不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及不结球白菜的叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
叶绿素是光合作用中捕获光的主要成分，在植物生长发育后期、叶片衰老或果实成熟时，叶绿素被大规模降解。叶绿素降解对叶片衰老过程中蛋白质氮的循环再利用具有重要意义（Hortensteiner S,Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77,2006）；同时叶绿素降解是衰老叶肉细胞的一种解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409, 1996)。最新的叶绿素降解途径为：叶绿素首先脱去镁离子，生成脱镁叶绿素（pheophytin），然后脱镁叶绿素在PPH（Pheophytin Pheophorbide Hydrolase）[Silvia Schelbert，et al. The Plant Cell,21: 767–785,2009]，又称CRN1（Co-regulated with NYE1）[Ren G,et al.Journal of Integrative Plant Biology,52(5):496-504,2010]的作用下被脱去植醇形成脱镁叶绿酸(Phaeophorbide a,Pheide)。脱镁叶绿酸是叶绿素降解中最后的绿色色素，它的卟啉大环在脱镁叶绿酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO) 和红色叶绿素降解物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR) 的作用下经过两步反应被氧化开环。由于卟啉环裂解与叶片色素(绿色) 丧失有关，因此这一步是叶片衰老时叶色黄化的关键步骤。该氧化过程的中间产物是红色叶绿素代谢产物（RCC），最终产物是原初荧光叶绿素降解产物（primer fluorescent Chl catabolite, pFCC），它是有荧光的四吡咯线性分子。然后pFCC被运出叶绿体，其C（82）位被羟基化并运送入液泡。在液泡里因为pH值偏酸性，修饰过的FCCs的D环和γ次甲基桥上发生非酶催化的异构，最后生成叶绿素最终代谢产物：非荧光叶绿素代谢产物（non- fluorescent Chl catabolite,NCCs）。叶绿素降解途径中的许多酶都已经被发现。
通过突变体（nye1-1）筛选和图位克隆，本实验室在国际上率先分离鉴定出了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1（At4g22920,GenBank accession number :DQ437531）(Ren et al. Plant Physiol,2007, 144: 1429-1441.)。拟南芥滞绿突变体nye1-1，在黑暗处理6天后，还保持了50%的叶绿素含量，与此同时处理的野生型植株仅含有不到10%的叶绿素，然而在nye1-1中光合作用和衰老相关的过程均未受到明显影响，因此滞绿突变体nye1-1属于滞绿突变体类型中的C型即非功能性的滞绿突变体。过量表达AtNYE1可导致植株叶片黄化, 甚至出现白化苗。AtNYE1受各种衰老信号诱导，编码一个新的叶绿体蛋白。
NYE1在植物中高度保守，在其它植物物种也鉴定出了AtNYE1的同源基因，这些基因的突变体植株在衰老时均具有叶片或子叶滞绿的特征，统称为衰老诱导的叶绿体滞绿相关蛋白基因（Senescence-inducible chloroplast stay-green protein, SGR）。如草地羊茅（Festuca pratensis）sid/Bf993 (Armstead et al., New Phytologist , 172: 592-597,2006)，水稻（Oryza sativa）sgr (Jiang et al. Plant J , 52:197-209., 2007; Park et al. Plant Cell, 19: 1649-1664, 2007)，辣椒（Capsicum annuum）cl (Barry et al., Plant Physiology , 147: 179-187 2008)，豌豆（Pisum sativum）JI2775 (Armstead et al., Science, 315: 73-73 2007)，西红柿（Solanum lycopersicon）gf [(Barry et al., Plant Physiology , 147: 179-187 2008)]等。
不结球白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis)原产中国，是我们南方人民十分喜爱的蔬菜，为人们提供每天健康所需的植物性蛋白、维生素、膳食纤维、可溶性糖及微量元素等营养物质，是不可多得的健康食物来源。由于不结球白菜的食用部分多为鲜嫩叶片，从植物体上采摘后极易失绿变黄，常常导致不结球白菜在采后运输、贮藏、货架销售过程中的可食用性生物量的损失。伴随着叶绿素的降解，叶片中的营养物质如维生素C等也快速流失，同时亚硝酸铵等有毒物质含量也随之增加。
延缓不结球白菜中叶绿素降解，使叶片保持更长久的绿色，对于延长不结球白菜货架期具有重要的意义。长期以来，不结球白菜新品种的培育基本上都是依靠传统育种方法。虽然许多性状已经得到长足改进，但其局限性也日益明显。遗传工程在改良不结球白菜性状方面已显示出了难以比拟的优越性。
发明内容
本发明的目的是提供一种不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白，是具有SEQ ID NO. 2所示 氨基酸残基序列的蛋白质。
不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白的编码基因，是下列核苷酸之一。
1）SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
2）编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸。
SEQ ID NO.1由963个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第12位至818位碱基；SEQ ID NO.2由268个氨基酸残基组成。
本发明还包括含有本发明基因的表达载体和细胞系。
本发明还包括上述基因在不结球白菜滞绿研究中的应用，以及在植物叶绿素降解途径中中的应用。
附图说明
图1为中间片断扩增产物凝胶电泳图谱。
图2为3’端扩增产物凝胶电泳图谱。
图3为5’端扩增产物凝胶电泳图谱。
图4为基因全长凝胶电泳图谱。
图5为不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白BcNYE1与其他植物叶绿素降解调控相关蛋白NYE同源性分析。
图6为不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白BcNYE1与其他植物叶绿素降解调控相关蛋白NYE亲缘关系进化树分析。
图7为黑暗处理4天下野生型拟南芥和互补转基因植株离体叶片的表型。
图8为正常生长45天的状态下野生型，滞绿突变体（nye1-1）,互补转基因植株的表型。
具体实施方式
实施例1、不结球白菜叶绿素降解代谢调控相关蛋白编码基因BcNYE1的获得。
1.1 RNA提取
取衰老的不结球白菜叶片材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml ( invitrogen公司 )，混匀后，室温放置15分钟，加0.2ml氯仿:异戊醇（24:1），剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4℃离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH2O水中，贮存于-80℃备用。
1.2 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2μg制备的总RNA，0.5μl Rnase inhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5μl, 2μl的Oligo(dT)18 primer. 65℃,5min,室温放置10min， 13000rpm 简短离心5s。 再依次加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase Inhibitor，2μl 100mM DTT, 2μl dNTP, 1μl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm 短暂离心5秒钟，存放于-20℃待用。
1.3 RT-PCR扩增BcNYE1中间片断
根据以往在其他植物中克隆到的NYE1蛋白基因的保守序列，设计了两条同源兼并引物BRASF（5’-GCAGCCGTTGA(C/T)GA (C/G)AAGAAGCATCC-3’)和BRASR (5’-GGCC(A/T)CCGCT(A/T)ATGTG(A/G)CAATGAAC-3’)（SEQ ID NO.3）作为PCR反应的引物。PCR 反应体系为50μl，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，63℃复性45s，72℃延伸45s，循环35次。72℃充分延伸10min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约214bp的片断。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD-19-T载体后，由上海英骏公司测序，获得BcNYE1的中间序列。
1.4 BcNYE1全序列的获得
1.4.1 BcNYE1的3’末端序列的扩增
BcNYE1的3’末端序列扩增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE试剂盒。根据已经获得的保守序列设计了一个特异性引物进行PCR反应。
BcNYE1 3’RACE F：5’-GGCGA ATGTC(C/G/T)CTTCA(C/T)GTTCATTG-3’
反应条件为：95℃预变性5min后进行35个循环，每个循环为95℃变性30sec, 55℃退火 45sec, 72℃延伸 45sec, 最后在72℃延伸 10min。将所得的PCR产物经1％电泳检测，获得约575bp的片段，割胶回收并克隆至克隆载体进行测序，获得BcNYE1的3’末端序列。
1.5 5’RACE 法扩增BcNYE1的末端序列
按照Takara 5’ FULL-RACE（Code：D6122）方法自行合成以下5个引物：
BcNYE1 5’末端P标记反转录引物：5’-(P)CTGAGTCCCAGAGTA-3’
（SEQ ID NO.4）
1st PCR A1: 5’-GCAGTTGTTGTTTCCCACC-3’
1st PCR S1: 5’-TGCTTCTTGCAACTCAGGAT-3’ （SEQ ID NO.5）
2nd PCR A2: 5’-GGTCCCATAGTCTTAGCAACG-3’
2nd PCR S2: 5’-TTGCGAAGAGATCTAAAAGG AA-3’ （SEQ ID NO.6）
按照Takara5’ FULL-RACE（Code：D6122）方法，依次经过 cDNA第一链的合成，Hybrid RNA的分解，连接反应（单链cDNA环化或形成首尾连接物），以及两轮PCR 反应，再经琼脂糖凝胶电泳分离获得503bp的PCR片断。最后经割胶回收，克隆至克隆载体，测序，最终获得BcNYE1的5’末端序列。
第一轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃复性60s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。
第二轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃复性60s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。
根据已经获得的BcNYE13’和5’末端序列以及中间序列拼接获得了BcNYE1的全长序列。
实施例2：不结球白菜叶绿素降解调控相关蛋白功能分析。
2.1序列比较分析
用Genedoc软件分析了BcNYE1与其他物种的同源性。分析结果表明BcNYE1与其他物种的NYE1蛋白具有极大的同源性。SbSGR (高粱，AAW82958), ZmSGR1 (玉米，NP_001105770), ZmSGR2 (玉米，NP_001105771), OsSGR (水稻，EAZ09856), HvSGR (大麦，AAW82955), AtNYE1 (拟南芥，NP_567673), AtNYE2 (拟南芥，ABD77556), LeSGR1 (番茄，AAY98500), GmSGR1 (大豆AAW82959), PsSGR (豌豆，BAF76352)。
为了分析BcNYE1同其他物种NYE蛋白的亲缘关系，使用MEGA软件建立了BcNYE1同其他物种NYE蛋白的系统进化树。结果表明BcNYE1同AtNYE1的亲缘关系最近。进化树中各物种NYE蛋白的序列登录号分别为：AtNYE1/At4g22920 (拟南芥Arabidopsis,DQ437531);AtNYE2/At4g11910(拟南芥，Arabidopsis, NM_117261.5); LeSGR/SlSGR1 (番茄，Tomato,AY850152);GmSGR1 (大豆，Soybean,AY850141); GmSGR2 (大豆，Soybean,AY850142); ZjSGR1 (结缕草，Zoysia,AY850154.1); HvSGR1 (大麦，H.vulgare,AY850135.1) ;OsSGR1 (水稻，Rice,AY850134.1); ZmSGR1 (玉米，Maize,AY850138.1); ZmSGR2 (玉米，Maize, AY850139.1); SbSGR1 (高粱，S.bicolor,AY850140.1)。
2.2 BcNYE1基因功能分析
2.2.1互补拟南芥nye1-1载体构建
利用引物AtNYE1PF和 AtNYE1PR扩增出拟南芥AtNYE1的启动子，并克隆至pMD19-T vector(Takara)，测序无误之后。使用EcoRI和SacI双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pCHF3载体上。命名为PAtNYE1- pCHF3
利用引物BcNYE1F 和BcNYE1R 扩增出BcNYE1的cDNA，并克隆至pMD19-T vector(Takara)，测序无误之后。使用BamHI和SalI双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的PAtNYE1- pCHF3载体上，获得互补载体，命名为PAtNAP-BcNYE1-pCHF3。
AtNYE1PF：5' CTGGAATTCAAATCCCTACATA 3'
AtNYE1PR：5' CTCTGAGCTCTTGAAACCCA 3' （SEQ ID NO.7）
BcNYE1F：5' ATAGGATCCATGTGTAGTTTGTCGGCGA 3'
BcNYE1R：5' GCGTCGACTCAATAGAGTTTCTCTGGACTAGG 3' （SEQ ID NO.8）。
2.2.2农杆菌转化。
2.2.2.1 LBA4404农杆菌感受态细胞制备
1) 在含利福霉素40μg/ml, 链霉素100μg/ml 的YEB固体培养基上划线， 28℃培养48h-72h；
2) 挑单菌落到含利福霉素40μg/ml, 链霉素100μg/ml 的YEB液体培养基中28℃培养至OD600 0.5；
3) 冰上冷却菌液，5000rpm, 4℃ 10分钟收集菌体；
4) 1mM Hepes pH 7.0洗涤3次，再用10％甘油洗涤一次；
5) 悬浮菌体于3ml 10％甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40μl。
2.2.2农杆菌转化
1）200ng质粒DNA，加40μl农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化；
U 1.8 KV
R 200 W
C 25 uF
2）电击后添加800μl SOC液体培养基，28℃ 培养1h；
3) 4000rpm， 10分钟收集菌体，悬浮于200μl SOC中，涂在含100 μg/ml壮观霉素，利福平40μg/ml, 链霉素100μg/ml LB固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。
2.2.3农杆菌介导的拟南芥转化。
2.2.3.1 拟南芥基质培养：
基质组分：蛭石：黑土：珍珠岩 9 : 3 : 0.5
营养液组分：
基质浸透营养液后，将种子播于钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。拟南芥生长到抽苔开花即可供转化。
2.2.3.2农杆菌准备
1) 接种携带目的表达载体的农杆菌到含适量抗生素的YEB培养基中，28℃，220rpm摇菌培养至OD600 1.2。
2) 5000rpm, 4℃ 10分钟离心收集菌体。
3) 菌体重新悬浮于5％的蔗糖溶液中，并调至OD600 0.8。
4）加入Silwet L-77至终浓度为0.03%。
2.2.3.3拟南芥转化
取拟南芥材料，倒置浸泡地上部分于预备好的农杆菌溶液中，晃动约3秒，取出，放置到荫蔽条件下，保湿24h，转入正常条件培养。
2.2.3.4拟南芥转化子筛选
收集转化后拟南芥的种子。种子用0.01% HgCl2 表面灭菌8分钟，无菌水冲洗4次，悬浮在0.1 %的琼脂糖中，然后按每平板（直径15cm）2000粒种子（约40mg），铺在卡那霉素50mg/L, 1/2MS培养基上。将平板置于4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。约10天左右可筛选出具卡那霉素抗性的转基因植株。将具抗性的植株转移到基质培养，并收获T2代种子。
2.2.4 BcNYE1互补拟南芥nye1-1转基因植株表型鉴定
收获的T3代纯合转基因植株种子经表面灭菌后铺在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上，4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下培养。25天后取第六片叶片，放在铺有湿润滤纸的培养皿上，并用保鲜膜覆盖培养皿，在黑暗中培养4天。野生型及突变体（nye1-1）的第六片叶片作为对照。结果表明，BcNYE1能够互补nye1-1突变体叶片衰老滞后的表型，黑暗处理4天后，各转基因植株离体叶片均有不同程度的黄化，大部分株系叶片黄化程度接近野生型拟南芥。
同时在正常生长状态下，观察互补转基因株系，野生型以及拟南芥滞绿突变体的表型。结果表明BcNYE1能够互补nye1-1突变体叶片衰老滞后的表型。
<110> 复旦大学
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<400> 1
ggagagtaga gatgtgtagt ttgtcggcga gtctgctgtt accaacaaag ctggaaccag 60
cttattccga caaccgaagt aacagcaaca gctcactctt tctcgccaat agaagacgac 120
ccaagaggaa gaaccaatca attgttccca tggcaagatt gtttggaccg gctattttcg 180
aatcatccaa gttgaaagta ttgtttctag gagttgacga gaagaagcat ccattaacgc 240
ttccaagaac ttacaccctc actcacagtg acattactgc taaattaact ttagctattt 300
cgaattccat taacaactct cagttgcaag gatgggcaaa taggctatac cgagatgaag 360
tggtagcaga gtggaagaaa gtgaaaggga agatgtcgct tcacgtccat tgtcacataa 420
gcggtggcca tttcctttta gatctcttcg caaagtttag atattacatc ttctgcaaag 480
aacttccagt ggtgttgaag gcttttgtgc atggagatgt gaacttgttg aaccaccatc 540
ctgagttgca agaagcactt gtttatgttt atttccactc caatgtcaat gagttcaaca 600
gagtcgagtg ttggggtccg ctttgggaag ctacttctcc tgatggtcac cggactcaaa 660
ctctccctga gaaacagtgc gtggatgaat gcagttgttg tttcccaccg gttagctcga 720
ttccatggtc ccatagtctt agcaacgaag gtgttgatag ctactctggg actcagggag 780
agggaatgtc tactcctagt ccagagaaac tctattgatt ttaaccaatg tatacaactt 840
tgttaaaaac ctttttggtg gatctaatat aggttttggt ttggtgtaac atattaatgt 900
gtataggaaa aataatgaaa tgtgttatgt acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaa 963
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<212> PRT
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Met Cys Ser Leu Ser Ala Ser Leu Leu Leu Pro Thr Lys Leu Glu Pro
1 5 10 15
Ala Tyr Ser Asp Asn Arg Ser Asn Ser Asn Ser Ser Leu Phe Leu Ala
20 25 30
Asn Arg Arg Arg Pro Lys Arg Lys Asn Gln Ser Ile Val Pro Met Ala
35 40 45
Arg Leu Phe Gly Pro Ala Ile Phe Glu Ser Ser Lys Leu Lys Val Leu
50 55 60
Phe Leu Gly Val Asp Glu Lys Lys His Pro Leu Thr Leu Pro Arg Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Leu Thr His Ser Asp Ile Thr Ala Lys Leu Thr Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Asn Ser Ile Asn Asn Ser Gln Leu Gln Gly Trp Ala Asn Arg Leu
100 105 110
Tyr Arg Asp Glu Val Val Ala Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Lys Met
115 120 125
Ser Leu His Val His Cys His Ile Ser Gly Gly His Phe Leu Leu Asp
130 135 140
Leu Phe Ala Lys Phe Arg Tyr Tyr Ile Phe Cys Lys Glu Leu Pro Val
145 150 155 160
Val Leu Lys Ala Phe Val His Gly Asp Val Asn Leu Leu Asn His His
165 170 175
Pro Glu Leu Gln Glu Ala Leu Val Tyr Val Tyr Phe His Ser Asn Val
180 185 190
Asn Glu Phe Asn Arg Val Glu Cys Trp Gly Pro Leu Trp Glu Ala Thr
195 200 205
Ser Pro Asp Gly His Arg Thr Gln Thr Leu Pro Glu Lys Gln Cys Val
210 215 220
Asp Glu Cys Ser Cys Cys Phe Pro Pro Val Ser Ser Ile Pro Trp Ser
225 230 235 240
His Ser Leu Ser Asn Glu Gly Val Asp Ser Tyr Ser Gly Thr Gln Gly
245 250 255
Glu Gly Met Ser Thr Pro Ser Pro Glu Lys Leu Tyr
260 265
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ataggatcca tgtgtagttt gtcggcgagc gtcgactcaa tagagtttct ctggactagg 60