用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。背景技术 平 菇 (Pleurotus ostreatus) 又 名 糙 皮 侧 耳， 隶 属 于 担 子 菌 亚 门 (Basidio mycotina)， 层菌纲 (Hymenomycetes)， 无隔担子菌亚纲 (Homobasidiomy cetidae)， 伞菌目 (Agaricales)， 侧耳科 (Pleurotaceae)， 侧耳属 (Pleurotus)， 是目前我国最丰富的真菌种 类资源之一。 平菇产量高、 生长速度， 营养丰富， 且具有一定的药用功效， 再加上可利用的栽 培基质丰富多样， 使得平菇成为研究食用菌生理生化和遗传的较好的模型。
通过分子生物学技术， 根据市场需求及时、 定向培育出高质量的新菌株， 通过基因 工程手段导入外源基因进行食用菌的遗传转化， 使其子实体具有相应目的性状， 是食用菌 产业发展的趋势。 另外相对于动植物而言， 食用菌分子生物学研究工作起步较晚， 同时由于 市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资， 导致食用菌分子生物学研究滞后。高效安全 的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。 平菇高效遗传转化 体系的建立， 将为其遗传发育机理的研究奠定基础， 为其分子育种提供技术支持， 为新型生 物反应器的研发提供储备， 为平菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件， 具有十分 重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。
本发明提供了一种 DNA 片段， 自上游至下游依次包括启动子 ( 平菇三磷酸甘油醛 脱氢酶基因启动子 ) 和终止子 ( 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子 ) ； 所述启动子的核 苷酸序列如序列表的序列 1 所示 ； 所述终止子的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示。
所述 DNA 片段还包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列 3 所示的 hph 基因。
所述 DNA 片段可用于制备转基因平菇。
含有所述 DNA 片段的重组质粒也属于本发明的保护范围。
所述重组质粒 ( 重组质粒甲 ) 可为在 pUC19 质粒的多克隆位点间自上游至下游依 次插入所述启动子和所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒优选为将 pUC19 质粒 Sph I 和 Sal I 酶切识别序列之间的小片段取代为所述启动子， BamH I 和 Sac I 酶切识别序列 之间的小片段取代为所述终止子得到的重组质粒。
本发明还保护在所述重组质粒甲的所述启动子和所述终止子之间插入含有外源 基因的 DNA 片段得到的重组质粒 ( 重组质粒乙 )。所述含有外源基因的 DNA 片段可包括 所述外源基因和抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列 3 自 5’ 末端第 763-1793 位核苷酸所示的 hph 基因。所述外源基因具体可为序列表的序列 3 自 5’ 末端第 1-726 位核苷酸所示的 egfp 基因。所述含有外源基因的 DNA 片段具体可为序列表的序列 3所示的 DNA 片段。
所述重组质粒可用于制备转基因平菇。
用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可为 ： 将所述重组质粒 ( 重组质粒乙 ) 转 化平菇的原生质体， 培育后得到转基因平菇。所述转化具体可通过 PEG/CaCl2 介导实现。
用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可包括如下步骤 ：
(1) 用溶壁酶裂解平菇菌丝， 得到原生质体 ；
(2) 将所述重组质粒 ( 重组质粒乙 ) 导入所述原生质体， 培育后得到转基因平菇。
所述步骤 (1) 具体可为 ： 将平菇菌丝悬浮于 1.5g/100mL 的溶壁酶溶液， 32 ℃、 60rpm 温浴 30 小时， 过滤并收集滤液， 然后将所述滤液 3000rpm 离心 10min 并收集沉淀， 然 后将所述沉淀洗涤后悬浮于 MMC 缓冲液中， 即为原生质体溶液。
MMC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 50mM 马来酸缓冲液 (pH 5.5) ； 所述溶 质及其在 MMC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.5M 甘露醇、 5mM CaCl2。
所述步骤 (2) 可为 ： 将步骤 (1) 的原生质体、 所述重组质粒、 金精三羧酸、 亚精胺和 肝素在 PTC 缓冲液中混合均匀， 依次进行冰浴和室温静置， 离心收集沉淀。
所述步骤 (2) 具体可为 ： 将 70μl 步骤 (1) 得到的原生质体溶液、 20μg 重组质粒 -1 ( 具体可为 10μl 2μg μl 的重组质粒溶液 )、 10μl 20mM 金精三羧酸水溶液、 5μl 50mM 亚精胺水溶液和 5μl 20mg/ml 肝素水溶液震荡混匀， 然后加入 50μlPTC 缓冲液并震荡混 匀， 然后冰浴 25min， 然后加入 1ml PTC 缓冲液后室温静置 20min， 3000rpm 离心 10min， 收集 沉淀。
PTC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 PTC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.4g/mL PEG3350、 100mM CaCl2。 所述培养可包括再生培养和选择性培养。
所述再生培养可为先用液体再生培养基 25℃静置培养 24 小时， 然后倾注于固体 再生平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 )25℃培养 10-14 天。
所述选择性培养可为将再生培养中的单菌落转接于固体 MCM 平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 上 25℃培养 10-14 天 ； 采用相同的方法连续转接 3-5 代， 获得纯培养的菌株。
液体 MCM 培养基的制备方法 ： 将酵母提取物 2g、 胰蛋白胨 2g、 葡萄糖 20g、 硫酸镁 0.5g、 磷酸二氢钾 0.5g 和磷酸氢二钾 1g 溶于水并用水定容至 1L。
液体再生培养基的制备方法 ： 在液体 MCM 培养基中添加山梨醇， 使其终浓度为 1M。
固体 MCM 平板 ： 在液体 MCM 培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
固体再生平板的制备方法 ： 在液体再生培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
序列表的序列 2 所示的 DNA 片段 ( 终止子 ) 也属于本发明的保护范围。
采用本发明的方法的转化效率可以达到 100-200 个转化子 /μg DNA。 并具有较好 的传代稳定性。本发明所建立的平菇遗传转化方法， 为平菇生长发育机理的基础研究和分 子育种奠定了理论基础和技术支持， 为新型生物反应器的研发提供储备， 为平菇资源及其 生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。
附图说明
图 1 为 pUC19 质粒的结构示意图。图 2 为 pEGFP-C1 质粒的结构示意图。
图 3 为重组质粒 pUEGFP-hph 的结构示意图。
图 4 为阳性转化子的 PCR 鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； P： 质粒 pEGFP-C1( 阳性 对照 ) ； 1、 2： 阳性转化子。
图 5 为阳性转化子的 southern 杂交鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； 1： 阳性对照 ； 2 阴性对照 ； 3： 阳性转化子。
图 6 为阳性转化子的 RT-PCR 鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； 1： 阴性对照 ； 2-3 ： 阳 性转化子。
图 7 为荧光显微镜下观察阳性转化子的绿色荧光蛋白的表达情况 ； A： 放大 400 倍 明视野下的图像 ； B： 放大 400 倍蓝光激发状态下的图像。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 pUC19 质粒 ： 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； 产品目录号 ： D3219。pAN7-1 质 粒： 购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心 ； 产品目录号 ： Biovector829。 pEGFP-C1 质 粒： 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司 ； 产品目录号 ： MCV046。平菇 ： 购自北京市农林科 学院植物保护环境保护研究所。
实施例 1、 重组表达载体的构建
一、 重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd 的构建
1、 提取平菇菌丝体的基因组 DNA。
2、 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子 (Pgpd) 的克隆
(1) 参照 Hirano 等于 2000 年发表的香菇的 gpd 基因的全序列设计用于扩增平菇 三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的引物对如下 ：
Pgpd-F( 上游引物 ) ： 5’ -ATTAGCATGCCGAAGTTTGAGGTGGTT-3’ ( 下划线标注 Sph I 识别序列 ) ；
Pgpd-R( 下游引物 ) ： 5’ -AAGTCGACATTCAAGCAGTCAATGGAT-3’ ( 下划线标注 Sal I 识别序列 )。
(2) 以步骤 1 提取的基因组 DNA 为模板， 用 Pgpd-F 和 Pgpd-R 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
PCR 体系 (50μl) 中含 20ng 模板、 80pmol 上游引物、 80pmol 下游引物、 1×Ex Taq 2+ Buffer(Mg Plus)、 0.2mmol/l dNTP 和 1.5U Ex Taq DNA 聚合酶 (Takara， Japan)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 58℃ 1min， 72℃ 30s) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
(3) 回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， Sph I 识别序列和 Sal I 识别 序列之间的核苷酸序列如序列表的序列 1 所示。
3、 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子 (Tgpd) 的克隆
(1) 参照 Hirano 等于 2000 年发表的香菇的 gpd 基因的全序列设计用于扩增平菇 三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子的引物对如下 ：
Tgpd-F( 上游引物 ) ： 5’ -TAAGGATCCGAAAGGGCTGTGCATCTCGAACT-3’ ( 下划线标注 BamH I 识别序列 ) ；
Tgpd-R( 下游引物 ) ： 5’ -TCAGAGCTCTCATCATACCCCCTACCGACATCT-3’ ( 下划线标注 Sac I 识别序列 )。
(2) 以步骤 1 提取的基因组 DNA 为模板， 用 Tgpd-F 和 Tgpd-R 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
PCR 体系和 PCR 扩增程序同步骤 2 的 (2)。
(3) 回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， BamH I 识别序列和 Sac I 识别 序列之间的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示。
4、 用限制性内切酶 Sph I 和 Sal I 双酶切步骤 2 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
5、 用限制性内切酶 Sph I 和 Sal I 双酶切 pUC19 质粒 ( 结构示意图见图 1)， 回收 载体骨架 ( 约 2674bp)。
6、 将步骤 4 的酶切产物和步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pUC19-Pgpd。
7、 用限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 双酶切步骤 3 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
8、 用限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 双酶切重组质粒 pUC19-Pgpd， 回收载体骨架 ( 约 3730bp)。
9、将 步 骤 7 的 酶 切 产 物 和 步 骤 8 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pUC19-Pgpd-Tgpd。
10、 根据测序结果， 对重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd 进行结构描述如下 ： 将 pUC19 质 粒 Sph I 和 Sal I 酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列 1 所示的启动子， BamH I 和 Sac I 酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列 2 所示的终止子。
二、 重组质粒 pUEGFP-hph 的构建
1、 以 pAN7-1 质粒为模板， 用 hph-up 和 hph-down 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得 到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
hph-up( 上游引物 ) ： 5’ -ACGCTCGAGCTATGAAAAAGCCTGAACTC-3’ ( 下划线标注 Xho I 识别序列 ) ；
hph-down( 下游引物 ) ： 5’ -AATGGATCCCGGTCGGCATCTACTCTAT-3’ ( 下划线标注 BamH I 识别序列 )。
PCR 体系同步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 1min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， Xho I 识别序列和 BamH I 识别序 列之间的核苷酸序列如序列表的序列 3 自 5’ 末端第 763-1793 位核苷酸所示 (hph 基因 )。 hph 基因为潮霉素抗性筛选的标记基因。
2、 用限制性内切酶 Xho I 和 BamH I 双酶切步骤 1 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
3、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切质粒 pEGFP-C1( 结构示意图见图 2)， 回 收载体骨架 ( 约 4590bp)。4、 将步骤 2 的酶切产物和步骤 3 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pEGFP-hph( 将质 粒 pEGFP-C1 Sal I 和 BamH I 酶切识别序列之间的小片段取代为序列表的序列 3 自 5’ 末 端第 763-1793 位核苷酸所示的 hph 基因 )。
5、 以重组质粒 pEGFP-hph 为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 hph-down( 下游引物 ) 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 (EGFP-hph 片段， 约 1700bp)。将 PCR 扩增 产物进行测序， EGFP-hph 片段的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。序列表的序列 3 中， 自 5’ 末端第 1-726 位核苷酸为 egfp 基因、 第 727 至 762 位核苷酸为载体中原有的多克隆 位点区域、 第 763-1793 位核苷酸为 hph 基因。
PCR 体系同步骤一的 2 的 (2)。
EGFP-F ： 5’ -AAGTCGACATGGTGAGCAAGGGC-3’ ( 下划线标注 Sal I 识别序列 )。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 2min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
6、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切步骤 5 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
7、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd， 回收载体 骨架 ( 约 4715bp)。 8、 将步骤 6 的酶切产物和步骤 7 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pUEGFP-hph( 结 构示意图见图 3)。
实施例 2、 PEG/CaCl2 介导的平菇原生质体转化
MMC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 50mM 马来酸缓冲液 (pH 5.5) ； 所述溶 质及其在 MMC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.5M 甘露醇、 5mM CaCl2。
液体 MCM 培养基 ： 将酵母提取物 2g、 胰蛋白胨 2g、 葡萄糖 20g、 硫酸镁 0.5g、 磷酸二 氢钾 0.5g 和磷酸氢二钾 1g 溶于水并用水定容至 1L。
固体 MCM 平板 ： 在液体 MCM 培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
PTC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 PTC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.4g/mL PEG3350、 100mM CaCl2。
STC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 STC 缓冲液中的浓度如下 ： 1M 山梨醇、 100mM CaCl2。
液体再生培养基 ： 在液体 MCM 培养基中添加山梨醇， 使其终浓度为 1M。
固体再生平板的制备方法 ： 在液体再生培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
一、 平菇原生质体的制备
1、 菌丝扩大培养
取平菇菌丝于液体 MCM 培养基中， 160rpm、 25℃培养 4 天 (3-5 天均可 )， 用 3 层无 菌擦镜纸过滤并收集菌丝， 然后用 0.6M 甘露醇水溶液洗涤 2-3 次。
2、 将步骤 1 的平菇菌丝 ( 约 1g) 悬浮于 1.5％溶壁酶溶液 ( 将 1.5g 溶壁酶用 0.6M 甘露醇水溶液溶解并定容至 100mL ； 溶壁酶购自广东碧德生物科技有限公司， 产品目录号 ： Bd_8110001023)， 在水浴摇床 (32℃、 60rpm) 中温浴 30 小时， 用 3 层无菌擦镜纸过滤并收集 滤液。
3、 将步骤 2 的滤液 3000rpm 离心 10min 并收集沉淀。
4、 将步骤 3 的沉淀用 MMC 缓冲液洗涤三次后， 悬浮于 100μl MMC 缓冲液中， 即为
原生质体溶液。
二、 原生质体转化
1、 将 70μl 步 骤 一 制 备 的 原 生 质 体 溶 液 与 10μl 实 施 例 1 制 备 的 重 组 质 粒 pUEGFP-hph(2μg μl-1 ； 即 10μl 中共含有 20μg 重组质粒 )10μl 20mM 金精三羧酸 (ATA ； Sigma-Aldrich) 水溶液、 5μl 50mM 亚精胺水溶液和 5μl 20mg/ml 肝素水溶液在涡旋震 荡器上震荡混匀 (1s×10 次 )， 加入 50μl PTC 缓冲液后在涡旋震荡器上震荡混匀 (1s×6 次 )， 然后冰浴 25min， 然后加入 1ml PTC 缓冲液后室温静置 20min， 3000rpm 离心 10min， 收 集沉淀 ( 原生质体 )。
2、 将步骤 1 的原生质体用 STC 缓冲液洗涤两次后， 悬浮于液体再生培养基中， 25℃ 静置培养 24 小时后倾注于固体再生平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 中， 25℃培养 10-14 天。 共倾注了 25 个固体再生平板。
三、 阳性转化子的筛选及验证
1、 阳性转化子的筛选
随机选取 1 个固体再生平板， 分别挑取平板上的单菌落， 转接于固体 MCM 平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 上 25℃培养 10-14 天 ； 采用相同的方法连续转接 3-5 代， 获得纯培养的 菌株， 从纯培养的菌株中随机选取四分之一 (63 个纯培养的菌株 )， 进行步骤 2 的鉴定。 2、 阳性转化子的 PCR 鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 提取基因组 DNA。
(2) 以基因组 DNA 为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 EGFP-R( 下游引物 ) 组成的引 物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。
EGFP-R ： 5’ -AATTAACCATCGACTG CAGAATT-3’ 。
PCR 体系同实施例 1 的步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 1min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
部分结果见图 4。egfp 基因已经成功导入了菌株。
3、 southern 杂交鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 提取基因组 DNA。
(2) 用限制性内切酶 Pst I 和 Sal I 双酶切基因组 DNA， 将酶切产物进行 southern 杂交 ( 所用的探针如序列表的序列 4 所示 )。
部分结果见图 5。egfp 基因已经成功整合进入了菌株的基因组 DNA。
4、 阳性转化子的 RT-PCR 鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 采用北京百泰克生物技术有限公司的 《高纯总 RNA 快 速提取试剂盒》 提取其总 RNA。
(2) 以步骤 (1) 的总 RNA 为模板， 采用 MBI Ferments 公司 《RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit》 试剂盒进行反转录， 得到 cDNA。
(3) 将步骤 (2) 的 cDNA 作为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 EGFP-R( 下游引物 )
组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。
PCR 体系同实施例 1 的步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序同 2 的步骤 (2)。
部分结果见图 6。在序列表的序列 1 所示的启动子的驱动下， egfp 基因成功进行 了转录。
5、 阳性转化子的荧光检测
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
挑取 5-7 日龄的菌株的菌丝于载玻片上， 盖上盖玻片， 在倒置荧光显微镜 (IX71 ； Olympus， Tokyo， Japan) 下用 40 倍目镜观察， 并用 DP2-BSW 软件进行照相。
部分结果见图 7。
步骤 2、 步骤 3、 步骤 4 和和步骤 5 同时鉴定为阳性的阳性转化子即为 EGFP 基因转 化成功的菌株。共获得了 24 株转化成功的菌株， 转化率为 38.10％ (24÷63×100％ )。转 化效率为 24×25×4÷20 ＝ 120 个转化子 /μg DNA。
本发明涉及一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。背景技术 平 菇 (Pleurotus ostreatus) 又 名 糙 皮 侧 耳， 隶 属 于 担 子 菌 亚 门 (Basidio mycotina)， 层菌纲 (Hymenomycetes)， 无隔担子菌亚纲 (Homobasidiomy cetidae)， 伞菌目 (Agaricales)， 侧耳科 (Pleurotaceae)， 侧耳属 (Pleurotus)， 是目前我国最丰富的真菌种 类资源之一。 平菇产量高、 生长速度， 营养丰富， 且具有一定的药用功效， 再加上可利用的栽 培基质丰富多样， 使得平菇成为研究食用菌生理生化和遗传的较好的模型。
通过分子生物学技术， 根据市场需求及时、 定向培育出高质量的新菌株， 通过基因 工程手段导入外源基因进行食用菌的遗传转化， 使其子实体具有相应目的性状， 是食用菌 产业发展的趋势。 另外相对于动植物而言， 食用菌分子生物学研究工作起步较晚， 同时由于 市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资， 导致食用菌分子生物学研究滞后。高效安全 的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。 平菇高效遗传转化 体系的建立， 将为其遗传发育机理的研究奠定基础， 为其分子育种提供技术支持， 为新型生 物反应器的研发提供储备， 为平菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件， 具有十分 重要的意义。
通过分子生物学技术， 根据市场需求及时、 定向培育出高质量的新菌株， 通过基因 工程手段导入外源基因进行食用菌的遗传转化， 使其子实体具有相应目的性状， 是食用菌 产业发展的趋势。 另外相对于动植物而言， 食用菌分子生物学研究工作起步较晚， 同时由于 市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资， 导致食用菌分子生物学研究滞后。高效安全 的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。 平菇高效遗传转化 体系的建立， 将为其遗传发育机理的研究奠定基础， 为其分子育种提供技术支持， 为新型生 物反应器的研发提供储备， 为平菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件， 具有十分 重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。
本发明提供了一种 DNA 片段， 自上游至下游依次包括启动子 ( 平菇三磷酸甘油醛 脱氢酶基因启动子 ) 和终止子 ( 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子 ) ； 所述启动子的核 苷酸序列如序列表的序列 1 所示 ； 所述终止子的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示。
所述 DNA 片段还包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列 3 所示的 hph 基因。
所述 DNA 片段可用于制备转基因平菇。
含有所述 DNA 片段的重组质粒也属于本发明的保护范围。
所述重组质粒 ( 重组质粒甲 ) 可为在 pUC19 质粒的多克隆位点间自上游至下游依 次插入所述启动子和所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒优选为将 pUC19 质粒 Sph I 和 Sal I 酶切识别序列之间的小片段取代为所述启动子， BamH I 和 Sac I 酶切识别序列 之间的小片段取代为所述终止子得到的重组质粒。
本发明还保护在所述重组质粒甲的所述启动子和所述终止子之间插入含有外源 基因的 DNA 片段得到的重组质粒 ( 重组质粒乙 )。所述含有外源基因的 DNA 片段可包括 所述外源基因和抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列 3 自 5’ 末端第 763-1793 位核苷酸所示的 hph 基因。所述外源基因具体可为序列表的序列 3 自 5’ 末端第 1-726 位核苷酸所示的 egfp 基因。所述含有外源基因的 DNA 片段具体可为序列表的序列 3所示的 DNA 片段。
所述重组质粒可用于制备转基因平菇。
用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可为 ： 将所述重组质粒 ( 重组质粒乙 ) 转 化平菇的原生质体， 培育后得到转基因平菇。所述转化具体可通过 PEG/CaCl2 介导实现。
用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可包括如下步骤 ：
(1) 用溶壁酶裂解平菇菌丝， 得到原生质体 ；
(2) 将所述重组质粒 ( 重组质粒乙 ) 导入所述原生质体， 培育后得到转基因平菇。
所述步骤 (1) 具体可为 ： 将平菇菌丝悬浮于 1.5g/100mL 的溶壁酶溶液， 32 ℃、 60rpm 温浴 30 小时， 过滤并收集滤液， 然后将所述滤液 3000rpm 离心 10min 并收集沉淀， 然 后将所述沉淀洗涤后悬浮于 MMC 缓冲液中， 即为原生质体溶液。
MMC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 50mM 马来酸缓冲液 (pH 5.5) ； 所述溶 质及其在 MMC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.5M 甘露醇、 5mM CaCl2。
所述步骤 (2) 可为 ： 将步骤 (1) 的原生质体、 所述重组质粒、 金精三羧酸、 亚精胺和 肝素在 PTC 缓冲液中混合均匀， 依次进行冰浴和室温静置， 离心收集沉淀。
所述步骤 (2) 具体可为 ： 将 70μl 步骤 (1) 得到的原生质体溶液、 20μg 重组质粒 -1 ( 具体可为 10μl 2μg μl 的重组质粒溶液 )、 10μl 20mM 金精三羧酸水溶液、 5μl 50mM 亚精胺水溶液和 5μl 20mg/ml 肝素水溶液震荡混匀， 然后加入 50μlPTC 缓冲液并震荡混 匀， 然后冰浴 25min， 然后加入 1ml PTC 缓冲液后室温静置 20min， 3000rpm 离心 10min， 收集 沉淀。
PTC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 PTC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.4g/mL PEG3350、 100mM CaCl2。 所述培养可包括再生培养和选择性培养。
所述再生培养可为先用液体再生培养基 25℃静置培养 24 小时， 然后倾注于固体 再生平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 )25℃培养 10-14 天。
所述选择性培养可为将再生培养中的单菌落转接于固体 MCM 平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 上 25℃培养 10-14 天 ； 采用相同的方法连续转接 3-5 代， 获得纯培养的菌株。
液体 MCM 培养基的制备方法 ： 将酵母提取物 2g、 胰蛋白胨 2g、 葡萄糖 20g、 硫酸镁 0.5g、 磷酸二氢钾 0.5g 和磷酸氢二钾 1g 溶于水并用水定容至 1L。
液体再生培养基的制备方法 ： 在液体 MCM 培养基中添加山梨醇， 使其终浓度为 1M。
固体 MCM 平板 ： 在液体 MCM 培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
固体再生平板的制备方法 ： 在液体再生培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
序列表的序列 2 所示的 DNA 片段 ( 终止子 ) 也属于本发明的保护范围。
采用本发明的方法的转化效率可以达到 100-200 个转化子 /μg DNA。 并具有较好 的传代稳定性。本发明所建立的平菇遗传转化方法， 为平菇生长发育机理的基础研究和分 子育种奠定了理论基础和技术支持， 为新型生物反应器的研发提供储备， 为平菇资源及其 生物活性物质的开发利用开辟了广阔的应用领域。
附图说明
图 1 为 pUC19 质粒的结构示意图。图 2 为 pEGFP-C1 质粒的结构示意图。
图 3 为重组质粒 pUEGFP-hph 的结构示意图。
图 4 为阳性转化子的 PCR 鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； P： 质粒 pEGFP-C1( 阳性 对照 ) ； 1、 2： 阳性转化子。
图 5 为阳性转化子的 southern 杂交鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； 1： 阳性对照 ； 2 阴性对照 ； 3： 阳性转化子。
图 6 为阳性转化子的 RT-PCR 鉴定 ； M： 1kb plus DNA ladder ； 1： 阴性对照 ； 2-3 ： 阳 性转化子。
图 7 为荧光显微镜下观察阳性转化子的绿色荧光蛋白的表达情况 ； A： 放大 400 倍 明视野下的图像 ； B： 放大 400 倍蓝光激发状态下的图像。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 pUC19 质粒 ： 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； 产品目录号 ： D3219。pAN7-1 质 粒： 购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心 ； 产品目录号 ： Biovector829。 pEGFP-C1 质 粒： 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司 ； 产品目录号 ： MCV046。平菇 ： 购自北京市农林科 学院植物保护环境保护研究所。
实施例 1、 重组表达载体的构建
一、 重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd 的构建
1、 提取平菇菌丝体的基因组 DNA。
2、 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子 (Pgpd) 的克隆
(1) 参照 Hirano 等于 2000 年发表的香菇的 gpd 基因的全序列设计用于扩增平菇 三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子的引物对如下 ：
Pgpd-F( 上游引物 ) ： 5’ -ATTAGCATGCCGAAGTTTGAGGTGGTT-3’ ( 下划线标注 Sph I 识别序列 ) ；
Pgpd-R( 下游引物 ) ： 5’ -AAGTCGACATTCAAGCAGTCAATGGAT-3’ ( 下划线标注 Sal I 识别序列 )。
(2) 以步骤 1 提取的基因组 DNA 为模板， 用 Pgpd-F 和 Pgpd-R 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
PCR 体系 (50μl) 中含 20ng 模板、 80pmol 上游引物、 80pmol 下游引物、 1×Ex Taq 2+ Buffer(Mg Plus)、 0.2mmol/l dNTP 和 1.5U Ex Taq DNA 聚合酶 (Takara， Japan)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 58℃ 1min， 72℃ 30s) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
(3) 回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， Sph I 识别序列和 Sal I 识别 序列之间的核苷酸序列如序列表的序列 1 所示。
3、 平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子 (Tgpd) 的克隆
(1) 参照 Hirano 等于 2000 年发表的香菇的 gpd 基因的全序列设计用于扩增平菇 三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子的引物对如下 ：
Tgpd-F( 上游引物 ) ： 5’ -TAAGGATCCGAAAGGGCTGTGCATCTCGAACT-3’ ( 下划线标注 BamH I 识别序列 ) ；
Tgpd-R( 下游引物 ) ： 5’ -TCAGAGCTCTCATCATACCCCCTACCGACATCT-3’ ( 下划线标注 Sac I 识别序列 )。
(2) 以步骤 1 提取的基因组 DNA 为模板， 用 Tgpd-F 和 Tgpd-R 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
PCR 体系和 PCR 扩增程序同步骤 2 的 (2)。
(3) 回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， BamH I 识别序列和 Sac I 识别 序列之间的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示。
4、 用限制性内切酶 Sph I 和 Sal I 双酶切步骤 2 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
5、 用限制性内切酶 Sph I 和 Sal I 双酶切 pUC19 质粒 ( 结构示意图见图 1)， 回收 载体骨架 ( 约 2674bp)。
6、 将步骤 4 的酶切产物和步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pUC19-Pgpd。
7、 用限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 双酶切步骤 3 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
8、 用限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 双酶切重组质粒 pUC19-Pgpd， 回收载体骨架 ( 约 3730bp)。
9、将 步 骤 7 的 酶 切 产 物 和 步 骤 8 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pUC19-Pgpd-Tgpd。
10、 根据测序结果， 对重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd 进行结构描述如下 ： 将 pUC19 质 粒 Sph I 和 Sal I 酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列 1 所示的启动子， BamH I 和 Sac I 酶切识别序列之间的小片段取代为了序列表的序列 2 所示的终止子。
二、 重组质粒 pUEGFP-hph 的构建
1、 以 pAN7-1 质粒为模板， 用 hph-up 和 hph-down 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得 到 PCR 扩增产物 ( 约 1000bp)。
hph-up( 上游引物 ) ： 5’ -ACGCTCGAGCTATGAAAAAGCCTGAACTC-3’ ( 下划线标注 Xho I 识别序列 ) ；
hph-down( 下游引物 ) ： 5’ -AATGGATCCCGGTCGGCATCTACTCTAT-3’ ( 下划线标注 BamH I 识别序列 )。
PCR 体系同步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 1min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
回收 PCR 扩增产物并进行测序， 测序结果表明， Xho I 识别序列和 BamH I 识别序 列之间的核苷酸序列如序列表的序列 3 自 5’ 末端第 763-1793 位核苷酸所示 (hph 基因 )。 hph 基因为潮霉素抗性筛选的标记基因。
2、 用限制性内切酶 Xho I 和 BamH I 双酶切步骤 1 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
3、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切质粒 pEGFP-C1( 结构示意图见图 2)， 回 收载体骨架 ( 约 4590bp)。4、 将步骤 2 的酶切产物和步骤 3 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pEGFP-hph( 将质 粒 pEGFP-C1 Sal I 和 BamH I 酶切识别序列之间的小片段取代为序列表的序列 3 自 5’ 末 端第 763-1793 位核苷酸所示的 hph 基因 )。
5、 以重组质粒 pEGFP-hph 为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 hph-down( 下游引物 ) 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 (EGFP-hph 片段， 约 1700bp)。将 PCR 扩增 产物进行测序， EGFP-hph 片段的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。序列表的序列 3 中， 自 5’ 末端第 1-726 位核苷酸为 egfp 基因、 第 727 至 762 位核苷酸为载体中原有的多克隆 位点区域、 第 763-1793 位核苷酸为 hph 基因。
PCR 体系同步骤一的 2 的 (2)。
EGFP-F ： 5’ -AAGTCGACATGGTGAGCAAGGGC-3’ ( 下划线标注 Sal I 识别序列 )。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 2min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
6、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切步骤 5 的 PCR 扩增产物， 回收酶切产物。
7、 用限制性内切酶 Sal I 和 BamH I 双酶切重组质粒 pUC19-Pgpd-Tgpd， 回收载体 骨架 ( 约 4715bp)。 8、 将步骤 6 的酶切产物和步骤 7 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pUEGFP-hph( 结 构示意图见图 3)。
实施例 2、 PEG/CaCl2 介导的平菇原生质体转化
MMC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 50mM 马来酸缓冲液 (pH 5.5) ； 所述溶 质及其在 MMC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.5M 甘露醇、 5mM CaCl2。
液体 MCM 培养基 ： 将酵母提取物 2g、 胰蛋白胨 2g、 葡萄糖 20g、 硫酸镁 0.5g、 磷酸二 氢钾 0.5g 和磷酸氢二钾 1g 溶于水并用水定容至 1L。
固体 MCM 平板 ： 在液体 MCM 培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
PTC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 PTC 缓冲液中的浓度如下 ： 0.4g/mL PEG3350、 100mM CaCl2。
STC 缓冲液由溶质和溶剂组成 ； 所述溶剂为 10mM Tris-HCl 缓冲液 (pH7.5) ； 所述 溶质及其在 STC 缓冲液中的浓度如下 ： 1M 山梨醇、 100mM CaCl2。
液体再生培养基 ： 在液体 MCM 培养基中添加山梨醇， 使其终浓度为 1M。
固体再生平板的制备方法 ： 在液体再生培养基中添加琼脂， 使其浓度为 20g/L。
一、 平菇原生质体的制备
1、 菌丝扩大培养
取平菇菌丝于液体 MCM 培养基中， 160rpm、 25℃培养 4 天 (3-5 天均可 )， 用 3 层无 菌擦镜纸过滤并收集菌丝， 然后用 0.6M 甘露醇水溶液洗涤 2-3 次。
2、 将步骤 1 的平菇菌丝 ( 约 1g) 悬浮于 1.5％溶壁酶溶液 ( 将 1.5g 溶壁酶用 0.6M 甘露醇水溶液溶解并定容至 100mL ； 溶壁酶购自广东碧德生物科技有限公司， 产品目录号 ： Bd_8110001023)， 在水浴摇床 (32℃、 60rpm) 中温浴 30 小时， 用 3 层无菌擦镜纸过滤并收集 滤液。
3、 将步骤 2 的滤液 3000rpm 离心 10min 并收集沉淀。
4、 将步骤 3 的沉淀用 MMC 缓冲液洗涤三次后， 悬浮于 100μl MMC 缓冲液中， 即为
原生质体溶液。
二、 原生质体转化
1、 将 70μl 步 骤 一 制 备 的 原 生 质 体 溶 液 与 10μl 实 施 例 1 制 备 的 重 组 质 粒 pUEGFP-hph(2μg μl-1 ； 即 10μl 中共含有 20μg 重组质粒 )10μl 20mM 金精三羧酸 (ATA ； Sigma-Aldrich) 水溶液、 5μl 50mM 亚精胺水溶液和 5μl 20mg/ml 肝素水溶液在涡旋震 荡器上震荡混匀 (1s×10 次 )， 加入 50μl PTC 缓冲液后在涡旋震荡器上震荡混匀 (1s×6 次 )， 然后冰浴 25min， 然后加入 1ml PTC 缓冲液后室温静置 20min， 3000rpm 离心 10min， 收 集沉淀 ( 原生质体 )。
2、 将步骤 1 的原生质体用 STC 缓冲液洗涤两次后， 悬浮于液体再生培养基中， 25℃ 静置培养 24 小时后倾注于固体再生平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 中， 25℃培养 10-14 天。 共倾注了 25 个固体再生平板。
三、 阳性转化子的筛选及验证
1、 阳性转化子的筛选
随机选取 1 个固体再生平板， 分别挑取平板上的单菌落， 转接于固体 MCM 平板 ( 含 100μg/ml 潮霉素 ) 上 25℃培养 10-14 天 ； 采用相同的方法连续转接 3-5 代， 获得纯培养的 菌株， 从纯培养的菌株中随机选取四分之一 (63 个纯培养的菌株 )， 进行步骤 2 的鉴定。 2、 阳性转化子的 PCR 鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 提取基因组 DNA。
(2) 以基因组 DNA 为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 EGFP-R( 下游引物 ) 组成的引 物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。
EGFP-R ： 5’ -AATTAACCATCGACTG CAGAATT-3’ 。
PCR 体系同实施例 1 的步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序 ： 95℃ 5min( 预变性 ) ； 30 个循环 (95℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 1min) ； 72℃ 10min ； 降至 4℃结束。
部分结果见图 4。egfp 基因已经成功导入了菌株。
3、 southern 杂交鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 提取基因组 DNA。
(2) 用限制性内切酶 Pst I 和 Sal I 双酶切基因组 DNA， 将酶切产物进行 southern 杂交 ( 所用的探针如序列表的序列 4 所示 )。
部分结果见图 5。egfp 基因已经成功整合进入了菌株的基因组 DNA。
4、 阳性转化子的 RT-PCR 鉴定
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
(1) 取七日龄的菌株的菌丝， 采用北京百泰克生物技术有限公司的 《高纯总 RNA 快 速提取试剂盒》 提取其总 RNA。
(2) 以步骤 (1) 的总 RNA 为模板， 采用 MBI Ferments 公司 《RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit》 试剂盒进行反转录， 得到 cDNA。
(3) 将步骤 (2) 的 cDNA 作为模板， 用 EGFP-F( 上游引物 ) 和 EGFP-R( 下游引物 )
组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物。
PCR 体系同实施例 1 的步骤一的 2 的 (2)。
PCR 扩增程序同 2 的步骤 (2)。
部分结果见图 6。在序列表的序列 1 所示的启动子的驱动下， egfp 基因成功进行 了转录。
5、 阳性转化子的荧光检测
将步骤 1 获得的各个纯培养的菌株分别进行如下鉴定 ：
挑取 5-7 日龄的菌株的菌丝于载玻片上， 盖上盖玻片， 在倒置荧光显微镜 (IX71 ； Olympus， Tokyo， Japan) 下用 40 倍目镜观察， 并用 DP2-BSW 软件进行照相。
部分结果见图 7。
步骤 2、 步骤 3、 步骤 4 和和步骤 5 同时鉴定为阳性的阳性转化子即为 EGFP 基因转 化成功的菌株。共获得了 24 株转化成功的菌株， 转化率为 38.10％ (24÷63×100％ )。转 化效率为 24×25×4÷20 ＝ 120 个转化子 /μg DNA。
重复进行三次实施例 2。三次的转化率分别如下 ： 39.28％、 38.04％、 37.97％。三 次的转化效率分别为 168 个转化子 /μg DNA、 197 个转化子 /μg DNA、 132 个转化子 /μg DNA。9CN 102492690 A
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