一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf

上传人:zhu****69 文档编号:4290046 上传时间:2018-09-13 格式:PDF 页数:6 大小:350.47KB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN201210136867.0

申请日:

2012.05.07

公开号:

CN102660607A

公开日:

2012.09.12

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12P 19/14申请日:20120507|||公开

IPC分类号:

C12P19/14; C07H3/06; C07H1/06; C08B37/02

主分类号:

C12P19/14

申请人:

江苏瑞光生物科技有限公司

发明人:

詹晓北; 朱莉; 吴剑荣; 郑志永

地址:

214125 江苏省无锡市滨湖区锦溪路99号国家大学科技园602室

优先权:

专利代理机构:

无锡市大为专利商标事务所 32104

代理人:

时旭丹;刘品超

PDF下载: PDF下载
内容摘要

一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,属于生物工程技术领域。本发明方法以热凝胶为原料,通过β-葡聚糖酶先酸解再酶解,或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液,再用超滤膜进行截留分离和浓缩,获得聚合度为4~15DP的β-1,3葡聚寡糖,可应用于植物抗病疫苗。本发明由于采用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶的寡聚化,使得酶解反应便于控制,同时由于采用较低温度的水解条件使得在不破坏β-1,3-葡聚寡糖的结构的条件下,能耗得以节约;且由于采用酸解与酶解和膜分离浓缩技术,使得整个生产工艺不产生环境污染,低能耗,低成本。本发明方法具有反应温和,便于控制反应进程,以及能耗低,对环境友好等优点。

权利要求书

1.一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,其特征在于以热凝胶为原料,通过β-葡聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解,或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液,再用超滤膜进行截留分离和浓缩,获得聚合度为4~15DP的β-1,3葡聚寡糖,其结构式如下式所示:β-1,3葡聚寡糖的结构式,n=2~13;制备步骤为:(1)先酸解再酶解,或先酶解再酸解,得到寡糖溶液;所述的先酸解再酶解方法,其反应体系是:热凝胶溶解于0.1M 三氟乙酸溶液中,1~2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液,60℃下水解处理8-24小时,再用氨水调整pH 6.0;然后按照热凝胶︰酶=(10~20)︰(1~2)的质量比例加入β-葡聚糖酶,37℃下水解5-24小时;所述的先酶解再酸解方法,其反应体系是:热凝胶溶于0.01M Ba(OH)2溶液中,1~2公斤的热凝胶溶解于8L该Ba(OH)2溶液,搅拌直至热凝胶完全溶解,用硫酸调整pH 7.0,按照热凝胶︰酶=(10~20)︰(1~2)的质量比例加入β-葡聚糖酶粉,混合均匀;溶液用无水乙酸调至pH 6.0,在37℃条件下水解2-24小时;然后再用0.1M三氟乙酸调整溶液 pH 2~5,60℃下水解1-16小时;(2)将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩:选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜来进行分离,操作压为0.5MPa,按照1︰5的体积比来进行超滤,用pH 6.0、5倍于所得寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜,超滤时间为25分钟;截留液继续用于酶解或酸解;对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作压为0.5MPa,超滤时间为25分钟;截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品。

说明书

一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法

技术领域

本发明涉及一种β-1,3-葡聚寡糖的制备方法,属于生物工程技术领域。

背景技术

寡糖是指聚合度低于20的低聚糖。传统的寡糖制备方法主要是采用酸水解的方法来进行,但是由于酸水解程度极其难于控制,大部分水解成单糖。而对于热凝胶,目前对其进行水解获得聚合度在4-15DP之间的寡糖的方法还没有报道。这主要是由于热凝胶是聚合度为500~800左右的多糖,其螺旋形的刚性三维立体结构使得热凝胶不溶于水,但是溶解于碱性溶液和二甲基亚砜(DMSO)等。虽有报道热凝胶在DMSO溶液中用酸处理的方法来获得寡糖,但是其聚合度主要在7DP以下,同时其需要用丙酮来洗涤水解产物以除去DMSO,而且有机溶剂的使用不利于环保。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备β-1,3葡聚寡糖的方法。该方法具有反应温和,便于控制反应进程,以及能耗低,对环境友好等优点。

本发明的技术方案:一种β-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,以热凝胶为原料,通过β-葡聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解,或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液,再用超滤膜进行截留分离和浓缩,获得聚合度为4~15DP的β-1,3葡聚寡糖,其结构式如下式所示:

β-1,3葡聚寡糖的结构式,n=2~13;

制备步骤为:

(1)先酸解再酶解,或先酶解再酸解,得到寡糖溶液;

所述的先酸解再酶解方法,其反应体系是:热凝胶溶解于0.1M 三氟乙酸溶液中,1~2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液,60℃下水解处理8-24小时,再用氨水调整pH 6.0;然后按照热凝胶︰酶=(10~20)︰(1~2)的质量比例加入β-葡聚糖酶,37℃下水解5-24小时;

所述的先酶解再酸解方法,其反应体系是:热凝胶溶于0.01M Ba(OH)2溶液中,1~2公斤的热凝胶溶解于8L该Ba(OH)2溶液,搅拌直至热凝胶完全溶解,用硫酸调整pH 7.0,按照热凝胶︰酶=(10~20)︰(1~2)的质量比例加入β-葡聚糖酶粉,混合均匀;溶液用无水乙酸调至pH 6.0,在37℃条件下水解2-24小时;然后再用0.1M三氟乙酸调整溶液 pH 2~5,60℃下水解1-16小时;

(2)将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩:选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜来进行分离,操作压为0.5MPa,按照1︰5的体积比来进行超滤,用pH 6.0、5倍于所得寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜,超滤时间为25分钟;截留液继续用于酶解或酸解;对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作压为0.5MPa,超滤时间为25分钟;截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品。

β-1,3葡聚寡糖的制备工艺。

采用先酶解再酸解,或先酸解再酶解的方法来制备β-葡聚寡糖。

路线一:

热凝胶溶于0.1M 三氟乙酸溶液中,60℃水解8-24小时,氨水调pH 6.0,加β-葡聚糖酶,37℃水解5-24小时。将水解液用超滤膜进行分离浓缩,即可获得产品。

路线二:

热凝胶溶于Ba(OH)2溶液中,硫酸调pH 7.0,加β-葡聚糖酶,用无水乙酸调pH 6.0,37℃水解2-24小时,用三氟乙酸调pH 2~5,60℃水解1-16小时。将水解液用超滤膜进行分离浓缩,即可获得产品。

β-1,3葡聚寡糖的聚合度监控分析

取10μL水解液,用HPLC-ELSD 系统进行分析,柱子采用Click mail柱,流动相为含有0.5mM KH2PO4 的80%乙腈作为流动相,流速为1mL/min。确定4-15DP聚合度的β-1,3葡聚寡糖所对应色谱峰,并根据色谱峰面积计算水解靶标产物的得率。

热凝胶产品由上海福乐贸易有限公司提供,热凝胶水解使用的β-葡聚糖酶由宁夏夏盛实业公司提供。

本发明的有益效果:其一,由于采用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶的寡聚化,使得酶解反应便于控制,同时由于采用较低温度的水解条件使得在不破坏β-1,3-葡聚寡糖的结构的条件下,能耗得以节约;其二,由于采用酸解与酶解和膜分离浓缩技术,使得整个生产工艺不产生环境污染,低能耗,低成本。

附图说明

图1β-1,3葡聚寡糖的制备流程示意图。

具体实施方式

本发明由以下的实施例进一步说明。这些实施例只是为了说明目的,而不是用来限制本发明的范围。

实施例1:热凝胶先酸解再酶解

取10~20公斤的热凝胶溶解于80L、0.1M 三氟乙酸溶液中,60℃下水解处理8-24小时,加入氨水调整pH 6.0,然后按照热凝胶︰酶=(10~20)︰(1~2)的重量比例加入β-葡聚糖酶粉,37℃下水解5-24小时。

实施例2:热凝胶先酶解再酸解

取10~20公斤的热凝胶置于100℃、80L的0.01M 的Ba(OH)2溶液中,并进行搅拌直至热凝胶完全溶解后,用硫酸调整pH 7.0后加入1~2公斤β-葡聚糖酶粉,混合均匀。溶液用无水乙酸调至pH 6.0,在37℃条件下水解2-24小时。然后再用三氟乙酸(0.1M)调整溶液 pH 2~5,60℃下水解1-16小时。

实施例3:β-1,3葡聚寡糖的提取

选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜分离方法来进行分离,操作压为0.5MPa,按照1︰5的体积比来进行超滤,用pH6.0、5倍于实施例1或实施例2所得的水解后寡糖溶液体积的水溶液推动反应混合液过膜,超滤时间为25分钟。截留液继续用于酶解或酸解。对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作压为0.5MPa,超滤时间为25分钟。截留的浓缩液经过干燥后即为聚合度为4-15的β-1,3葡聚寡糖产品,产品得率为70%。

实施例4:β-1,3葡聚寡糖植物抗病疫苗在农作物抗真菌病害中的应用

将β-1,3葡聚寡糖(聚合度在4-15)溶解于水,调整浓度为1‰-10‰,在农作物早苗出土3周龄时,开始用喷雾器喷洒。以后每隔40天喷洒一次,结实后停止喷洒。根据参照对比,β-1,3葡聚寡糖对小麦赤霉病防效达60%,棉花黄萎病防效达80%,大豆花叶病防效达71%,对辣椒病毒病防效达75%,番茄晚疫病防效达70%,白菜软腐病防效达85%,苹果黑星病防效达57%,木瓜花叶病防效达96%。

一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf_第1页
第1页 / 共6页
一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf_第2页
第2页 / 共6页
一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf_第3页
第3页 / 共6页
点击查看更多>>
资源描述

《一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种Β1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法.pdf(6页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102660607 A (43)申请公布日 2012.09.12 C N 1 0 2 6 6 0 6 0 7 A *CN102660607A* (21)申请号 201210136867.0 (22)申请日 2012.05.07 C12P 19/14(2006.01) C07H 3/06(2006.01) C07H 1/06(2006.01) C08B 37/02(2006.01) (71)申请人江苏瑞光生物科技有限公司 地址 214125 江苏省无锡市滨湖区锦溪路 99号国家大学科技园602室 (72)发明人詹晓北 朱莉 吴剑荣 郑志永 (74)专利代理机构无锡市大为。

2、专利商标事务所 32104 代理人时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法 (57) 摘要 一种-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,属 于生物工程技术领域。本发明方法以热凝胶为原 料,通过-葡聚糖酶先酸解再酶解,或先酶解再 酸解处理后得到寡糖溶液,再用超滤膜进行截留 分离和浓缩,获得聚合度为415DP的-1,3葡 聚寡糖,可应用于植物抗病疫苗。本发明由于采 用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶的寡聚 化,使得酶解反应便于控制,同时由于采用较低温 度的水解条件使得在不破坏-1,3-葡聚寡糖的 结构的条件下,能耗得以节约;且由于采用酸解 与酶解和膜分离浓缩技术,使得整。

3、个生产工艺不 产生环境污染,低能耗,低成本。本发明方法具有 反应温和,便于控制反应进程,以及能耗低,对环 境友好等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1页 2 1.一种-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,其特征在于以热凝胶为原料,通过-葡 聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解,或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液,再用超滤膜进 行截留分离和浓缩,获得聚合度为415DP的-1,3葡聚寡糖,其结构式如下式所示: -1,3葡聚寡糖的结构式,n=213; 制备步骤为:。

4、 (1)先酸解再酶解,或先酶解再酸解,得到寡糖溶液; 所述的先酸解再酶解方法,其反应体系是:热凝胶溶解于0.1M 三氟乙酸溶液中,1 2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液,60下水解处理8-24小时,再用氨水调整pH 6.0;然后按照热凝胶酶=(1020)(12)的质量比例加入-葡聚糖酶,37下 水解5-24小时; 所述的先酶解再酸解方法,其反应体系是:热凝胶溶于0.01M Ba(OH) 2 溶液中,12公斤 的热凝胶溶解于8L该Ba(OH) 2 溶液,搅拌直至热凝胶完全溶解,用硫酸调整pH 7.0,按照热 凝胶酶=(1020)(12)的质量比例加入-葡聚糖酶粉,混合均匀;溶液用无水 乙酸调。

5、至pH 6.0,在37条件下水解2-24小时;然后再用0.1M三氟乙酸调整溶液 pH 2 5,60下水解1-16小时; (2)将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩:选用截留分子量为15000Da的中空卷 式膜来进行分离,操作压为0.5MPa,按照15的体积比来进行超滤,用pH 6.0、5倍于所得 寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜,超滤时间为25分钟;截留液继续用于酶解或酸 解;对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作压为0.5MPa,超滤 时间为25分钟;截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的-1,3葡聚寡糖产品。 权 利 要 求 书CN 102660607 。

6、A 1/3页 3 一种 -1,3 葡聚寡糖的寡聚化制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种-1,3-葡聚寡糖的制备方法,属于生物工程技术领域。 背景技术 0002 寡糖是指聚合度低于20的低聚糖。传统的寡糖制备方法主要是采用酸水解的方 法来进行,但是由于酸水解程度极其难于控制,大部分水解成单糖。而对于热凝胶,目前对 其进行水解获得聚合度在4-15DP之间的寡糖的方法还没有报道。这主要是由于热凝胶是 聚合度为500800左右的多糖,其螺旋形的刚性三维立体结构使得热凝胶不溶于水,但 是溶解于碱性溶液和二甲基亚砜(DMSO)等。虽有报道热凝胶在DMSO溶液中用酸处理的方 法来获得寡糖,但是其聚合。

7、度主要在7DP以下,同时其需要用丙酮来洗涤水解产物以除去 DMSO,而且有机溶剂的使用不利于环保。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种制备-1,3葡聚寡糖的方法。该方法具有反应温和,便 于控制反应进程,以及能耗低,对环境友好等优点。 0004 本发明的技术方案:一种-1,3葡聚寡糖的寡聚化制备方法,以热凝胶为原料, 通过-葡聚糖酶对热凝胶进行先酸解再酶解,或先酶解再酸解处理后得到寡糖溶液,再 用超滤膜进行截留分离和浓缩,获得聚合度为415DP的-1,3葡聚寡糖,其结构式如下 式所示: -1,3葡聚寡糖的结构式,n=213; 制备步骤为: (1)先酸解再酶解,或先酶解再酸解,得到寡糖溶液。

8、; 所述的先酸解再酶解方法,其反应体系是:热凝胶溶解于0.1M 三氟乙酸溶液中,1 2公斤的热凝胶溶解于8L该三氟乙酸溶液,60下水解处理8-24小时,再用氨水调整pH 6.0;然后按照热凝胶酶=(1020)(12)的质量比例加入-葡聚糖酶,37下 水解5-24小时; 所述的先酶解再酸解方法,其反应体系是:热凝胶溶于0.01M Ba(OH) 2 溶液中,12公 斤的热凝胶溶解于8L该Ba(OH) 2 溶液,搅拌直至热凝胶完全溶解,用硫酸调整pH 7.0,按照 热凝胶酶=(1020)(12)的质量比例加入-葡聚糖酶粉,混合均匀;溶液用无 水乙酸调至pH 6.0,在37条件下水解2-24小时;然后。

9、再用0.1M三氟乙酸调整溶液 pH 25,60下水解1-16小时; 说 明 书CN 102660607 A 2/3页 4 (2)将所得寡糖溶液用超滤膜进行分离和浓缩:选用截留分子量为15000Da的中空卷 式膜来进行分离,操作压为0.5MPa,按照15的体积比来进行超滤,用pH 6.0、5倍于所得 寡糖溶液体积的水溶液推动寡糖溶液过膜,超滤时间为25分钟;截留液继续用于酶解或酸 解;对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作压为0.5MPa,超滤 时间为25分钟;截留的浓缩液经过干燥后即得聚合度为4-15的-1,3葡聚寡糖产品。 0005 -1,3葡聚寡糖的制备工艺。 0。

10、006 采用先酶解再酸解,或先酸解再酶解的方法来制备-葡聚寡糖。 0007 路线一: 热凝胶溶于0.1M 三氟乙酸溶液中,60水解8-24小时,氨水调pH 6.0,加-葡聚糖 酶,37水解5-24小时。将水解液用超滤膜进行分离浓缩,即可获得产品。 0008 路线二: 热凝胶溶于Ba(OH) 2 溶液中,硫酸调pH 7.0,加-葡聚糖酶,用无水乙酸调pH 6.0, 37水解2-24小时,用三氟乙酸调pH 25,60水解1-16小时。将水解液用超滤膜进行 分离浓缩,即可获得产品。 0009 -1,3葡聚寡糖的聚合度监控分析 取10L水解液,用HPLC-ELSD 系统进行分析,柱子采用Click m。

11、ail柱,流动相为含有 0.5mM KH 2 PO 4 的80%乙腈作为流动相,流速为1mL/min。确定4-15DP聚合度的-1,3葡 聚寡糖所对应色谱峰,并根据色谱峰面积计算水解靶标产物的得率。 0010 热凝胶产品由上海福乐贸易有限公司提供,热凝胶水解使用的-葡聚糖酶由宁 夏夏盛实业公司提供。 0011 本发明的有益效果:其一,由于采用温和的酶解和酸解混合法来进行热凝胶 的寡聚化,使得酶解反应便于控制,同时由于采用较低温度的水解条件使得在不破坏 -1,3-葡聚寡糖的结构的条件下,能耗得以节约;其二,由于采用酸解与酶解和膜分离浓 缩技术,使得整个生产工艺不产生环境污染,低能耗,低成本。 附。

12、图说明 0012 图1-1,3葡聚寡糖的制备流程示意图。 具体实施方式 0013 本发明由以下的实施例进一步说明。这些实施例只是为了说明目的,而不是用来 限制本发明的范围。 0014 实施例1:热凝胶先酸解再酶解 取1020公斤的热凝胶溶解于80L、0.1M 三氟乙酸溶液中,60下水解处理8-24小 时,加入氨水调整pH 6.0,然后按照热凝胶酶=(1020)(12)的重量比例加入 -葡聚糖酶粉,37下水解5-24小时。 0015 实施例2:热凝胶先酶解再酸解 取1020公斤的热凝胶置于100、80L的0.01M 的Ba(OH) 2 溶液中,并进行搅拌直 至热凝胶完全溶解后,用硫酸调整pH 7。

13、.0后加入12公斤-葡聚糖酶粉,混合均匀。溶 液用无水乙酸调至pH 6.0,在37条件下水解2-24小时。然后再用三氟乙酸(0.1M)调整 说 明 书CN 102660607 A 3/3页 5 溶液 pH 25,60下水解1-16小时。 0016 实施例3:-1,3葡聚寡糖的提取 选用截留分子量为15000Da的中空卷式膜分离方法来进行分离,操作压为0.5MPa,按 照15的体积比来进行超滤,用pH6.0、5倍于实施例1或实施例2所得的水解后寡糖溶 液体积的水溶液推动反应混合液过膜,超滤时间为25分钟。截留液继续用于酶解或酸解。 对透过液的浓缩则采用截留分子量为1000Da的截留膜来进行,操作。

14、压为0.5MPa,超滤时间 为25分钟。截留的浓缩液经过干燥后即为聚合度为4-15的-1,3葡聚寡糖产品,产品得 率为70%。 0017 实施例4:-1,3葡聚寡糖植物抗病疫苗在农作物抗真菌病害中的应用 将-1,3葡聚寡糖(聚合度在4-15)溶解于水,调整浓度为1 -10,在农作物早苗 出土3周龄时,开始用喷雾器喷洒。以后每隔40天喷洒一次,结实后停止喷洒。根据参照 对比,-1 ,3葡聚寡糖对小麦赤霉病防效达60,棉花黄萎病防效达80,大豆花叶病防 效达71,对辣椒病毒病防效达75,番茄晚疫病防效达70,白菜软腐病防效达85,苹 果黑星病防效达57,木瓜花叶病防效达96。 说 明 书CN 102660607 A 1/1页 6 图1 说 明 书 附 图CN 102660607 A 。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 化学;冶金 > 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1