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 EGFR 或 HER2 的第二寡聚物一起施用。在多个其它实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 HER2 的第二寡聚物以及靶向 EGFR 的第三寡聚物一起施用。在本文所述方法中， 这样的寡聚物可以同时或相继施用。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 HER2 表达的其它治疗剂 ( 例如靶向 HER2 mRNA 的反 义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在其它可以相同或不同的实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的 方法， 其通过施用包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 EGFR 表达的其它治疗剂 ( 例如靶 向 EGFR mRNA 的反义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在一些实施方案中， 靶向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有相同的设计 ( 例如， 缺口聚物， 头聚物， 尾聚物 )。在多个实施方案中， 靶 向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有不同的设计。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 一种或多种本文所述寡聚物与一种或多种另外化学治疗剂， 包括但不限于， 烷化剂， 抗代谢 物， 表鬼臼毒素， 蒽环类， 常春藤生物碱， 植物碱和萜类化合物， 单克隆抗体， 紫杉醇类， 拓扑 异构酶抑制剂， 和铂化合物。
     5.13. 试剂盒
     本发明还通了治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法使用 包含第一组分和第二组分的试剂盒。在多个实施方案中， 所述第一组分包含能够抑制 ( 例 如， 通过下调 )HER3 的表达的本文所述寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。在其它 实施方案中， 第二组分包含第二活性成分。在一些实施方案中， 第二组分是作为本文所述 寡核苷酸的治疗剂。在其它实施方案中， 治疗剂是除寡核苷酸外 ( 例如， 小分子治疗剂如 taxol)。在一些实施方案中， 本文所述试剂盒用于过度增生性病症 ( 例如耐受用 PTK 抑制 剂治疗的癌症 ) 的治疗方法， 其包括包含向患者按需要施用有效量的试剂盒第一组分和第 二组分。在多个实施方案中， 同时施用第一和第二组分。在其它实施方案中， 相继地或按任 何顺序施用第一和第二组分。
     在一些实施方案中， 试剂盒包含的第一组分和第二组分， 所述第一组分含有能够 抑制 ( 例如， 通过下调 )HER3 的表达的寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物， 所述第二 组分是如本文所述能够抑制 ( 例如， 通过下调 )HER2 表达和 / 或 EGFR 表达的反义寡核苷酸， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。 6. 实施例6.1. 实施例 1 ： 单体合成
     LNA 单体构造块及其衍生物根据公开操作进行制备。参见 WO07/031081 和本文所 引用的参考文献。
     6.2. 实施例 2 ： 寡核苷酸合成
     寡核苷酸根据 WO07/031081 中描述的方法来合成。表 1 显示了本发明的反义寡核 苷酸基序的实例。
     6.3. 实施例 3 ： 寡核苷酸的设计
     根 据 本 发 明， 设 计 一 系 列 不 同 的 寡 核 苷 酸 除 了 人 HER3(GenBank 登 记 号 NM_001982， SEQ ID NO ： 197) 之外还靶向人 EGFR(GenBank 登记号 NM 005228， SEQ ID NO ： 198) 和人 HER2(GenBank 登记号 NM 004448， SEQ ID NO ： 199) 的不同区域。
     在表 1 中所示的序列中， SEQ ID NO ： 1-50、 53、 139 和 140 设计为除了靶向人 HER3 之外还靶向人 EGFR 和人 HER2。显示了与 HER3、 EGFR 和 HER2 的序列同源性的百分比。所 述寡聚物在相比于 EGFR 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 0 到 2 个错配， 在相比于 HER2 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 1 到 2 个错配。
    
    
    
    
    在表 2 中， 黑体字母表示表 1 中所示的较短序列。在表 3 中所示的 SEQ ID NOs ： 141-168 中， 大写字母表示核苷类似物单体， 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基。小写字母表示 DNA 单体。单体 ( 如果有一些的话 ) 之间不存在 “s” 表示连接磷酸二酯基。
    
    
    
    6.4. 实施例 4 ： 体外模型 ： 细胞培养 反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试， 条件是该靶核酸以可检测的水平存在。 靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染 或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用， 例如， RNA 印迹分析、 实时 PCR、 核 糖核酸酶保护测试而确定。为了例示， 提供以下细胞类型， 但可常规使用其它细胞类型， 条 件是该靶在所选的细胞类型中表达。
     细胞如下所述在合适的培养基中培养， 并保持在 37℃和 95-98％湿度和 5％ CO2 下。细胞每周常规传代 2-3 次。
     15PC3 ： 人 前 列 腺 癌 细 胞 株 15PC3 在 DMEM(Sigma)+10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)+2mM Glutamax I+ 庆大霉素 (25μg/ml) 中培养。
     HUH7 ： 人肝癌细胞株在 DMEM(Sigma)+10％胎牛血清 (FBS)+2mMGlutamax I+ 庆大 霉素 (25μg/ml)+1x 非必需氨基酸中培养。
     6.5. 实施例 5 ： 体外模型 ： 用反义寡核苷酸处理
     将细胞用寡核苷酸处理， 使用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作 为转染载体。将细胞接种于 6- 孔细胞培养板 (NUNC) 并当铺满 80-90％时进行处理。寡核 苷酸浓度范围为 1nM 至 25nM 终浓度。寡聚物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的 进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚物的培养基来停止处理。清洗细胞且添加含血 清的培养基。寡核苷酸处理后， 使细胞恢复 20 小时， 然后将其收集用于 RNA 分析。
     6.6. 实施例 6 ： 体外模型 ： RNA 的提取和 cDNA 合成
     使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 (Qiagen cat.no.74104) 根据厂家的说明书从如上所 述转染的细胞提取总 RNA。根据厂家的说明书使用来自 Ambion 的逆转录酶试剂 (Reverse Transcriptase reagents) 进行第一链合成。
     对于每个样品， 使用无 RNase H2O 将 0.5μg 总 RNA 调节到 10.8μl， 并与 2μl 十碱 基的随机引物 (random decamers)(50μM) 和 4μl dNTP 混合物 ( 每种 dNTP 2.5mM) 混合， 加热到 70℃保持 3 分钟， 在这之后样品在冰上快速冷却。在冰上冷却样品之后， 将 2μl10x 缓冲液 RT、 1μl 的 MMLV 逆转录酶 (100U/μl) 和 0.25μl RNase 抑制剂 (10U/μl) 添加到 各样品中， 随后在 42℃孵育 60 分钟， 酶在 95℃加热灭活 10 分钟， 然后将样品冷却到 4℃。
     6.7. 实施例 7 ： 体外模型 ： 通过实时 PCR 分析 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的寡核苷酸 抑制作用
     HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义调节可以以本领域已知的多种方式分析。举例来 说， HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平可以通过例如 RNA 印迹分析、 竞争性聚合酶链式反应 (PCR) 或实时 PCR 来定量。实时定量 PCR 当前是优选。可以对总细胞 RNA 或 mRNA 进行 RNA 分析。 RNA 分离和 RNA 分析的方法例如 RNA 印迹分析是本领域常规的， 在例如 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley 和 Sons 中教导了。
     实时定量的 (PCR) 可以使用可从 Applied Biosystems 商业上获得的 Multi-Color Real Time PCR 检测系统方便地实现。
     HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平的实时定量 PCR 分析
     人 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的 样 品 含 量 使 用 人 HER3、 EGFR 和 HER2AB I Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents(Applied Biosystemscat.no.Hs00951444_ m1(HER3)、 Hs00193306_m1(EGFR) 和 Hs00170433_m1(HER2) 根据厂家的说明书来定量。甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH)mRNA 的量用作内源对照用于标准化样品制备中 的任何变化。人 GAPDH mRNA 的样品含量使用人 GAPDH ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.4310884E) 根据厂家的说明书来定量。
     实时定量 PCR 是本领域公知的技术， 在例如 Heid 等人的 Real time quantitative PCR， Genome Research(1996)， 6： 986-994 中教导了。
     实时 PCR
     将来自第一链合成的 cDNA( 如实施例 5 中描述进行的 ) 稀释 2-20 倍， 通过使用 来自 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 或 7900FAST 的实时定量 PCR 来分析。将 引物和探针与 2×Taqman Fast Universal PCR 主混合物 (master mix)(2×)(Applied Biosystems Cat.#4364103) 混合， 添加到 4μlcDNA 中至 10μl 的终体积。 一式两份分析每 种样品。测试 2 倍稀释的 cDNA 得到该测试的标准曲线， 该 cDNA 从表达感兴趣的 RNA 的细 胞株纯化的物质制备。使用无菌的 H2O 代替 cDNA 用于无模板对照。PCR 程序 ： 95℃ 30 秒， 然后进行 40 个循环， 95℃ 3 秒， 60℃ 20-30 秒。使用 Applied BiosystemsFast System SDS 软件版本 1.3.1.21. 或 SDS 软件版本 2.3 根据计算的阈值循环测定靶 mRNA 的相对数量。
     6.8. 实施例 8 ： 体外分析 ： 寡核苷酸化合物对人 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义抑 制
     评估表 4 中呈现的寡核苷酸在 1、 5 和 25nM 浓度下在 15PC3 细胞 ( 或如 * 所指示 的 Huh-7) 中下调 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的潜力 ( 参见附图 2、 3、 4 和 5)。SEQ ID NO ： 235 和 236 用作乱序 (scrambled) 对照。
     表 4 中的数据被表示为在 25nM 下相对于模拟品转染的细胞的 mRNA 下调百分比。 小写字母表示 DNA 单体， 粗体大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体。LNA 单体中的所有胞嘧 啶是 5- 甲基胞嘧啶。下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接。
    如在表 4 中所示， 在这些实验中在 15PC3 细胞中， 具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 中所示序列的寡核苷酸在 25nM 展 现了的 85％或更大的对 HER3 mRNA 表达抑制。
     同样优选的是， 基于列举的反义寡聚物序列的寡核苷酸， 例如， 改变长度 ( 更短或更长 ) 和 / 或单体含量 ( 例如， 核苷类似物单体的类型和 / 或比例 )， 其也提供了
     对 HER3 表达的良好的抑制。
     6.9. 实施例 9 ： LNA 寡核苷酸的细胞凋亡诱导
     在转染的前一天， 将 HUH7 细胞以 2.5×105 个细胞 / 孔的密度接种在 6 孔培养平板 (NUNC) 中。当 75-90％汇合时利用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。 使用的寡聚物浓度是 5nM 和 25nM( 反应孔中的终浓度 )。 寡聚 物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/ mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用 Optimem 洗涤之后， 将 300μl 的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加 3ml HUH7 培养基来灭活胰蛋白酶， 通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物 EQ ID NO ： 235 用作对照。
     在 这 之 后， 将 100μl 的 细 胞 悬 浮 液 添 加 到 来 自 Nunc 的 白 色 96 孔 平 板 (cat#136101)) 的每个孔中 ( 制备四个平板， 用于在不同时间点测量 )。 然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     半胱氨酸蛋白酶分析 ： 细胞凋亡特异性半胱氨酸蛋白酶 3 和 7 的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7- 底物分析 ( 来自 Promega 的 Cat#G8091) 来测量。要分析的平板平衡到 室温保持 15 分钟。Caspase-3/7 缓冲液与 Caspase-3/7 底物混合以形成 Caspase- 工作溶 液， 将其平衡到室温。 然后， 将 100μl 的 Caspase- 工作溶液小心地添加到 96 孔平板的每个 孔的培养基中 ( 避免气泡和孔之间的污染 )。平板小心地振摇 1 分钟， 在这之后， 将它在室 温避光孵育 1 小时。 半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent 仪器 (Thermo Labsystems) 中的每秒的相对光单元 (RLU/s) 来测量。相对于被设置为 1 的模拟品 (mock) 的平均值将 数据进行相关和绘图。参见图 6。
     6.10. 实施例 10 ： 使用 LNA 寡核苷酸对增殖的体外抑制
     如实施例 9 中所述， 转染 HUH7 细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO ： 235 充当 乱序的对照。
     在收集之后， 将 100μl 的细胞悬浮液添加到 96 孔平板 (” OrangeScientific” )的 每个孔中用于 MTS 实验 ( 制备四个平板， 用于在不同的时间点测量 )。然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     增殖的活细胞的测定 (MTS 分析 )
     对于增殖分析， 将 10μl CellTiter AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega， G3582) 添加到 96 孔平板的每个孔的培养基中， 小心地振摇平板， 并在测量 前在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 孵育 1 小时。在分光光度计中测量 490nm 处的吸光度， 减去 从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。 490nm 处的吸光度与活细胞的数量成比例， 对模拟 品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参见图 7。
     6.11. 实施例 11 ： 靶 mRNA 敲减的体内评估
     为了评估 HER3 寡聚化合物的体内敲减 (knockdown) 效力， 带有 15PC3 异种移植物 6 的雌性裸小鼠 ( 通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×10 个细胞 / 小鼠得到 )， 在多种剂量和注 射方案 ( 即， 单剂量、 每天 (qd)、 每 3 天 (q3d)、 每 4 天 (q4d)) 下用寡聚物静脉内注射。 乱序 的寡聚物 EQ ID NO ： 236 充当阴性对照。最后注射后 24 小时， 小鼠被麻醉， 将肝脏和肿瘤组 织采集在 RNAlater 溶液 (Ambion) 中。从组织纯化总 RNA， 使用 QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒 (Cat# ： 204443 ； Qiagen) 的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR) 测定 HER3 mRNA 的水平。 GAPDH mRNA 充当内部对照。
     小鼠 ErbB3 ： 探针 ： cca cac ctg gtc ata gcg gtg a(SEQ ID NO 237)， 引物 -1 ： ctg ttt agg cca agc aga gg(SEQ ID NO 238)， 引物 -2 ： att ctg aat cct gcg tcc ac。
     人 ErbB3 ： 探针 ： cat tgc cca acc tcc gcg tg， 引物 -1 ： tgc agt gga ttc gag aag tg， 引物 -2 ： ggc aaa ctt ccc atc gta ga。
     人 GAPDH ： 探针 ： act ggc gct gcc aag gct gt， 引物 -1 ： cca ccc aga aga ctg tgg at， 引物 -2 ： ttc agc tca ggg atg acc tt。
     小鼠 GAPDH ： 探针 ： agc tgt ggc gtg atg gcc gt， 引物 -1 ： aac ttt ggc att gtg gaa gg， 引物 -2 ： gga tgc agg gat gat gtt ct。通过使用包括软件的 ABI-7500PCR Fast System 进行数据分析。参见表 5。
     表 5 中的数据表示为， 在按照指定的剂量用寡核苷酸连续 5 天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中， 相对于盐水治疗的对照 HER3 mRNA 水平的％。
    6.12. 实施例 12 ： 肿瘤生长抑制的评估
     ErbB3 特异性 LNA 抑制体内肿瘤生长的能力在带有 15PC3 异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3 人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×106 个细胞 / 小鼠来 构建。 肿瘤体积将通过卡尺测量 2 个方向来测定， 并使用下式来计算 ： 肿瘤体积＝ ( 长度 × 2 3 宽度 )/2)。当肿瘤达到 70-100mm 的平均体积时， 将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以 q3d x10 的方案， 小鼠分别静脉注射 25 和 50mg/kg 的 SEQ ID NO ： 180。盐水或具有 SEQ ID NO ： 236 的乱序寡核苷酸充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过 临床观察、 临床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例 11 描述的 QPCR 测量肿 瘤 HER3 mRNA。参见附图 8A 和 8B。
     6.13. 实施例 13 ： 小鼠肝脏中 HER3 mRNA 的抑制
     连续三天以 1 或 5mg/kg 寡核苷酸对 NMRI 小鼠静脉给药 ( 每组 5 只小鼠 )。 反义寡 核苷酸 (SEQ ID NO ： 180 和 SEQ ID NO ： 234) 溶于 0.9％盐水 (NaCl) 中。 在最后的给药后 24 小时处死动物， 采样肝脏组织， 并保存在 RNA later(Ambion) 中直到 RNA 提取和 QPCR 分析。 提提取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_ m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。 取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。结果对小鼠 GAPDH(cat.no.4352339E， Applied Biosystems) 进行归一化， 相对于盐水处理的对照绘图 ( 参见附图 9)。
     6.14. 实施例 14 ： 具有聚乙二醇的寡聚物的缀合物的制备
     具有 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 所示序列的寡聚物， 通过利用常规的亚磷 酰胺化学作用将用阻断基团例如 Fmoc 阻断的氨基烷基基团例如己烷 -1- 胺连接到寡聚物 的 5’ 磷酸基团， 来在 5’ 末端功能化， 氧化产生的化合物， 将它脱保护， 纯化来得到分别具有 式 (IA) 或 (IB) 的功能化的寡聚物 ：
    其中粗体大写字母表示核苷类似物单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示硫 代磷酸酯连接基。 。
     活化的 PEG 的方案， 例如在式 (IV) 中所示的一种 ：
    
    其中 PEG 部分具有 12,000Da 的平均分子量， 且式 (IA) 或 (IB) 的每个化合物在 PBS 缓冲液中在室温下搅动 12 小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次， 合并的有机层用硫酸 镁干燥， 并过滤， 溶剂减压蒸发。将所得残余物溶于双蒸水， 并加载到阴离子交换柱上。
     未反应的 PEG 连接基 (linker) 用水洗脱， 产物用 NH4HCO3 溶液洗脱。收集含有纯 产物的级分， 冻干得到式 (IIIA) 或 (IIIB) 分别所示的缀合物 ： SEQ ID NO ： 141 和 152 ：
    
    其中 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12,000 平均分子量的 PEG 聚合物上。
     可使用本文所述方法由具有 SEQ ID NOs ： 169， 180 和 234 中所示序列的寡聚物制 得 PEG 聚合物缀合物的化学结构， 分别在式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中加以显示。
    
    其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示 Me 硫代磷酸酯连接基， 以及 C 表示 5- 甲基胞嘧啶碱基。
     在该方法中可用于分别制备式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中所示缀合物的活化寡聚物 具有式 (VA)、 (VB) 和 (VC) 所示的化学结构。
    
    
    6.15. 实施例 15 ： 使用不同的给药周期评估靶 mRNA 体内敲减 使用与上文实施例 11 中描述的类似方案， 在带有来自 15PC3 细胞或 A549 细胞(NSCLC) 或 N87 细胞 ( 胃癌 ) 的异种移植肿瘤的裸小鼠中， 体内评估寡聚物的敲减效力。寡 聚物通过每三天 2-4 剂注射给药。在最后的注射后 3 或 4 天收集组织。
     表 6 和 7 中的数据表示为相对于盐水治疗的对照， 在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后， 在肝脏和肿瘤样品中 HER3 mRNA 或 HIF-1αmRNA 水平的％。
    观察到的具有 SEQ ID NO ： 169 和 SEQ ID NO ： 180 的序列的寡聚物的敲减效果不是 对 15PC3 肿瘤细胞独特的， 因为在来自 A549(NSCLC) 和 N87( 胃癌 ) 细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见下表 7。
    6.16. 实例 16 ： 耐受吉非替尼的细胞系的产生
     HCC827 肺腺癌细胞 (ATCC CRL-2868) 在 5 ％ CO2 和 95 ％空气的增湿气氛下于 RPMI 介质中维持在 37℃， 所述介质补充有 10％胎牛血清。为了产生吉非替尼耐受性， 用逐 渐增加量的吉非替尼 ( 一直到 500nM) 处理细胞 3 个月的时段。在 3 个月时段结束时， 使 用 MTT((3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 分析相对于母系细胞和 HCC827R 吉非替尼耐受性细胞测试细胞增殖。结果显示， HCC827R 细胞耐受甚至所测最高浓 度 (10μM) 的吉非替尼。( 图 10)
     6.17. 实施例 17 ： 耐受吉非替尼的细胞系的表征
    使用 RTK 抗体分析试剂盒 (R&D Systems， Inc.， Minneapolis， MN) 描绘 HCC827 和 耐受吉非替尼的细胞即 HCC827R 中受体酪氨酸激酶 (“RTK” ) 的表达水平和磷酸化状态。 简言之， 将细胞溶解在溶菌缓冲液中并且测定细胞溶菌的总蛋白质浓度。将 500ug 中蛋白 质在孵育缓冲液中进行稀释， 用分析膜 (assay membrane) 进行孵育， 并根据制造商提供的 方案进行处理。最终图像结果 ( 图 11) 显示 HCC827R 细胞中的磷酸化 EGFR 水平比母系中 的那些低很多。
     Western blot 分析
     HCC827 和 耐 受 吉 非 替 尼 的 克 隆 体 (R2、 R3 和 R5) 在 具 有 (“+” ) 或不具有 (“-” )1μM 吉非替尼的介质中培养 24h。然后制备细胞溶菌并测定总蛋白质浓度。使约 15μg/lane 蛋白质在 8％ SDS-PAGE 凝胶中进行电泳并且使用 BioRad 液体转移设备将其转
     移到 PVDF。用合适的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体 (Transduction Labs) 和增强的化 学发光试剂 (SuperSignal， Pierce) 进行 western 分析。所使用的一级抗体 (Abs) 包括 ： 抗 -Met 单克隆 Ab(25H2)， 抗 - 磷 -Met(Y1234) 兔单克隆 Ab(D26)， 和抗 - 磷 -ErbB3(Y1289) 兔单克隆 Ab(21D3)， 来自 Cell Signaling ； 来自 Santa Crutz 的抗 -ErbB3 Ab(sc285) ； 抗 - 磷 -Met(Y1349)Ab(Ab47606R)， 抗 - 磷 -EGFR 兔单克隆 Ab(Ab40815)， 和抗 -EGFR Ab， 来 自 Abcam ； 以及用于负载对照品的缀合辣根过氧化物酶的抗 - 微管蛋白 Ab。
     数据显示， 相比于未处理 ( “-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化 EGFR 的水平， 非磷 酸化和磷酸化 EGFR 的水平在 HCC827 耐受吉非替尼的克隆体中得到显著降低， 无论是存在 (“+” ) 或存在 (“-” ) 吉非替尼。形成对照的是， 与母系细胞相比， ErbB3 或 MET( 其也涉 及 EGFR 信号发出通路 ) 的水平在耐受性克隆体中没有得到显著降低。这些发现表明， EGFR 的下调可能是一些癌细胞获得对吉非替尼的耐受性的机制所在。
     6.18. 实例 18 ： 寡聚物对耐受吉非替尼的细胞的作用
     将 HCC287 和 HCC287R 细胞以副本配制在 6- 孔板的 200 细胞 / 孔上并且孵育 24 小 时。用 1μM 的 ON180(SEQ ID NO ： 180) 处理细胞并孵育 10 天， 之后使细胞染有 MTT 并数计 菌落的数目。就 HCC827 和 HCC727R 细胞计算对照品的百分数。图 13 中所示的结果显示， 与在下调 HCC287 吉非替尼敏感细胞的生长方面相比 ( 与未处理的对照品相比细胞生长减 少约 50％ )， 寡核苷酸 ON180 在下调耐受吉非替尼的细胞方面显著更为有效 ( 与未处理的 对照品相比细胞生长减少大于 80％ )。
     结合图 14-16 来说明本发明的仍其它方面和实施方案。
     图 14 显示， 在三个人乳腺癌细胞系、 BT474、 SKBR3 和 MDA453 中， 降低 HER3 表达的 LNA 寡聚物， 虽然没有曲妥珠单抗， 但是能够防止 HER3 和 P-HER3 表达由于拉帕替尼而反馈 下调。如就仅拉帕替尼治疗的细胞 (1)， 拉帕替尼加上曲妥珠单抗治疗的细胞 (2)， 拉帕替 尼加上 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (3) 和仅 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (4) 所示。在 0， 1， 4， 24 和 48 小时显示了 HER3， P-HER3(Y1197) 和 P-HER3(Y1289) 的表达水平。拉帕替尼 以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓 度使用。
     图 15 显示， 3 个人乳腺癌细胞系的细胞凋亡协同促进大于拉帕替尼与降低 HER3 表 达的 LNA 寡聚物的组合， 后者大于拉帕替尼与曲妥珠单抗的组合。该图显示了就每个三细 胞系 ( 与图 14 中相同的系 ) 所进行的 ApoBrdU 细胞凋亡的结果。 用拉帕替尼和 / 或曲妥珠 单抗治疗细胞 48 小时。在 72 小时， 细胞呈血清饥饿并且用 SEQ ID NO ： 180 或随机化对照 寡聚物进行治疗。对于每个细胞系， 治疗是 ： 仅随机化寡核苷酸对照品 (1)， 仅 SEQ ID NO ： 180， 仅曲妥珠单抗 (3)， 仅拉帕替尼 (4)， 拉帕替尼加上 SEQ ID NO ： 180(5)， 以及拉帕替尼 加上曲妥珠单抗 (6)。拉帕替尼以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓度使用。
     图 16 显示， SEQ ID NO ： 180 抑制使用 HCC827 人细胞系的人非小细胞肺癌体内小 鼠异种移植模型中肿瘤的生长。对于用 30mg/kg SEQ ID NO ： 180(i.v)( 静脉内 ) 治疗， 在 大约 31 天时平均肿瘤体积相对于盐水对照品降低 65.5％， 对于用 45mg/kg SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗， 在大约 31 天时相对于盐水对照品降低 81.3％。N ＝ 6。
     具体实施方案， 参考文献的引用本发明不受本文所述具体实施方案的范围的限制。 实际上， 除本文描述的那些外， 在本发明的范围内的各自修饰对于本领域技术人员而言由前述描述和附图将变得明显。 此 外， 结合本发明一个实施方案所述的特征也可以与其它实施方案相结合， 即使上文没有明 确指出。
     本文引用的多个参考文献， 包括专利申请、 专利和科学文献 ； 这些文献各自的公开 内容以其全部并入本文作为参考。58102395374 A CN 102395383
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     图 13 ： 数据显示了用 1μm 具有 SEQ ID NO ： 180 的寡核苷酸治疗 10 天时间段对抑 制耐受吉非替尼的 HCC827 细胞的生长具有较大的影响 ( 与未治疗的对照相比在生长方面 降低大于 80％ ) 与对吉非替尼敏感的 HCC827 细胞相比。
     图 14 ： 数据显示了降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物， 但不是曲妥珠单抗， 能够在 三种人类癌细胞系中通过拉帕替尼防止 HER3 和对 HER3 表达的反馈上调。
     图 15 ： 数据显示了拉帕替尼和降低 HER3 表达的 LNA 反义寡聚物的组合与拉帕替 尼和曲妥珠单抗的组合相比， 三种人类癌细胞系中凋亡的协同促进作用更大。
     图 16 ： 数据显示了反义 HER3 抑制剂 SEQ ID NO ： 180 抑制了人体非小细胞肺癌的 小鼠体内异种移植模型中的肿瘤生长。
     5. 详述
     在某些实施方案中， 本发明提供了调节细胞中 HER3( 和 / 或 EGFR 和 / 或 HER2) 的 表达的方法， 所述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗。 在一些实施方案中， 耐受性细胞 是癌细胞。在多个实施方案中， 提供了通过施用在胞内条件下特异地与核酸编码杂交的寡 核苷酸 ( 寡聚物 )， 来治疗或防止与 HER3 过表达有关的疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的癌症的方法。在一些实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3 的表达。在其它实施方案中， 用于本文所述方法的寡核苷酸下调了 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 的表达。 术语 “HER3” 与术语 “ErbB3” 在本文中互换使用。
     5.1. 方法
     在多个实施方案中， 本发明包括在细胞中抑制 HER3 的表达和 / 或活性的方法， 所 述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括使 所述细胞与有效量的寡聚化合物 ( 或其缀合物 ) 接触以在细胞中实现 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 表达和 / 或活性的抑制 ( 例如下调 )。在某些实施方案中， 抑制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 )mRNA 的表达。 在其它实施方案中， 抑 制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 蛋白质的表达。在多个实施方案中， 所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。
     在某些实施方案中， 在体外发生所述接触。 在其它实施方案中， 通过向哺乳动物施 用本文所描述的组合物而在体内实现所述接触。在多个实施方案中， 本发明提供了在细胞 中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及 HER2 蛋白质和 / 或 mRNA 的 表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列显示为 SEQ ID NO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明 提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及在细胞中 EGFR 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它 实施方案中， 本发明提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或 蛋白的表达的方法。
     如本文中所互换使用的， 术语 “蛋白酪氨酸激酶抑制剂” “PTK 抑制剂” 和 “酪氨酸激
     5.1. 方法
     在多个实施方案中， 本发明包括在细胞中抑制 HER3 的表达和 / 或活性的方法， 所 述细胞耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括使 所述细胞与有效量的寡聚化合物 ( 或其缀合物 ) 接触以在细胞中实现 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 表达和 / 或活性的抑制 ( 例如下调 )。在某些实施方案中， 抑制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 )mRNA 的表达。 在其它实施方案中， 抑 制 HER3( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 蛋白质的表达。在多个实施方案中， 所述细胞是哺乳动物细胞， 例如人细胞。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。
     在某些实施方案中， 在体外发生所述接触。 在其它实施方案中， 通过向哺乳动物施 用本文所描述的组合物而在体内实现所述接触。在多个实施方案中， 本发明提供了在细胞 中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及 HER2 蛋白质和 / 或 mRNA 的 表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列显示为 SEQ ID NO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明 提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达， 以及在细胞中 EGFR 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它 实施方案中， 本发明提供了在细胞中抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或 蛋白的表达的方法。
     如本文中所互换使用的， 术语 “蛋白酪氨酸激酶抑制剂” “PTK 抑制剂” 和 “酪氨酸激
     酶抑制剂” 是指结合并抑制一个或多个酪氨酸激酶区的活性的分子。蛋白酪氨酸激酶抑制 剂不是如下文所描述靶向 HER3 的寡聚物。在一些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是单 克隆抗体。在其它实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶抑制剂是具有小于 1000Da， 例如 300-700Da 的分子量的小分子。
     在某些实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一个或多个 EGFR 家族成员的酪氨酸激酶。 在多个实施方案中， 使 PTK 抑制剂靶向一种或多种蛋白质的酪氨酸激酶， 所述蛋白质与一 个或多个 EGFR 家族成员相互作用或受一个或多个 EGFR 家族成员调节， 所述 EGFR 家族成员 是例如涉及一个或多个由一个或多个 EGFR 家族成员发出的信号级联的蛋白质。在一些实 施方案中， 酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶， 即是具有细胞外配体结合区域且通过结合一个 或多个配体而活化的较大蛋白质的细胞内区域。在某些实施方案中， 蛋白酪氨酸激酶是非 受体酪氨酸激酶。酪氨酸激酶在一个或多个信号通路中调节其它蛋白质的活性， 其通过使 它们磷酸化来进行调节。
     如本文所使用的， 耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞是指在与蛋白酪氨酸 激酶抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。如本文所使用的， 在与 PTK 抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 PTK 抑制剂治疗， 与相同类型的没有与 PTK 抑制 剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性细胞是内在地耐受用 PTK 抑制剂治疗的 那些。在一些实施方案中， 耐受性细胞是从先前暴露于 PTK 抑制剂而获得耐受性的细胞， 所述暴露是作为单药疗法或者作为与一种或多种另外的药物例如化疗药物或反义寡核苷 酸组合治疗的一部分。类似地， 如本文所使用的， 耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治 疗的细胞通常是指在与这些抑制剂接触时它们的生长或增殖基本上不被降低的细胞。 如本 文所使用的， 在与所述抑制剂接触时， 细胞的生长或增殖耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑 制剂治疗， 与相同类型的没有与所述抑制剂接触且缺乏这种耐受性的细胞的生长或增殖相 比， 生长或增殖降低小于 30％， 例如小于 20％， 例如小于 10％。在一些实施方案中， 耐受性 细胞是内在地耐受用 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂治疗的那些。在一些实施方案中， 耐 受性细胞是从先前暴露于 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂获得耐受性的细胞。
     在一些实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非 TM 替 尼 (ZD-1839， Iressa )， 伊 马 替 尼 (Gleevec )， 埃 罗 替 尼 (OSI-1774， Tarceva )， 卡 纽替尼 (canertinib)(CI-1033)， 凡德他尼 (vandetanib)(ZD6474， Zactima )， 酪氨酸磷 酸化抑制剂 (tyrphostin)AG-825(CAS 149092-50-2)， 拉帕替尼 (GW-572016)， 索拉非尼 (sorafenib)(BAY43-9006)， AG-494(CAS 133550-35-3)， RG-13022(CAS 149286-90-8)， RG-14620(CAS 136831-49-7)， BIBW 2992(Tovok)，酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 9(CAS 136831-49-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 23(CAS 118409-57-7)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 25(CAS 118409-58-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 46(CAS 122520-85-8)， 酪氨酸磷酸化抑制剂 47(CAS 122520-86-9)， 酪 氨 酸 磷 酸 化 抑 制 剂 53(CAS 122520-90-5)， 紫 铆 因 (butein)(1-(2， 4- 二羟基苯基 )-3-(3， 4- 二羟基苯基 )-2- 丙烯 -1- 酮， 2’ ， 3， 4， 4’ - 四羟基查耳酮 ； CAS 487-52-5)， 姜黄色素 ((E， E)-1， 7- 双 (4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 )-1， 6- 庚二烯 -3， 5- 二酮 ； CAS 458-37-7)， N4-(1- 苄基 -1H- 吲唑 -5- 基 )-N6， N6- 二甲基 - 吡啶 -[3， 4-d]- 嘧啶 -4， 6- 二胺 (202272-68-2)， AG-1478， AG-879， 环丙烷羧酸 -(3-(6-(3- 三氟甲基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 )- 苯基 )- 酰胺 (CAS 879127-07-8)， N8-(3- 氯 -4- 氟苯基 )-N2-(1- 甲基哌 啶 -4- 基 )- 嘧啶并 [5， 4-d] 嘧啶 -2， 8- 二胺， 2HCl(CAS 196612-93-8)， 4-(4- 苄氧基苯氨 基 )-6， 7- 二甲氧基喹唑啉 (CAS 179248-61-4)， N-(4-((3- 氯 -4- 氟苯基 ) 氨基 ) 吡啶并 [3， 4-d] 嘧啶 -6- 基 )2- 丁炔酰胺 (CAS 881001-19-0)， EKB-569， HKI-272 和 HKI-357。
     在多个实施方案中， 细胞在暴露于选自如下的 PTK 抑制剂后获得耐受性 ： 吉非替 尼， 伊马替尼， 埃罗替尼， 拉帕替尼， 卡纽替尼和索拉非尼。在一个变化形式中， 细胞在暴露 于吉非替尼后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 细胞在暴露于 HER2 抑制剂例如 HER2 结合和抑制的抗体或结 合和抑制的抗体片段后获得耐受性。在一个变化形式中， 细胞在暴露于曲妥珠单抗和 / 或 帕妥珠单抗后获得耐受性。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗患者疾病的方法， 其中所述疾病耐受用 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗， 该方法包括向所需患者施用包含有效量的至 少一种寡聚物或其缀合物， 和药物可接受的赋形剂的药物组合物。如本文所使用的， 术语 “进行治疗” 和 “治疗” 是指现有疾病 ( 例如， 下文涉及的疾病或病症 ) 的治疗， 或防止疾病， 即预防。 在某些实施方案中， 本发明的方法用于抑制耐受 PTK 抑制剂和 / 或 HER2 和 / 或 HER2 通路抑制剂的细胞的增殖。在多个实施方案中， 与未经治疗的细胞样本相比， 抗增殖 作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在其它实施方案中， 与用小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞样本相比， 抗增殖作用是细胞增殖降低至少 10％、 降低至少 20％、 降低至少 30％、 降低至少 40％、 降低至少 50％、 降低至少 60％、 降低至 少 70％、 降低至少 80％或降低至少 90％。在多个实施方案中， 所述细胞是癌细胞。在一些 实施方案中， 所述癌细胞选自乳腺癌细胞、 前列腺癌细胞、 肺癌细胞和上皮癌细胞。
     因此， 本发明的方法用于治疗过度增殖疾病， 例如耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂 治疗和 / 或耐受用 HER2 或 HER2 通路抑制剂治疗的癌症。 在一些实施方案中， 耐受治疗的癌 症选自淋巴瘤及白血病 ( 例如非霍奇金淋巴瘤、 霍奇金淋巴瘤、 急性白血病、 急性淋巴细胞 白血病、 急性髓细胞性白血病、 慢性粒细胞白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 多发性骨髓瘤 )， 结肠癌， 直肠癌， 上皮癌， 胰腺癌， 乳腺癌癌， 卵巢癌， 肾细胞癌， 前列腺癌， 肝癌， 胆管细胞 癌， 绒毛膜癌， 宫颈癌， 睾丸癌， 肺癌， 膀胱癌， 黑色素瘤， 头颈部肿瘤， 脑肿瘤， 不明原发部位 癌症， 肿瘤， 癌症周围神经系统， 中枢神经系统， 纤维肉瘤， 粘液肉瘤， 脂肪肉瘤， 软骨肉瘤， 骨肉瘤， 脊索瘤， 血管肉瘤， 内皮肉瘤， 淋巴管肉瘤， 淋巴管内皮肉瘤， 滑膜瘤， 间皮瘤， 尤因 氏瘤， 平滑肌肉瘤， 横纹肌肉瘤， 鳞状细胞癌， 癌基底细胞癌， 腺癌， 汗腺癌， 皮脂腺癌， 乳头 状癌， 乳头状例腺癌， 囊腺癌， 髓质癌， 支气管癌， 精原细胞瘤， 胚胎癌， 肾母细胞瘤， 小细胞 肺癌， 上皮细胞癌， 神经胶质瘤， 星形细胞瘤， 髓母细胞瘤， 颅咽管瘤， 室管膜瘤， 松果体瘤， 血管母细胞瘤， 听神经瘤， 少突， 脑膜瘤， 神经母细胞瘤， 和视网膜母细胞瘤， 重链病， 转移， 或以不受控制的或异常的细胞生长为特征的任何疾病或病症。
     在某些实施方案中， 耐受性癌症选自肺癌， 前列腺癌， 乳腺癌， 卵巢癌， 结肠癌， 上 皮癌， 胃癌。
     在某些其它实施方案中， 肺癌是非小细胞肺癌。本发明的一个这种实施方案提供
     了用于治疗非小细胞肺癌的方法， 该方法包括向哺乳动物例如需要治疗所述癌症的人类患 者施用治疗有效量的至少一种反义寡聚物或其缀合物， 所述反义寡聚物或其缀合物降低 HER3 以及任选地 HER2 抑制剂或 HER2 通路抑制剂中的一种或多种的表达。 在一个变化形式 中， 至少一种寡聚物或其缀合物包括或是 SEQ ID NO ： 180 或其缀合物。
     在某些实施方案中， 本发明还提供了用于药物制造的本文所描述的化合物或缀合 物的用途， 所述药物用于本文提及的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑 制剂耐受性的病症的治疗， 或者还提供了治疗本文称作病症的方法。
     在多个实施方案中， 根据本发明的 PTK 抑制剂耐受性、 HER2 抑制剂耐受性或 HER2 通路抑制剂耐受性病症的治疗可以与一种或多种其它抗癌治疗， 例如放射治疗、 化学治疗 或免疫治疗组合。
     在某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 基因 ( 和 / 或 HER2 基因和 / 或 EGFR 基因 )、 或其蛋白质产物与 HER3 相关或与相互作用的基因的突变相关。在一些实施方 案中， 突变基因由于酪氨酸激酶区域中的突变而对蛋白质进行编码。 在多个实施方案中， 酪 氨酸激酶区域中的突变是在小分子 PTK 抑制剂的结合位置和 / 或 ATP 结合位置中。因此， 在多种实施方式中， 靶 mRNA 是 HER3( 和 / 或 HER2 和 / 或 EGFR) 序列的突变的形式 ； 例如， 它包含一个或多个单点突变， 例如与癌症相关的 SNPs。
     在某些实施方案中 PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的突变形式的异常水平相关。 在 某些实施方案中， PTK 抑制剂耐受性疾病与 HER3 的野生型形式的异常水平相关。本发明的 一方面涉及治疗患有或易遭受与 HER3 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 该方法包括 向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡 聚物包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗患有或易遭受与 HER2 的突变形式的异常水 平， 或 HER2 的野生型形式的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋 白酪氨酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选 地， HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物 包含一个或多个下文所描述的 LNA 单元。
     在仍其它实施方案中， 本发明治疗患有或易遭受与突变 EGFR 的异常水平， 或野生 型 EGFR 的异常水平相关的疾病的患者的方法， 其中所述疾病耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗， 该方法包括向所述患者施用治疗有效量的靶向 HER3( 以及任选地， HER2 和 EGFR 中 的一种或多种 ) 或其缀合物的寡聚物。在一些实施方案中， 所述寡聚物包含一个或多个下 文所描述的 LNA 单元。
     在多个实施方案中， 本文所描述的本发明包括防止或治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶 抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法包括向需要这种治疗的人施用治疗有效量的 HER3 调节 寡聚物 ( 以及任选地 HER2 和 EGFR 中的一种或多种 ) 或其缀合物。
     在多种实施方案中， 该寡聚物或其缀合物， 通过例如氢键合至靶核酸， 在人体内引 起所需的治疗效果。该寡聚物通过氢键合 ( 例如杂交 ) 至靶的 mRNA 导致基因表达减少， 引 起靶的表达减少 ( 例如抑制 )。
     高度优选是， 本发明的化合物能够通过 Watson-Crick 碱基配对与靶核酸例如 HER3 mRNA 杂交。5.2. 寡聚物
     在第一方面， 提供了寡聚化合物 ( 本文称作寡聚物 )， 其例如用于调节编码哺乳动 物 HER3 的核酸分子， 例如 SEQ ID NO ： 197 中所示的 HER3 核酸、 以及编码哺乳动物 HER3 的 这种核酸分子的天然存在的等位基因变体的功能。所述寡聚物由共价连接的单体组成。
     术语 “单体” 包括在核酸中天然存在且不含有改性的糖类或改性的核碱基的核苷 和脱氧核苷二者 ( 统称为 “核苷” )， 所述即改性的糖类或改性的核碱基是其中核糖或脱氧 核糖共价键合至自然存在的、 未改性的核碱基 ( 碱基 ) 部分 ( 即嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤、 鸟 嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶或脲嘧啶 ) 的化合物和 “核苷类似物” ， 所述核苷类似物是在核酸中 天然存在的或不在核酸中天然存在的核苷， 其中糖部分是除核糖或脱氧核糖外 ( 例如二环 糖类或 2’ 改性的糖类如 2’ 取代的糖类 )， 或碱基部分是改性的 ( 例如， 5- 甲基胞嘧啶 )， 或 这二者。
     “RNA 单体” 是含有核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “DNA 单体” 是含有脱氧核糖和未改性的核碱基的核苷。
     “锁核酸单体” “锁单体” 或 “LNA 单体” 是具有如下文进一步描述的二环糖的核苷 类似物。
     术语 “相应的核苷类似物” 和 “相应的核苷” 表示核苷类似物中的碱基部分和核苷 中的碱基部分相同。例如， 当 “核苷” 含有连接至腺嘌呤的 2- 脱氧核糖时， “相应的核苷类 似物” 含有例如连接至腺嘌呤碱基部分的改性的糖。
     术语 “寡聚物” 、 “寡聚化合物” 和 “寡核苷酸” 在本文所描述的方法的上下文中互换 使用， 并且是指通过例如磷酸酯基团 ( 在核苷之间形成磷酸二酯连接基 ) 或硫代磷酸酯基 ( 在核苷之间形成硫代磷酸酯连接基 )， 由两个或更多个连续单体的共价连接形成的分子。 所述寡聚物由 10-50 单体， 例如 10-30 单体组成或包含 10-50 单体， 例如 10-30 单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含本文提及的核苷或核苷类似物， 或它们的混合物。 “LNA 寡聚物” 或 “LNA 寡核苷酸” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡核苷酸。
     任选包括在寡聚物内的核苷类似物可以起到类似于相应核苷的作用， 或可以具有 特异的改进功能。 其中一些或全部单体是核苷类似物的寡聚物相对于天然形式常常是优选 的， 因为这样的寡聚物具有一些期望的性质， 例如， 穿透细胞膜的能力、 对细胞外和 / 或细 胞内核酸酶的良好耐受性， 以及对核酸靶的高亲和力和特异性。 例如， 为了赋予若干上述性 能， LNA 单体的特别优选的。
     在多个实施方案中， 存在于寡聚物内的一种或多种核苷类似物在功能上是 “沉默” 或 “等价” 于相应的天然核苷， 即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影 响。这样的 “等价” 核苷类似物可以仍然是有用的， 如果例如， 它们更容易或更便宜地制造， 或在保存或制备条件下更为稳定， 或者可纳入标签或标记。然而， 典型地， 所述类似物将对 寡聚物抑制表达的作用方式具有功能性影响 ； 例如， 通过产生对靶核酸的靶区域的提高的 亲和力， 和 / 或对细胞内核酸酶的提高的耐受性， 和 / 或更方便地转运到细胞中。
     因此， 在多个实施方案中， 用于本发明方法的寡聚物包含核苷单体和至少一个核 苷类似物单体， 例如 LNA 单体或其它核苷类似物单体。
     术语 “至少一个 ( 一种 )” 包含大于或等于 1 的整数， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 等等。在多个实施方案中， 例如当涉及本发明的化合物的核酸或蛋白质靶时， 术语 “至少一个 ( 一种 )” 包括术语 “至少两个 ( 种 )” 和 “至少三 个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。同样， 在一些实施方案中， 术语 “至少两个 ( 种 )” 包含术 语 “至少三个 ( 种 )” 和 “至少四个 ( 种 )” 。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-50 个连续单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个连续单体组成。
     在一些实施方案中， 寡聚物由 10-25 个单体， 优选 10-16 个单体， 和更优选 12-16 个单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-25 个连续单体， 10-24 个 连续单体， 12-25 或 12-24 或 10-22 个连续单体， 例如 12-18 个连续单体， 例如 13-17 或 12-16 个连续单体， 例如 13、 14、 15、 16 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含以下或由以下组成 ： 10-22 个连续单体， 或 10-18， 例如 12-18 或 13-17 或 12-16， 例如 13、 14、 15 或 16 个连续单体。
     在一些实施方案中， 寡聚物包含 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体或由 10-16 或 12-16 或 12-14 个连续单体组成。在其它实施方案中， 寡聚物包含 14-18 或 14-16 个连 续单体或由 14-18 或 14-16 个连续单体组成。 在多个实施方案中， 寡聚物包含 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体或由 10、 11、 12、 13 或 14 个连续单体组成。
     在多个实施方案中， 寡聚物由不超过 22 个连续单体， 例如不超过 20 个连续单体， 例如不超过 18 个连续单体， 例如 15、 16 或 17 个连续单体组成。在某些实施方案中， 寡聚物 包含小于 20 个连续单体。
     在多个实施方案中， 寡聚物不包含 RNA 单体。
     优选地， 用于本文所述方法的寡聚物是线性分子或在合成时呈线性。在这样的实 施方案中， 寡聚物是单链的分子， 典型地不包含与相同寡聚物内的另一区域互补的例如至 少 3、 4 或 5 个连续单体的短区， 使得所述寡聚物形成内双螺旋。在多个实施方案中， 所述寡 聚物基本上不是双链的， 即不是 siRNA。
     在一些实施方案中， 寡聚物由连续伸长的单体组成， 其序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定 ( 参见例如表 1-4)。在其它实施方案中， 寡聚物包含第一区域 ( 该区域由 连续伸长的单体组成 )， 和一个或多个另外的区域 ( 其由至少一个另外的单体组成 )。在一 些实施方案中， 第一区域的序列通过本文公开的 SEQ ID NO 加以确定。
     5.3. 缺口聚物 (gapmer) 设计
     典型地， 用于本发明方法的寡聚物是缺口聚物。
     “缺口聚物” 是包含连续伸长的单体的寡聚物， 所述单体能够募集如下文进一步描 述的 RNAse( 例如 RNAseH)， 例如至少 6 或 7 个 DNA 单体的区域 ( 本文中称作 B 区 )， 其中 B 区的 5’ 和 3’ 的侧翼分别称作 A 区和 C 区， A 区和 C 区各自包含以下或由以下组成 ： 核苷类 似物， 例如增强亲和力的核苷类似物， 如 1-6 个核苷类似物。
     通 常， 所 述 缺 口 聚 物 包 含 以 下 的 5’至 3’的 区 域 ： A-B-C， 或 任 选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ： A 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体 ； B 区由以下组成或包含以下 ： 至少 5 个能够募集 RNAse( 当 与靶 RNA 分子的互补靶区域， 如 mRNA 靶形成双螺旋时 ) 的连续单体， 例如 DNA 单体 ； C 区由
     以下组成或包含以下 ： 至少一个核苷类似物， 例如至少一个 LNA 单体， 如 1-6 核苷类似物， 如 LNA 单体， 和； D 区， 当存在时由以下组成或包含以下 ： 1， 2 或 3 个单体， 例如 DNA 单体。
     在多种实施方案中， A 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单 体； 和 / 或 C 区由 1， 2， 3， 4， 5 或 6 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， 如 2-5 个核苷酸类 似物， 如 2-5 个 LNA 单体， 如 3 或 4 个核苷酸类似物， 如 3 或 4 个 LNA 单体。
     在某些实施方案中， B 区由以下组成或包含以下 ： 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11 或 12 个能募 集 RNAse 的连续单体， 或 6-10， 或 7-9， 如 8 个能募集 RNAse 的连续单体。在某些实施方案 中， B 区由以下组成或包含以下 ： 至少一个 DNA 单体， 如 1-12 个 DNA 单体， 优选 4-12 个 DNA 单体， 更优选 6-10 个 DNA 单体， 如 7-10 个 DNA 单体， 最优选 8， 9 或 10 个 DNA 单体。
     在某些实施方案中， A 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成， B 区由 7， 8， 9 或 10 个 DNA 单体组成， 且 C 区由 3 或 4 个核苷酸类似物 ( 如 LNA 单体 ) 组成。这些设 计 包 括 (A-B-C)3-10-3， 3-10-4， 4-10-3， 3-9-3， 3-9-4， 4-9-3， 3-8-3， 3-8-4， 4-8-3， 3-7-3， 3-7-4， 4-7-3， 且可以进一步包括 D 区， 其可具有 1 个或 2 个单体， 如 DNA 单体。
     其它缺口聚物设计公开于 WO 2004/046160， 在此将其并入本文作为参考。 美国临时申请 60/977,409( 将其并入本文作为参考 ) 涉及 “短聚物 (shortmer)” 缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中， 此处给出的寡聚物可以是这类短聚物缺口聚物。
     在某些实施方案中， 该寡聚物由 10， 11， 12， 13 或 14 个连续单体组成， 其中寡聚物 区具有形式 (5’ -3’ )， A-B-C， 或任选 A-B-C-D 或 D-A-B-C， 其中 ； A 区由 1， 2 或 3 个核苷类 似物单体 ( 如 LNA 单体 ) 组成 ； B 区由 7， 8 或 9 个连续单体组成， 当与互补 RNA 分子 ( 如 mRNA 靶 ) 形成双螺旋时， 所述连续单体能够募集 RNAse ； 且 C 区由 1， 2 或 3 个核苷类似物单 体 ( 如 LNA 单体 ) 组成。当存在时， D 区由单一 DNA 单体组成。
     在某些实施方案中， A 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， A 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 1 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 2 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， C 区由 3 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 7 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B区 由 8 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区由 9 个 LNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含 1-9 个 DNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7 或 8 个 DNA 单体。在某些实施方案中， B 区由 DNA 单体组成。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L 构型的 LNA 单体， 如 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8 或 9 个 α-L- 构型的 LNA 单体。在某些实施方案中， B 区包含至少一个 α-L- 氧基 LNA 单 体。在某些实施方案中， B 区中所有 α-L- 构型的 LNA 单体是 α-L- 氧基 LNA 单体。在某些 实施方案中， 寡聚物的 A-B-C 区中存在的单体数选自 ( 核苷类似物单体 -B 区 - 核苷类似物 单 体 )： 1-8-1， 1-8-2， 2-8-1， 2-8-2， 3-8-3， 2-8-3， 3-8-2， 4-8-1， 4-8-2， 1-8-4， 2-8-4，或 ； 1-9-1， 1-9-2， 2-9-1， 2-9-2， 2-9-3， 3-9-2， 1-9-3， 3-9-1， 4-9-1， 1-9-4， 或； 1-10-1， 1-10-2， 2-10-1， 2-10-2， 1-10-3 和 3-10-1。在某些实施方案中， 本文所述寡聚物的 A-B-C 区中存在 的单体数选自 ： 2-7-1， 1-7-2， 2-7-2， 3-7-3， 2-7-3， 3-7-2， 3-7-4 和 4-7-3。 在某些实施方案 中， A 区和 C 区各自都由两个 LNA 单体组成， 且 B 区由 8 或 9 个核苷酸单体， 优选 DNA 单体 组成。
     在多个实施方案中， 其它缺口聚物设计包括以下那些 ： 其中 A 区和 / 或 C 区由 3， 4，
     5 或 6 个核苷类似物组成， 如含有 2’ -O- 甲氧基乙基 -RNA(2’ MOE) 的单体或含有 2’ - 氟 -DNA 的单体的核苷类似物， 且 B 区由 8， 9， 10， 11 或 12 个核苷， 如 DNA 单体组成， 其中 A-B-C 区具 有 5-10-5 和 4-12-4 个单体。其它缺口聚物设计公开于 WO 2007/146511A2 中， 在此将其并 入本文作为参考。
     5.4. 连接基
     本文所述寡聚物的单体通过连接基联结在一起。合适地， 各单体通过连接基连接 至 3’ 邻近的单体。
     术语 “连接基” 或 “核苷间连接 (internucleotide linkage)” 是指能够将两个连 续单体共价联结在一起的基团。具体且优选的实例包括磷酸基 ( 在邻近的核苷单体之间形 成磷酸二酯 ) 和硫代磷酸酯基 ( 在邻近的核苷单体之间硫代磷酸酯连接基 )。
     合适的连接基包括列于 WO 2007/031091 的那些， 例如列于 WO2007/031091 的第 34 页第一段的连接基 ( 在此将其并入本文作为参考 )。
     也就是说， 在多种实施方案中， 优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸 酶攻击更有耐受性的基团， 如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 这两个可被 RNase H 裂解， 也允许靶基因表达的 RNAse 调变反义抑制。
     在一些优选实施方案中， 优选本文所提供的合适含硫 (S) 连接基。在多个实施方 案中， 硫代磷酸酯连接基是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口 (gap) 区 (B)。在某些实施方 案中， 硫代磷酸酯连接用于将侧翼区 (A 和 C) 中的单体连接在一起。在多个实施方案中， 硫 代磷酸酯连接用于将 A 或 C 区连接至 D 区， 并且用于将 D 区内的单体连接在一起。
     在多个实施方案中， A、 B 和 C 区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基， 如磷酸二酯 连接， 特别地， 例如当使用核苷类似物防止 A 和 C 区内的连接基进行内切核酸酶降解 - 如当 A 和 C 区包含 LNA 单体时。
     在多个实施方案中， 邻近的寡聚物单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。
     应认识到将磷酸二酯连接， 如一个或两个连接， 与硫代磷酸酯一起纳入寡聚物， 特 别是与介于核苷类似物单体之间或相邻于核苷类似物单元 ( 典型地在 A 区和 / 或 C 区 ) 的 硫代磷酸酯一起， 可修饰寡聚物的生物利用度和 / 或生物分布 - 参见 WO 2008/053314， 在此 将其并入本文作为参考。
     在一些实施方案中， 如上述实施方案， 其中适当且非特异表明， 所有剩余的连接基 为磷酸二酯或硫代磷酸酯， 或它们的混合物。
     在一些实施方案中， 所有核苷间连接基是硫代磷酸酯。
     当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列， 例如本文提供的那些， 应理解在多种实施 方案中， 当该连接为硫代磷酸酯连接时， 可以使用如那些本文公开的其它连接， 例如可使用 磷酸酯 ( 磷酸二酯 ) 连接， 特别是用于核苷类似物， 如 LNA 单体之间的连接。
     5.5. 靶核酸
     术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 在本文中可互换使用， 并且定义为通过两个或更多个 如上所述单体的共价连接形成的分子。包括 2 个或更多个单体， “核酸” 可以具有任意长度， 并且该术语一般是指 “寡聚物” ， 其具有本文所述的长度。术语 “核酸” 和 “多核苷酸” 包括 单链、 双链断裂、 部分双链断裂， 和环状的分子。
     在多个实施方案中， 本文使用的术语 “靶核酸” 是指编码哺乳动物 HER3 多肽的核 酸 ( 如 DNA 或 RNA)， 所 述 HER3 多 肽 例 如 是 具 有 SEQ ID NO 197 中 的 序 列 的 人 HER3 mRNA， 或者具有以下序列的哺乳动物 mRNAs ： GenBank 编号 NM_001005915， NM_001982 与交 替 剪 接 形 式 NP_001973.2 和 NP_001005915.1( 人 ) ； NM_017218( 大 鼠 ) ； NM_010153( 小 鼠)； NM_001103105( 牛 ) ； 或具有 GenBank 编号的 XM_001491896( 马 )、 XM_001169469 和 XM_509131( 黑猩猩 ) 的预测 mRNA 序列。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动物 HER2 多肽的核酸 ( 例如， 具 有以下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_001005862 和 NM_004448( 人 ) ； NM_017003 和 NM_017218( 大鼠 ) ； NM_001003817( 小鼠 ) ； NM_001003217( 狗 ) ； 和 NM_001048163( 猫 ))。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括编码哺乳动 EGFR 多肽的核酸 ( 例如， 具有以 下的哺乳动物 mRNA ： GenBank 编号 NM_201284， NM_201283， NM_201282 和 NM_005228( 人 ) ； NM_007912 和 NM_207655( 小鼠 ) ； NM_031507( 大鼠 ) ； 和 NM_214007( 猪 ))。
     应认识到上述公开的 GenBank 编号是指 cDNA 序列而非 mRNA 序列本身。成熟 mRNA 的序列可以直接源自相应的 cDNA 序列， 胸腺嘧啶碱基 (T) 被尿嘧啶碱基 (U) 替代。
     在多个实施方案中， “靶核酸” 还包括 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码核酸或其天然存 在的变体， 以及由其衍生的 RNA 核酸， 优选 mRNA， 例如 pre-mRNA， 尽管优选成熟 mRNA。在多 种实施方式中， 例如， 当在研究或诊断中使用时， 所述 “靶核酸” 源自上述 DNA 或 RNA 靶核酸 的 cDNA 或合成的寡核苷酸。本文所述的寡聚物通常能够与靶核酸杂交。
     术语 “其天然存在的变体” 是指 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 多肽或核酸序列的变体， 其 在规定的分类群， 例如哺乳动物， 例如小鼠、 猴和优选人中天然地存在。 一般地， 当涉及多核 苷酸的 “天然存在的变体” 时， 该术语还可涵盖 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 编码基因组 DNA( 在 染色体 Chr 12 ： 54.76-54.78Mb 处通过染色体转位或复制存在的 )， 以及 RNA( 例如， 由此衍 生的 mRNA) 的任何等位变体。当提及具体多肽序列时， 例如， 该术语还包括天然存在形式的 蛋白质， 因此其可被加工， 例如， 通过其翻译时或翻译后修饰， 例如信号肽裂解、 蛋白酶裂解 (proteolytic cleavage)、 糖基化等等。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 通 过 Watson-Crick 碱 基 配 对、 Hoogsteen 氢 键 或 反 向 的 Hoogsteen 氢键， 在寡聚物的单体和靶核酸的单体之间， 本文所描述的寡聚物结合至靶核酸 的区域 (“靶区域” )。这样的结合也称作 “杂交” 。除非另外指明， 连接是通过互补碱基的 Watson-Crick 配对 ( 即腺嘌呤与胸腺嘧啶 (DNA) 或尿嘧啶 (RNA)， 和鸟嘌呤与胞嘧啶 )， 并 且寡聚物结合至靶区域， 这是因为该寡聚物的序列等同于， 或部分等同于靶区域的反向补 体的序列 ； 就本文而言， 寡聚物被认为是与靶区域 “互补” 或 “部分互补” ， 并且寡聚物序列相 对于靶区域序列的 “互补性” 百分数是相对于靶区域序列的反向补体的 “特性” 百分数。
     除非本文另外明确澄清， 本文的 “靶区域” 将是具有如下序列的靶核酸区域， 所述 序列是使用对位排列程序和下文所描述的参数， 与特定寡聚物的序列的反向补体 ( 或其区 域 ) 最佳对位排列。
     在确定用于本文所述方法的寡聚物 ( 或其区域 ) 和编码哺乳动物 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如本文公开的那些 ) 的靶区域之间的 “互补性” 程度中， “互补性” (也 是 “同源性” ) 的程度表示为寡聚物 ( 或其区域 ) 的序列和与其最佳对位排列的靶区域序列 的反向补体之间的相同性百分数。通过计算与 2 个序列之间相同的对位排列碱基的数目， 除以寡聚物中连续单体的总数， 并乘以 100 来计算百分数。在这样的比较中， 如果存在缺口(gap)， 优选是这些缺口仅仅是错配而不是一些下述区域， 其中缺口内单体数量在寡聚物和 靶区域之间不同。
     氨基酸和多核苷酸排列、 序列相同性百分数和互补度就本发明而言可以使用标准 设置的 ClustalW 算法确定 ： 参见 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html， 方 法： EMBOSS:: 水 ( 局部 ) ： 缺口产生 (Gap Open) ＝ 10.0， 缺口延伸 (Gap extend) ＝ 0.5， 使 用 Blosum 62( 蛋白质 )， 或用于核苷酸 / 核碱基序列的 DNAfull。
     如应理解的是， 取决于上下文， “错配” 是指序列的不相同性 ( 如， 例如在寡聚物的 核碱基序列和结合至它的靶区域的反向补体之间 ； 如， 例如在两个对位排列的编码核酸的 HER3 的碱基序列之间 )， 或是指序列的不互补性 ( 如， 例如， 在寡聚物和结合至它的靶区域 之间 )。
     合适地， 寡聚物 ( 或缀合物， 如以下进一步描述 ) 能够抑制 ( 例如通过下调 ) HER3( 或 HER2 或 EGFR) 基因的表达。
     在多个实施方式中， 与正常的表达水平相比， 本文所述寡聚物产生至少 10 ％， 至 少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 表达抑制作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％的抑制。在多个实施方式中， 与正常的表达 水平相比， 所述寡聚物产生至少 10％， 至少 20％的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 蛋白质表达抑制 作用， 更优选与正常的表达水平相比至少 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％或 95％ 的抑制。在一些实施方案中， 当使用 1nM 所述寡聚物或缀合物用于本发明的方法时可看到 这种抑制。在多个实施方案中， 当使用 25nM 所述寡聚物或缀合物时可看到这种抑制。
     在多个实施方案中， mRNA 表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如 低于 98％的抑制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。 在多 个实施方案中， 蛋白质表达的抑制低于 100％ ( 即， 小于完全表达抑制 )， 例如低于 98％的抑 制、 低于 95％抑制、 低于 90％抑制、 低于 80％抑制， 例如低于 70％抑制。
     或者， 表达水平的调节可以通过测量 mRNA 的水平， 例如通过 RNA 印迹或定量 RT-PCR 来确定。当通过 mRNA 水平测量时， 在使用合适的剂量， 1 和 25nM 浓度时， 在多种实 施方式中， 抑制的水平一般达到不存在所述化合物的情况下正常水平的 10-20％的水平。
     表达水平的调节 ( 即抑制或提高 ) 还可以通过测量蛋白水平来确定， 例如， 通过例 如 SDS-PAGE 随后使用针对靶蛋白产生的适合的抗体的蛋白质印迹的方法。
     在一些实施方案中， 本发明提供了抑制 ( 例如下调 ) 一个或多个交替剪接的同 种型 HER3 mRNA 和 / 或由其衍生的蛋白质的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 本发明 提供了抑制一个或多个交替剪接的蛋白质同种型 HER3(GenBank 编号 No.NP_001973.2 和 NP_001005915.1) 的表达和 / 或编码 HER3 蛋白质同种型 (GenBank 编号 No.NM_001982 和 NM_001005915.1) 的核酸的表达的寡聚物。在一些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 的 mRNA 是靶核酸。在其它实施方案中， 编码 HER3 同种型 2 的 mRNA 是靶核酸。在某些实施方案中， 编码 HER3 同种型 1 和 HER3 同种型 2 的核酸都是靶核酸， 例如具有 SEQ ID NO ： 180 的序列 的寡聚物。
     在多个实施方案中， 寡聚物或其第一区域具有与 HER3 核酸中靶区域的序列互补 的碱基序列， 该寡聚物下调 HER3 mRNA 和 / 或 HER3 蛋白质表达并且下调一个或多个其它 ErbB 受体酪氨酸激酶家族成员， 例如 HER2 和 / 或 EGFR 的 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。有效地结合至二个不同的 ErbB 受体家族核酸的靶区域 ( 例如 HER2 和 HER3 mRNA) 且下调两个 靶的 mRNA 和 / 或蛋白质表达的寡聚物或其第一区域被称为 “双特异性的” 。结合至三个不 同的 ErbB 受体家族成员的靶区域且能够有效地下调所有三个基因的寡聚物或其第一区域 被称为 “三特异性的” 。 在多个实施方案中， 反义寡核苷酸可以呈多特异性， 即能够结合至受 体酪氨酸激酶的 ErbB 家族的多个成员的靶核酸的靶区域且下调它们的表达。如本文所使 用的， 术语 “双特异性” 和 “三特异性” 不以任何方式理解为是限制性的。举例来说， “双特 异性寡聚物” 可能对第三靶核酸具有某些效果， 而 “三特异性寡聚物” 可能对它的 3 个靶核 酸之一具有非常弱的因而不明显的效果。
     在多个实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 核酸中的靶 区域和 HER2 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 和 HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在某些实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 HER2 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达下调至相同程度。 在其它优选实施方案中， 双特异性寡聚物或其第一区域， 能 够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域和 EGFR 靶核酸中的靶区域并且有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。 在多个实施方案中， 双特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。在仍其它实 施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够结合至 HER3 靶核酸中的靶区域， 和结合至 受体酪氨酸激酶靶核酸的两个其它 ErbB 家族中的靶区域并且有效地下调受体酪氨酸激酶 的 ErbB 家族的两个其它成员的 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质与 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个优选的实施方案中， 三特异性寡聚物或其第一区域， 能够有效地下调 HER3 mRNA 和 / 或 蛋白质的表达， HER2 mRNA 和 / 或蛋白质的表达， 以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在 多个实施方案中， 三特异性寡聚物没有将 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质， HER2 mRNA 和 / 或蛋白 质以及 EGFR mRNA 和 / 或蛋白质的表达下调至相同程度。
     在多个实施方案中， 本发明因此提供了抑制 ( 例如通过下调 ) 癌细胞中 HER3 蛋白 质和 / 或 mRNA 的表达的方法， 所述癌细胞表达 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 且耐受用蛋白酪氨 酸激酶抑制剂治疗， 该方法包括使所述细胞与本文所述有效抑制 ( 例如下调 ) 所述细胞中 HER3 蛋白质和 / 或 mRNA 的表达的量的寡聚物或缀合物接触。合适地， 所述细胞是哺乳动 物细胞， 例如人细胞。在某些实施方式中， 可以在体外进行给药。在其它实施方案中， 可以 通过将本文所述的化合物或缀合物给药到哺乳动物， 在体外实施接触。 在多个实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 HER2 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 HER2 mRNA 的序列 显示为 SEQIDNO ： 199。在仍其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制 剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白和 / 或 mRNA 的表达以及 EGFR 蛋白和 / 或 mRNA 的表达的方法。人 EGFR mRNA 的序列显示为 SEQIDNO ： 198。在还其它实施方案中， 本发明提供了在耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的细胞中， 抑制 ( 例如通过下调 )HER3、 HER2 和 EGFR mRNA 和 / 或蛋白的表达的方法。
     本文所述的寡聚物通常结合至人 HER3 和 / 或人 HER2 和 / 或人 EGFR mRNA 的靶 区域， 且因此， 包含以下或由以下组成 ： 具有与例如 SEQ ID NO 197、 SEQ ID NO ： 198 和 / 或 SEQ ID NO ： 199 的碱基序列互补或部分互补的碱基序列的区域。在某些实施方案中， 当与 SEQ ID NO ： 197、 198 或 199 的最佳对准靶区域的序列相比时， 本文所述寡聚物的序列可以任选包含 1、 2、 3、 4 或更多个碱基错配。
     在一些实施方案中， 本文所述的寡聚物具有与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相同的序列 ( 参见下文表 1)。在其它实施方案中， 当与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列相比时， 所述寡聚物具有 1、 2 或 3 个碱基不同的序列。 在一些实施方案中， 所述寡聚物由 10-16 个连续单体组成或包含 10-16 个连续单体。由 16 个连续单体构成的寡聚物的序列的实例为 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140。较短序列可由其 衍生， 例如， 较短寡聚物的序列可以等同地存在于选自具有 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的碱基序列的那些的寡聚物的区域中。 较长寡聚物可以包括具有至少 10 个连续单 体的序列的区域， 所述连续单体等同地存在于 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 中。
     还提供了含有靶区域的靶核酸 ( 例如编码 HER3 的 DNA 或 mRNA)， 所述靶区域与 SEQ ID NO ： 1-140 的寡聚物中的一种或多种互补或部分 - 互补， 其中所述寡聚物能够抑制 ( 例如通过下调 )HER3 蛋白质或 mRNA 的表达。例如， 在图 1 中显示了人 HER3 mRNA 的与具 有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的反义寡聚物互补的靶区域 ( 粗体和下划线的， 具有上 文所述的相应的寡聚物 SEQ ID NO)。
     在多个实施方案中， 寡聚物具有 SEQ ID NO ： 141-168 中所示的碱基序列。 在某些实 施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如， 具有 SEQ ID NO ： 169-196 和 234 的序列的那些， 特别 是具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 的碱基序列的那些。在多个实施方案中， 寡聚物是 LNA 寡聚物， 例如具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 172、 174、 175、 176 和 179 的碱基序列的那些。在一些实施方案中， 寡聚物或其区域由 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的碱基序列组成或包含 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所 示的碱基序列。在一些实施方案中， 缀合物包括具有 SEQ ID NO ： 169、 180 或 234 中所示的 碱基序列的寡聚物。
     在某些实施方案中， 本文所述寡聚物可以合适地包含具有特定序列， 例如选自 SEQ ID NO ： 200-227， 即等同地存在于较短寡聚物中的序列的区域。 优选地， 所述区域包含 10-16 个单体。例如， 具有 SEQ ID NO ： 200-227 的碱基序列的寡聚物各自包含如下区域， 其中所 述区域的序列分别等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 和 140 的序列的较短寡聚物中。 在一些实施方案中， 具有比 16 个更少的单体， 例如 10、 11、 12、 13、 14、 或 15 个单体的寡聚 物， 具有至少 8、 至少 9、 至少 10、 至少 11、 至少 12、 至少 13、 至少 14 或 15 个区域， 所述序列 的连续单体的等同地存在于具有 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 的序列的寡聚物中。因此， 在 多个实施方案中， 较短寡聚物的序列源于较长寡聚物的序列。 在一些实施方案中， 具有本文 公开的 SEQ ID NO 的寡聚物的序列， 或其至少 10 个连续单体的序列， 都等同地存在于较长 寡聚物中。通常， 寡聚物包含具有等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的序列的第 一区域， 如果与等同地存在于 SEQ ID NO ： 1、 16、 17、 18、 19、 34、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 74、 75、 76、 91、 92、 107、 122、 137、 138、 139 或 140 中的第一区域相比， 所述寡聚物更长， 则所述寡聚物的侧翼区具有与在靶核酸的靶区域的侧翼的序列互补的序列。两种这 样的寡聚物是 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 54。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含或由这样的单体序列构成， 所述单体序列与编码 哺乳动物 HER3 的靶核酸的靶区域完全互补 ( 完美互补 )。
     然而， 在一些实施方案中， 寡聚物的序列在与 HER3 靶核酸的最佳对位排列靶区域 相比时包括 1、 2、 3 或 4 个 ( 或更多个 ) 错配， 并且仍充分地结合到靶区域以实现 HER3 mRNA 或蛋白质表达的抑制。错配对 Watson-Crick 氢键结合双螺旋的失稳效应可以例如通过增 加寡聚物的程度和 / 或增加寡聚物内存在的核苷类似物 ( 例如 LNA 单体 ) 的数目得到弥补。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物碱基序列包含相对于 ( 例如编码哺乳动物 HER3 的 靶核酸的 ) 最佳对位排列靶区域碱基序列不超过 3 个， 例如不超过 2 个的错配。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与选自 SEQ ID NO ： 200-227、 1-140 和 228-233 的序列至少 80％相同， 例如至少 85％、 至少 90％、 至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％相 同， 甚至 100％相同。
     本发明所述寡聚物或其区域的碱基序列或连续核碱基序列优选与 SEQ ID NO ： 197、 198 和 / 或 199 中存在的靶区域的序列至少 80 ％互补， 例如至少 85 ％、 至少 90 ％、 至 少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％互补， 甚至 100％互补。 在多个实施方案中， 寡聚物的序列 ( 或其第一区域 ) 选自 SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或者选自 SEQ ID NOs ： 200-227， 1-140 和 228-233 的至少 10 个连续单体。 在其它实施方案中， 寡聚物的序列或其第一区域任选包含 1、 2 或 3 个碱基部分， 当与所述选 定序列或其区域最佳对位排列时， 该碱基部分不同于具有如下序列的寡聚物中的那些 ： SEQ ID NOs ： 200-227、 1-140 和 228-233， 或其至少 10 个连续单体的序列。
     在某些实施方案中， 单体区域由以下构成 ： 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26， 27， 28， 或 29 个连续单体， 例如 10-15， 12-25， 12-22， 例如 12-18 个单体。 合适地， 在多个实施方案中， 所述区域与寡聚物具有相同的长度。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 或 3’ 端包含另外的单体， 例如， 独立地， 1， 2， 3， 4 或 5 个另外的寡聚物单体 5’ 末端和 / 或 3’ 末端， 其与靶区域的序列呈非互补性。在多个实 施方案中， 寡聚物包含与所述靶互补的区域， 该区域通过另外的单体在 5’ 和 / 或 3’ 侧翼。 在多种实施方式中， 所述区域的 3’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单元。3’ DNA 单体常 常在寡聚物的固态合成期间使用。 在多种实施方式中， 其可以是相同的或不同的， 所述寡聚 物的 5’ 末端侧翼是 1、 2 或 3 个 DNA 或 RNA 单体。在某些实施方式中， 附加的 5’ 或 3’ 单体 是天然存在的核苷， 例如 DNA 或 RNA 单体。在多种实施方式中， 5’ 或 3’ 单体可以代表如本 文缺口聚物寡聚物的上下文中所涉及的 D 区。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 200 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 201 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据
     SEQ ID NO ： 202 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 203 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 204 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 205 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 206 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 207 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 208 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 209 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 210 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 211 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 212 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 213 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 214 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 215 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 216 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 217 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 218 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 219 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 220 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 221 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 222 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 223 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 224 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 225 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 226 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     在某些实施方式中， 寡聚物包含以下连续单体或由以下连续单体组成 ： 具有根据 SEQ ID NO ： 227 或根据其区域的核碱基序列的连续单体。
     序列比对 ( 例如上述那些 ) 也可以用于鉴定编码来自人和一个或多个不同哺乳动 物物种如猴、 小鼠和 / 或大鼠的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的区域， 其中该区域在所述 物种两者或多者之间具有足够长度的核酸一致度 (identity)， 以允许设计同时靶向 ( 即， 其与足够的特异性结合以抑制 ) 人 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 靶核酸和不同哺乳动物物种中 存在的相应核酸的寡核苷酸。
     在一些实施方案中， 这样的寡聚物由由以下区域组成或包含以下区域 ： 至少 10 个、 例如至少 12 个、 例如至少 14 个、 例如至少 16 个、 例如至少 18 个， 例如 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17 或 18 个连续单体， 所述连续单体与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸的靶区域序列 100％序列互 补。
     在一些实施方式中， 用于本发明方法的寡聚物包含连续连续单体区域或由连续单 体区域组成， 所述连续单体区域的序列与编码来自人的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸、 以 及编码来自不同哺乳动物物种的 HER3( 或 HER2 或 EGFR) 的核酸 ( 例如编码 HER3 的小鼠 核酸 ) 的靶区域序列至少 80％、 例如至少 85％、 例如至少 90％、 例如至少 95％、 例如至少 98％、 例如至少 99％、 或 100％互补。优选是， 所述寡聚物的连续核碱基序列与人 HER3( 或 HER2 或 EGFR)mRNA 的靶区域 100％互补。
     在一些实施方案中， 本文描述的寡聚物结合到 HER3 靶核酸的靶区域并且下调 HER3 mRNA 和 / 或蛋白质的表达。在多个实施方案中， 结合到 HER3 核酸靶区域的本文所述 寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169-196 和 234 中所示的序列。
     在一些实施方案中， 本文描述的双特异寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶 区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 HER2 核酸的靶区域， 所述寡聚物下调 HER3 和 HER2 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同程度下调 HER3 和 HER2 的表达。在一些 实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同的。 在多个实施方案中， 寡聚物的第一区 域和第二区域重叠。在某些实施方案中， 与 HER3 核酸的靶区域和 HER2 核酸的靶区域结合 的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 177 和 178 中所示的序列。在仍其它实施方案中， 双 特异寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域， 并且下调 HER3 和 EGFR 的表 达。在一些实施方案中， 结合到 HER3 核酸的靶区域和 EGFR 核酸的靶区域的双特异寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 171 和 173 中所示的序列。在一些实施方案中， 本文所述双特异寡聚 物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 双特异寡聚物的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 双特异寡聚物以不同 程度下调 HER3 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域是相同 的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一区域和第二区域重叠。在还其它实施方案中， 本文述 的三特异性寡聚物结合到 HER3 核酸的靶区域， 结合到 HER2 核酸的靶区域， 结合到 EGFR 核 酸的靶区域， 并且下调所有三个基因的表达。 在一些实施方案中， 结合到 HER3、 HER2 和 EGFR 的三特异性寡聚物具有例如 SEQ ID NOs ： 169、 170、 172、 174-176 和 179 中所示的序列。在 一些实施方案中， 三特异性寡聚物的第一区域结合到 HER3 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物 的第二区域结合到 EGFR 核酸的靶区域， 三特异性寡聚物的第三区域结合到 HER2 核酸的靶 区域， 并且所述寡聚物下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在多个实施方案中， 三特异性寡聚 物以不同程度下调 HER3、 HER2 和 EGFR 的表达。在一些实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和 第三区域是相同的。在多个实施方案中， 寡聚物的第一、 第二和第三区域重叠。在多个实施 方案中， 双特异或三特异性寡聚物在与例如靶核酸的最佳对位排列靶区域相比时具有 1、 2、 3、 4、 5 或更多个错配， 所述靶核酸具有例如 SEQ ID NO ： 197， 198 和 / 或 199 中所示的序列。
     5.6. 核苷和核苷类似物
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个单体是包含修饰碱基的核苷类 似物， 所述碱基例如选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿 嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤、 2- 氯 -6- 氨基嘌呤、 黄嘌呤和次黄嘌呤。
     在多个实施方案中， 寡聚物中存在的单体中的至少一个是含有修饰糖的核苷类似 物。
     在一些实施方案中， 寡聚物的至少 2 个连续单体之间的连接基是除磷酸二酯连接 基外。
     在某些实施方案中， 寡聚物包括至少一个具有修饰碱基的单体， 至少一个具有修 饰糖的单体 ( 它们可以是相同的单体 ) 和至少一个非天然产生的单体内连接基。
     用于本文所述寡聚物核苷类似物的具体实例由例如 Freier & Altmann ； Nucl。 Acid Res.， 1997， 25， 4429-4443 和 Uhlmann ； Curr。Opinion in Drug Development， 2000， 3(2)， 293-213 中以及方案 1( 其中一些核苷类似物以核苷进行显示 ) 中所描述 ：
    方案 1
     因此寡聚物可以包含或由以下构成 ： 单序列的核苷 - 优选 DNA 单体， 但是还可能是 RNA 单体， 或者核苷和一种或多种核苷类似物的组合。在一些实施方案中， 这样的核苷类似 物合宜地提高寡聚物对靶核酸的靶区域的亲和性。
     适合的和优选核苷酸类似物的实例在 WO2007/031091 中描述， 因而在此引用作为 参考， 或参考其中的内容。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖部分， 该糖部分经修饰以提供 2’ - 取代基， 例如 2’ -O- 烷基 - 核糖、 2’ - 氨基 - 脱氧核糖和 2’ - 氟 - 脱氧核糖。
     在一些实施方案中， 核苷类似物包含糖， 在该糖中存在产生双环糖 (LNA) 的桥接 结构， 其提高结合亲和性并且还可以提供一些提高的核酸酶耐受性。在多个实施方案中， LNA 单体选自氧 -LNA( 例如 β-D- 氧基 -LNA， 和 α-L- 氧基 -LNA)， 和 / 或氨基 -LNA( 例如 β-D- 氨基 -LNA 和 α-L- 氨基 -LNA) 和 / 或硫基 -LNA( 例如 β-D- 硫基 -LNA 和 α-L- 硫 基 -LNA) 和 / 或 ENA( 例如 β-D-ENA 和 α-L-ENA)。在某些实施方式中， 所述 LNA 单体是
     β-D- 氧基 -LNA。下面进一步描述了 LNA 单体。
     在多个实施方案中， 在寡聚物中纳入增强亲和性的核苷类似物， 例如 LNA 单体或 含 2’ - 取代糖的单体， 或者纳入修饰的连接基， 提供了提高的核酸酶耐受性。在多个实施方 案中， 纳入这样的增强亲和性的核苷类似物允许降低寡聚物的大小， 并且在发生非特异性 或异常结合之前还降低上限至寡聚物的大小。
     在某些实施方式中， 所述寡聚物包含至少 2 个核苷酸类似物。在一些实施方式中， 所述寡聚物包含 3-8 个核苷酸类似物， 例如 6 个或 7 个核苷酸类似物。在优选实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物是锁核酸 (LNA) 单体 ； 例如， 至少 3 或至少 4、 或至少 5、 或至少 6、 或至少 7、 或 8 个核苷酸类似物是 LNA 单体。在一些实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。
     可认识到， 当提及优选的寡聚物碱基序列时， 在某些实施方案中所述寡聚物包含 相应的核苷类似物， 例如相应的 LNA 单体或其它相应的核苷类似物， 这提高了寡聚物 / 靶区 域双螺旋 ( 即增强亲和性的核苷类似物 ) 的双螺旋稳定性 (Tm)。
     在多个优选实施方案中， 寡聚物的碱基序列和靶区域的碱基序列之间的任何错配 ( 即， 非互补性 )， 如果存在， 位于除含增强亲和性的核苷类似物的寡聚物区域 ( 例如区域 A 或 C) 外的区域， 例如在本文提及的区域 B 中， 和 / 或在本文提及的区域 D 中， 和 / 或在 5’ 或 3’ 连接到与靶区域互补的寡聚物区域的区域中。 在一些实施方案中， 寡聚物内 ( 例如在本文提及的区域 A 和 C 中 ) 存在的核苷 类似物独立地选自例如 ： 含 2’ -O- 烷基 - 核糖的单体， 含 2’ - 氨基 - 脱氧核糖的单体， 含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的单体， LNA 单体， 含树胶醛醣的单体 (“ANA 单体” )， 含 2’ - 氟 - 树胶醛 醣的单体， 含 d- 阿拉伯糖基 - 己糖醇糖的单体 ( “HNA 单体” )， Christensen， Nucl。Acids. Res.30 ： 4918-4925(2002) 中定义的插层 (intercalating) 单体 ( 将其并入本文作为参 考 )， 和含 2’ MOE 糖的单体。在某些实施方案中， 寡聚物或其区域中仅存在一种上述类型的 核苷类似物。
     在 某 些 实 施 方 案 中， 核 苷 类 似 物 含 有 2’ -O- 甲 氧 基 乙 基 - 核 糖 (2’ MOE)， 或 2’ - 氟 - 脱氧核糖或 LNA 糖， 因此本发明的寡核苷酸 (oligonucleotide) 可以包含独立地 选自这三种类型的核苷类似物。在某些含核苷类似物的寡聚物实施方式中， 至少一个所述 核苷类似物含有 2’ -MOE- 核糖， 例如含 2’ -MOE- 核糖的 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 或 10 核苷类似 物。在某些实施方式中， 至少一个所述核苷酸类似物含有 2’ - 氟 - 脱氧核糖， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个含 2’ - 氟 - 脱氧核糖的苷酸类似物。
     在多种实施方式中， 本文所述寡聚物包含至少一个锁核酸 (LNA) 单元， 例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 或 8 个 LNA 单体， 例如 3-7 个或 4-8 个 LNA 单体， 或 3、 4、 5、 6 或 7 个 LNA 单体。在 多种实施方式中， 所有的核苷酸类似物是 LNA 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物同时包 含 β-D- 氧基 -LNA 单体以及一种或多种以下的 LNA 单体元 ： β-D 或 α-L 构型的硫基 -LNA 单体、 氨基 -LNA 单体、 氧基 -LNA 和 / 或 ENA 或其组合。在某些实施方案中， 寡聚物中所有 LNA 单体的胞嘧啶碱基部分是 5- 甲基胞嘧啶。在本发明的某些实施方式中， 寡聚物同时包 含 LNA 和 DNA 单体。典型地， LNA 和 DNA 单体的组合的总数是 10-25 个， 优选 10-20 个， 再 更优选 12-16 个。在本发明的某些实施方案中， 寡聚物或其区域包括至少一个 LNA 单体， 其 余单体是 DAN 单体。在某些实施方式中， 所述寡聚物仅包含 LNA 单体和核苷 ( 例如 RNA 或
     DNA 单体， 最优选 DNA 单体 )， 任选与改性连接基例如例如硫代磷酸酯连接。
     在多种实施方式中， 所述寡聚物中存在的至少一个核苷类似物具有修饰的碱基， 其选自 5- 甲基胞嘧啶、 异胞嘧啶、 假异胞嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 5- 丙炔基尿嘧啶、 6- 氨基嘌呤、 2- 氨基嘌呤、 肌苷、 二氨基嘌呤和 2- 氯 -6- 氨基嘌呤。
     5.7.LNA
     术语 “LNA” 是指含二环糖 (“LNA 糖” ) 的核苷酸类似物。术语 “LNA 寡核苷酸” 和 “LNA 寡聚物” 是指含有一个或多个 LNA 单体的寡聚物。
     本 发 明 的 寡 核 苷 酸 化 合 物 中 使 用 的 LNA 优 选 具 有 通 式 I 的 结 构， 及其碱盐 (basicsalts) 和酸加成盐。
    其中 X 选自 -O-、 -S-、 -N(RN*)-、 -C(R6R6*)- ；
     B 选自氢、 任选取代的 C1-4- 烷氧基、 任选取代的 C1-4- 烷基、 任选取代的 C1-4- 酰基氧 基、 核碱基、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基 (report group) 和 配体 ；
     P 表示与在后的单体之间的核苷酸间连接 (internucleotide linkage) 的基团位 置， 或 5’ - 末端基团， 该核苷酸间连接或 5’ - 末端基团任选包括取代基 R5 或等同适用取代 基 R5* ；
     P* 表示与在前的单体的核苷酸间连接， 或 3’ - 末端基团 ； 4* 2*
     R 和 R 一 起 表 示 由 1-4 个 选 自 下 列 的 基 团 / 原 子 组 成 的 二 价 基 团 (biradical) ： -C(RaRb)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-、 -C(Ra) ＝ N-、 -O-、 -Si(Ra)2-、 -S-、 -SO2-、 -N(Ra)和＞ C ＝ Z，
     其中 Z 选自 -O-、 -S- 和 -N(Ra)-， 且 Ra 和 Rb 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷 基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰 基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰 基氧基、 磺基 (sulphono)、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体， 其中芳基 a b 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的 (geminal) 取代基 R 和 R 一起可表示任选取代 的亚甲基 ( ＝ CH2)， 以及存在的取代基 R1*、 R2、 R3、 R5、 R5*、 R6 和 R6* 各自独立地选自氢、 任选取 代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷 氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧
     基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷 基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲 基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷 基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 信息基和配体、 其中芳基 和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、 硫代、 亚氨基或任选取 代的亚甲基， 或一起可形成由 1-5 个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团， 所述亚烷基链 任选插入一个或多个杂原子 / 基团和 / 或被一个或多个杂原子 / 基团终止， 所述杂原子 / N N 基团选自 -O-、 -S- 和 -(NR )-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基， 且其中两个相邻的 ( 非成对的 ) N* 取代基可表示另一键， 导致形成双键 ； 且R ， 当存在且不涉及二价基团时， 选自氢和 C1-4- 烷 基； 以及它们的碱性盐和酸加成盐。
     在多种实施方案中， R5* 选自 H， -CH3， -CH2-CH3， -CH2-O-CH3 和 -CH ＝ CH2。 4* 2*
     在多种实施方案中， R 和 R 一起表示二价基团， 其选自 -C(RaRb)-O-、 -C(RaRb)-C(R c d R )-O-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、 -C(RaRb) -C(RcRd)-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、 -C(Ra) ＝ C(Rb)-C(RcRd)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-、 -C(RaRb)-C (RcRd)-N(Re)-、 -C(RaRb)-N(Rc)-O- 和 -C(RaRb)-S-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-， 其中 Ra、 Rb、 Rc、 Rd、 Re 和 Rf 各自独立地选自氢、 任选取代的 C1-12- 烷基、 任选取代的 C2-12- 烯基、 任选取代的 C2-12- 炔 基、 羟基、 C1-12- 烷氧基、 C2-12- 烷氧基烷基、 C2-12- 烯基氧基、 羧基、 C1-12- 烷氧基羰基、 C1-12- 烷 基羰基、 甲酰基、 芳基、 芳基氧基 - 羰基、 芳基氧基、 芳基羰基、 杂芳基、 杂芳基氧基 - 羰基、 杂 芳基氧基、 杂芳基羰基、 氨基、 单和二 (C1-6 烷基 ) 氨基、 氨基甲酰基、 单和二 (C1-6- 烷基 )- 氨 基 - 羰基、 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 单和二 (C1-6- 烷基 ) 氨基 -C1-6- 烷基 - 氨基羰基、 C1-6- 烷基 - 羰基氨基、 脲基、 C1-6- 烷酰基氧基、 磺基、 C1-6- 烷基磺酰基氧基、 硝基、 叠氮基、 硫 基 (sulphanyl)、 C1-6- 烷基硫基、 卤素、 DNA 嵌入剂、 光化学活性基、 热化学活性基、 螯合基、 a b 信息基和配体， 其中芳基和杂芳基可任选被取代， 且其中两个成对的取代基 R 和 R 一起可 表示任选取代的亚甲基 ( ＝ CH2)，
     在其它实施方案中， R4* 和 R2* 一起表示二价基团， 其选自 -CH2-O-、 -CH2-S-、 -CH2-NH -、 -CH2-N(CH3)-、 -CH2-CH2-O-、 -CH2-CH(CH3)-、 -CH2-CH2-S-、 -CH2-CH2-NH-、 -CH2-CH2-CH2-、 -CH2-C H2-CH2-O-、 -CH2-CH2-CH(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH2-O-CH2-O-、 -CH2-NH-O-、 -CH2-N(CH3)-O-、 -CH2-O-CH2-、 -CH(CH3)-O-、 -CH(CH2-O-CH3)-O-。
     对于所有手性中心， 不对称的基团可为 R 或 S 取向。
     优选地， 本发明的寡聚物中使用的 LNA 包括至少一个根据任一下式的 LNA 单元
    其中 Y 为 -O-、 -O-CH2-、 -S-、 -NH- 或 N(RH) ； Z 和 Z* 独立地选自核苷酸间连接基、 末端基团或保护基 ； B 构成天然或非天然核酸的未修饰碱基部分或修饰碱基部分， 以及 RH选自氢和 C1-4- 烷基。
     特别优选的 LNA 单元示于方案 2 ：
    术语″硫基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 选自 S 或 -CH2-S- 的 LNA 单体。硫 基 -LNA 可为 β-D 和 α-L- 构型。
     术 语 ″ 氨 基 -LNA ″ 是 指 其 中 上 述 通 式 中 的 Y 选 自 -N(H)-、 N(R)-、 CH2-N(H)- 和 -CH2-N(R)-， 其中 R 选自氢和 C1-4- 烷基的 LNA 单体。氨基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″氧基 -LNA″是指其中上述通式中的 Y 表示 -O- 或 -CH2-O- 的 LNA 单体。氨 基 LNA 可以是 β-D 构型或 α-L 构型。
     术语″ ENA″是指其中上述通式中的 Y 为 -CH2-O-( 其中 -CH2-O- 的氧原子连接至 相对碱基 B 的 2’ - 位 ) 的 LNA 单体。
     在优选实施方案中， LNA 单体选自 β-D- 氧基 -LNA 单体， α-L- 氧基 -LNA 单体， β-D- 氨基 -LNA 单体， β-D- 硫基 -LNA 单体， 特别是 β-D- 氧基 -LNA 单体。
     在本文中， 术语″ C1-4- 烷基″是指直链或支链的饱和烃链， 其中该链具有 1 至 4 个碳原子， 如甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁基和叔丁基。
     5.8.RNAse H 募集
     在一些实施方案中， 寡聚物通过靶 mRNA 的非 RNase 调变降解发挥作用， 例如通过 翻译的空间阻碍或者其它机制 ； 然而， 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物能够募集核糖核
     酸内切酶 (RNase)， 例如 RNase H。
     典型地， 寡聚物包含至少 6 个， 例如至少 7 个连续单体， 例如至少 8 或至少 9 个连续 单体的区域， 包括 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15 或 16 个连续单体的区域， 其在与靶 RNA 的靶 区域形成双螺旋时能够募集 RNase。能募集 RNAse 的寡聚物区域可为本文所述的缺口聚物 (gapmer) 涉及的 B 区。在某些实施方案中， 能募集 RNAse 的寡聚物区域 ( 如 B 区 ) 由 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19 或 20 个单体构成。
     EP 1222309 提 供 了 体 外 测 定 RNaseH 活 性 的 方 法， 其可用于测定寡聚物募集 RNaseH 的能力。使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当与 RNA 靶的互补靶区 域接触时， 具有的初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为至少 1％， 如至少 5％， 如至少 10％或 少于 20％寡核苷酸具有相同的碱基序列， 但是仅含有 DNA 单体， 没有 2’ 取代， 且在寡核苷酸 中的所有单体间具有硫代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H， 将所述文献并入 作为参考。
     在多种实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 少于使用寡核苷 酸所测定的初始速率的 1％， 如少于 5％， 如少于 10％或少于 20％， 所述寡核苷酸具有相同 的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫代磷 酸酯连接基， 则认为该寡聚物基本不能募集 RNase H。
     在其它实施方案中， 使用 EP 1222309 的实施例 91-95 提供的方法， 如果当接触 RNA 靶的互补靶区域和 RNaseH 时， 该 RNaseH 初始速率 ( 以 pmol/l/min 测量 )， 为使用寡核苷酸 所测定的初始速率的至少 20％， 如至少 40％， 如至少 60％， 如至少 80％， 所述寡核苷酸具有 相同的碱基序列、 但是仅含有 DNA 单体、 没有 2’ 取代且在寡核苷酸中的所有单体间具有硫 代磷酸酯连接基， 则认为该寡聚物能募集 RNase H。
     典型地， 与靶 RNA 的互补靶区域形成双螺旋并且能够募集 RNase 的寡聚物区域， 含有 DNA 单体和 LNA 单体并且与所述靶区域形成类似双螺旋的 DNA/RNA。LNA 单体优选为 α-L 构型， 特别优选为 -L- 氧基 LNA。
     在多个实施方案中， 寡聚物包含核苷和核苷类似物二者， 并且为如上所定义的缺 口聚物 (gapmer)、 头聚物 (headmer) 或混合聚物 (mixmer) 的形式。
     “头聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部 (5’ -most) 单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物， 第二区域包含 RNAse 可识别和断开的连续伸长的 ( 例如至少 7 个连 续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体。
     “尾聚物” 定义为包含连续的第一区域和第二区域的寡聚物， 其中第二区域的 5’ - 端部单体连接至第一区域的 3’ - 端部单体。第一区域包含 RNAse 可识别和断开的连续 伸长的 ( 例如至少 7 个连续单体 )DNA 单体或核苷类似物单体， 第二区域包含连续伸长的非 RNase 募集核苷类似物。
     其它 “嵌合” 寡聚物， 称为 “混合聚物” ， 其由下述交替组分构成 ： i) 可由 RNAse 识 别和裂解的 DNA 单体或核苷酸类似物单体， 和 ii) 非 - 募集 RNase 的核苷酸类似物单体。
     在一些实施方案中， 除提高寡聚物对靶区域的亲和性外， 一些核苷类似物也调变 RNase( 例如， RNase H) 结合和断裂。因为 α-L-LNA 单体募集 RNase 活性至一定程度， 在一些实施方案中， 含 α-L-LNA 单体的寡聚物的缺口区域 ( 例如， 在下文也称作区域 B) 由较少 RNase 可识别和断裂的单体构成， 并且在混合聚物的结构中引入更大灵活性。
     5.9. 缀合物
     在本发明的上下文中， 如本文中所示， 术语 “缀合物” 是指通过将寡聚物共价连接 ( 缀合 ) 到一个或多个本身不为核酸或单体的部分 (“缀合部分” ) 的化合物。这样的缀合 部分的实例包括大分子化合物如蛋白质、 脂肪酸链、 糖残基、 糖蛋白、 聚合物或其组合。 典型 的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典型聚合物可为聚乙二醇。WO2007/031091 提供了合适的部 分和缀合物， 其在此引入作为参考。
     因此， 本文提供了包含本文所述寡聚物和至少一个缀合部分的缀合物， 所述缀合 部分不是核酸或单体， 并且共价连接到所述寡聚物。因此， 在某些实施方案中， 如本文中所 公开， 在寡聚物由具有规定碱基序列的连续单体构成时， 缀合物还可以包含至少一个共价 连接到所述寡聚物的缀合部分。
     在某些实施方案中， 寡聚物缀合到可提高寡聚化合物的细胞吸收的部分。
     在多个实施方案中个， 缀合物可增强本文所述寡聚物的活性、 细胞分布或细胞 吸收。这些部分包括， 但不限于， 抗体、 多肽、 脂质部分如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己 基 -s- 三苯甲基硫醇、 硫胆固醇 (thiocholesterol)、 脂肪链， 例如， 十二烷二醇或十一烷基 残基、 磷脂， 例如， 二 - 十六烷基 -rac- 甘油或 1， 2- 二 -o- 十六烷基 -rac- 甘油 -3-h- 膦酸 三乙基铵、 聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 十八烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 氧 基胆固醇部分。 在某些实施方案中， 寡聚物缀合至活性药物， 例如， 阿司匹林， 布洛芬， 磺胺药物， 抗糖尿药， 抗菌药或抗生素。
     在某些实施方案中， 该缀合的部分为固醇， 如胆固醇。
     在多种实施方案中， 该缀合的部分包含或由以下组成 ： 带正电荷的聚合物， 如带 正电荷的肽， 例如长度为 1-50， 如 2-20 如 3-10 个氨基酸残基， 和 / 或聚环氧烷如聚乙二 醇 (PEG) 或聚丙二醇 - 参见 WO 2008/034123， 在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚 合物， 如聚环氧烷可通过连接基连接至寡聚物， 如描述于 WO 2008/034123 的可释放的连接 基。
     5.10. 活化的寡聚物
     本文所用的术语 “活化的寡聚物” ， 是指本文所述共价连接 ( 即， 官能化 ) 至至少 一个官能部分 (functional moiety) 的本发明的寡聚物， 该官能部分允许寡聚物共价连 接至一个或多个缀合的部分 ( 即本身不为核酸或单体的部分 )， 以形成本文描述的缀合 物。典型地， 官能部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团 ： 例如， 3’ -羟 在一些实施方案中是亲水性间隔基 (spacer) 和能结合至 基或腺嘌呤碱基的环外 NH2 基， 缀合的部分的末端基团 ( 例如， 氨基、 巯基或羟基 )。在一些实施方案中， 末端基团未被 保护， 例如， 为 NH2 基团。在其它实施方案中， 末端基团被保护， 例如， 被任何合适的保护 基， 如描述于 Theodora WGreene 和 Peter G M Wuts， 第三版 (John Wiley&Sons， 1999) 的 “ProtectiveGroups in Organic Synthesis” 的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括 酯如乙酸酯， 芳烷基如苄基， 二苯基甲基， 或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基 的实例包括苄基， α- 甲基苄基， 二苯基甲基， 三苯基甲基， 苄基氧基羰基， 叔丁氧基羰基和
     酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。
     在一些实施方案中， 该官能部分是自裂解的 (self-cleaving)。在其它实施方案 中， 该官能部分为生物可降解的。 参见例如， 美国专利号 7,087,229， 其以其整体在此引入作 为参考。
     在一些实施方案中， 寡聚物在 5’ 端官能化以使缀合的部分共价连接至寡聚物的 5’ 端。在其它实施方案中， 寡聚物可在 3’ 端官能化。在其它实施方案中， 寡聚物可沿着主 链或在杂环碱基部分上官能化。 在其它实施方案中， 寡聚物可在多于一个位置官能化， 所述 位置独立地选自 5’ 端、 3’ 端、 主链和碱基。
     在一些实施方案中， 本文所述的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个 共价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中， 活化的寡聚物使用未被官能化的 单体合成， 且该寡聚物在合成完成后立即官能化。
     在一些实施方案中， 该寡聚物使用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化， 其中该烷 基部分具有式 (CH2)w， 其中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直 链或支链的， 且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH) 连接至寡聚物。
     在其它实施方案中， 该寡聚物使用含 (CH2)w- 巯基 (SH) 连接基的位阻酯官能化， 其 中 w 为 1 至 10 的整数， 优选约 6， 其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的， 且其中该官 能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wSH) 连接至寡聚物。在一些实施方案中， 巯基 - 活化的寡核 苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 ( 通过二硫键的形成 )。
     可通过本领域已知的任何方法合成与至少一个功能部分连接的活化寡聚物， 所 述方法特别是公开于美国专利公开 No.2004/0235773( 将其全文并入本文作为参考 ) 以 及 Zhao 等 (2007)J.Controlled Release 119 ： 143-152 ； 和 Zhao 等 (2005)Bioconjugate Chem.16 ： 758-766 中的方法。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物通过使用官能化试剂向寡聚物引入巯基、 氨基或羟基而官能化， 该官能化试剂基本上描述于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210， 即， 为基本上链状的试剂， 其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite) 通过亲水性间隔基 链连接至相对的端， 该相对的端包含保护的或未保护的巯基、 氨基或羟基。 这些试剂主要与 寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的 5’ - 羟基。在其它实施方案中， 该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至 3’ - 羟基。在其它 实施方案中， 活化的寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方 案中， 寡聚物使用多于一种官能化试剂官能化， 该官能化试剂描述于美国专利号 4,962,029 以其整体在此引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡 和 4,914,210 中， 聚物的方法公开于美国专利号 4,962,029 和 4,914,210。
     在一些实施方案中， 固相结合的寡聚物的 5’ - 端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化， 然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过 Diels-Alder 环加成反应而缀合。
     在多种实施方案中， 将含 2’ - 糖修饰的单体， 如 2’ - 氨基甲酸酯取代的糖或 2’ -(O- 戊基 -N- 邻苯二甲酰亚氨基 )- 脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚物 的糖的共价连接。在其它实施方案中， 一个或多个单体的 2’ - 位具有含氨基的连接基的寡 聚物使用以下试剂制备 ： 例如， 5’ - 二甲氧基三苯甲基 -2’ -O-(e- 邻苯二甲酰亚氨基氨基 戊基 )-2’ - 脱氧腺苷 -3’ -N， N- 二异丙基 - 氰基乙氧基亚磷酰胺。参见， 例如， Manoharan，等人， Tetrahedron Letters， 1991， 34， 7171。
     在其它实施方案中， 本文所述的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分， 包括 在 N6 嘌呤氨基上， 在鸟嘌呤的环外 N2 上， 或在胞嘧啶的 N4 或 5 位上。在一些实施方案中， 该官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。
     一 些 官 能 部 分 是 可 商 购 的， 例 如， 异 双 官 能 (heterobifunctional) 和 同 双 官 能 (homobifunctional) 连接部分可购自 Pierce Co.(Rockford， Ill.)。其它可商购的 连 接 基 为 5’ - 氨 基 - 修 饰 体 (Modifier)C6 和 3’ - 氨 基 - 修 饰 体 试 剂， 均 可 购 自 Glen Research Corporation(Sterling， Va.)。5’ - 氨基 - 修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI(Applied Biosystems Inc.， Foster City， Calif.)， 且 3’ - 氨基 - 修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto， Calif.)。
     5.11. 组合物
     在多个实施方案中， 本文所述的寡聚物以药物制剂或组合物使用。合适地， 该组 合物包含药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。WO2007/031091( 并入本文作为参考 ) 提 供了适宜和优选的药学可接受的稀释剂、 载体、 盐或佐剂。合适的剂量、 制剂、 给药途径、 组合物、 剂型、 与其它治疗剂的组合， 前药制剂也提供于 WO2007/031091- 其也在此引入 作为参考。配制和施用的技术细节还可以在最新版的 “REMINGTON’ S PHARMACEUTICAL SCIENCES” (Maack Publishing Co， Easton Pa.) 中找到。
     在一些实施方案中， 本文所述寡聚物共价连接到缀合部分以有助于将寡聚物贯穿 细胞膜进行输送。有助于将寡聚物贯穿细胞膜进行输送的缀合部分的实例是亲脂性部分， 例如胆固醇。 在多个实施方案中， 本文所述寡聚物用形成脂质体的脂质制剂进行配制， 所述 脂质体例如 Lipofectamine 2000 或 Lipofectamine RNAiMAX， 其均可商购自 Invitrogen。 在一些实施方案中， 本文所述寡聚物用一种或多种脂质状非天然小分子的混合物 (“脂 质体分子库” ) 进行配制。脂质体分子库可以通过共价合成化学方法进行合成， 并且可以 尝试各种量和组合的脂质体分子库以开发按照所选给药路径有效将特定尺寸的寡聚物递 送到靶组织的载体。合适的脂质体分子库和组合可例如在 Akinc 人等的 (2008)Nature Biotechnol. 中 找 到， 其 获 得 自 http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/ abs/nbt1402.html， 将其并入本文作为参考。
     如本文所述， 术语″药学可接受的盐″是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示可接受水平的不希望有的有毒作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机 氨基酸形成， 以及与金属阳离子形成的碱加成盐， 该金属阳离子如锌、 钙、 铋、 钡、 镁、 铝、 铜、 钴、 镍、 镉、 钠、 钾等， 或与由氨形成的阳离子， N， N’ - 二苄基乙二胺， D- 葡糖胺， 四乙基铵， 或 乙二胺形成的碱加成盐 ； 或 (a) 和 (b) 的 (c) 组合 ； 例如， 鞣酸锌盐等。
     有效用于治疗或防止可耐受用 PTK 抑制剂治疗的疾病的至少一种寡聚物的量可 通过标准临床技术加以确定。通常， 剂量范围可以基于在体外和体内动物模型中发现有效 的 EC50 来确立。所使用的精确剂量还将取决于， 例如， 给药途径和疾病的严重程度， 并且可 根据从业者和 / 或每个患者的状况的判断加以确定。在它的其它实例中， 将尤其必须取决 于如下加以变化 ： 进行治疗的患者的体重和身体状况 ( 例如， 肝肾功能 )， 治疗的痛苦性， 症 状的严重性， 用药间隔频率， 和任何有害副作用的存在。
     在多个实施方案中， 寡聚物的剂量为约 0.01μg- 约 1g/kg 体重， 并且可以每天、 每周、 每月或每年给予一次或多次， 或甚至没 2-10 年给予一次， 或者连续灌输数小时一直到 数月。在某些实施方案中， 用药的重复速率可基于所测得的活性剂在体液或组织内的停留 时间和浓度进行确定， 患者可用 HER3 靶向疗法进行维持治疗以防止疾病状态的复发。
     5.12. 与其它反义寡聚物和化学治疗剂的组合
     在一些实施方案中， 使本文所述寡聚物靶向 HER3、 HER2 和 / 或 EGFR 核酸。因此， 在一些实施方案中， 本发明涉及通过向靶向的两种或所有三种靶核酸施用多于一种寡聚物 来治疗疾病的方法， 所述疾病耐受用 PTK 抑制剂治疗。 在多个实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 EGFR 或 HER2 的第二寡聚物一起施用。在多个其它实施方案中， 靶向 HER3 的寡聚 物与靶向 HER2 的第二寡聚物以及靶向 EGFR 的第三寡聚物一起施用。在本文所述方法中， 这样的寡聚物可以同时或相继施用。
     在多个实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 HER2 表达的其它治疗剂 ( 例如靶向 HER2 mRNA 的反 义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在其它可以相同或不同的实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的 方法， 其通过施用包含靶向 HER3 的寡聚物与靶向和下调 EGFR 表达的其它治疗剂 ( 例如靶 向 EGFR mRNA 的反义寡聚物 ) 的药物组合物。
     在一些实施方案中， 靶向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有相同的设计 ( 例如， 缺口聚物， 头聚物， 尾聚物 )。在多个实施方案中， 靶 向 HER2 和 / 或 EGFRmRNA 的寡聚物 ( 或其缀合物 )， 与靶向 HER3 的寡聚物具有不同的设计。
     在某些实施方案中， 本发明涉及治疗耐受 PTK 抑制剂的疾病的方法， 其通过施用 一种或多种本文所述寡聚物与一种或多种另外化学治疗剂， 包括但不限于， 烷化剂， 抗代谢 物， 表鬼臼毒素， 蒽环类， 常春藤生物碱， 植物碱和萜类化合物， 单克隆抗体， 紫杉醇类， 拓扑 异构酶抑制剂， 和铂化合物。
     5.13. 试剂盒
     本发明还通了治疗耐受用蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗的疾病的方法， 该方法使用 包含第一组分和第二组分的试剂盒。在多个实施方案中， 所述第一组分包含能够抑制 ( 例 如， 通过下调 )HER3 的表达的本文所述寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。在其它 实施方案中， 第二组分包含第二活性成分。在一些实施方案中， 第二组分是作为本文所述 寡核苷酸的治疗剂。在其它实施方案中， 治疗剂是除寡核苷酸外 ( 例如， 小分子治疗剂如 taxol)。在一些实施方案中， 本文所述试剂盒用于过度增生性病症 ( 例如耐受用 PTK 抑制 剂治疗的癌症 ) 的治疗方法， 其包括包含向患者按需要施用有效量的试剂盒第一组分和第 二组分。在多个实施方案中， 同时施用第一和第二组分。在其它实施方案中， 相继地或按任 何顺序施用第一和第二组分。
     在一些实施方案中， 试剂盒包含的第一组分和第二组分， 所述第一组分含有能够 抑制 ( 例如， 通过下调 )HER3 的表达的寡聚物， 或者其缀合物和 / 或药物组合物， 所述第二 组分是如本文所述能够抑制 ( 例如， 通过下调 )HER2 表达和 / 或 EGFR 表达的反义寡核苷酸， 或者其缀合物和 / 或药物组合物。 6. 实施例6.1. 实施例 1 ： 单体合成
     LNA 单体构造块及其衍生物根据公开操作进行制备。参见 WO07/031081 和本文所 引用的参考文献。
     6.2. 实施例 2 ： 寡核苷酸合成
     寡核苷酸根据 WO07/031081 中描述的方法来合成。表 1 显示了本发明的反义寡核 苷酸基序的实例。
     6.3. 实施例 3 ： 寡核苷酸的设计
     根 据 本 发 明， 设 计 一 系 列 不 同 的 寡 核 苷 酸 除 了 人 HER3(GenBank 登 记 号 NM_001982， SEQ ID NO ： 197) 之外还靶向人 EGFR(GenBank 登记号 NM 005228， SEQ ID NO ： 198) 和人 HER2(GenBank 登记号 NM 004448， SEQ ID NO ： 199) 的不同区域。
     在表 1 中所示的序列中， SEQ ID NO ： 1-50、 53、 139 和 140 设计为除了靶向人 HER3 之外还靶向人 EGFR 和人 HER2。显示了与 HER3、 EGFR 和 HER2 的序列同源性的百分比。所 述寡聚物在相比于 EGFR 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 0 到 2 个错配， 在相比于 HER2 的最佳对位排列靶区域的序列时含有 1 到 2 个错配。
    
    
    
    
    在表 2 中， 黑体字母表示表 1 中所示的较短序列。在表 3 中所示的 SEQ ID NOs ： 141-168 中， 大写字母表示核苷类似物单体， 下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接基。小写字母表示 DNA 单体。单体 ( 如果有一些的话 ) 之间不存在 “s” 表示连接磷酸二酯基。
    
    
    
    6.4. 实施例 4 ： 体外模型 ： 细胞培养 反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试， 条件是该靶核酸以可检测的水平存在。 靶可内源性表达或通过对编码所述靶的核酸进行瞬时转染 或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用， 例如， RNA 印迹分析、 实时 PCR、 核 糖核酸酶保护测试而确定。为了例示， 提供以下细胞类型， 但可常规使用其它细胞类型， 条 件是该靶在所选的细胞类型中表达。
     细胞如下所述在合适的培养基中培养， 并保持在 37℃和 95-98％湿度和 5％ CO2 下。细胞每周常规传代 2-3 次。
     15PC3 ： 人 前 列 腺 癌 细 胞 株 15PC3 在 DMEM(Sigma)+10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)+2mM Glutamax I+ 庆大霉素 (25μg/ml) 中培养。
     HUH7 ： 人肝癌细胞株在 DMEM(Sigma)+10％胎牛血清 (FBS)+2mMGlutamax I+ 庆大 霉素 (25μg/ml)+1x 非必需氨基酸中培养。
     6.5. 实施例 5 ： 体外模型 ： 用反义寡核苷酸处理
     将细胞用寡核苷酸处理， 使用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作 为转染载体。将细胞接种于 6- 孔细胞培养板 (NUNC) 并当铺满 80-90％时进行处理。寡核 苷酸浓度范围为 1nM 至 25nM 终浓度。寡聚物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的 进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚物的培养基来停止处理。清洗细胞且添加含血 清的培养基。寡核苷酸处理后， 使细胞恢复 20 小时， 然后将其收集用于 RNA 分析。
     6.6. 实施例 6 ： 体外模型 ： RNA 的提取和 cDNA 合成
     使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 (Qiagen cat.no.74104) 根据厂家的说明书从如上所 述转染的细胞提取总 RNA。根据厂家的说明书使用来自 Ambion 的逆转录酶试剂 (Reverse Transcriptase reagents) 进行第一链合成。
     对于每个样品， 使用无 RNase H2O 将 0.5μg 总 RNA 调节到 10.8μl， 并与 2μl 十碱 基的随机引物 (random decamers)(50μM) 和 4μl dNTP 混合物 ( 每种 dNTP 2.5mM) 混合， 加热到 70℃保持 3 分钟， 在这之后样品在冰上快速冷却。在冰上冷却样品之后， 将 2μl10x 缓冲液 RT、 1μl 的 MMLV 逆转录酶 (100U/μl) 和 0.25μl RNase 抑制剂 (10U/μl) 添加到 各样品中， 随后在 42℃孵育 60 分钟， 酶在 95℃加热灭活 10 分钟， 然后将样品冷却到 4℃。
     6.7. 实施例 7 ： 体外模型 ： 通过实时 PCR 分析 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的寡核苷酸 抑制作用
     HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义调节可以以本领域已知的多种方式分析。举例来 说， HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平可以通过例如 RNA 印迹分析、 竞争性聚合酶链式反应 (PCR) 或实时 PCR 来定量。实时定量 PCR 当前是优选。可以对总细胞 RNA 或 mRNA 进行 RNA 分析。 RNA 分离和 RNA 分析的方法例如 RNA 印迹分析是本领域常规的， 在例如 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley 和 Sons 中教导了。
     实时定量的 (PCR) 可以使用可从 Applied Biosystems 商业上获得的 Multi-Color Real Time PCR 检测系统方便地实现。
     HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 水平的实时定量 PCR 分析
     人 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的 样 品 含 量 使 用 人 HER3、 EGFR 和 HER2AB I Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagents(Applied Biosystemscat.no.Hs00951444_ m1(HER3)、 Hs00193306_m1(EGFR) 和 Hs00170433_m1(HER2) 根据厂家的说明书来定量。甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH)mRNA 的量用作内源对照用于标准化样品制备中 的任何变化。人 GAPDH mRNA 的样品含量使用人 GAPDH ABIPrism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat.no.4310884E) 根据厂家的说明书来定量。
     实时定量 PCR 是本领域公知的技术， 在例如 Heid 等人的 Real time quantitative PCR， Genome Research(1996)， 6： 986-994 中教导了。
     实时 PCR
     将来自第一链合成的 cDNA( 如实施例 5 中描述进行的 ) 稀释 2-20 倍， 通过使用 来自 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 或 7900FAST 的实时定量 PCR 来分析。将 引物和探针与 2×Taqman Fast Universal PCR 主混合物 (master mix)(2×)(Applied Biosystems Cat.#4364103) 混合， 添加到 4μlcDNA 中至 10μl 的终体积。 一式两份分析每 种样品。测试 2 倍稀释的 cDNA 得到该测试的标准曲线， 该 cDNA 从表达感兴趣的 RNA 的细 胞株纯化的物质制备。使用无菌的 H2O 代替 cDNA 用于无模板对照。PCR 程序 ： 95℃ 30 秒， 然后进行 40 个循环， 95℃ 3 秒， 60℃ 20-30 秒。使用 Applied BiosystemsFast System SDS 软件版本 1.3.1.21. 或 SDS 软件版本 2.3 根据计算的阈值循环测定靶 mRNA 的相对数量。
     6.8. 实施例 8 ： 体外分析 ： 寡核苷酸化合物对人 HER3、 EGFR 和 HER2 表达的反义抑 制
     评估表 4 中呈现的寡核苷酸在 1、 5 和 25nM 浓度下在 15PC3 细胞 ( 或如 * 所指示 的 Huh-7) 中下调 HER3、 EGFR 和 HER2mRNA 的潜力 ( 参见附图 2、 3、 4 和 5)。SEQ ID NO ： 235 和 236 用作乱序 (scrambled) 对照。
     表 4 中的数据被表示为在 25nM 下相对于模拟品转染的细胞的 mRNA 下调百分比。 小写字母表示 DNA 单体， 粗体大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体。LNA 单体中的所有胞嘧 啶是 5- 甲基胞嘧啶。下标 “s” 表示硫代磷酸酯连接。
    如在表 4 中所示， 在这些实验中在 15PC3 细胞中， 具有 SEQ ID NO ： 169、 170、 173、 174、 180、 181、 183、 185、 187、 188、 189、 190、 191、 192 和 194 中所示序列的寡核苷酸在 25nM 展 现了的 85％或更大的对 HER3 mRNA 表达抑制。
     同样优选的是， 基于列举的反义寡聚物序列的寡核苷酸， 例如， 改变长度 ( 更短或更长 ) 和 / 或单体含量 ( 例如， 核苷类似物单体的类型和 / 或比例 )， 其也提供了
     对 HER3 表达的良好的抑制。
     6.9. 实施例 9 ： LNA 寡核苷酸的细胞凋亡诱导
     在转染的前一天， 将 HUH7 细胞以 2.5×105 个细胞 / 孔的密度接种在 6 孔培养平板 (NUNC) 中。当 75-90％汇合时利用阳离子脂质体制剂 LipofectAMINE 2000(Gibco) 作为转 染载体用寡核苷酸处理细胞。 使用的寡聚物浓度是 5nM 和 25nM( 反应孔中的终浓度 )。 寡聚 物 - 脂质复合物的配制基本上如厂家所描述的进行， 使用无血清 OptiMEM(Gibco) 和 5μg/ mL 的最终的脂质浓度的 LipofectAMINE 2000。 细胞在 37℃孵育 4 小时， 通过除去含有寡聚 物的培养基来停止处理。在用 Optimem 洗涤之后， 将 300μl 的胰蛋白酶添加到每个孔中直 到细胞从孔脱离。通过向孔中添加 3ml HUH7 培养基来灭活胰蛋白酶， 通过上下地轻轻地吸 移细胞悬浮液来产生单细胞悬浮液。乱序的寡聚物 EQ ID NO ： 235 用作对照。
     在 这 之 后， 将 100μl 的 细 胞 悬 浮 液 添 加 到 来 自 Nunc 的 白 色 96 孔 平 板 (cat#136101)) 的每个孔中 ( 制备四个平板， 用于在不同时间点测量 )。 然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     半胱氨酸蛋白酶分析 ： 细胞凋亡特异性半胱氨酸蛋白酶 3 和 7 的活性使用荧光 Caspase-Glo 3/7- 底物分析 ( 来自 Promega 的 Cat#G8091) 来测量。要分析的平板平衡到 室温保持 15 分钟。Caspase-3/7 缓冲液与 Caspase-3/7 底物混合以形成 Caspase- 工作溶 液， 将其平衡到室温。 然后， 将 100μl 的 Caspase- 工作溶液小心地添加到 96 孔平板的每个 孔的培养基中 ( 避免气泡和孔之间的污染 )。平板小心地振摇 1 分钟， 在这之后， 将它在室 温避光孵育 1 小时。 半胱氨酸蛋白酶活性以 LuminoscanAscent 仪器 (Thermo Labsystems) 中的每秒的相对光单元 (RLU/s) 来测量。相对于被设置为 1 的模拟品 (mock) 的平均值将 数据进行相关和绘图。参见图 6。
     6.10. 实施例 10 ： 使用 LNA 寡核苷酸对增殖的体外抑制
     如实施例 9 中所述， 转染 HUH7 细胞并收集成单细胞悬浮液。SEQ IDNO ： 235 充当 乱序的对照。
     在收集之后， 将 100μl 的细胞悬浮液添加到 96 孔平板 (” OrangeScientific” )的 每个孔中用于 MTS 实验 ( 制备四个平板， 用于在不同的时间点测量 )。然后将平板在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 中孵育直到进行实验。
     增殖的活细胞的测定 (MTS 分析 )
     对于增殖分析， 将 10μl CellTiter AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega， G3582) 添加到 96 孔平板的每个孔的培养基中， 小心地振摇平板， 并在测量 前在 37℃、 95％湿度和 5％ CO2 孵育 1 小时。在分光光度计中测量 490nm 处的吸光度， 减去 从仅含有培养基的孔中得到的实验背景。 490nm 处的吸光度与活细胞的数量成比例， 对模拟 品转染的细胞和对用寡聚物转染的细胞相对于时间进行绘图。参见图 7。
     6.11. 实施例 11 ： 靶 mRNA 敲减的体内评估
     为了评估 HER3 寡聚化合物的体内敲减 (knockdown) 效力， 带有 15PC3 异种移植物 6 的雌性裸小鼠 ( 通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×10 个细胞 / 小鼠得到 )， 在多种剂量和注 射方案 ( 即， 单剂量、 每天 (qd)、 每 3 天 (q3d)、 每 4 天 (q4d)) 下用寡聚物静脉内注射。 乱序 的寡聚物 EQ ID NO ： 236 充当阴性对照。最后注射后 24 小时， 小鼠被麻醉， 将肝脏和肿瘤组 织采集在 RNAlater 溶液 (Ambion) 中。从组织纯化总 RNA， 使用 QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒 (Cat# ： 204443 ； Qiagen) 的定量逆转录实时 PCR(qRT-PCR) 测定 HER3 mRNA 的水平。 GAPDH mRNA 充当内部对照。
     小鼠 ErbB3 ： 探针 ： cca cac ctg gtc ata gcg gtg a(SEQ ID NO 237)， 引物 -1 ： ctg ttt agg cca agc aga gg(SEQ ID NO 238)， 引物 -2 ： att ctg aat cct gcg tcc ac。
     人 ErbB3 ： 探针 ： cat tgc cca acc tcc gcg tg， 引物 -1 ： tgc agt gga ttc gag aag tg， 引物 -2 ： ggc aaa ctt ccc atc gta ga。
     人 GAPDH ： 探针 ： act ggc gct gcc aag gct gt， 引物 -1 ： cca ccc aga aga ctg tgg at， 引物 -2 ： ttc agc tca ggg atg acc tt。
     小鼠 GAPDH ： 探针 ： agc tgt ggc gtg atg gcc gt， 引物 -1 ： aac ttt ggc att gtg gaa gg， 引物 -2 ： gga tgc agg gat gat gtt ct。通过使用包括软件的 ABI-7500PCR Fast System 进行数据分析。参见表 5。
     表 5 中的数据表示为， 在按照指定的剂量用寡核苷酸连续 5 天对动物静脉给药后， 在肝脏和肿瘤样品中， 相对于盐水治疗的对照 HER3 mRNA 水平的％。
    6.12. 实施例 12 ： 肿瘤生长抑制的评估
     ErbB3 特异性 LNA 抑制体内肿瘤生长的能力在带有 15PC3 异种移植物的裸雌性小 鼠中评估。15PC3 人前列腺肿瘤模型通过向右侧腋下肋部皮下注射 5×106 个细胞 / 小鼠来 构建。 肿瘤体积将通过卡尺测量 2 个方向来测定， 并使用下式来计算 ： 肿瘤体积＝ ( 长度 × 2 3 宽度 )/2)。当肿瘤达到 70-100mm 的平均体积时， 将带有肿瘤的小鼠被分成治疗组和对照 组。以 q3d x10 的方案， 小鼠分别静脉注射 25 和 50mg/kg 的 SEQ ID NO ： 180。盐水或具有 SEQ ID NO ： 236 的乱序寡核苷酸充当对照。每周两次地测量小鼠的体重和肿瘤大小。通过 临床观察、 临床化学和组织病理学检验来估计毒性。通过如实施例 11 描述的 QPCR 测量肿 瘤 HER3 mRNA。参见附图 8A 和 8B。
     6.13. 实施例 13 ： 小鼠肝脏中 HER3 mRNA 的抑制
     连续三天以 1 或 5mg/kg 寡核苷酸对 NMRI 小鼠静脉给药 ( 每组 5 只小鼠 )。 反义寡 核苷酸 (SEQ ID NO ： 180 和 SEQ ID NO ： 234) 溶于 0.9％盐水 (NaCl) 中。 在最后的给药后 24 小时处死动物， 采样肝脏组织， 并保存在 RNA later(Ambion) 中直到 RNA 提取和 QPCR 分析。 提提取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_ m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。 取总 RNA， 肝脏样品中的 HER3 mRNA 表达使用小鼠 HER3QPCR 实验 (cat.no.Mm01159999_m1， Applied Biosystems)， 如实施例 7 中描述的通过 QPCR 来测量。结果对小鼠 GAPDH(cat.no.4352339E， Applied Biosystems) 进行归一化， 相对于盐水处理的对照绘图 ( 参见附图 9)。
     6.14. 实施例 14 ： 具有聚乙二醇的寡聚物的缀合物的制备
     具有 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 所示序列的寡聚物， 通过利用常规的亚磷 酰胺化学作用将用阻断基团例如 Fmoc 阻断的氨基烷基基团例如己烷 -1- 胺连接到寡聚物 的 5’ 磷酸基团， 来在 5’ 末端功能化， 氧化产生的化合物， 将它脱保护， 纯化来得到分别具有 式 (IA) 或 (IB) 的功能化的寡聚物 ：
    其中粗体大写字母表示核苷类似物单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示硫 代磷酸酯连接基。 。
     活化的 PEG 的方案， 例如在式 (IV) 中所示的一种 ：
    
    其中 PEG 部分具有 12,000Da 的平均分子量， 且式 (IA) 或 (IB) 的每个化合物在 PBS 缓冲液中在室温下搅动 12 小时。反应溶液用二氯甲烷提取三次， 合并的有机层用硫酸 镁干燥， 并过滤， 溶剂减压蒸发。将所得残余物溶于双蒸水， 并加载到阴离子交换柱上。
     未反应的 PEG 连接基 (linker) 用水洗脱， 产物用 NH4HCO3 溶液洗脱。收集含有纯 产物的级分， 冻干得到式 (IIIA) 或 (IIIB) 分别所示的缀合物 ： SEQ ID NO ： 141 和 152 ：
    
    其中 SEQ ID NO ： 141 或 SEQ ID NO ： 152 的寡聚物经由可释放的连接基连接到具有 12,000 平均分子量的 PEG 聚合物上。
     可使用本文所述方法由具有 SEQ ID NOs ： 169， 180 和 234 中所示序列的寡聚物制 得 PEG 聚合物缀合物的化学结构， 分别在式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中加以显示。
    
    其中大写字母表示 β-D- 氧基 -LNA 单体， 小写字母表示 DNA 单体， 下标 “s” 表示 Me 硫代磷酸酯连接基， 以及 C 表示 5- 甲基胞嘧啶碱基。
     在该方法中可用于分别制备式 (IVA)、 (IVB) 和 (IVC) 中所示缀合物的活化寡聚物 具有式 (VA)、 (VB) 和 (VC) 所示的化学结构。
    
    
    6.15. 实施例 15 ： 使用不同的给药周期评估靶 mRNA 体内敲减 使用与上文实施例 11 中描述的类似方案， 在带有来自 15PC3 细胞或 A549 细胞(NSCLC) 或 N87 细胞 ( 胃癌 ) 的异种移植肿瘤的裸小鼠中， 体内评估寡聚物的敲减效力。寡 聚物通过每三天 2-4 剂注射给药。在最后的注射后 3 或 4 天收集组织。
     表 6 和 7 中的数据表示为相对于盐水治疗的对照， 在用指定的寡聚物对动物静脉 给药后， 在肝脏和肿瘤样品中 HER3 mRNA 或 HIF-1αmRNA 水平的％。
    观察到的具有 SEQ ID NO ： 169 和 SEQ ID NO ： 180 的序列的寡聚物的敲减效果不是 对 15PC3 肿瘤细胞独特的， 因为在来自 A549(NSCLC) 和 N87( 胃癌 ) 细胞的肿瘤中观察到了 相似的效果。参见下表 7。
    6.16. 实例 16 ： 耐受吉非替尼的细胞系的产生
     HCC827 肺腺癌细胞 (ATCC CRL-2868) 在 5 ％ CO2 和 95 ％空气的增湿气氛下于 RPMI 介质中维持在 37℃， 所述介质补充有 10％胎牛血清。为了产生吉非替尼耐受性， 用逐 渐增加量的吉非替尼 ( 一直到 500nM) 处理细胞 3 个月的时段。在 3 个月时段结束时， 使 用 MTT((3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐 ) 分析相对于母系细胞和 HCC827R 吉非替尼耐受性细胞测试细胞增殖。结果显示， HCC827R 细胞耐受甚至所测最高浓 度 (10μM) 的吉非替尼。( 图 10)
     6.17. 实施例 17 ： 耐受吉非替尼的细胞系的表征
    使用 RTK 抗体分析试剂盒 (R&D Systems， Inc.， Minneapolis， MN) 描绘 HCC827 和 耐受吉非替尼的细胞即 HCC827R 中受体酪氨酸激酶 (“RTK” ) 的表达水平和磷酸化状态。 简言之， 将细胞溶解在溶菌缓冲液中并且测定细胞溶菌的总蛋白质浓度。将 500ug 中蛋白 质在孵育缓冲液中进行稀释， 用分析膜 (assay membrane) 进行孵育， 并根据制造商提供的 方案进行处理。最终图像结果 ( 图 11) 显示 HCC827R 细胞中的磷酸化 EGFR 水平比母系中 的那些低很多。
     Western blot 分析
     HCC827 和 耐 受 吉 非 替 尼 的 克 隆 体 (R2、 R3 和 R5) 在 具 有 (“+” ) 或不具有 (“-” )1μM 吉非替尼的介质中培养 24h。然后制备细胞溶菌并测定总蛋白质浓度。使约 15μg/lane 蛋白质在 8％ SDS-PAGE 凝胶中进行电泳并且使用 BioRad 液体转移设备将其转
     移到 PVDF。用合适的缀合辣根过氧化物酶的二级抗体 (Transduction Labs) 和增强的化 学发光试剂 (SuperSignal， Pierce) 进行 western 分析。所使用的一级抗体 (Abs) 包括 ： 抗 -Met 单克隆 Ab(25H2)， 抗 - 磷 -Met(Y1234) 兔单克隆 Ab(D26)， 和抗 - 磷 -ErbB3(Y1289) 兔单克隆 Ab(21D3)， 来自 Cell Signaling ； 来自 Santa Crutz 的抗 -ErbB3 Ab(sc285) ； 抗 - 磷 -Met(Y1349)Ab(Ab47606R)， 抗 - 磷 -EGFR 兔单克隆 Ab(Ab40815)， 和抗 -EGFR Ab， 来 自 Abcam ； 以及用于负载对照品的缀合辣根过氧化物酶的抗 - 微管蛋白 Ab。
     数据显示， 相比于未处理 ( “-” ) 母系细胞中非磷酸化和磷酸化 EGFR 的水平， 非磷 酸化和磷酸化 EGFR 的水平在 HCC827 耐受吉非替尼的克隆体中得到显著降低， 无论是存在 (“+” ) 或存在 (“-” ) 吉非替尼。形成对照的是， 与母系细胞相比， ErbB3 或 MET( 其也涉 及 EGFR 信号发出通路 ) 的水平在耐受性克隆体中没有得到显著降低。这些发现表明， EGFR 的下调可能是一些癌细胞获得对吉非替尼的耐受性的机制所在。
     6.18. 实例 18 ： 寡聚物对耐受吉非替尼的细胞的作用
     将 HCC287 和 HCC287R 细胞以副本配制在 6- 孔板的 200 细胞 / 孔上并且孵育 24 小 时。用 1μM 的 ON180(SEQ ID NO ： 180) 处理细胞并孵育 10 天， 之后使细胞染有 MTT 并数计 菌落的数目。就 HCC827 和 HCC727R 细胞计算对照品的百分数。图 13 中所示的结果显示， 与在下调 HCC287 吉非替尼敏感细胞的生长方面相比 ( 与未处理的对照品相比细胞生长减 少约 50％ )， 寡核苷酸 ON180 在下调耐受吉非替尼的细胞方面显著更为有效 ( 与未处理的 对照品相比细胞生长减少大于 80％ )。
     结合图 14-16 来说明本发明的仍其它方面和实施方案。
     图 14 显示， 在三个人乳腺癌细胞系、 BT474、 SKBR3 和 MDA453 中， 降低 HER3 表达的 LNA 寡聚物， 虽然没有曲妥珠单抗， 但是能够防止 HER3 和 P-HER3 表达由于拉帕替尼而反馈 下调。如就仅拉帕替尼治疗的细胞 (1)， 拉帕替尼加上曲妥珠单抗治疗的细胞 (2)， 拉帕替 尼加上 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (3) 和仅 SEQ ID NO ： 180 治疗的细胞 (4) 所示。在 0， 1， 4， 24 和 48 小时显示了 HER3， P-HER3(Y1197) 和 P-HER3(Y1289) 的表达水平。拉帕替尼 以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓 度使用。
     图 15 显示， 3 个人乳腺癌细胞系的细胞凋亡协同促进大于拉帕替尼与降低 HER3 表 达的 LNA 寡聚物的组合， 后者大于拉帕替尼与曲妥珠单抗的组合。该图显示了就每个三细 胞系 ( 与图 14 中相同的系 ) 所进行的 ApoBrdU 细胞凋亡的结果。 用拉帕替尼和 / 或曲妥珠 单抗治疗细胞 48 小时。在 72 小时， 细胞呈血清饥饿并且用 SEQ ID NO ： 180 或随机化对照 寡聚物进行治疗。对于每个细胞系， 治疗是 ： 仅随机化寡核苷酸对照品 (1)， 仅 SEQ ID NO ： 180， 仅曲妥珠单抗 (3)， 仅拉帕替尼 (4)， 拉帕替尼加上 SEQ ID NO ： 180(5)， 以及拉帕替尼 加上曲妥珠单抗 (6)。拉帕替尼以 1μM 的浓度使用， 曲妥珠单抗以 10μg/ml 的浓度使用， 和 SEQ ID NO ： 180 以 5μM 的浓度使用。
     图 16 显示， SEQ ID NO ： 180 抑制使用 HCC827 人细胞系的人非小细胞肺癌体内小 鼠异种移植模型中肿瘤的生长。对于用 30mg/kg SEQ ID NO ： 180(i.v)( 静脉内 ) 治疗， 在 大约 31 天时平均肿瘤体积相对于盐水对照品降低 65.5％， 对于用 45mg/kg SEQ ID NO ： 180 静脉注射治疗， 在大约 31 天时相对于盐水对照品降低 81.3％。N ＝ 6。
     具体实施方案， 参考文献的引用本发明不受本文所述具体实施方案的范围的限制。 实际上， 除本文描述的那些外， 在本发明的范围内的各自修饰对于本领域技术人员而言由前述描述和附图将变得明显。 此 外， 结合本发明一个实施方案所述的特征也可以与其它实施方案相结合， 即使上文没有明 确指出。
     本文引用的多个参考文献， 包括专利申请、 专利和科学文献 ； 这些文献各自的公开 内容以其全部并入本文作为参考。58102395374 A CN 102395383
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