一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010512952.3	申请日：	2010.10.20
公开号：	CN102453714A	公开日：	2012.05.16
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	文件的公告送达IPC(主分类):C12N 15/113收件人:上海生博医学生物工程科技有限公司财务处文件名称:退款审批通知书\|\|\|发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/113申请公布日:20120516\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/113(2010.01)I; C07H21/02; A61K48/00; A61P35/04	主分类号：	C12N15/113
申请人：	上海生博医学生物工程科技有限公司
发明人：	车丽花; 黄红军; 郑大; 夏清梅; 潘讴东
地址：	201203 上海市浦东新区蔡伦路720弄生物药谷一号楼
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内容摘要

本发明涉及一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA、其制备方法及其应用。该干扰小分子RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤迁移有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤迁移的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。

权利要求书

1：抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA，其特征在于该基因为 SEQ NO.1 所示的碱基序列。2：一种制备根据权利要求 1 所述的用于抑制胶质瘤迁移的的干扰小分子 RNA 的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据载体设计的具体要求，设计对应于 SMAD1 基因 299-317 位，即 : GGA AAC AGG GCG ATG AAG A 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 55bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的 shRNA 的寡核苷酸序列序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3’ ；依据载体设计的要求，将设计的 shRNA 序列和 MAGic 质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤迁移的一种干扰小分子 RNA。3：根据权利要求 1 所述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 在制取抑制胶质瘤迁移药物中的应用。

说明书

一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA
    【技术领域】
     本发明涉及抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA、其制备方法及其应用。背景技术脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性脑肿瘤，起源于神经胶质细胞。由于恶性脑胶质瘤具有生长迅速，侵袭性强，手术后容易复发，病死率高等的特点，尽管包括手术切除术，放疗以及化疗在内的脑胶质瘤综合治疗水平在不断提高，但其总体疗效仍不理想。患上多形性胶质母细胞瘤（WHO IV 级）的病人的平均存活时间仅仅为 12-15 个月，而患上间变性星形细胞瘤（WHO Ⅲ级）的病人的平均存活时间为 2-5 年。因此，寻找有效的脑胶质瘤治疗方法仍是神经外科领域关注的焦点。
     基因治疗是指用正常或野生型基因校正或置换致病基因或引入有治疗价值的其他来源基因的一种治疗方法。目前，基因治疗主要处于基础研究阶段，常用的有通过基因工程产生抗肿瘤药物如重组细胞因子、生长因子拮抗物等；以新的基因替代突变的基因；引入肿瘤抑制基因等方法。脑胶质瘤的基因治疗基本上可以分为以下几种：酶前体药物治疗、免疫基因治疗、肿瘤抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、反义基因治疗和 RNAi 治疗。其中 RNAi 技术与传统的类似技术相比具有更多的优点，因而在肿瘤研究和基因治疗中得以广泛应用。
     RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是指由双链 RNA 介导的细胞内与其序列同源的 mRNA 发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。
     通过 RNAi 手段特异性地下调 Smad1 基因的表达在胶质瘤的研究中，目前尚未见诸报道。
     发明内容本发明的目的之一在于提供用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA。
     本发明的目的之二在于提供该干扰小分子 RNA 的制备方法。
     本发明的目的之三在于提供该干扰小分子 RNA 的应用。
     为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA，其特征在于该基因为 SEQ NO.1 所示的碱基序列。
     一种制备上述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据载体设计的具体要求，设计对应于 SMAD1 基因 299-317 位，即 : GGA AAC AGG GCG ATG AAG A 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 55bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的 shRNA 的寡核苷酸序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC
     TTT TTT g-3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3’ ；根据上海生博医学生物工程科技有限公司提供的 MAGic 质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将设计的 shRNA 的寡核苷酸序列引物和 MAGic 质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤迁移干扰小分子 RNA。
     一种上述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 在制备抗胶质瘤迁移的分泌药物中的应用。
     本发明设计对胶质瘤迁移有关联的基因的 RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤迁移的促进作用，为 RNAi 在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。
     具体实施方式：一、胶质瘤细胞的培养：胶质瘤细胞 U251 细胞系培养于 37℃， 5%CO2 恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混匀细胞；将得到的细胞悬液移入 15ml 离心管中， 1500rpm 离心 3min ；去上清；用 5ml 无菌 1×PBS 将细胞悬起，吹打混匀；加约 1ml 细胞悬液于装有 5ml 新鲜培养基的新培养瓶中，放入 37℃， 5%CO2 培养箱中培养，约 2 天左右传代 1 次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。
     二、人脑胶质瘤细胞的分离：取人脑胶质瘤手术标本 , 浸入 4℃的 KRBB 溶液中 . 清洗二次 , 然后将标本剪成小块 , 转移至盛有 5mL 消化酶液的三角瓶中 , 于恒温摇床中 37 ℃保温 , 摇床转速 100r/min, 每 10min 玻璃管反复吹打一次 , 放置 30min。将该悬液离心 500-1000rpm， 5min, 最后剩下为胶质瘤细胞 . 用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。
     三、 SMAD1-RNAi 质粒的设计和转染：根据 RNAi 载体设计的具体要求，设计对应于 SMAD1 基因 299-317，即 :GAG TCA AGG AGA CAT GCA A 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 55bp，送华大基因研究中心进行合成。
     SMAD1-RNAi 对应的序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3’ ；根据 MAGic 载体设计的具体要求，将设计的 SMAD1 -RNAi 的干扰片段和 MAGic 质粒连接，参见图 1，然后转染进胶质瘤细胞。
     SMAD1-RNAi 质粒的转染：转染前一天，在含有 5ml 无抗生素的 DMEM 生长培养基 6 首先用 500μl 无的 60-mm 培养皿里种上 2×10 个胶质瘤细胞。铺板后第二天准备转染：血清的培养基（DMEM）溶解 8.0μg 的 SMAD1-RNAi 表达载体，用 500μl 培养基（DMEM）溶 TM 解 Lipofectamine 2000(20μl)，轻轻地混匀，室温孵育 5 分钟。孵育后，为促使 shRNA TM 表达载体与 Lipofectamine 2000 充分结合，将它们轻轻混匀，室温孵育 20 分钟，以形成 TM TM DNA-Lipofectamine 2000 的复合物。将 DNA-Lipofectamine 2000 复合物加入到 60mm 培
     养皿，之后将含有 DNA-LipofectamineTM2000 复合物的细胞培养皿放入 37℃， 5% CO2 培养箱内培养 6 小时，换上正常细胞培养液。
     四、实验分组与检测指标正常对照组：胶质瘤细胞 , 培养液为胶质瘤细胞培养液； RNAi 组：转染过 SMAD1-RNAi 的胶质瘤细胞 , 培养液为胶质瘤细胞培养液。
     胶质瘤细胞迁移的检测：将贴壁细胞培养皿的定点拍照部位做好标记，用 1000μl tip 在底部轻轻划线（垂直 90 度，用力均匀），确保划线处无细胞。划线两侧间距为 average gaps（AGs）。连续两天倒置显微镜下 100× 下拍照，记录各组细胞的 AGs，即细胞的迁移情况。如图 2(A) 和图 2 （B）。 MAGic
     图 1 为 shRNA 的寡核苷酸序列引物和 P 质粒的连接图。
     图 2（A）正常 U251 细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞 U251 的迁移的细胞数量和 AVGs 均呈时间依赖性。
     图 2（B）转染过 PLVT-136 的 U251 细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞 U251 的迁移随时间的延长和对照相比细胞迁移的数量和细胞迁移的 AVGs 均有所下降。图中 PLVT136 为 SMAD1-RNAi 质粒，标尺的长度为 500um。
     五、结果：转染过 SMAD1-RNAi 干扰质粒的胶质瘤的细胞迁移数量减少，细胞的 AVGs 减少。该实验结果表明，通过 RNAi 技术下调胶质瘤中的 SMAD1 表达抑制了胶质瘤的迁移。
     5CN 102453714 A序列表1/2 页SEQUENCE LISTING <110> <120> <130> <140> <141> <160> <170> <210> <211> <212> <213> 上海生博医学生物工程科技有限公司一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 3778626 2010105129523 2010-10-20 2 PatentIn version 3.3 1 55 DNA 人工序列<220> <221> <222>misc_RNA (1)..(55)<400> 1 ccggggaaac agggcgatga agactcgagt cttcatcgcc ctgtttcctt ttttg55<210> <211> <212> <213>2 55 DNA 人工序列<220> <221> <222>misc_RNA (1)..(55)6CN 102453714 A序列表2/2 页<400> 2 aattcaaaaa aggaaacagg gcgatgaaga ctcgagtctt catcgccctg tttcc55

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1、(10)申请公布号 CN 102453714 A (43)申请公布日 2012.05.16 C N 1 0 2 4 5 3 7 1 4 A *CN102453714A* (21)申请号 201010512952.3 (22)申请日 2010.10.20 C12N 15/113(2010.01) C07H 21/02(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (71)申请人上海生博医学生物工程科技有限公司地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路720弄生物药谷一号楼 (72)发明人车丽花黄红军郑大夏清梅潘讴东 (54) 发明名。

2、称一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA (57) 摘要本发明涉及一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA、其制备方法及其应用。该干扰小分子 RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤迁移有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤迁移的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书3页序列表2页附图5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页序列表 2 页附图 5 页 1/1页 2 1.抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA，其特征在于。

3、该基因为SEQ NO.1所示的碱基序列。 2.一种制备根据权利要求1所述的用于抑制胶质瘤迁移的的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据载体设计的具体要求，设计对应于SMAD1基因 299-317位，即: GGA AAC AGG GCG ATG AAG A的shRNA的寡核苷酸序列，各为55bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为： SEQ NO.1: Sense: 5-CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3 Anti-sens。

4、e:5-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3；依据载体设计的要求，将设计的shRNA序列和MAGic质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤迁移的一种干扰小分子RNA。 3.根据权利要求1所述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA在制取抑制胶质瘤迁移药物中的应用。权利要求书CN 102453714 A 1/3页 3 一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 技术领域 0001 本发明涉及抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA、其制备方法及其应用。背景技术 0002 脑胶质瘤。

5、是中枢神经系统中最常见的原发性脑肿瘤，起源于神经胶质细胞。由于恶性脑胶质瘤具有生长迅速，侵袭性强，手术后容易复发，病死率高等的特点，尽管包括手术切除术，放疗以及化疗在内的脑胶质瘤综合治疗水平在不断提高，但其总体疗效仍不理想。患上多形性胶质母细胞瘤（WHO IV级）的病人的平均存活时间仅仅为12-15个月，而患上间变性星形细胞瘤（WHO 级）的病人的平均存活时间为2-5年。因此，寻找有效的脑胶质瘤治疗方法仍是神经外科领域关注的焦点。 0003 基因治疗是指用正常或野生型基因校正或置换致病基因或引入有治疗价值的其他来源基因的一种治疗方法。目前，基因治疗主要处于基础研究阶段，常用的有通过。

6、基因工程产生抗肿瘤药物如重组细胞因子、生长因子拮抗物等；以新的基因替代突变的基因；引入肿瘤抑制基因等方法。脑胶质瘤的基因治疗基本上可以分为以下几种：酶前体药物治疗、免疫基因治疗、肿瘤抑癌基因治疗、抗血管生成治疗、反义基因治疗和RNAi治疗。其中 RNAi技术与传统的类似技术相比具有更多的优点，因而在肿瘤研究和基因治疗中得以广泛应用。 0004 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。 0005 通过RNAi手段特异性地下调Smad1基因的表。

7、达在胶质瘤的研究中，目前尚未见诸报道。发明内容 0006 本发明的目的之一在于提供用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。 0007 本发明的目的之二在于提供该干扰小分子RNA的制备方法。 0008 本发明的目的之三在于提供该干扰小分子RNA的应用。 0009 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA，其特征在于该基因为SEQ NO.1所示的碱基序列。 0010 一种制备上述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据载体设计的具体要求，设计对应于SMAD1基因299-317位，即: GGA AAC AGG G。

8、CG ATG AAG A的shRNA的寡核苷酸序列，各为55bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为： SEQ NO.1: Sense: 5-CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC 说明书CN 102453714 A 2/3页 4 TTT TTT g-3 Anti-sense:5-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3；根据上海生博医学生物工程科技有限公司提供的。

9、MAGic质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤迁移干扰小分子RNA。 0011 一种上述的用于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA在制备抗胶质瘤迁移的分泌药物中的应用。 0012 本发明设计对胶质瘤迁移有关联的基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤迁移的促进作用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。 0013 0014 具体实施方式：一、胶质瘤细胞的培养：胶质瘤细胞U251细胞系培养于37，5%CO 2 恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混匀。

10、细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1PBS将细胞悬起，吹打混匀；加约1ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37， 5%CO 2 培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。 0015 二、人脑胶质瘤细胞的分离：取人脑胶质瘤手术标本, 浸入4的KRBB溶液中. 清洗二次,然后将标本剪成小块, 转移至盛有5mL 消化酶液的三角瓶中, 于恒温摇床中37 保温, 摇床转速100r/min, 每10min玻璃管反复吹打一次,放置30min。将该悬液离心500-1000rpm， 5min, 最后剩下为。

11、胶质瘤细胞. 用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。 0016 三、SMAD1-RNAi质粒的设计和转染：根据RNAi载体设计的具体要求，设计对应于 SMAD1基因299-317，即:GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列，各为55bp，送华大基因研究中心进行合成。 0017 SMAD1-RNAi 对应的序列为： SEQ NO.1: Sense: 5-CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3 Anti-sens。

12、e:5-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3；根据MAGic载体设计的具体要求，将设计的SMAD1 -RNAi的干扰片段和MAGic质粒连接，参见图1，然后转染进胶质瘤细胞。 0018 SMAD1-RNAi质粒的转染：转染前一天，在含有5ml 无抗生素的DMEM生长培养基的60-mm培养皿里种上210 6 个胶质瘤细胞。铺板后第二天准备转染：首先用500l无血清的培养基（DMEM）溶解8.0g的SMAD1-RNAi表达载体，用500l培养基（DMEM）溶解Lipofec。

13、tamine TM 2000(20l)，轻轻地混匀，室温孵育5分钟。孵育后，为促使 shRNA 表达载体与Lipofectamine TM 2000充分结合，将它们轻轻混匀，室温孵育20分钟，以形成 DNA-Lipofectamine TM 2000的复合物。将DNA-Lipofectamine TM 2000复合物加入到60mm培说明书CN 102453714 A 3/3页 5 养皿，之后将含有DNA-Lipofectamine TM 2000复合物的细胞培养皿放入37，5% CO 2 培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。 0019 四、实验分组与检测指标正常对照组：胶质瘤细胞。

14、,培养液为胶质瘤细胞培养液；RNAi组：转染过SMAD1-RNAi的胶质瘤细胞,培养液为胶质瘤细胞培养液。 0020 胶质瘤细胞迁移的检测：将贴壁细胞培养皿的定点拍照部位做好标记，用1000l tip在底部轻轻划线（垂直 90度，用力均匀），确保划线处无细胞。划线两侧间距为average gaps（AGs）。连续两天倒置显微镜下100下拍照，记录各组细胞的AGs，即细胞的迁移情况。如图2(A)和图2（B）。 0021 图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和P MAGic 质粒的连接图。 0022 图2（A）正常U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞U251的迁移的细胞数量和AVGs。

15、均呈时间依赖性。 0023 图2（B）转染过PLVT-136的U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞U251 的迁移随时间的延长和对照相比细胞迁移的数量和细胞迁移的AVGs均有所下降。图中 PLVT136为SMAD1-RNAi质粒，标尺的长度为500um。 0024 五、结果：转染过SMAD1-RNAi干扰质粒的胶质瘤的细胞迁移数量减少，细胞的 AVGs减少。该实验结果表明，通过RNAi技术下调胶质瘤中的SMAD1表达抑制了胶质瘤的迁移。 0025 0026 说明书CN 102453714 A 1/2页 6 SEQUENCE LISTING 上海生博医学生物工程科技有限公司一种用。

16、于抑制胶质瘤迁移的干扰小分子RNA 3778626 2010105129523 2010-10-20 2 PatentIn version 3.3 1 55 DNA 人工序列 misc_RNA (1)(55) 1 ccggggaaac agggcgatga agactcgagt cttcatcgcc ctgtttcctt ttttg 55 2 55 DNA 人工序列 misc_RNA (1)(55) 序列表CN 102453714 A 2/2页 7 2 aattcaaaaa aggaaacagg gcgatgaaga ctcgagtctt catcgccctg tttcc 55 序列表CN 102453714 A 1/5页 8 图1 说明书附图CN 102453714 A 2/5页 9 图2（A-1）说明书附图CN 102453714 A 3/5页 10 图 2（A-2）说明书附图CN 102453714 A 10 4/5页 11 图2（B-1）说明书附图CN 102453714 A 11 5/5页 12 图 2（B-2）说明书附图CN 102453714 A 12 。

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