一种杨树愈伤组织诱导方法及诱导培养基.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110441967.X	申请日：	2011.12.26
公开号：	CN102511397A	公开日：	2012.06.27
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20111226\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	北京林业大学
发明人：	安新民; 李英; 郭斌; 王佳
地址：	100083 北京市海淀区清华东路35号
优先权：
专利代理机构：	北京元本知识产权代理事务所 11308	代理人：	叶凡
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内容摘要

本发明公开了一种杨树愈伤组织的诱导方法及诱导培养基，属于杨树的组织培养领域。本发明所筛选、优化的杨树愈伤组织诱导培养基为添加0.5-1.5mg/L萘乙酸、0.5-1.5mg/L？6-糠氨基嘌呤、20-40g/L蔗糖和4.5-6.5g/L琼脂的H培养基。本发明以单核靠边期的杨树花药为外植体，将其接种到所筛选的愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得生长速度快、器官分化率高的杨树愈伤组织。本发明愈伤组织诱导培养基可以有效提高愈伤组织的诱导率，所获得的愈伤组织质量高，可以在短期内形成大量优良的杨树试管苗，不仅可以快速繁殖杨树，同时也可以应用于杨树植物改良，种质保存等方面。

权利要求书

1：一种杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 0.5-1.5mg/L+6- 糠氨基嘌呤 0.5-1.5mg/L+ 蔗糖 20-40g/L+ 琼脂 4.5-6.5g/L。2：如权利要求 1 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 0.5-1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 0.5-1.0mg/L+ 蔗糖 20-40g/L+ 琼脂 4.5-6.5g/L。3：如权利要求 2 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5.5g/L。 4. 一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤： 1) 从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体； 2) 将无菌花药接种在权利要求 1-3 任何一项所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织。 5. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 2) 中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为 25±1℃。 6. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述花药是发育时期为小孢子处于单核靠边期的杨树花药。 7. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是所述的杨树是北京杨 (Populus beijingensis)。 8. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述消毒处理包括如下步骤： 1-A) 用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽； 1-B) 用酒精浸泡花芽； 1-C) 用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗； 1-D) 吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。 9. 如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-B) 中所述酒精的体积百分比浓度为 70.0％。 10. 如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-C) 中所述次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为 7.0％。4： 5-6.5g/L。 2. 如权利要求 1 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 0.5-1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 0.5-1.0mg/L+ 蔗糖 20-40g/L+ 琼脂 4.5-6.5g/L。 3. 如权利要求 2 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂5： 5g/L。 4. 一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤： 1) 从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体； 2) 将无菌花药接种在权利要求 1-3 任何一项所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织。 5. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 2) 中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为 25±1℃。 6. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述花药是发育时期为小孢子处于单核靠边期的杨树花药。 7. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是所述的杨树是北京杨 (Populus beijingensis)。 8. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述消毒处理包括如下步骤： 1-A) 用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽； 1-B) 用酒精浸泡花芽； 1-C) 用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗； 1-D) 吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。 9. 如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-B) 中所述酒精的体积百分比浓度为 70.0％。 10. 如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-C) 中所述次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为 7.0％。6： 5g/L。 2. 如权利要求 1 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 0.5-1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 0.5-1.0mg/L+ 蔗糖 20-40g/L+ 琼脂 4.5-6.5g/L。 3. 如权利要求 2 所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是： H 培养基 + 萘乙酸 1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5.5g/L。 4. 一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤： 1) 从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体； 2) 将无菌花药接种在权利要求 1-3 任何一项所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织。 5. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 2) 中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为 25±1℃。 6. 如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述花药是发育时期为小孢子处于单核靠边期的杨树花药。7：如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是所述的杨树是北京杨 (Populus beijingensis)。8：如权利要求 4 所述的诱导方法，其特征是步骤 1) 中所述消毒处理包括如下步骤： 1-A) 用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽； 1-B) 用酒精浸泡花芽； 1-C) 用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗； 1-D) 吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。9：如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-B) 中所述酒精的体积百分比浓度为 70.0％。10：如权利要求 8 所述的诱导方法，其特征是步骤 1-C) 中所述次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为 7.0％。

说明书

一种杨树愈伤组织诱导方法及诱导培养基
    技术领域本发明涉及一种植物的组织培养基，特别涉及杨树愈伤组织的诱导培养基及其在培养杨树花药愈伤组织中的应用，属于杨树的组织培养领域。
     背景技术北京杨 (Populus beijingensis) 为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点，是优良的用材林、防护林、行道树和 “四旁” 绿化树种，深受群众喜爱。主要分布于中国的华北和西北等地区。
     由于杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将之进行加倍成为双单倍体 (doubled haploids， DHs)，这样就可显著缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。
     目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。愈伤组织培养是一种最常见的培养方式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其它几种植物组织培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生植株。此外愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的材料来源。愈伤组织分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织易于再生芽，可发育成幼嫩的植株。
     在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉诱导愈伤组织，愈伤组织分化培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是一直以来花药培养过程中存在愈伤组织诱导率低的问题，使得植物单倍体远远不能满足研究者们的需求。
     发明内容
     本发明所要解决的技术问题是针对现有的杨树花药培养过程中所存在的愈伤组织诱导率低的问题，提供一种新的杨树愈伤组织的诱导方法，本发明方法摸索并筛选到最适宜的杨树花药愈伤组织的诱导培养基及其培养条件，该方法可以在较短时间内形成大量优良的杨树愈伤组织，愈伤组织诱导率高，获得的愈伤组织的器官分化率高，可进行规模化、工厂化生产。
     为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
     本发明一方面提供一种优化的杨树花药愈伤组织诱导培养基，所述杨树花药愈伤组织诱导培养基是添加了 0.5-1.5mg/L 萘乙酸 (NAA)、 0.5-1.5mg/L 6- 糠氨基嘌呤 (KT)、 20-40g/L 蔗糖、 4.5-6.5g/L 琼脂的 H 培养基。
     其中，所述 NAA 的浓度优选为 0.5-1.0mg/L，进一步优选为 1.0mg/L ；所述 KT 的浓度优选为 0.5-1.0mg/L，进一步优选为 1.0mg/L ；所述蔗糖的浓度优选为 30g/L ；所述琼脂的浓度优选为 5.5g/L。
     优选地，本发明所述杨树为北京杨 (Populus beijingensis)。
     本发明另一方面提供一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：
     1) 从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体；
     2) 将无菌花药接种在所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织。
     本发明中所述的杨树优选为北京杨 (Populus beijingensis)。
     为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率，诱导得到的愈伤组织生长速度快，呈黄色或褐色，表面粗糙，质地疏松易碎，具有较高的活力。其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。
     由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤 1) 中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果：
     1-A) 用无菌水冲洗花芽；
     1-B) 用酒精浸泡花芽；
     1-C) 用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗；
     1-D) 吸干花芽表面水分后取出花药，即得。
     优选地，步骤 1-A) 中无菌水冲洗次数为 4-5 次；步骤 1-B) 中所述酒精的体积百分比浓度为 70.0％；浸泡时间为 30s ；步骤 1-C) 中次氯酸钠的质量百分比浓度为 7.0％；表面灭菌时间为 5min ；无菌水冲洗次数为 3-5 次。
     愈伤组织的诱导培养基的组成直接关系到愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的质量高低，为了提高杨树花药愈伤组织的诱导率，本发明对杨树花药愈伤组织的诱导培养基进行了优化，通过大量的筛选试验最终确定，采用下述的愈伤组织诱导培养基进行花药的愈伤组织诱导培养，愈伤组织的诱导效果最好：愈伤组织诱导培养基优选为： H基本培养基 + 奈乙酸 (NAA)0.5-1.5mg/L+6- 糠氨基嘌呤 (KT)0.5-1.5mg/L+ 蔗糖 20-40g/ 进一步优选为： H 基本培养基 + 奈乙酸 0.5-1.0mg/L+6- 糠氨基嘌呤 L+ 琼脂 4.5-6.5g/L ； 0.5-1.0mg/L+ 蔗糖 20-40g/L+ 琼脂 4.5-6.5g/L ；最优选为： H 基本培养基 + 奈乙酸 1.0mg/ L+6- 糠氨基嘌呤 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5.5g/L。
     优选地，步骤 2) 中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为 25±1℃。本发明对北京杨花药进行离体培养，花药内小孢子诱导发育为具有活力高的愈伤组织，杨树花药愈伤组织诱导率高，达到 30.0％。获得的愈伤组织生长速度快，愈伤组织器官分化培养得到不定芽，不定芽的分化率高达 100.0％，为杨树品质改良和新品种选育提供了有力的手段。利用本发明方法诱导得到的愈伤组织培育杨树单倍体植株，植株生长健壮、繁殖系数高，获得试管小苗移栽成活率高达 92.0％，是工厂化大规模生产杨树植株的简便、快捷的技术体系。具体实施方式
     下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
     一、试验材料
     1、供试材料：北京杨 (Populus beijingensis) ；
     2、植物生长调节剂本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸 (NAA)、 6- 苄氨基腺嘌呤 (BAP)、 6- 糠氨基嘌呤 (KT)、赤霉素 (GA3)、 2， 4- 二氯苯氧基乙酸 (2， 4-D)、吲哚丁酸 (IBA)。
     3、培养基的配制：
     (1)“MS 基本培养基” 的组成或配制方法：
     表 1 MS 培养基 (Murashige and Skoog， 1962)
     以上各种营养成分的用量，除了母液 I 为 20 倍浓缩液外，其余的均为 200 倍浓缩液。上述 MS 培养基母液配好后，储存于 4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积 3/4 的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液
     体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用 pH 计测试培养基酸碱度，用滴管吸取 1.0mol/L 的 NaOH 溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的 pH 值调整至 5.8。
     (2)“H 培养基” 的组成及配制方法：
     表 2H 培养基
     以上各种营养成分的用量，除了母液 I 为 20 倍浓缩液外，其余的均为 200 倍浓缩液。上述 H 培养基母液配好后，储存于 4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积 3/4 的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用 pH 计测试培养基酸碱度，用滴管吸取 1.0mol/L 的 NaOH 溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的 pH 值调整至 5.5。
     (3)N6 基本培养基的组成及配制方法：
     表 3 N6 培养基 ( 北京植物所，黑龙江农业科学院， 1974)
     以上各种营养成分的用量，除了母液 I 为 20 倍浓缩液外，其余的均为 200 倍浓缩液。上述 N6 培养基母液配好后，储存于 4℃冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积 3/4 的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用 pH 计测试培养基酸碱度，用滴管吸取 1.0mol/L 的 NaOH 溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的 pH 值调整至 5.8。
     (4) 不定芽分化培养基配方： MS 基本培养基 +BAP 0.6-1.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/ L+GA3 0.02-02mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L ；调节 pH 值为 5.8，培养基在 121℃下恒温灭菌 20 分钟。
     (5) 不定芽生根培养基配方为： 1/2MS 基本培养基 +IBA 0.2-0.5mg/L 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L ；调节 pH 值为 5.8，培养基在 121℃下恒温灭菌 20 分钟。
     试验例 1 北京杨花药愈伤组织诱导培养基的筛选和优化
     1、离体培养的花药及小孢子的合适发育时期
     剪取带有饱满花芽的北京杨花枝于室温 25℃下水培数日。将杨树花芽放在载玻片上，剥出花药，然后采用醋酸洋红染色，显微镜镜检观察小孢子的发育时期，以确定花粉发育时期。本试验选取小孢子处于单核靠边期的花药进行接种，研究结果表明此时正是花药培养的最佳时期。
     2、外植体消毒
     将处于单核靠边期的花芽从柔荑花序上取下，先用无菌水冲洗 5 次，滤纸吸干水分。将外植体置于超净工作台上，用体积百分比浓度为 70.0％的酒精浸泡花芽 30s，接着用质量百分比浓度为 7.0％的次氯酸钠溶液中进行表面消毒 5 分钟，然后用无菌水冲洗 3-5 次，取出花芽。
     在解剖镜下将花芽的鳞片剥去，取花序中部的花药，接种于培养皿中，用保鲜膜封口，进行暗培养，每个培养皿接种 30 个花药，每个处理重复 5 次。培养条件：黑暗条件，培养
     温度 25±1℃。
     3、愈伤组织诱导培养基的筛选
     将处于单核靠边期的花药分别接种于 MS、 H 和 N6 三种基本培养基中，每种中添加 1.0mg/L 2， 4-D 和 1.0mg/L BAP，蔗糖 30g/L，琼脂 5.5g/L， pH5.8。每个培养皿接种 30 个花药，每个处理重复 5 次。培养条件：黑暗条件，培养温度 25±1℃，培养 35 天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养 120 天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表 4。
     表 4 不同培养基对愈伤组织的诱导效果
     基本培养基 MS H N6
     接种花药数 ( 个 ) 150 150 150 产生愈伤组织的花药数 ( 个 ) 3 5 0 愈伤诱导率 (％ ) 2.0 3.3 0.0表 4 的试验结果表明：
     1) 采用 H 培养基，杨树花药的愈伤组织诱导率高。
     2) 花药接种 35 天左右，开始观察到有愈伤组织形成。在 MS、 H 培养基中均观察到有愈伤组织的形成，该愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面呈颗粒状，生长缓慢。在 N6 培养基中没有观察到愈伤组织的形成。
     4、愈伤组织诱导培养基激素种类筛选
     根据筛选的 H 基本培养基，筛选不同的激素种类。
     将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同激素种类和浓度的 H 基本培养基中，添加不同激素种类和浓度的 H 基本培养基如表 5 所示。
     表 5 含有不同激素的 H 培养基
     每种培养基中添加蔗糖 30g/L，琼脂 5.5g/L， pH5.5。每个培养皿接种 30 个花药，每个处理重复 3 次。培养条件：黑暗条件，培养温度 25±1℃，培养 35 天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养 120 天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表 6。
     表 6 不同激素种类对愈伤组织诱导的影响
     试验结果表明：激素种类 NAA 与 KT 组合对花药愈伤组织诱导率最高，平均诱导率达到 9.3％，其次是 2， 4-D 和 BAP 组合使用。检测结果表明， NAA 与 KT 的激素组合对愈伤组织的诱导效果比较理想。
     5、愈伤组织诱导培养基激素浓度筛选
     根据筛选的基本培养基和激素种类，筛选激素的配比。
     将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同浓度的 NAA、 KT 的 H 培养基中，并且
     每种培养基中添加蔗糖 30g/L，琼脂 5.5g/L， pH5.5。每个培养皿接种 30 个花药，每个处理重复 3 次。培养条件：黑暗条件，培养温度 25±1℃，培养 35 天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养 120 天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表 7 所示。
     表 7 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
     根据表 7 试验结果可见，当 H 培养基中所添加的 NAA 以及 KT 的浓度分别在 0.5-1.0mg/L 范围之内，有利于提高杨树花药愈伤组织的诱导率，其中，添加 1.0mg/LNAA 和 1.0mg/L KT 的 H 培养基中愈伤组织的诱导率最高，愈伤组织的诱导率达到了 30.0％；其次是 H 培养基中添加 1.0mg/L NAA 和 0.5mg/L KT，愈伤组织的诱导率达到了 17.8％；
     接种于愈伤组织的诱导培养基： H 培养基 +NAA1.0mg/L+KT1.0mg/L 中的杨树花药在培养 10 天左右，可观察到花药逐渐膨大，培养 35 天左右可以观察到培养基中有愈伤组织形成，该愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面呈颗粒状，生长缓慢。此后在诱导培养基中相继观察到有愈伤组织的形成，培养至 120 天后愈伤组织极少再形成。
     试验例 2
     1、制备无菌花药
     取单核靠边期的杨树花芽，用无菌水冲洗花芽 3-5 次，用滤纸吸干水分后用体积百分比浓度为 70.0％的酒精浸泡花芽 30s，接着用质量百分比浓度为 7.0％的次氯酸钠溶液消毒 5min，然后用无菌水冲洗花芽 3-5 次。在超净工作台上剥去花芽的鳞片，取出花序中部的花药，即得。
     2、愈伤组织诱导培养
     将花药接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，培养条件：黑暗条件下，培养温度为 25±1℃，培养 120 天，统计花药愈伤组织诱导率达到 30.0％，其中，愈伤组织诱导培养基为： H+NAA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH5.5。
     3、不定芽分化培养
     将培养得到的直径为 3mm 左右的杨树花药愈伤组织接种到不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为 25±1℃，光照 1500 ～ 2000lx，光照时间 16 小时 / 天。分化培养过程中，杨树花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周左右在愈伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，然后不定芽抽茎， 20 天左右无根苗生长高度可达 1.5 ～ 2cm。培养 20 天后统计不定芽的分化率为 100.0％，其中，不定芽分化培养基配方为： MS+BAP 0.6-1.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+GA3 0.02-0.2mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH5.8。
     愈伤组织器官分化培养基是诱导杨树愈伤组织分化时所公开的任何一种杨树愈伤组织器官分化培养基，这些杨树愈伤组织器官分化培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开，除了采用上述培养基： MS+BAP 0.6-1.0mg/ L+NAA0.2-0.5mg/L+GA3 0.02-0.2mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L 之外，其他杨树愈伤组织不定芽分化培养基也适用于本发明，例如： MS+BAP 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L 和 MS+KT 2.0mg/ L+IAA 0.5mg/L 等。
     4、生根培养
     将培养至具有 3-5 片幼嫩叶片的不定芽接种到生根培养基中进行生根培养，培养条件：培养温度为 25±1℃，光照 1500 ～ 2000lx，光照时间 16 小时 / 天，培养 20 天后统计不定芽的生根情况，生根率达到 100.0％，得到杨树试管小苗，其中，不定芽生根培养基配方为： 1/2MS+IBA 0.2-0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L， pH5.8，试管小苗的主根粗壮，须根众多。不定芽生根培养基是诱导杨树不定芽生根培养时所公开的任何一种杨树不定芽生根培养基，这些杨树不定芽生根培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开，除了采用上述培养基： 1/2MS+IBA0.2-0.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L 之外，其他杨树不定芽生根培养基也适用于本发明，例如： H+IAA 1.0-1.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L、 1/2MS+IAA 1.0-1.5g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5.5g/L 等。
     5、炼苗、移栽
     选取生根较好的试管小苗，放置在温室中的遮阴棚中炼苗培养 2-3 天，然后取出小苗并洗净根部培养基，移栽到杨树无土栽培基质 ( 珍珠岩和蛭石的混合物 ) 中，无土栽培基质为珍珠岩与蛭石的体积之比为 1 ∶ 1 的混合物。移栽后浇透水， 15 天后统计移栽成活率，成活率为 92.0％。
     实际应用表明：采用本发明愈伤组织组织诱导培养基所诱导培养的杨树花药愈伤组织可在多次不同重复试验中获得杨树单倍体植株，可靠性强；将单倍体植株经天然加倍或人工用秋水仙碱处理生长点，得到纯合的二倍体。
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1、(10)申请公布号 CN 102511397 A (43)申请公布日 2012.06.27 C N 1 0 2 5 1 1 3 9 7 A *CN102511397A* (21)申请号 201110441967.X (22)申请日 2011.12.26 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人北京林业大学地址 100083 北京市海淀区清华东路35号 (72)发明人安新民李英郭斌王佳 (74)专利代理机构北京元本知识产权代理事务所 11308 代理人叶凡 (54) 发明名称一种杨树愈伤组织诱导方法及诱导培养基 (57) 摘要本发明公开了一种杨树愈伤组织的诱导方法及诱。

2、导培养基，属于杨树的组织培养领域。本发明所筛选、优化的杨树愈伤组织诱导培养基为添加0.5-1.5mg/L萘乙酸、0.5-1.5mg/L 6-糠氨基嘌呤、20-40g/L蔗糖和4.5-6.5g/L琼脂的H培养基。本发明以单核靠边期的杨树花药为外植体，将其接种到所筛选的愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得生长速度快、器官分化率高的杨树愈伤组织。本发明愈伤组织诱导培养基可以有效提高愈伤组织的诱导率，所获得的愈伤组织质量高，可以在短期内形成大量优良的杨树试管苗，不仅可以快速繁殖杨树，同时也可以应用于杨树植物改良，种质保存等方面。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页。

3、说明书9页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 9 页 1/1页 2 1.一种杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是：H培养基+萘乙酸 0.5-1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L。 2.如权利要求1所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是：H培养基 +萘乙酸0.5-1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5-1.0mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L。 3.如权利要求2所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基，其特征是，其组成是：H培养基 +萘乙酸1.。

4、0mg/L+6-糠氨基嘌呤1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。 4.一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤： 1)从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体； 2)将无菌花药接种在权利要求1-3任何一项所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织。 5.如权利要求4所述的诱导方法，其特征是步骤2)中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为251。 6.如权利要求4所述的诱导方法，其特征是步骤1)中所述花药是发育时期为小孢子处于单核靠边期的杨树花药。 7.如权利要求4所述的诱导方法，其特征是所述的杨树是北京杨(Popu。

5、lus beijingensis)。 8.如权利要求4所述的诱导方法，其特征是步骤1)中所述消毒处理包括如下步骤： 1-A)用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽； 1-B)用酒精浸泡花芽； 1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗； 1-D)吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。 9.如权利要求8所述的诱导方法，其特征是步骤1-B)中所述酒精的体积百分比浓度为 70.0。 10.如权利要求8所述的诱导方法，其特征是步骤1-C)中所述次氯酸钠溶液的质量百分比浓度为7.0。权利要求书CN 102511397 A 1/9页 3 一种杨树愈伤组织诱导方法及诱导培养基技。

6、术领域 0001 本发明涉及一种植物的组织培养基，特别涉及杨树愈伤组织的诱导培养基及其在培养杨树花药愈伤组织中的应用，属于杨树的组织培养领域。背景技术 0002 北京杨(Populus beijingensis)为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点，是优良的用材林、防护林、行道树和“四旁”绿化树种，深受群众喜爱。主要分布于中国的华北和西北等地区。 0003 由于杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用。

7、自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将之进行加倍成为双单倍体(doubled haploids，DHs)，这样就可显著缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。 0004 目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。愈伤组织培养是一种最常见的培养方式，除茎尖分生组织培养和。

8、一部分器官培养以外，其它几种植物组织培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生植株。此外愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的材料来源。愈伤组织分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织易于再生芽，可发育成幼嫩的植株。 0005 在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉诱导愈伤组织，愈伤组织分化培养获得单。

9、倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是一直以来花药培养过程中存在愈伤组织诱导率低的问题，使得植物单倍体远远不能满足研究者们的需求。发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是针对现有的杨树花药培养过程中所存在的愈伤组织诱导率低的问题，提供一种新的杨树愈伤组织的诱导方法，本发明方法摸索并筛选到最适宜的杨树花药愈伤组织的诱导培养基及其培养条件，该方法可以在较短时间内形成大量优良的杨树愈伤组织，愈伤组织诱导率高，获得的愈伤组织的器官分化率高，可进行规模。

10、说明书CN 102511397 A 2/9页 4 化、工厂化生产。 0007 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下： 0008 本发明一方面提供一种优化的杨树花药愈伤组织诱导培养基，所述杨树花药愈伤组织诱导培养基是添加了0.5-1.5mg/L萘乙酸(NAA)、0.5-1.5mg/L 6-糠氨基嘌呤(KT)、 20-40g/L蔗糖、4.5-6.5g/L琼脂的H培养基。 0009 其中，所述NAA的浓度优选为0.5-1.0mg/L，进一步优选为1.0mg/L；所述KT的浓度优选为0.5-1.0mg/L，进一步优选为1.0mg/L；所述蔗糖的浓度优选为30g/L；所述琼脂的浓度。

11、优选为5.5g/L。 0010 优选地，本发明所述杨树为北京杨(Populus beijingensis)。 0011 本发明另一方面提供一种杨树愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤： 0012 1)从消毒处理后杨树花序中取出花药，获得无菌花药外植体； 0013 2)将无菌花药接种在所述的杨树花药愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织。 0014 本发明中所述的杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)。 0015 为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率，。

12、诱导得到的愈伤组织生长速度快，呈黄色或褐色，表面粗糙，质地疏松易碎，具有较高的活力。其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，本发明通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。 0016 由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤1)中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果： 0017 1-A)用无菌水冲洗花芽； 0018 1-B)用酒精浸泡花芽； 0019 1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗； 0020 1-D)吸干花芽表面水分后取出花药，即得。 0021 优选地，。

13、步骤1-A)中无菌水冲洗次数为4-5次；步骤1-B)中所述酒精的体积百分比浓度为70.0；浸泡时间为30s；步骤1-C)中次氯酸钠的质量百分比浓度为7.0；表面灭菌时间为5min；无菌水冲洗次数为3-5次。 0022 愈伤组织的诱导培养基的组成直接关系到愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的质量高低，为了提高杨树花药愈伤组织的诱导率，本发明对杨树花药愈伤组织的诱导培养基进行了优化，通过大量的筛选试验最终确定，采用下述的愈伤组织诱导培养基进行花药的愈伤组织诱导培养，愈伤组织的诱导效果最好：愈伤组织诱导培养基优选为：H基本培养基+奈乙酸(NAA)0.5-1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)0。

14、.5-1.5mg/L+蔗糖20-40g/ L+琼脂4.5-6.5g/L；进一步优选为：H基本培养基+奈乙酸0.5-1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤 0.5-1.0mg/L+蔗糖20-40g/L+琼脂4.5-6.5g/L；最优选为：H基本培养基+奈乙酸1.0mg/ L+6-糠氨基嘌呤1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。 0023 优选地，步骤2)中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行：黑暗条件下，培养温度为251。说明书CN 102511397 A 3/9页 5 0024 本发明对北京杨花药进行离体培养，花药内小孢子诱导发育为具有活力高的愈伤组织，杨树花药愈伤组织诱导率高，。

15、达到30.0。获得的愈伤组织生长速度快，愈伤组织器官分化培养得到不定芽，不定芽的分化率高达100.0，为杨树品质改良和新品种选育提供了有力的手段。利用本发明方法诱导得到的愈伤组织培育杨树单倍体植株，植株生长健壮、繁殖系数高，获得试管小苗移栽成活率高达92.0，是工厂化大规模生产杨树植株的简便、快捷的技术体系。具体实施方式 0025 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修。

16、改和替换均落入本发明的保护范围内。 0026 一、试验材料 0027 1、供试材料：北京杨(Populus beijingensis)； 0028 2、植物生长调节剂 0029 本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤 (BAP)、6-糠氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA 3 )、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚丁酸(IBA)。 0030 3、培养基的配制： 0031 (1)“MS基本培养基”的组成或配制方法： 0032 表1 MS培养基(Murashige and Skoog，1962) 0033 0034 以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓。

17、缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述MS培养基母液配好后，储存于4冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液说明书CN 102511397 A 4/9页 6 体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取1.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至5.8。 0。

18、035 (2)“H培养基”的组成及配制方法： 0036 表2H培养基 0037 0038 以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述H培养基母液配好后，储存于4冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取 1.0mol/L的NaOH。

19、溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至 5.5。 0039 (3)N 6 基本培养基的组成及配制方法： 0040 表3 N 6 培养基(北京植物所，黑龙江农业科学院，1974) 0041 0042 说明书CN 102511397 A 5/9页 7 0043 以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述N 6 培养基母液配好后，储存于4冰箱待用。根据配制培养基的总量，称量所需的琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的蒸馏水中，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量，如需。

20、添加激素则根据培养基配方中激素的种类和浓度，将其与各种母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一种都充分搅拌，最后加蒸馏水定容至总体积，搅拌均匀。用pH计测试培养基酸碱度，用滴管吸取 1.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培养基中，边滴边搅拌，直到培养基的pH值调整至 5.8。 0044 (4)不定芽分化培养基配方：MS基本培养基+BAP 0.6-1.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/ L+GA 3 0.02-02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L；调节pH值为5.8，培养基在121下恒温灭菌20分钟。 0045 (5)不定芽生根培养基配方为：1/2MS基本培养基+IBA 0.。

21、2-0.5mg/L蔗糖20g/L+ 琼脂5.5g/L；调节pH值为5.8，培养基在121下恒温灭菌20分钟。 0046 试验例1北京杨花药愈伤组织诱导培养基的筛选和优化 0047 1、离体培养的花药及小孢子的合适发育时期 0048 剪取带有饱满花芽的北京杨花枝于室温25下水培数日。将杨树花芽放在载玻片上，剥出花药，然后采用醋酸洋红染色，显微镜镜检观察小孢子的发育时期，以确定花粉发育时期。本试验选取小孢子处于单核靠边期的花药进行接种，研究结果表明此时正是花药培养的最佳时期。 0049 2、外植体消毒 0050 将处于单核靠边期的花芽从柔荑花序上取下，先用无菌水冲洗5次，滤纸吸干水分。将外。

22、植体置于超净工作台上，用体积百分比浓度为70.0的酒精浸泡花芽30s，接着用质量百分比浓度为7.0的次氯酸钠溶液中进行表面消毒5分钟，然后用无菌水冲洗3-5 次，取出花芽。 0051 在解剖镜下将花芽的鳞片剥去，取花序中部的花药，接种于培养皿中，用保鲜膜封口，进行暗培养，每个培养皿接种30个花药，每个处理重复5次。培养条件：黑暗条件，培养说明书CN 102511397 A 6/9页 8 温度251。 0052 3、愈伤组织诱导培养基的筛选 0053 将处于单核靠边期的花药分别接种于MS、H和N 6 三种基本培养基中，每种中添加 1.0mg/L 2，4-D和1.0mg/L BAP，蔗糖。

23、30g/L，琼脂5.5g/L，pH5.8。每个培养皿接种30个花药，每个处理重复5次。培养条件：黑暗条件，培养温度251，培养35天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养120天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表4。 0054 表4不同培养基对愈伤组织的诱导效果 0055 基本培养基接种花药数(个) 产生愈伤组织的花药数(个) 愈伤诱导率() MS 150 3 2.0 H 150 5 3.3 N 6 150 0 0.0 0056 表4的试验结果表明： 0057 1)采用H培养基，杨树花药的愈伤组织诱导率高。 0058 2)花药接种35天左右，开始观察到有愈伤组织形成。在MS、H培。

24、养基中均观察到有愈伤组织的形成，该愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面呈颗粒状，生长缓慢。在N 6 培养基中没有观察到愈伤组织的形成。 0059 4、愈伤组织诱导培养基激素种类筛选 0060 根据筛选的H基本培养基，筛选不同的激素种类。 0061 将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同激素种类和浓度的H基本培养基中，添加不同激素种类和浓度的H基本培养基如表5所示。 0062 表5含有不同激素的H培养基 0063 说明书CN 102511397 A 7/9页 9 0064 0065 每种培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，pH5.5。每个培养皿接种30个花药，每个处理重复。

25、3次。培养条件：黑暗条件，培养温度251，培养35天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养120天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表6。 0066 表6不同激素种类对愈伤组织诱导的影响 0067 0068 试验结果表明：激素种类NAA与KT组合对花药愈伤组织诱导率最高，平均诱导率达到9.3，其次是2，4-D和BAP组合使用。检测结果表明，NAA与KT的激素组合对愈伤组织的诱导效果比较理想。 0069 5、愈伤组织诱导培养基激素浓度筛选 0070 根据筛选的基本培养基和激素种类，筛选激素的配比。 0071 将处于单核靠边期的花药分别接种于添加不同浓度的NAA、KT的H培养基中，并且。

26、说明书CN 102511397 A 8/9页 10 每种培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，pH5.5。每个培养皿接种30个花药，每个处理重复3次。培养条件：黑暗条件，培养温度251，培养35天后开始统计各处理形成的愈伤组织数，培养120天后计算出愈伤组织诱导率，统计和计算结果如表7所示。 0072 表7不同激素组合对愈伤组织诱导的影响 0073 0074 根据表7试验结果可见，当H培养基中所添加的NAA以及KT的浓度分别在 0.5-1.0mg/L范围之内，有利于提高杨树花药愈伤组织的诱导率，其中，添加1.0mg/LNAA和 1.0mg/L KT的H培养基中愈伤组织的诱导率。

27、最高，愈伤组织的诱导率达到了30.0；其次是H培养基中添加1.0mg/L NAA和0.5mg/L KT，愈伤组织的诱导率达到了17.8； 0075 接种于愈伤组织的诱导培养基：H培养基+NAA1.0mg/L+KT1.0mg/L中的杨树花药在培养10天左右，可观察到花药逐渐膨大，培养35天左右可以观察到培养基中有愈伤组织形成，该愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面呈颗粒状，生长缓慢。此后在诱导培养基中相继观察到有愈伤组织的形成，培养至120天后愈伤组织极少再形成。 0076 试验例2 0077 1、制备无菌花药 0078 取单核靠边期的杨树花芽，用无菌水冲洗花芽3-5次，用滤纸吸干水分后。

28、用体积百分比浓度为70.0的酒精浸泡花芽30s，接着用质量百分比浓度为7.0的次氯酸钠溶液消毒5min，然后用无菌水冲洗花芽3-5次。在超净工作台上剥去花芽的鳞片，取出花序中部的花药，即得。 0079 2、愈伤组织诱导培养 0080 将花药接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，培养条件：黑暗条件下，培养温度为251，培养120天，统计花药愈伤组织诱导率达到30.0，其中，愈伤组织诱导培养基为：H+NAA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH5.5。 0081 3、不定芽分化培养说明书CN 102511397 A 10 9/9页 11 00。

29、82 将培养得到的直径为3mm左右的杨树花药愈伤组织接种到不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为251，光照15002000lx，光照时间16小时 /天。分化培养过程中，杨树花药愈伤组织由黄色转为黄绿色继而变为绿色，一周左右在愈伤组织表面可以看到绿色突起的芽点，接着叶片伸展出来，然后不定芽抽茎，20天左右无根苗生长高度可达1.52cm。培养20天后统计不定芽的分化率为100.0，其中，不定芽分化培养基配方为：MS+BAP 0.6-1.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+GA 3 0.02-0.2mg/L+蔗糖20g/L+ 琼脂5.5g/L，pH5.8。 0083。

30、愈伤组织器官分化培养基是诱导杨树愈伤组织分化时所公开的任何一种杨树愈伤组织器官分化培养基，这些杨树愈伤组织器官分化培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开，除了采用上述培养基：MS+BAP 0.6-1.0mg/ L+NAA0.2-0.5mg/L+GA 3 0.02-0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L之外，其他杨树愈伤组织不定芽分化培养基也适用于本发明，例如：MS+BAP 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L和MS+KT 2.0mg/ L+IAA 0.5mg/L等。 0084 4、生根培养 0085 将培养至具有3-5片幼嫩叶片的不定芽接种到生根培养基。

31、中进行生根培养，培养条件：培养温度为251，光照15002000lx，光照时间16小时/天，培养20天后统计不定芽的生根情况，生根率达到100.0，得到杨树试管小苗，其中，不定芽生根培养基配方为：1/2MS+IBA 0.2-0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8，试管小苗的主根粗壮，须根众多。 0086 不定芽生根培养基是诱导杨树不定芽生根培养时所公开的任何一种杨树不定芽生根培养基，这些杨树不定芽生根培养基均能适用于本发明，其组成成分已在各种文献或教科书中公开，除了采用上述培养基：1/2MS+IBA0.2-0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L之外，其。

32、他杨树不定芽生根培养基也适用于本发明，例如：H+IAA 1.0-1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L、1/2MS+IAA 1.0-1.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L等。 0087 5、炼苗、移栽 0088 选取生根较好的试管小苗，放置在温室中的遮阴棚中炼苗培养2-3天，然后取出小苗并洗净根部培养基，移栽到杨树无土栽培基质(珍珠岩和蛭石的混合物)中，无土栽培基质为珍珠岩与蛭石的体积之比为11的混合物。移栽后浇透水，15天后统计移栽成活率，成活率为92.0。 0089 实际应用表明：采用本发明愈伤组织组织诱导培养基所诱导培养的杨树花药愈伤组织可在多次不同重复试验中获得杨树单倍体植株，可靠性强；将单倍体植株经天然加倍或人工用秋水仙碱处理生长点，得到纯合的二倍体。说明书CN 102511397 A 11 。

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