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1、(10)申请公布号 CN 102726292 A (43)申请公布日 2012.10.17 C N 1 0 2 7 2 6 2 9 2 A *CN102726292A* (21)申请号 201210201360.9 (22)申请日 2012.06.19 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1 号 (72)发明人熊兴耀 李炎林 石梦蝶 秦宇 张家银 (74)专利代理机构长沙市融智专利事务所 43114 代理人袁靖 (54) 发明名称 一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速打破南方红豆杉种。
2、子 休眠的方法。包括：（1）种子外种皮剥离：利用机 械破壳，手工剥离外种皮；（2）外植体消毒：依次 经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min， 无菌水冲洗5次后备用；（3）种子预处理：用无菌 水密封常温浸种1-5天；（4）分离合子胚；（5）试 管苗的离体培养：将种胚接种到试管苗诱导培养 基上，可以获得99.9%的种子萌发率。本发明提供 了一种简便、快速打破南方红豆杉种子休眠的方 法，为获取整齐一致的南方红豆杉种苗打下基础， 能节省大量的人力、物力、提高劳动效率。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。
3、 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1页 2 1.一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）种子种胚的剥离：将南方红豆杉（Taxales chinensis var.mairei）种子从外种皮 中剥离出来； （2）外植体消毒：取步骤（1）得到的种子用70%的酒精和0.1%的氯化汞表面消毒，再用 无菌水清洗； （3）种子的预处理：将步骤（2）得到的种子用无菌水浸泡1-5天； （4）种子合子胚的分离：在无菌条件下剥取种子的合子胚或带部分胚乳组织的合子 胚； （5）试管苗的诱导：将步骤（4）剥离的合子胚或带部分胚乳组织的合子胚接种到试管 苗诱导培养基。
4、上诱导试管苗；诱导培养基为：BLCG培养基+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+琼 脂7g/L，培养基pH值5.8；培养条件为：经过30天的暗培养后转入14h光照，光照强度为 4400lx和10h暗培养的光周期条件下培养，温度均为241。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤（1）中的南方红豆杉种子为当年生或者4保存1-2年的南方红豆杉种子。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步骤（2）清洗消毒过程具体如下：先将去除外种皮的种子放入无菌的容器中，在 超净工作台内依次经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用。 4.根据权利要求1所述的方。
5、法，其特征在于， 所述步骤（3）种子预处理具体过程如下：将去掉外种皮的种子经过步骤（2）的表面消 毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下无菌密封浸泡1-5天。 权 利 要 求 书CN 102726292 A 1/4页 3 一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方 法。 背景技术 0002 紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是20世纪六七十年代从红豆杉科（Taxaceae） 红豆杉属（Taxus L.）植物树皮中分离出来的一种天然的四环二萜类生物碱，其在治疗宫颈 癌、乳腺癌、小细胞肺癌、黑素瘤和结。
6、肠癌等方面有显著的疗效。紫杉醇首先在太平洋短叶 红豆杉的树皮和形成层中提取出来。按照目前的纯化技术，生产1kg的紫杉醇大约需要10 吨红豆杉树皮。这大约需要从2000到4000棵60-70年生的红豆杉中才能获得。据相关资 料介绍，每年全球大约需要消耗250kg紫杉醇纯品。这需要从250万千克树皮或者75万棵 红豆杉中提取才能满足这一市场的需要。随着对紫杉醇需求量的日益递增，目前仅仅从天 然的红豆杉林树体中提取分离紫杉醇的产量已经不能满足医药市场需要，加之大肆的开采 使红豆杉自然资源日趋枯竭、红豆杉资源自然更新能力差、生长缓慢、濒危灭绝，各国政府 已明文规定禁止砍伐野生红豆杉资源。因此紫杉醇其他。
7、途径的开发就显得极为重要，其中 利用人工栽培的红豆杉中提取分离紫杉醇是目前获取紫杉醇及半合成前体的一条重要途 径，这可以加强对红豆杉野生种质资源及其生态环境的保护。 0003 红豆杉种子具有较长的休眠期，采收后必须在低温下用湿沙层积贮藏，春季播种 后，其发芽期可延至第二年，红豆杉种子的这种发芽特性严重影响了其种苗的生产。植物组 织培养技术是一种不依赖于环境条件进行生产的技术，通过红豆杉种胚离体培养，即可以 获得更多的红豆杉种苗，可以克服生产中种子萌发率不高的特性，也可以将种胚直接或者 间接的诱导成细胞系生产紫杉醇。 0004 红豆杉种子中含有较多抑制种子萌发的物质。南方红豆杉种子中含有正庚 酸。
8、、壬酸、乙酸等发芽抑制物质，其种皮、内种皮和胚乳的浸泡液对白菜种子发芽率和幼 苗的生长、根生长均有抑制作用，并且与浸提液浓度呈正比（张艳杰等，南方红豆杉种 子种发芽抑制物的研究，南京林业大学学报（自然科学版），2007,4（31）:51-58）。成 熟的种子较未成熟的种子萌发率高（Yang F，et al，In vitro embryo culture of Taxus chinensis var.mairei，Journal of Anhui Normal University(Natural Science),2010,3(33):262-269）。 0005 影响红豆杉种胚萌发的因素很多。
9、，除了遗传因素外，很多的环境因素如基本 培养基种类、光照、环境温度、适当的预处理等。南方红豆杉种胚离体培养萌发率显著 受培养基类型和光照的影响，在B5培养基上10小时的光周期种胚离体培养萌发率高 达96%（Yang F，et al，In vitro embryo culture of Taxus chinensis var.mairei， Journal of Anhui Normal University(Natural Science),2010,3(33):262-269）。云 南红豆杉种胚离体培养萌发率在MS培养基上较高，达到80%左右，胚乳可以促进种胚的 萌发，幼苗中紫杉醇含量低于成。
10、年树皮中紫杉醇的含量（赵沛基等，云南红豆杉离体胚的 说 明 书CN 102726292 A 2/4页 4 培养，植物生理学通讯，2003,4（39）：327-330）。Hector等对短叶红豆杉种胚的离体研 究表明Whites和MS培养基可以再离体培养2周后获得70%左右的萌发率，低温贮藏 可以显著降低短叶红豆杉种子的萌发（Hector EF,In vitro culture and precocious germination of Taxus embryos，In Vitro Cell.Dev.Biol.，1991,27P:139-142）。Chee 对短叶红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉和。
11、欧洲红豆杉另一个品种成熟离体胚研究表明， B5培养基为其萌发的最佳基本培养基，外源BA在低浓度处理时对种胚萌发无显著的影 响，但高浓度的BA抑制种胚的萌发（Chee PP，In Vitro Culture of Zygotic Embryos of Taxus Species，Hortscience,1994,29(6):695-697）。Zhiri等利用流动的自来水冲 洗短叶红豆杉的种子7天，在改良后的MS培养基上离体培养得到了100%的萌发率（Zhiri A,et al，Factors affecting the in vitro rapid germination of Taxus em。
12、bryos and the evaluation of taxol content in the plantlets，Plant Cell,1issue and Organ Culture,1994,39:261-263）。Zarek将欧洲红豆杉种子在4条件下至少浸泡48h后，分离 种胚在MS培养（附加5g/L活性炭）离体培养在黑暗条件下可获得100%的萌发率（Zarek M，A practical method for overcoming the dormancy of Taxus baccata isolated embryos under in vitro conditions，In 。
13、Vitro Cell.Dev.Biol.2007,(43):623-630）。 0006 种胚的离体再生与增殖也受红豆杉种类、植物激素种类和浓度、培养条件等因 素的影响。Wann等以欧洲短叶红豆杉成熟种胚为材料，在BLCG培养基上附加2mg/L的 2,4-D和1mg/L的BA，6周后获得可连续培养的红豆杉胚状体细胞（Wann.Induction of somatic embryo genesis in Taxus,and the production of Taxane-ring containing alkaloids therefrom，US，Patent No.5310672,1994-。
14、3-10）。Chee描述了一种短叶红豆 杉种苗的方法，他将短叶红豆杉种胚接种在1/2B5培养（附加10M BA）14天后再转接 到McCowns基本培养基上（附加1.0%）的活性炭，大约有5%的外植体发生了体细胞体细 胞胚胎（Chee PP，Organogenesis in Taxus brevifolia tissue cultures，Plant Cell Reports,1995,14:560-565）。Chee于1996年再次建立了短叶红豆杉未成熟种胚体细胞胚 胎发生途径（Chee，Plant regeneration from somatic embryos of Taxus bre。
15、vifolia， Plant Cell Reports,1996,16:184-187）。Majada等建立了欧洲红豆杉种胚离体培养的再 生体系，他们将种胚离体接种到WP培养基上（附加22.19mM的BAP，0.5%的活性炭和2%的 蔗糖）培养30天，在转接到无激素培养基上，总共70天后可见到再生从芽的出现（Maja da JP，One step more towards taxane production through enhanced Taxus propagation， Plant Cell Reports,2000,19:825-830）。Datta等报道了西藏红豆杉的合子胚愈伤组织。
16、 再生的研究报道，试验结果表明西藏红豆杉的种胚接种到Lloyd and McCowns基本培养 基，并附加SH有机物、0.5mg/L的BA、1.0-2.0mg/L的2,4-D或者NAA，2个月后将愈伤组织 转接到1/2WPMSH培养基上并附加2.5mg/L的BA，4个月后可以获得再生苗（Datta MM,et al，Organogenesis and plant regeneration in Taxus wallichiana(Zucc.)，Plant Cell Rep,2006,25:1118）。 0007 可见红豆杉的不同种类，以及处理方法，培养条件等的不同都是影响其种胚萌发 的重要因素。
17、。目前为止，还没有关于快速，简便的种胚离体再生获取南方红豆杉种苗的方法 报道。 说 明 书CN 102726292 A 3/4页 5 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，为快速打破南 方红豆杉种子休眠，获取整齐一致的南方红豆杉种苗打下基础。 0009 本发明的目的是通过以下方式实现的。 0010 一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，包括以下步骤： 0011 （1）种子种胚的剥离：将南方红豆杉（Taxales chinensis var.mairei）种子从外 种皮中剥离出来； 0012 （2）外植体消毒：取步骤（1）得到的种子用70%的酒。
18、精和0.1%的氯化汞表面消毒， 再用无菌水清洗； 0013 （3）种子的预处理：将步骤（2）得到的种子用无菌水浸泡1-5天； 0014 （4）种子合子胚的分离：在无菌条件下剥取种子的合子胚或带部分胚乳组织的合 子胚； 0015 （5）试管苗的诱导：将步骤（4）剥离的合子胚或带部分胚乳组织的合子胚接种 到试管苗诱导培养基上诱导试管苗；诱导培养基为：BLCG培养基（该培养基配方见Wann et al.,induction of somatic embryogenisis in taxus,and the production of taxane-ring containing alkaloids 。
19、therefrom,United States Patent,US005310672A） +活性炭5g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，培养基pH值5.8；培养条件为：经过30天的暗培养 后转入14h光照，光照强度4400lx和10h暗培养的光周期条件下培养，温度均为241。 0016 所述步骤（1）中的南方红豆杉种子为当年生或者4保存1-2年的南方红豆杉种 子。 0017 所述步骤（2）清洗消毒过程具体如下：先将去除外种皮的种子放入无菌的容器 中，在超净工作台内依次经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后 备用。 0018 所述步骤（3）种子预处理具体过程如下。
20、：将去掉外种皮的种子经过步骤（2）的表 面消毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下无菌密封浸泡1-5天。 0019 该发明具有以下优点：（1）外植体采集时期集中，污染率极低；（2）相比现有的其 他种类的红豆杉种子复杂的预处理过程，本发明针对南方红豆杉种子的预处理过程则简单 的多，而且用静水处理可以大量节约水资源，并且适合大批量的种子处理；（3）通过一步培 养可以获得整齐一致的南方红豆杉种苗；种子萌发率达到99.9%。 附图说明 0020 图1是采用本发明方法快速打破南方红豆杉种子休眠的过程， 0021 其中A.红豆杉种子及去种皮的种子； 0022 B.离体培养0天的红豆杉种胚； 0023 C.离。
21、体培养7天的红豆杉种胚； 0024 D.离体培养10天的红豆杉种胚； 0025 E.离体培养15天的红豆杉种胚； 0026 F.暗培养30天后转入14h光照和10h暗培养的光周期条件下培养10天后的试管 苗。 说 明 书CN 102726292 A 4/4页 6 具体实施方式 0027 以下实施例旨在进一步说明本发明，而不会限制本发明。 0028 实施例1 0029 （1）种子种胚的剥离：收集当年生的南方红豆杉种子，使用机械结合手工方法破 壳，将种子从外种皮中剥离出来； 0030 （2）外植体消毒：先将去外种皮的种子放入无菌的容器中，在超净工作台内经70% 酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒1。
22、2min，无菌水冲洗5次后备用，清洗时每次浸种5分钟左 右。 0031 （3）种子的预处理：将去掉外种皮的种子经过步骤（2）的表面消毒处理后，用无菌 的蒸馏水在室温条件下密封浸泡3-5天。 0032 （4）种子合子胚的分离：在无菌条件下剥取种子的合子胚或带少量胚乳组织，其他 部分弃除； 0033 （5）试管苗的诱导：将剥离的种胚接种到诱导培养基上进行诱导，诱导培养基为： BLCG培养基+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，培养基pH值5.8；培养温度为241， 经过30天的暗培养后将离体培养的种胚转入14h光照（光照强度4400lx）和10h暗培养的 光周期条件下培养10天，即可获得健壮的试管苗。种子萌发率达到99.9%。 说 明 书CN 102726292 A 1/1页 7 图1 说 明 书 附 图CN 102726292 A 。