鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒及检测方法.pdf

本发明公开了一种鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒及检测方法，该试剂盒包括：1)正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；2)反向引物，其为SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列。本发明利用该试剂盒进行鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR方法，包括：1)提取我国南疆3种常见蛉种的DNA；2)利用所述试剂盒，将提取的DNA在PCR扩增仪上进行扩增；3)对扩增的产物进行电泳鉴别。本发明解决了传统形态学种类鉴定存在的局限性，而且本发明的方法可靠、简便、易行，对我国南疆3种常见蛉种的鉴定具有积极意义。

1.  一种鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，其特征在于，包括：
(1)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的反向引物，其为SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列；
其中，我国南疆3种常见蛉种包括：长管白蛉、吴氏白蛉和亚历山大白蛉。

2.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：聚合酶链式反应试剂。

3.  如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶链式反应试剂，包括：
1)聚合酶链式反应缓沖液；
2)四种脱氧核糖核苷酸，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2.5mmol/L；
3)牛血清白蛋白，其浓度为40mg/mL；
4)ExTaq酶，其为5U/μL；
5)灭菌双蒸水。

4.  如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶链式反应缓沖液的成份如下：
Tris-HCl    100mmol/L
KCl         500mmol/L
MgCl₂       15mmol/L。

5.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的正向引物、SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列的浓度均为10μmol/L。

6.  一种利用如权利要求1～5任一项所述的试剂盒进行鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR方法，其特征在于，步骤包括：
(1)提取我国南疆3种常见蛉种的DNA，作为DNA模板；
其中，我国南疆3种常见蛉种包括：长管白蛉、吴氏白蛉和亚历山大白蛉；
(2)利用所述试剂盒，将DNA模板在PCR扩增仪上进行扩增；
(3)对扩增的产物进行电泳鉴别。

7.  如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，扩增中的反应体系如下：
聚合酶链式反应缓沖液5μL、2.5mmol/L dNTPs4μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.1所示的正向引物3.0μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.2所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.3所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.4所示的序列1μL、40mg/mL牛血清白蛋白1μL、5U/μL ExTaq聚合酶0.36μL、DNA模板1.5μL，用灭菌双蒸水补足体积至50μL；
扩增中的反应条件如下：
95℃3min；95℃25s，54℃20s，72℃30s，共37个循环；72℃延伸7min。

8.  如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，电泳的条件为：采用1.5g/100mL～2g/100mL的琼脂糖凝胶进行电泳。

9.  如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，鉴别的方法如下：
长管白蛉的PCR扩增片段的长度为248bp，吴氏白蛉的PCR扩增片段的长度为632bp，亚历山大白蛉的PCR扩增片段的长度为395bp。

10.  一种利用如权利要求1～5任一项所述的试剂盒在鉴别长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉中的应用。

鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种PCR试剂盒及检测方法，特别是涉及一种鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)的多重PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
白蛉属于双翅目毛蛉科白蛉亚科(Phlebotominae)，是一类体小多毛的吸血昆虫，全世界已知800多种，其中约10％蛉种已被证实可传播利什曼病等多种疾病。特定的蛉种只能传播特定种类的利什曼原虫，不同蛉种有不同的生物学特征，对应有不同的控制策略。传统形态学种类鉴定存在很大局限性，受发育状态的限制，白蛉主要是根据成虫的内部解剖结构、外部形态，或者雄虫外生殖器的形态特征进行物种鉴定，卵、幼虫、蛹等非成虫虫态一般不能鉴定。肢体残缺的种类就很容易造成种类鉴定不准确或者根本无法鉴定。而且培养一个传统的分类工作者往往需要数年的专业培训，不断缩减的分类学家队伍，使分类学发展面临巨大的挑战。
然而，分子生物学鉴定方法更为方便简单，在物种鉴定方面显示了独特的优势。目前已被广泛应用于昆虫物种的鉴定，但目前我国传统蛉种鉴别方法存在不足，迫切需要新型分子生物学蛉种鉴别方法的出现。
目前南疆是我国内脏利什曼病病例最多的地区，占全国病例一半以上。分布于南疆的蛉种有长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉以及微小司蛉新疆亚种。长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉均为我国内脏利什曼病传播媒介，微小司蛉新疆亚种为野生野栖蛉种，非内脏利什曼病传播媒介，近年南疆黑热病媒介调查显示该蛉种占当地蛉种组成较小，不足0.1％，故不做常见蛉种研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)的多重PCR试剂盒及检测方法。本发明基于我国南疆3种常见蛉种COI基因序列的差异，设计了多重PCR试剂盒及检测方法，而且该方法可靠、简便、易行，可用于我国南疆3种常见蛉种的鉴定。
为解决上述技术问题，本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，包括：
(1)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的反向引物，其为SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列；
其中，我国南疆3种常见蛉种包括：长管白蛉(Ph.longiductus)、吴氏白蛉(Ph.wui)和亚历山大白蛉(Ph.Alexandri)。
进一步的，所述试剂盒还包括：聚合酶链式反应试剂。其中，所述聚合酶链式反应试剂，可包括：
1)聚合酶链式反应缓沖液(即10×PCR缓冲液)；
2)四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2.5mmol/L；
3)牛血清白蛋白(BSA)，其为40mg/mL；
4)ExTaq酶，其浓度为5U/μL；
5)灭菌双蒸水。
进一步的，所述聚合酶链式反应缓沖液的成份如下：
Tris-HCl    100mmol/L
KCl         500mmol/L
MgCl₂       15mmol/L。
进一步的，所述试剂盒中的正向引物、SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列的浓度均为10μmol/L。
另外，本发明还公开了一种利用上述试剂盒进行鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR方法，其步骤包括：
(1)按照常规方法(如采用DNA提取试剂盒)，提取我国南疆3种常见蛉种的DNA，作为DNA模板；
(2)利用上述的试剂盒，将提取的DNA(DNA模板)在PCR扩增仪上进行扩增；
(3)对扩增的产物进行电泳鉴别。
所述步骤(2)中，扩增中的反应体系如下：
聚合酶链式反应缓沖液5μL、2.5mmol/L dNTPs4μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.1所示的正向引物3.0μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.2所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.3所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.4所示的序列1μL、40mg/mL牛血清白蛋白1μL、5U/μL ExTaq聚合酶0.36μL、DNA模板1.5μL，用灭菌双蒸水补足体积至50μL；
扩增中的反应条件如下：
95℃3min；95℃25s，54℃20s，72℃30s，共37个循环；72℃延伸7min。
所述步骤(3)中，电泳的条件为：采用1.5g/100mL～2g/100mL的琼脂糖凝胶进行电泳。
所述步骤(3)中，鉴别的方法如下：
长管白蛉的PCR扩增片段的长度可为248bp，吴氏白蛉的PCR扩增片段的长度可为632bp，亚历山大白蛉的PCR扩增片段的长度可为395bp。
再者，本发明还提供了上述试剂盒在鉴别长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉中的应用。
本发明和已有传统形态学鉴定方法相比较，其效果是积极和明显的，解决了传统形态学种类鉴定存在的局限性，而且本发明的方法可靠、简便、易行，对我国南疆3种常见蛉种的鉴定具有积极意义。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是采用本发明的试剂盒鉴别长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉的结果图；其中，M:标记(DNA Marker II)；1-2:阴性对照(ddH₂O)；3-6:亚历山大白蛉(Ph.Alexandri)；7-10:吴氏白蛉(Ph.wui)；11-14:长管白蛉(Ph.longiductus)。
具体实施方式
以下的试剂如未特别说明，则为商业化产品。
实施例1试剂盒的制备
本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，其组分如下：
1)10μmol/L正向引物PFU：5'-ATTCAACTAAACATAAAGATATTGGAAC-3'(如SEQ ID NO.1所示)
2)10μmol/L反向引物，其具体如下：
10μmol/L的如SEQ ID NO.2所示的序列、10μmol/L的如SEQ ID NO.3所示的序列和10μmol/L的如SEQ ID NO.4所示的序列。
Ph.longiductus反向引物：5'-GGGGACCTAAGTATTAAGGGGATA-3'(SEQ ID NO.2)
Ph.wui反向引物：5'-GAAGTATTTAAATTACGGTCTGTTCAAAG-3'(SEQ ID NO.3)
Ph.Alexandri反向引物：5'-CCATGAGCAATATTTCTTGATAAT-3'(SEQ ID NO.4)
将组分1)、2)的引物分别配制后，制备成试剂盒，该试剂盒可存放于-20℃冰箱。
实施例2试剂盒的制备
本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，其组分如下：
1)10μmol/L正向引物(如SEQ ID NO.1所示)；
2)10μmol/L反向引物，具体如下：
10μmol/L的如SEQ ID NO.2所示的序列、10μmol/L的如SEQ ID NO.3所示的序列和 10μmol/L的如SEQ ID NO.4所示的序列；
3)聚合酶链式反应缓沖液(10×PCR缓冲液)，其中，该缓沖液的成份如下：
Tris-HCl    100mmol/L
KCl         500mmol/L
MgCl₂       15mmol/L；
4)2.5mmol/L dNTPs；
5)40mg/mL牛血清白蛋白；
6)5U/μL ExTaq聚合酶；
7)灭菌双蒸水。
将组分1)～7)分别配制后，制备成试剂盒，该试剂盒可存放于-20℃冰箱。
实施例3利用试剂盒进行蛉种鉴定
利用实施例2的试剂盒，鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)，其具体的鉴别步骤如下：
a.PCR扩增
按照Qiagen DNA提取试剂盒说明书，单只单管提取长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉(长管白蛉64只采自新疆喀什市郊伯什克拉木乡；吴氏白蛉66只采自新疆喀什市郊伯什克拉木乡以及新疆喀什伽师县三乡；亚历山大白蛉20只采自新疆库尔勒什店镇哈满沟煤矿以及新疆吐鲁番煤窑沟；同时，这些蛉种均经形态学鉴定)的基因组DNA。
Multiplex-PCR扩增条件经优化实验条件，确定PCR50μL反应体系：
10×PCR缓冲液5μL(含Mg2+)，2.5mmol/L dNTPs4μL，正向引物PFU(10μmol/L)3.0μL，反向引物3μL(SEQ ID NO.2所示的Ph.longiductus引物1μL、SEQ ID NO.3所示的Ph.wui引物1μL和SEQ ID NO.4所示的Ph.alexandri引物1μL，其浓度均为10μmol/L)，牛血清白蛋白(40mg/mL)1μL，0.36μL ExTaq聚合酶(5U/μL)，DNA模板(单只单管提取的模板)1.5μL，用ddH₂O补足体积至50μL。
将PCR反应体系置于PCR仪上按以下程序进行扩增：95℃3min；95℃25s，54℃20s，72℃30s，共37个循环；72℃延伸7min。
b.电泳和观察
配制2g/100mL的琼脂糖凝胶(含GoodView核酸染料)。然后，取10μL扩增后的样品进行上样，100V电压电泳35分钟时间，在紫外灯下观察，长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉分别扩增出248bp、632bp、395bp三条清晰的特异性条带(如图1所示)。
由此可知，采用本发明的试剂盒和检测方法，能明显鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)，而且方法简单。