一种吲唑化合物的用途及制备.pdf

本发明提供一种吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐在制备治疗脑血管疾病药物中的用途。由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯出发，经重氮化合环反应制得吲唑乙酸，经酰氯化后与哌嗪侧链结合后得吲唑乙酰胺，再经四氢锂铝或四氢硼钠还原成吲唑胺，再盐酸化、重结晶制得目的化合物。本发明的吲唑化合物能够减少或阻断ONOO-产生及继发，逆转血管内皮细胞氧化应激损伤，能够逆转血管内皮细胞氧化应激损伤，保护脑血管。制备方法简便，原材料廉价，收率高。

1.  一种吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐在制备治疗脑血管疾病药物中的应用，所述脑血管疾病是因血管氧化应激损伤所致。

2.  一种吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯(I)出发，经重氮化合环反应制得吲唑乙酸(II)，经酰氯化后与哌嗪侧链结合后得吲唑乙酰胺(III)，再经四氢锂铝(LiAIH₄)或四氢硼钠(NaBH₄)还原成吲唑胺(IV)，再盐酸化、重结晶制得目的化合物(V)，
反应式为：

一种吲唑化合物的用途及制备
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种吲唑化合物在制备药物方面的用途。特别涉及3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐用于制备血管内皮细胞氧化应激损伤引起的相关脑血管疾病预防和治疗药物的用途，以及3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的制备方法。
背景技术
脑血管病是危害人类生命与健康的常见病、多发病。具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。脑血管病的发病率与年龄成正相关，随着我国人口老龄化程度加重。其发病呈上升趋势。以脑卒中为例，我国每年发病率为150/10万人，死亡率为120/10万人，存活中约有75％致残，5年复发率高达41％，由此造成了社会和经济负担日趋加重。
据统计资料显示，脑血管病以缺血性为多见。缺血性脑损伤以后，首先发生明显的脑微血管系统缺血性改变，病灶区出现血液循环障碍，血脑屏障通透性增加及脑水肿，最后导致继发性神经元细胞死亡等重要的病理生理变化。目前，国内外许多学者已经研究发现微循环局部与整体全过程的联系，提出血管内皮细胞是脑缺血损伤致病因素的重要靶细胞(Zlokovic BV.The blood-brainbarrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.2008，24：178-201；高梅等，缺血性中风治疗新策略——靶向神经血管单元。《中国临床药理学与治疗学》2008，13：813-821)。以血管内皮作为切入点，是进一步研究脑血管疾病治疗方法的突破口所在(Zlokovic BV.The blood-brainbarrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.2008，24：178-201.)。
氧化应激(oxidative stress)是缺血性脑血管疾病重要病理反应过程。其中过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite，ONOO-)是心脑血管损害时氧化应激的重要信号途径，ONOO-因为其强大氧化活性使含硫基团氧化、羟基化和蛋白质酪氨酸残基硝化，可改变细胞内信号通路，从而引起血管内皮细胞凋亡(Xu J，He L，Ahmed SH et al.Oxygen-glucose deprivation induces inducible nitric oxidesynthase and nitrotyrosine expression in cerebral endothelial cells.Stroke.2000，31：1744-1751)。应用药物阻止ONOO-，逆转血管内皮细胞氧化应激损伤是改善脑血管内皮损伤的关键环节，对防治以血管内皮细胞氧化应激损伤为病理基础的脑血管疾病有重大实际意义。
3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(JP09-301955)的化学式如下：

3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的制备仅见上述专利报道：由吲唑基乙酸出发先制成其乙酯，再还原成吲唑基乙醇，醇羟基卤代后与哌嗪侧链偶联后，经盐酸化、重结晶制得。合成过程长且收率较低。
近年来的文献中已介绍过3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐可以调控心肌肥厚病理过程中的钙调素依赖激酶和磷酸化酶的稳态平衡(Lu YM，Shioda N，Han F，Moriguchi S，Kasahara J，Shirasaki Y，Qin ZH，Fukunaga K.Imbalance between CaM kinase II andcalcineurin activities impairs caffeine-induced calcium release in hypertrophiccardiomyocytes.Biochem Pharmacol.200715；74(12)：1727-37)。但目前尚未见该物质用于逆转血管内皮细胞氧化应激损伤，脑血管损伤保护作用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐在制备治疗脑血管疾病药物中的用途。所述的吲唑化合物3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐能够减少或阻断ONOO-产生及继发，逆转血管内皮细胞氧化应激损伤，可用于制备以血管氧化应激损伤为病理基础的脑血管疾病的防治的药物。
本发明的另一个目的是提供3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的制备方法，通过以下步骤实现：
由3，4-二甲基-6-氨基咖啡酸乙酯(I)出发，经重氮化合环反应制得吲唑乙酸(II)，经酰氯化后与哌嗪侧链结合后得吲唑乙酰胺(III)，再经四氢锂铝(LiAIH4)或四氢硼钠(NaBH4)还原成吲唑胺(IV)，再盐酸化、重结晶制得目的化合物(V)。
反应式：

基于氧化应激损伤条件下的血管内皮细胞在多种脑病病理过程中的关键环节地位，本发明采用永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系制作了血管内皮细胞缺氧低糖氧化应激损伤模型(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)，模拟了体外的血管内皮细胞的氧化应激损伤状态。采用该模型观察3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的抗过氧亚硝基阴离子产生作用及对血管内皮细胞保护作用。
本发明建立了大脑中动脉缺血再灌注大鼠模型对3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐的神经血管单元保护作用进行了体内外的药效学评价。
通过本发明提供的制备方法可以很容易得到3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐。血管内皮细胞缺氧低糖氧化应激损伤实验结果表明，3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐可以减少或消除ONOO^-，并能有效减少血管内皮细胞死亡率。大脑中动脉脑缺血动物实验结果也证实该吲唑盐腹腔内给药可以显著减少血脑屏障破坏和脑梗塞，并可改善神经功能障碍。两组实验数据就共同证实3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐能够逆转血管内皮细胞氧化应激损伤，保护脑血管。使用本发明提供的方法可以从简单廉价的咖啡酸衍生物(I)出发，高收率地合成中间体(II、III、IV)，以较高得率、更廉价地制得目标化合物(V)。
附图说明
图1是不同浓度的3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对OGD条件下血管内皮细胞死亡率的影响情况图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
实施例一化学合成法合成3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐
步骤1：吲唑基乙酸合成
将669mg的2-氨基-3，4-二甲氧基桂皮酸乙酯(I)在冰冷条件下投入3ml2mol/L盐酸中，搅拌均匀。向其中滴加1.5ml 140g/L亚硝酸钠水溶液，半小时后加入4.5ml 3.0mmol/L的亚硫酸钠水溶液，充分混合。然后向其中加入乙醇6mL，搅拌后滤取结晶，用乙醇洗涤，50度4小时减压干燥后，将其悬浊于2mol/L 1.0mL盐酸中，60度下搅拌半小时。醋酸钠调pH至中性，滤取结晶，水洗，50度下4小时减压干燥得吲唑基乙酸(II)248mg。
步骤2：吲唑基乙酰胺的合成
取上述产物4.724g加入50mL二氯亚砜中，回流1小时后，将其残渣溶于100mL四氢呋喃中，向该溶液中滴加含4.21g 1-1N-(2-甲基-3-氯苯基)哌嗪的10mL四氢呋喃溶液，室温下搅拌3小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液淬活，每次100mL乙酸乙酯提取4次，无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩得吲唑基乙酰胺(III)粗产物8.2g，收率96％。
步骤3：3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(IV)粗品的合成
将上述步骤得到(IV)的粗品溶于60mL四氢呋喃中，并将该溶液滴加至含0.91g四氢锂铝的100mL四氢呋喃中，室温下反应3小时，向混合液中滴加水0.25mL，过滤，浓缩滤液，柱层析分离得产物2.49g。将该化合物溶于35mL丙酮，向该溶液中加入浓盐酸5mL，回流搅拌1小时，冷却结晶，洗涤，自然干燥后得(V)粗产物2.77g。
步骤4：粗品的精制
将上述步骤3得到的化合物(V)的粗品溶于10mL纯水中。加热至完全溶解后加入活性炭1.0克并保温半小时，过滤，滤液冷却至0度。滤取结晶，减压干燥得3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(V)2.55g。收率28％。¹H NMR(400MHz，DMSO)：7.21(s，1H)，6.98(s，1H)，3.94(s，2H)，3.89(s，3H)，3.83(s，3H)。
实施例二化学合成法合成3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(V)
步骤1：吲唑基乙酰胺(III)的合成
取实施例一中步骤1得到的产物吲唑酸(II)4.724g，向其中加入50mL二氯亚砜中，回流1小时后，将其残渣溶于100mL四氢呋喃中，向该溶液中滴加含4.21g 1-1N-(2-甲基-3-氯苯基)哌嗪的10mL四氢呋喃溶液，室温下搅拌3小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液淬活，每次100mL乙酸乙酯提取4次，无水硫酸钠干燥，过滤后滤液减压浓缩得吲唑基乙酰胺(III)粗产物8.2g，收率96％。
步骤2：3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑(IV)粗品的合成
将步骤1得到的粗品溶于60mL四氢呋喃中，并将该溶液滴加至含1.15g四氢硼钠的100mL四氢呋喃中，室温下反应3小时，向混合液中滴加水0.25mL，过滤，浓缩滤液，柱层析分离得产物(IV)2.49g。
步骤3：3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(IV)粗品的合成
将上述步骤2得到的产物(IV)溶于35mL丙酮，向该溶液中加入浓盐酸5mL，回流搅拌1小时，冷却结晶，洗涤，自然干燥后得粗产物2.70g。
步骤4：粗品的精制
按实施例一中步骤4的精制方法精制后得目标化合物2.04克，收率22％。¹H NMR(400MHz，DMSO)：7.21(s，1H)，6.98(s，1H)，3.94(s，2H)，3.89(s，3H)，3.83(s，3H)。
实施例三3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对缺氧低糖氧化应激损伤条件下血管内皮细胞损伤的保护作用
药品与试剂
高糖DMEM、高糖DMEM培养基购于美国GIBICO公司，胎牛血清、新生小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所，I型胶原酶和四氮唑蓝为Sigma公司产品，其它试剂均为国产和进口分析纯试剂。试验所使用的细胞培养用人脐静脉内皮EA.hy926细胞系为永生化细胞株。
细胞培养
人脐静脉内皮EA.hy 926细胞用高糖DMEM培养液(含10％灭活国产胎牛血清)在37℃、饱和空气湿度、含5％CO₂的培养箱内常规传代培养，细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长。细胞长至融合，倒去培养液，PBS清洗2～3次，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，制成单细胞悬液。
体外低糖缺氧模型(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)构建
将单细胞悬液移入96孔板，3×10³cells/well、37℃、5％CO₂培养箱内培养，细胞完全融合时加入不同处理：空白对照组在正常条件下培养；实验组每孔用预热至37℃的HBSS(NaCl 8.00，KCl 0.20，CaCl₂0.14，MgSO₄.7H₂O 0.20，Na₂HPO₄.H₂O 0.06，KH₂PO₄0.06，NaHCO₃0.35)清洗三次，并换入相同培养基，以上每组每种剂量设平行3孔，先放入缺氧密闭箱(美国Billups-Rothenberg公司产品，MIC-101)通入混合气体(含95％N₂，5％CO₂)约5min，然后将密闭箱放入孵箱处理6h，最后换入正常高糖DMEM培养基，并加入20μL 0.5％MTT，轻轻摇匀，培养箱中孵育4h，吸干培养液，然后加入150μL DMSO，酶标仪上以570nm波长测定吸光度，测内皮细胞在不同浓度的存活率，并观察细胞的形态学变化。
实验结果：
受试药品在OGD模型制作前1h加入培养基直至实验结束。实验结果可见3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐可以有效降低人脐静脉内皮EA.hy926细胞死亡率，且呈剂量依赖性，参见图1，3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐10^-5μg/μl-10^-3μg/μl可以有效减少血管内皮细胞死亡率。
实施例四3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对缺氧低糖氧化条件下血管内皮细胞过氧亚硝基阴离子产生的影响
药品与试剂
高糖DMEM、高糖DMEM培养基购于美国GIBICO公司，胎牛血清、新生小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。nitrotyrosine鼠抗一抗(UpstateBiotechnology)，鼠二抗(Amersham Bioscience)，其它试剂均为国产和进口分析纯试剂。试验所使用的细胞培养用人脐静脉内皮EA.hy926细胞系为永生化细胞株。
细胞培养
人脐静脉内皮EA.hy 926细胞用高糖DMEM培养液(含10％灭活国产胎牛血清)在37℃、饱和空气湿度、含5％CO₂的培养箱内常规传代培养，细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长。细胞长至融合，倒去培养液，PBS清洗2～3次，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，制成单细胞悬液。
体外低糖缺氧模型构建
将单细胞悬液移入96孔板，3×10³cells/well、37℃、5％CO₂培养箱内培养，细胞完全融合时加入不同处理：空白对照组在正常条件下培养；OGD组和OGD合并3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐用药组(10^-5μM-10^-3μM)，每孔用预热至37℃的HBSS(NaCl 8.00g，KCl0.20g，CaCl₂0.14g，MgSO₄.7H₂O 0.20g，Na₂HPO₄.H₂O 0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g)清洗三次，并换入相同培养基，以上每组每种剂量设平行3孔，先放入缺氧密闭箱通入混合气体(含95％N₂，5％CO₂)约5min，然后将密闭箱放入孵箱处理6h，然后收集细胞进行蛋白定量。
免疫印迹法定量检测3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对血管内皮OGD损伤后过氧亚硝基阴离子表达的影响：
血管内皮OGD损伤后nitrotyrosine蛋白(特异性识别过氧亚硝基阴离子水平)表达变化定量检测，蛋白标本电泳、转膜、5％脱脂奶粉室温封闭45分钟。滴加nitrotyrosine鼠抗一抗(1∶500)，4℃过夜。10mM PBS洗3次各5分钟。滴加鼠抗二抗(1∶2000)室温120分钟。10mM PBS洗3次各5分钟，ECL化学发光法显影。对免疫印迹的条带进行定量分析。
实验结果
3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐(10^-5μg/μl-10^-3μg/μl)在OGD模型制作前1h加入培养基直至实验结束。实验结果显示3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐相比OGD模型组可以更有效降低OGD 6小时后人脐静脉内皮EA.hy 926细胞过氧亚硝基阴离子产生量，呈明显剂量依赖性(*P＜0.05或**P＜0.01)，参见表1。
表1是不同浓度的3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对OGD 6小时条件后过氧亚硝基阴离子产生的影响(均数±标准差，n＝6)。表中吲唑盐酸盐即3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐
表1与OGD模型组比较

^*P＜0.05；^**P＜0.01
实施例五3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对脑微血管损伤后血脑屏障的保护作用
操作方法
Wistar大鼠，体重220～270g，雄性。Dextran-40：Sigma公司产品。特制碳素微栓，New England Nuclear公司产品。大鼠采用水合氯醛(10％)麻醉，固定，颈正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内、颈外动脉、翼突腭动脉，动脉夹临时夹闭颈外动脉和翼突腭动脉。颈总动脉近心端结扎，在距颈内、颈外动脉分叉之前插入导管，将直径为50μm的碳素微栓在不中断动脉血流的情况下缓慢注入颈内动脉，去动脉夹，外科用手术封口胶修补动脉，皮肤缝合。
实验分组如下：假手术组、脑微血管损伤模型组，脑微血管损伤+药物(低剂量)治疗组，脑微血管损伤组+药物(高剂量)治疗组，每组动物6只。药物采用腹腔注射，分别于脑微血管损伤前60分和损伤后1小时时间点两次给药。24小时后测定实验动物血脑屏障通透性：脑微血管损伤损伤后22小时大鼠尾静脉注射伊文思蓝，2h后实验动物断头取脑，观察血脑屏障对伊文思蓝的通透性；按(王超云，蒋王林，智红英等，黄芩苷对脑损伤的保护作用。中草药，2004；35(2)，188-190)中的操作方法称取大脑湿重，105℃烘烤至恒重，精确称量干重，计算含水量。
所有数据以均数±标准差表示，统计学分析采用Dunnett-t检验。
实验结果
实验结果显示3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐可以有效减少了伊文思蓝的漏出。同时，也观察到微血管损伤+药物(低剂量)治疗组，脑微血管损伤组+药物(高剂量)治疗组比脑微血管损伤模型组有更低的脑含水量。证明3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐具有减轻脑水肿的作用(P＜0.01)，见表2。
表2是不同浓度的吲唑盐对脑微血管损伤后血脑屏障破坏的影响(均数±标准差，n＝6)。表中吲唑盐酸盐即3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐
表2与脑微血管损伤模型组比较

^*P＜0.05
实施例六3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用
操作方法
雄性Wistar大鼠，体重220～270g。大鼠采用水合氯醛(10％)麻醉，固定，颈正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内、颈外动脉。颈外动脉、颈总动脉近心端结扎，在距颈内、颈外动脉分叉之前剪口，插入直径统一的3-0尼龙线栓(造成脑缺血现象)，2小时后尼龙线栓退出(造成脑血再灌注现象)，皮肤缝合。
实验分组如下：假手术组、脑血管损伤模型组，脑血管损伤+药物治疗组(低剂量)，脑血管损伤+药物治疗组(高剂量)，每组动物7只。药物采用腹腔注射，脑缺血损伤前60分和再灌注后两次给药。
24小时后实验动物评价：观察动物行为变化、通常动物会出现眼球震颤，共济失调，运动障碍等一系列神经功能损害的表现，按照Longa法对脑血管损伤SD大鼠行为学评分。评分标准如下：0分：无神经功能缺损症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向外侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。
梗塞面积测定：实验动物大脑标本，去掉嗅球、小脑和低位脑干，用大鼠脑模冠状切4刀分为5片，每片厚2mm。脑片用红四氮唑(TTC)染色，染色液成分为：1.5ml 4％TTC、0.1ml 1mol/L KH₂PO₄，3.4ml生理盐水，37℃避光染色30min。用NIH1.63图像分析软件计算梗塞体积。
所有数据以均数±标准差表示，统计学分析采用Dunnett-t检验。
实验结果
实验结果显示脑血管损伤+药物治疗组(低剂量)，脑血管损伤+药物治疗组(高剂量)两组都得到比脑血管损伤模型组有较低的神经功能障碍评分，梗塞面积也较小。证明3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐可以有效改善神经功能障碍，同时有效减少了脑梗塞体积(P＜0.01)，见表3。
表3是不同浓度的3-{2-[4N-(2-甲基-3-氯苯基)-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲氧基-1H-吲唑盐酸盐对大脑中动脉缺血再灌注损伤后神经功能障碍及梗塞体积的影响(均数±标准差，n＝7)。
表3与脑血管损伤模型组比较(^**P＜0.01)