18元或14元大环内酯类埃博霉素化合物及其应用.pdf

1.  一组大环内酯类埃博霉素化合物，包括18元大环内酯类埃博霉素化合物和14元大环内酯类埃博霉素化合物，其特征在于：
所述18元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式(I)所示：

式(I)
式(I)中

  R₁+R₂＝O，R₃＝H  埃博霉素M  R₁＝R₂＝OH，R₃＝H  埃博霉素N  R₁+R₂＝O，R₃＝CH₃  埃博霉素M1  R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃  埃博霉素N1  R₁＝R₂＝H，R₃＝H  埃博霉素O  R₁＝R₂＝H，R₃＝CH₃  埃博霉素O1；
所述14元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式(II)所示：

式(II)
式(II)中
  R＝H  埃博霉素L  R＝CH₃  埃博霉素L1。

2.  权利要求1所述大环内酯类埃博霉素化合物的制备方法，其特征在于，所述18或14元大环内酯类埃博霉素类化合物是由纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2 CCTCC M 208078经液体发酵后，从其液体发酵产物中分离得到。

3.  权利要求1的化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。

4.  权利要求1的化合物在制备预防和治疗肺癌的药物中的应用。

5.  权利要求1的化合物在制备预防和治疗乳腺癌的药物中的应用。

6.  如权利要求3、4或5所述的应用，其特征在于，所述权利要求1的化合物是埃博霉素M。

7.  用于预防和治疗肝癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

8.  用于预防和治疗肺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

9.  用于预防和治疗乳腺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

10.  如权利要求7、8或9所述的药物组合物，其特征在于，所述权利要求1的化合物是埃博霉素M。

18元或14元大环内酯类埃博霉素化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一组大环内酯类埃博霉素化合物(18或14元大环内酯类埃博霉素化合物)，及其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它在制备治疗和预防肝癌、肺癌和乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
埃博霉素(Epothilone)是一类16元大环内酯类具有显著抗肿瘤活性的化合物，最先发现的该类化合物如埃博霉素A和B，其结构式如下：

其中：R=H，埃博霉素A
R=CH₃，埃博霉素B
纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于粘球菌目，堆囊菌亚目，堆囊菌科，堆囊菌属的一类可以滑动的单细胞革兰氏阴性杆菌，在土壤中广泛存在。它能够合成结构多样的次级代谢产物，其代谢产物化学结构和生物学活性作用机制的多样性可以与链霉菌相比拟。
由纤维堆囊菌合成的埃博霉素主要为埃博霉素A和B，从其生物合成可以推测它们是由多模块聚酮合酶与单模块的非核糖体肽合酶组成的复杂的多酶复合体催化合成的。
1993年Rechenbach和等人发现了这类具有细胞毒活性的天然产物，在1995年Merch研究小组证实了这类化合物具有与紫杉醇pacilitaxel()类似的作用机制。直到1996年等人揭示了埃博霉素B的立体化学结构，由于其中典型的epoxide／thiazole／ketone结构特征，所以reichenbach和将其命名为“epothilones”。
埃博霉素具有类似于紫杉醇()的促微管聚合及稳定微管(microtubule-stabilizing)的作用，诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态，阻碍有丝分裂的进行，进而阻止肿瘤细胞繁殖。埃博霉素的分子结构远比紫杉醇的结构简单；并且具有更好的水溶性以及良好的化学修饰潜力；它对紫杉醇耐药性的肿瘤细胞也具有很高的活性；埃博霉素由粘细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生，具有大规模发酵生产的潜力。由于以上的种种特点，使得埃博霉素被认为是紫杉醇更新换代的产品，是具有很大市场潜力的新型抗肿瘤药物。
目前已经有多种埃博霉素类似物进入不同的临床评估阶段甚至上市销售，如ixabepilone(aza-epothilone B BMS-247550)，BMS-310705(a water-soluble analogof epothilone B)，patupilone(epothilone B，EP0906，developed by Novatis)，epothilone D(KOS-862，Kosan/Sloan-Kettering/Roche)，ZK-EPO 以及C20-desmethyl-C20-methylsulfanyl-Epo B(ABJ879，Novatis)。但关于18或14元大环内酯类埃博霉素化合物经检索尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一组大环内酯类埃博霉素化合物(18或14元大环内酯类埃博霉素化合物)，及其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它在制备治疗和预防肝癌、肺癌和乳腺癌的药物中的应用。
本发明所述大环内酯类埃博霉素化合物，包括18元大环内酯类埃博霉素化合物和14元大环内酯类埃博霉素化合物，其特征在于：
所述18元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式(I)所示：

式(I)
式(I)中

  R₁+R₂＝O，R₃＝H  埃博霉素M  R₁＝R₂＝OH，R₃＝H  埃博霉素N  R₁+R₂＝O，R₃＝CH₃  埃博霉素M1  R₁＝R₂＝OH，R₃＝CH₃  埃博霉素N1  R₁＝R₂＝H，R₃＝H  埃博霉素O  R₁＝R₂＝H，R₃＝CH₃  埃博霉素O1；
所述14元大环内酯类埃博霉素化合物结构如式(II)所示：

式(II)
式(II)中
  R＝H  埃博霉素L  R＝CH₃  埃博霉素L1。
本发明所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物的制备方法，其特征在于，所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物是由纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078经液体发酵后，从其液体发酵产物中分离得到。
发明人发现本发明所述大环内酯类埃博霉素化合物对肝癌、肺癌、乳腺癌具有预防和治疗作用。本发明的化合物和药物组合物均可用于制备相关的药物。
本发明所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗肝癌的药物中的应用。
本发明所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗肺癌的药物中的应用。
本发明所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物在制备预防和治疗乳腺癌的药物中的应用。
其中：上述大环内酯类埃博霉素化合物优选埃博霉素M。
本发明所述用于预防和治疗肝癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
本发明所述用于预防和治疗肺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
本发明所述用于预防和治疗乳腺癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物和药学上可接受的载体。
其中：上述大环内酯类埃博霉素化合物优选埃博霉素M。
上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物活性成分，最优选含有重量比为0.5％-10％的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物活性成分，特别是活性成分埃博霉素M。
本发明所述18或14元大环内酯类埃博霉素化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化针对选择，其日剂量可以是0.01-10mg/kg体重，优选0.1-5mg/kg体重。可以一次或多次施用。
本发明的18或14元大环内酯类埃博霉素化合物在浓度为10^-9～10^-6M时，对人肝癌细胞HepG2细胞有强效抑制作用；对人肺癌A-549细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞也有不同程度的抑制作用，证明该化合物的活性部位可以用作肝癌、肺癌和乳腺癌的化学抑制剂。
附图说明
图1：14元埃博霉素制备过程中的液相分离效果图。
具体实施方式
下面结合实施例来使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
1.菌株的获得、保藏及18和14元埃博霉素的分离纯化(以埃博霉素M，N和L，L1为例)：
本发明所述纤维堆囊菌So0157-2是以常规方法分离自云南地区土样，由山东大学微生物国家重点实验室鉴定为粘细菌(Sorangium cellulosum)So0157-2，其16S rDNA序列信息已经公布(DQ256394.1)，并于2008年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078。
发明人的研究表明：纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M208078为埃博霉素类化合物的产生菌。利用该菌的液体发酵和液质联用检测及活性跟踪的方法，发明人不仅检测到了埃博霉素A/B/C等化合物，也检测到了18和14元大环内酯类埃博霉素化合物M，M1，N，N1，O，O1，L，L1的分子离子峰。还从其提物中分离到有抗癌活性的该类化合物(M，N，L，L1)。
1.1.纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078的发酵和化合物的提取
以常规培养方法从固体CNST培养基上挑取纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078菌体接种至固体M26平板。30℃培养3-4天后刮取菌体，接种至50ml液体M26培养基摇瓶，30℃培养4-5天达到对数生长期，用灭菌转瓶打匀菌体，转接M26液体培养基进行扩培。扩培后的菌体作为液体发酵种子，接种到M26液体培养基继续培养3-4天后，作为次级种子接种到发酵培养基中，在32℃，150rpm以及20m³/h通气量的条件下继续培养7天后收集吸附树脂XAD-16，以备获得埃博霉素类的提取物。
例如：收集70L发酵液中的吸附树脂XAD-160，置于40℃烘箱烘干多余水分，之后用甲醇浸泡多次，浸提取液用滤纸过滤，旋转蒸发仪减压45℃蒸干，得含埃博霉素类的提取物(4.5g)。
上述涉及的CNST的配方及配制方法：KNO₃0.5g/L，Na₂HPO₄0.25g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，FeCl₃0.001％，微量元素液1ml/L，琼脂1.5％，pH7.2。灭菌后倒平板，待冷却凝固后贴放无菌滤纸片。
上述M26培养基的配方及配制方法：马铃薯淀粉8g/L，酵母浸粉2g/L，蛋白胨2g/L，葡萄糖2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，CaCl₂ 1g/L，EDTA-FeCl₃ 1ml/L，微量元素液1ml/L，pH7.2。固体需添加12g/L的琼脂粉。
上述发酵培养基的配方为：马铃薯淀粉0.8％，葡萄糖0.2％，黄豆饼粉0.2％，玉米桨0.2％，MgSO₄ 0.1％，CaCl₂ 0.1％，EDTA-Fe³⁺ 1ml/l，微量元素液1ml/L(pH7.2)，XAD-16树脂1％(v/v)。
上述微量元素液的配方：MnCl₂·4H₂O 0.1g/L，CoCl₂ 0.02g/L，CuSO₄ 0.01g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g/L，ZnCl₂ 0.02g/L，LiCl 0.005g/L，SnCl₂·2H₂O 0.005g/L，H₃BO₃0.01g/L，KBr 0.02g/L，KI 0.02g/L。
1.218元大环内酯类埃博霉素化合物的分离纯化
取上述纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078的发酵提取物用凝胶柱层析分离(Sephadex LH-20，120g)，甲醇洗脱，自动接收15-20s/滴，根据TLC检测，合并成五个组分Fr 1(1-27)主要为泡敌，Fr 2(28-43)和Fr 3(44-58)主要含有埃博类化合物，Fr 4(59-70)，Fr 5(LH-20洗柱部分)。
Fr 3甲醇拌样后用10g正相硅胶柱层析分离。50ml石油醚部分洗出的都是脂肪酸类化合物；接着用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1，220ml；6∶1，210ml；)PE：Acetone(6∶1，350ml)，20ml/tube接收，Acetone洗脱(300mg)，记为Fr 3a甲醇洗脱。
Fr 3a(300mg)用凝胶柱层析分离，甲醇洗脱，从有颜色下来开始接收，根据TLC检测结果分为Fr 3a1(19-31，150mg)和Fr 3a2(32-35，55mg)。
Fr 3a1(150mg)，用1.5g正相硅胶柱分离，石油醚-丙酮系统洗脱(40∶3，86ml；40∶5，45ml；40∶8，48ml；40∶10，50ml.Acetone洗柱)。合并40∶10，洗下的25-35得不纯的LF(46mg)，接着用反相中压液相柱层析分离，甲醇-水系统(30％，300ml；55％，300ml洗脱得到的8-9管合并(10mg)，进行LC分离。Agilents 1200系列；RP-18色谱柱(5μ)，4.6 X 250mm，247nm紫外波长检测，MeOH-H₂O(65∶35)洗脱，流速1ml/min)，t_R＝7.8min的主要峰为化合物1(2mg)，t_R＝10.9的另一个峰为化合物2(0.8mg)。
进一步的，对以上化合物1和化合物2再进行HR-TOF-MS检测。
1.3.14元大环内酯类埃博霉素化合物的分离纯化
取纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So0157-2CCTCC M 208078的发酵提取物直接用凝胶(160g)柱层析分离，甲醇洗脱，自动接受15-20s/Drop，根据TLC检测，①泡敌部分；②不含埃博霉素；③不含埃博霉素，含有脂肪酸；④含埃博霉素，也有脂肪酸；⑤不含埃博，含脂肪酸。其中的④用MPLC分离，甲醇水系统洗脱(30∶70，约40％，M，2L；50∶50，约55％，2L；70∶30，75％，2L；甲醇1L)。用大的反相管接收，合并④-①；④-②，④-③，④-④，其中的④-②用20g正相柱层析分离，PE-A(10∶1，275ml；6∶1，280ml)；接着用C-M(100∶1，505ml；100∶2，300ml；100∶3，300ml)；TLC检测在C-M(100∶2)洗脱的组分中含有埃博霉素，用反相柱层析分离，甲醇水系统洗脱(40％，300m L；55％，300mL；甲醇洗脱)。TLC检测埃博组分全部在甲醇洗下部分，并且没有去除杂质；继续用MPLC分离，甲醇水系统洗脱(40％，300mL；甲醇洗脱)，合并6-15极性相对较大的埃博类的混合物，记为LF300A。LF300A用HPLC分离，Agi lent 1200系列，RP-18色谱柱9.4×250mm(5μ)，紫外检测波长247nm，乙腈-水(38∶62)洗脱，流速：2.5ml/min，图谱见说明书附图中图1。从9.1min开始接收，得到LF300p1；t_R＝9.8min(LF300p2)；t_R＝10.4min(LF300p3)；t_R＝11.1min(LF300p4)；t_R＝12.3-12.8min(LF300p5)；t_R＝13.6min(LF300p6)；t_R＝14.5min(LF300p7)，t_R＝15.9min(LF300p8)；t_R＝16.8min(LF300p9)；t_R＝18.2min(LF300p10)；t_R＝20.5min(LF300p11)。其中的LF300p1和LF300p4分别蒸干用CDCl3溶解，进行HR-TOF-MS检测和NMR实验。
2.1化合物1的结构鉴定
HR-TOF-MS给出化合物1的准分子离子峰为分子量为m/z532.3589[M+Na]⁺510.3305[M+H]⁺，推测其分子量为509.。
化合物1的碳谱(包括DEPT)给出26个信号：包括5个甲基，9个亚甲基，5个次甲基和7个季碳(表1)。根据¹H NMR和¹³C NMR波谱清楚的表明了该结构中含有典型埃博霉素类化合物的结构特征-噻唑环(thioazole ring)，碳碳双键(carbon-carbon doublebond)，环氧单元(epoxy moiety)和一个羧基碳(a carboxyl carbonyl group)。但是与已知化合物埃博A的数据相比，26位甲基的信号消失，而多了一个羟甲基。与报道的化合物epothilone A₉相似。但是，在¹H NMR中羟甲基的质子化学位移在5.07和5.45ppm，而在epothilone A₉中，其羟甲基质子信号为4.11和4.49ppm。该显著差异可能是酯化造成的。同时我们也分离到了化合物epothilone A₉。HMBC中质子δ5.07和5.45与羧基碳δ171.9有明显的远程相关关系，进一步表明了亚甲基的氧与羧基碳的连接。因此化合物1鉴定为具有埃博霉素特征的18元大环内酯，命名为epothilone M.
2.2.化合物2的结构鉴定
HR-TOF-MS给出化合物2的准分子离子峰为分子量为m/z m/z 550.3109[M+Na]⁺，528.3001[M+H]⁺)，推测其分子量为527。化合物2的碳谱(包括DEPT)给出26个信号：包括5个甲基，9个亚甲基，5个次甲基和7个季碳。比较1和2的NMR数据表明二者结构基本一致，只是在2中没有了环氧单元，而是环氧环打开，变成了两个羟基取代。碳谱数据更清楚的确证了该结论[55.2(C-12)和57.7(C-13)in 1；69.8(C-12)和68.8(C-13)in 2](表1).因此2的结构鉴定为12，13-deepoxy-12，13-dihydroxyl epothilone M，命名为epothilone N.
2.3化合物LF300p1的结构鉴定
HR-TOF-MS给出化合物LF300p1的准分子离子峰为分子量为m/z z 534.4[M+Na]⁺，512.4[M+H]⁺，推测其分子量为511。
化合物LF300p1的碳谱(包括DEPT)给出26个信号：包括6个甲基，5个亚甲基，9个次甲基和6个季碳(表2)。根据¹H NMR和¹³C NMR波谱清楚的表明了该结构中含有典型埃博霉素类化合物的结构特征.比较该化合物与epothilone A的NMR数据表明二者数据基本一致，只是在该化合物中没有了环氧单元，而是环氧环打开，变成了两个羟基取代。碳谱数据更清楚的确证了该结论[72.7(C-12)和76.4(C-13)](表2).¹H NMR中质子H-13(at 5.14)以及H-15(4.45)和C-14，C-13，C-17的远程相关关系表明该化合物为14元大环内酯。ESIMS给出该化合物完全乙酰化的产物的分子量为m/z 679.8[M+H]⁺，表明结构中含有4个自由羟基基团。完全乙酰化的¹H NMR显示质子4.50(H-3)，3.70(H-7)，3.90(H-12)，4.45(H-15)分别向低场位移至6.02，5.04，5.00和5.32，而质子5.13(H-13)仅位移至5.22，进一步确证了该化合物为14元大环内酯。因此其结构鉴定为具有埃博霉素特征的14元大环内酯，鉴定为命名为epothilone L.
2.4化合物LF300p4的结构鉴定
HR-TOF-MS给出化合物LF300p4的准分子离子峰为分子量为m/z m/z 548.3100[M+Na]⁺，526.3001[M+H]⁺)，推测其分子量为525。
化合物LF300p4的碳谱(包括DEPT)给出27个信号：包括6个甲基，8个亚甲基，5个次甲基和8个季碳。比较LF300p1和LF300p4的NMR数据表明二者结构基本一致，只是在LF300p4中多了一个单峰的甲基信号(表2)。因此LF300p4的结构鉴定为12-methylepothilone L，命名为epothi lone L1。
表1.化合物1和2的核磁共振数据
Table 1.The NMR data for compounds 1and 2(in CDCl₃，δin ppm，Jin Hz).


表2.化合物LF300p 1和LF300p4的核磁共振数据
Table 2.The NMR data for compounds LF300p1 and LF300p4 (in CDCl₃，δin ppm，Jin Hz).


3.化合物——埃博霉素M抗肿瘤活性测试
筛选方法：四氮唑盐(methyl-thiazol-tetozolium，MTT)还原法硫酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法
细胞株：HepG2人肝癌、A-549人肺腺癌和MDA-MB-435人乳腺癌
作用时间：48-72h
结果评定：无效：10^-5mol/L＜85％
弱效：10^-5mol/L≥85％或10^-6mol/L＞50％
强效：10^-6mol/L＞85％或10^-7mol/L＞50％
具体实验结果见表3：
表3.埃博霉素M对人肝癌细胞HepG2、人肺腺癌细胞A-549和人乳腺癌细胞
MDA-MB-435的抑制率

结论：从表3可以看出，埃博霉素M在浓度为10^-6M时，对肝癌细胞HepG2、人肺腺癌细胞A-549和人乳腺癌细胞MDA-MB-435均有有强效抑制作用。因此该化合物及其活性部位可以作为有关癌细胞的化学抑制剂。
实验还证实：本专利中所述的其它埃博霉素类化合物同样具有与埃博霉素M类似的抗肿瘤活性。
实施例2：

制备方法：将埃博霉素M与乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，均匀后压片，每片重240mg，埃博霉素M含量为1mg。
实施例3：

制备方法：将埃博霉素M与乳糖和硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，埃博霉素M含量为1mg。
实施例4：

制备方法：将埃博霉素M和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。
同样的，本专利所述的其它埃博霉素类化合物也可以如埃博霉素M所采用方法制备预防和治疗肝癌、肺癌和乳腺癌的药物。