提供作物广谱病毒抗性的包含木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的基因转移载体及其应用技术领域
本发明涉及一种用于提供植物对于病毒的抗性的重组载体，其包含木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因(Papaya ringspot virus helper-componentprotease gene，PRSV HC-Pro gene)的编码序列片段。本发明也涉及一种重组微生物。本发明也涉及一种用于使植物对病毒具有抗性的方法。本发明也涉及辅助组分蛋白酶的全长基因或其基因片段用于制造对病毒具有抗性的植物的用途。
背景技术
木瓜(Carica papaya L.)为具有高度经济价值的作物，其病毒病害并无药剂可以治疗，近年来由于植物组织培养技术的提高，植物转基因技术的突破，加上病原诱导抗性理论(pathogen-derived resistance，PDR)(Sanford andJohnson 1985)的启示，将病毒基因组的一部分转移至宿主植物染色体内，已达到抗病毒感染的目的，已成为目前热门的方法。Fitch等人(Fitch et al.，1992)首先将PRSV夏威夷分离株的CP基因以微粒轰击(microprojectilebombardment)的方式转入木瓜中，但他们的转基因木瓜对于台湾系统的PRSV永康分离株(YK isolate)不具抗性，其依赖序列同源性的抗性成为此转基因木瓜在其他地区应用的限制因素。
申请人以前将台湾PRSV YK分离株的外壳蛋白(coat protein，CP)基因以农杆菌(Agrobacterium sp.)转移方式获得转基因木瓜株系(Cheng，1996)，经攻击接种、分析后，证明这些转基因木瓜株系除了对台湾PRSVYK具有良好抗性外，对其他不同地区较疏远的PRSV病毒如夏威夷(HA)、墨西哥(MX)及泰国(TH)分离株也均有良好的抗性(Bau et al.，2003)。显示YK的外壳蛋白转基因木瓜对于PRSV提供很高程度的抗性(Bau et al.2004)。现有技术借助对外壳蛋白转基因木瓜的应用，虽然可得到抗病的转基因植物，其抗性原理为转移的CP基因激发木瓜防御反应作用的转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，使得木瓜产生分解入侵的PRSVRNA基因组的能力，而具有病毒抗性。但此原理有序列同源性专一性问题， 对于CP基因较疏远的PRSV不具抗性，这种病毒株系专一性抗性的缺点仍是普遍存在的问题(Tennant et al.2001)，因此由不同株系病毒的外壳蛋白转基因植物仅具有区域性的应用价值。
申请人的研究团队利用农杆菌介导(Agrobacterium-mediated)的手段，将台湾PRSV YK系统的外壳蛋白基因导入木瓜未成熟胚中(Cheng et al.1996)，得到对PRSV具不同程度抗性的株系，并且筛选出数个株系除了对本土的YK系统具良好抗性外，还对源自于夏威夷(HA)、泰国(TH)及墨西哥(MX)等不同地域的病毒均有良好的抗性(Bau et al.2003)。所得到的PRSVYK系统的外壳蛋白转基因木瓜株系经田间试验证实对于PRSV提供很高程度的抗性(Bau et al.2004)。
申请人于PRSV YK系统的外壳蛋白转基因木瓜的田间试验期间发现，结果发现PRSV YK外壳蛋白转基因木瓜会被超强的木瓜环斑病毒株击垮，而探讨其可击垮由外壳蛋白基因介导的抗性的原因为病毒蛋白辅助组分蛋白酶(helper-component protease，HC-Pro)造成。HC-Pro为基因沉默阻抑物(suppressor)，其具有抑制转录后基因沉默作用的能力(Anadalakshmi et al.，1998；Brigneti et al.，1998；Shi et al.，1997)，申请人推测PRSV 5-19的HC-Pro的抑制基因沉默的能力超强，可使得PRSV YK CP转基因木瓜的基因沉默机制被5-19HC-Pro所抑制，而无法发挥作用，从而使得转基因木瓜的抗性被抑制而失效。基于单独以外壳蛋白基因来提供抗性已不足以对付超强病毒株系(super virus strain)的事实，本技术领域特发展出对付超强病毒的新的转基因策略。
发明内容
有鉴于现有技术的外壳蛋白转基因植物对病毒的抗性为同源性依赖的抗性(homology-dependent resistance)，因为此抗性会被携有超强基因沉默抑制物HC-Pro的超强病毒株系击垮的问题尚未解决，本发明的目的在于提供一种基因转移载体及其应用，以木瓜环斑病毒辅助组分蛋白(HC-Pro)为靶基因，利用非翻译性构建策略将HC-Pro基因构建于二元载体，所产生的转基因植物可激发针对基因沉默抑制物HC-Pro基因的转录后沉默作用(PTGS)，将病毒保护自己对抗宿主防御反应的最重要基因瓦解，如此产生的转基因植物会具有广谱抗病毒株系的特性，也就是具有能够抵抗不同地理区域、不同系统的病毒的能力，并可解决田间超强PRSV病毒株击垮外壳蛋白转基因木瓜应用的问题。
发明简述
为了达到上述目的，在一方面，本发明提供了一种用于提供植物对病毒的抗性的重组载体，其包含控制序列以及与该控制序列可操纵连接的木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段。
另一方面，本发明提供了一种重组微生物，其是用如前所述的重组载体转化微生物所制得的。
又一方面，本发明提供了一种用于使植物对病毒具有抗性的方法，其包含下列步骤：将如前所述的重组载体转移至植物内，以令该植物以非翻译性表达该重组载体的木瓜环斑病毒的辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段的转录物，但不表达辅助组分蛋白酶，借助RNA介导产生的转录后基因沉默作用(PTGS)使该植物产生对于病毒的抗性。
又一方面，本发明提供了一种植物细胞，其基因组中插入了选自于下列组中的核酸分子：具有与SEQ ID NO：5具有85％以上同源性的核酸序列、与SEQ ID NO：6具有85％以上同源性的核酸序列以及SEQ ID NO：7所示序列具有85％以上同源性的核酸序列。
再一方面，本发明提供了一种木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶的全长基因或其基因片段用于制造对病毒具有抗性的植物的用途。
基于上述内容，本发明是以HC-Pro基因为靶基因来攻击病毒HC-Pro基因的策略，提供植物对于不同株系病毒的广谱抗性，解决非依赖同源性抗性的问题，从而使产生的转基因植物具有跨地理区域性的应用价值。
实施方案
发明的详细说明
本发明的用于提供植物对于病毒的抗性的重组载体，其包含控制序列以及与该控制序列可操纵连接的木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段。
依据本发明，木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶为基因沉默阻抑物，其具有抑制转录后基因沉默的能力(Anadalakshmi et al.，1998；Brigneti et al.，1998；Shi et al.，1997)。
依据本发明，该木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段可以任何方法将该编码序列片段构建于质粒中使其不表达蛋白质，例如但不限于：使该编码序列片段位于该控制序列下游，且该木瓜环斑病毒辅助组 分蛋白酶基因的编码序列片段的5’端为具有至少一个终止密码子；优选具有多个终止密码子；更优选具有两个连续的终止密码子。
依据本发明，木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段具有如SEQ ID NO：8所示序列。
依据本发明，如此处使用的术语“可操纵连接”意指基因的表达是由空间上相连接的控制序列所控制。所述的控制序列可以位于该基因的5’端(上游)或3’端(下游)而使该基因受所述的控制序列所控制。如本领域技术人员所知，该距离可以在不影响控制序列功能的条件下作适当的调整。依据本发明，所述的“编码序列”意指基因中会被转录成信使RNA(mRNA)且会被翻译成蛋白质的区域，因此所述的“编码序列片段”意指前述区域的全长或片段。
依据本发明，如本文所使用的术语“同源性”在本文中定义为两个序列之间相关联的程度，其可以序列间相同的比率来决定。
术语“控制序列”如本文所使用，指一种能使基因或其片段启动或关闭，从而影响该基因或其片段的表达的序列；例如该控制序列可为启动子或终止子。
依据本发明，其中该控制序列可以是任何适用于本发明的转基因HC-Pro表达的启动子，例如但不限于：35S启动子。该控制序列可以是任何于植物中表达的启动子，例如但不限于：来自花椰菜花叶病毒35S启动子(Cauliflower mosaic virus 35S promoter，CaMV 35S promoter)。
依据本发明，该编码序列片段可以以任何可造成该编码序列片段不表达蛋白质的方法进行修饰，优选但不限于：在其5’端插入有至少一个终止密码子或含有读框移位。
依据本发明，该编码序列片段优选具有选自于由下列所构成的组：(i)与SEQ ID NO：5所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列；(ii)与SEQID NO：6所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列；以及(iii)与SEQID NO：7所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列。
依据本发明，前述的重组载体除了上述控制序列外，还含有抗药性基因，该抗药性基因为任何抗生素基因或筛选性基因，例如但不限于：npt II基因的卡那霉素的抗药性基因。
依据本发明，所述的重组载体可由任何二元载体(binary vector)借助基因工程技术插入木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段而得，该二元载体包括在任何植物中会表达的启动子或终止子，例如但不限于： pBI121及其衍生的载体。如本领域技术人员所知，该二元载体为一种被用于产生转基因植物的克隆载体，其具有可以于大肠杆菌(Escherichia coli)以及根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中复制的能力，其具有CaMV 35S启动子及Nos终止子，该编码序列片段优选位于该二元载体的CaMV 35S启动子及Nos终止子之间。
在本发明的重组载体的一个优选的具体实例中，该用于提供植物对病毒的抗性的重组载体为pBI-519HCF，其以转移于宿主的形式保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2010112。
在本发明的该重组载体的另一优选的具体实例中，用于提供植物对于病毒的抗性的重组载体为pBI-519HCN或pBI-519HCC，其可以以pBI-519HCF为模板以基因工程技术如使用引物对519HCStopA(SEQ IDNO：1)与519HCSacA(SEQ ID NO：3)；或引物对519HCStopB(SEQ ID NO：4)与519HCSacB(SEQ ID NO：2)，借助聚合酶链反应以及一般克隆技术而得；或者以pBI-519HCF为基础利用限制酶酶切以及克隆而得。
本发明的一种重组微生物，其是用如前所述的重组载体转化微生物所制得，其中该微生物优选为细菌，以及更优选为去毒的根瘤农杆菌(disarmedAgrobacterium tumefaciens)。
依据本发明，所述去毒的根瘤农杆菌意指具有转移能力基因(vir genes)及T-DNA，但不具有农杆菌的致癌基因(oncogenes)的根瘤农杆菌。
本发明的一种用于使植物对病毒具有抗性的方法，其包含下列步骤：将如前所述的重组载体转移至植物内，以使该植物非翻译性表达该重组载体的木瓜环斑病毒的辅助组分蛋白酶基因的编码序列片段的转录物，但不表达辅助组分蛋白酶，从而使该植物产生对于病毒的抗性。
依据本发明，如此处所使用的术语“导入”以及“转移”交替地被使用，意指将核苷酸片段、载体及其类似物以各种任何已知的转移技术导入组织细胞中。
依据本发明，所述的将如前所述的重组载体转移至植物内的步骤，如本领域技术人员所知，可借助例如但不限于：农杆菌、微粒轰击、电穿孔法、微注射法以及超声波法。
依据本发明，所述的“非翻译性表达”意指利用任何手段使基因表达仅止于基因翻译阶段前，即没有表达完整蛋白质，因此所述的手段包括使该编码序列片段为读框移位以及插入终止密码子，其只会产生转基因的转录物但不产生转基因的蛋白，但转录物会因“转录后基因沉默作用”而分解成 小干挠RNA(small-interfering RNA，siRNA)，因此所得的具有病毒抗性的株系测不到转基因的转录物，但有大量小片段siRNA产生。
依据本发明，所述的植物是源自于选自下列所构成的组的植物：葫芦科(Cucurbitaceae)以及番木瓜科(Caricaceae)植物。优选所述的植物是源自于木瓜(Caricapapaya L.)，包括其根、茎、叶部以及胚。
依据本发明，将如前所述的重组载体转移至植物内的步骤包括：将该重组载体导入农杆菌中，以获得重组农杆菌；以及以该重组农杆菌转染至该植物，以获得带有该编码序列片段的植物。
本发明的一种木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的全长或其基因片段用于制造对病毒具有抗性的植物的用途。
优选所述的全长基因具有如SEQ ID NO：8所示序列。更优选所述的全长基因或其基因片段为选自于具有由下列所构成的组的核苷酸序列：(i)与SEQ ID NO：5所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列；(ii)与SEQ IDNO：6所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列；以及(iii)与SEQ IDNO：7所示序列具有85％以上的同源性的核苷酸序列。
优选本发明的用途包括将含有该木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶的全长基因或其基因片段的非翻译性构建体导入植物。
依据本发明，所述的非翻译性构建体衍生自于将该木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶的全长基因或其基因片段克隆至该表达载体内，但其不表达木瓜环斑病毒辅助组分蛋白。非翻译性构建体可能借助RNA的表达，而利用植物本身基因沉默的机制，以达到抑制与木瓜环斑病毒具有实质性相同的辅助组分蛋白的病毒的目的。
所述的非翻译性构建体优选是插入有终止密码子以及含有读框移位的木瓜环斑病毒辅助组分蛋白的全长基因或其基因片段的二元载体。
本发明的一种重组植物细胞，其基因组中插入有选自于下列组中的核酸分子：具有与SEQ ID NO：5所示序列具有85％以上同源性的核酸序列、SEQ ID NO：6所示序列具有85％以上同源性的核酸序列以及SEQ ID NO：7所示序列具有85％以上同源性的核酸序列的核酸分子；更优选其基因组中插入有选自于下列组中的核酸分子：具有与SEQ ID NO：5所示序列具有90％以上同源性的核酸序列、与SEQ ID NO：6所示序列具有90％以上同源性的核酸序列以及与SEQ ID NO：7所示序列具有90％以上同源性的核酸序列的核酸分子。
优选该重组植物细胞是通过将如前所述的重组载体或如前所述的重组 微生物转化植物细胞所制得。更优选该植物细胞源自于植物愈伤组织及体细胞胚。
附图简述
图1为PRSV 5-19的辅助组分蛋白HC-Pro的全长及部分基因以非翻译方式构建成pBI-519HCF，pBI-519HCN及pBI-519HCC的简易图谱。
图2为高抗性5-19HC-Pro转基因木瓜品系F3-2-2对PRSV 5-19及PRSV YK抗性情形的比较图。
图3显示以DNA印迹法分析转基因木瓜转基因插入拷贝数的凝胶电泳图。
图4显示以RNA印迹法分析转基因木瓜的转基因转录物(mRNA)及siRNA表达量的凝胶电泳图。
图5A至D显示不同地区PRSV的HC-Pro核酸序列比对图，其中「…」代表其与PRSV 5-19的HC-Pro序列相同区域。
实施例
本发明将进一步借助下面的实施例来作说明，但应了解的是这些实施例仅做为说明的用途，而不应被视为本发明的实施上的限制。
实施例1.辅助组分蛋白HC-Pro基因的非翻译性构建体的制备
PRSV 5-19的HC-Pro基因(SEQ ID NO：8)经RT-PCR扩增后构建于 载体(Invitrogen)，以非翻译性方式构建，设计一组特异性引物：519HCStopA(5′-CGCATGAACATGCTCTAGATGAACGATTGATGAGAAAAATTTCTG-3′)(SEQ ID NO：1)及519HCSacB(5′-GTGGTTGGATCAAAGAGCTCACCGACAATGTAGTGTTTCATTTC-3′)(SEQ ID NO：2)，上游引物(519HCStopA)上设计两个终止密码子(TGATGA)、XbaI酶切位点(TCTAGA)并多加一个碱基(T)使整个蛋白读框移位，下游引物(519HCSacB)设计SacI酶切位点(CTCGAG)，经PCR扩增TOPO载体上的HC-Pro全长基因(1371bp后)多加一个碱基T为1372bp(SEQ ID NO：5)，利用XbaI及SacI限制酶酶切后载入以相同限制酶酶切的pBI121(Clontech，CA)，最后得到非翻译性构建体“pBI-519HCF”，其是以转移于宿主的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010112，如图1所示，含有两个终止密码子(如**标示处)以及一个核苷酸T(粗体字)，所得构建体经测序及限制酶确认无误后备用。
同样设计一对特异性引物，上游引物为：519HCStopA(SEQ ID NO：1)，下游引物为：519HCSacA(5′-TTTGTGGAGAATATGAGCTCACCAATGGCAACCTTTCGAATG-3′)(SEQ ID NO：3)，以PCR扩增HC-Pro基因N端750bp片段(亦为读框移位的非翻译性构建体)，多加一个碱基T为751bp(SEQ ID NO：6)，利用XbaI及SacI限制酶酶切后载入以相同限制酶酶切的pBI121载体，最后得到非翻译性构建体“pBI-519HCN”，如图1所示，(含有两个终止密码子(如**标示处)及一个核苷酸T(粗体)，所得构建体经测序及限制酶确认无误后备用。
同样设计一对特异性引物，上游引物为：519HCStopB(5′-GACAGAAATGGGCTCTAGATGTGGGGTGAATGATGATATCATCGCCAAAAG)(SEQ ID NO：4)，下游引物为：519HCSacB(SEQ ID NO：2)，上游引物(519HCStopB)上设计两个终止密码子(TGATGA)、XbaI酶切位点(TCTAGA)并多加一个碱基(T)使整个蛋白的读框移位，以PCR扩增HC-Pro基因C端750bp片段(亦为读框移位的非翻译性构建体)，多加一个碱基T为751bp(SEQ ID NO：7)，利用XbaI及SacI限制酶酶切后载入以相同的限制酶酶切的pBI121载体，得到非翻译性构建体“pBI-519HCC”(含有两个终止密码子(如**标示处)及一个核苷酸T(粗体字)，所得构建体经测序及限制酶确认无误后备用。
将前述包含PRSV 5-19的HC-Pro全长基因、N端及C端的非翻译性构建体分别以电穿孔方式转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)(Invitrogen)中，所得的转基因后的农杆菌含有非翻译性嵌合体，而可在木瓜转基因中使用。
实施例2.转基因木瓜的制备
为了缩短转移及筛选的时间，利用申请人实验室近年所发展出的一套快速的木瓜转基因方法(Kung et al.，2009)，其利用田间已知优良性状的木瓜，切取其顶芽，在实验室组织培养系统进行木瓜瓶苗繁殖。在含有0.02mg/lα-萘乙酸以及0.2mg/l苄基氨基嘌呤的穆拉许给-史酷格培养基(Murashige-Skoog medium containing 0.02mg/lα-naphthaleneacetic acid and0.2mg/l benzylaminopurine，MSNB)培养两星期后，移至含吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，经28℃暗培养一个星期后诱导根原基发生，此时处于根诱导时期(root induction period)[具植物生长激素依赖性(Auxin dependent)]，再移至含1/2体积的MS的珍珠石中使根发展延长，此时处于根发展时期(Root development period)[与植物生长激素无关(Auxin independent)]，两个星期后，切取其根尖，在含1mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸与0.1mg/l的6-苄基氨基嘌呤的MS固体培养基(Murashige-Skoog medium containing 1mg/l2，4-dichlorophenoxyacetic acid与0.1mg/l benzylaminopurine，MSDB培养基)中诱导愈伤组织及体细胞胚产生。以此方法获得木瓜体细胞胚。
在下列实施例中，以日升品种木瓜不定根发展的体细胞胚当作转基因材料，于无菌水中加入金刚砂经震荡一分钟使体细胞胚产生伤口(Cheng etal.，1996)，加入带有前述不同构建体的转基因农杆菌进行混合后静置5分钟，在含5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2-4D)的培养基中共同培养2天，再以无菌水漂洗农杆菌，将体细胞胚移于含500mg/l羧苄青霉素(carbenicillin)及5mg/l的2-4D的培养基中，经两个星期后再加入50mg/l卡那霉素以筛选转化成功的株系。再经100mg/l卡那霉素筛选两个月后，去除卡那霉素休养一个月，使转化成功的体细胞胚能恢复原有的再生能力。移至含50mg/l卡那霉素的MSNB培养基中使其发芽，取得「拟转基因植株」。
实施例3.聚合酶链反应检测拟转基因植物
提取拟转基因植株的基因组DNA作为模板，并以前述所得的pBI-HCF、pBI-HCN及pBI-HCC构建体做为阳性对照组，使用根据靶基因HC-Pro序列所设计出的特异性引物对，其包括519HCStopA/519HCSacB、519HCStopA/519HCSacA及519HCStopB/519HCSacB引物对，分别对HC-Pro全长基因、N端片段及C端片段进行聚合酶链反应(PCR)扩增。另一方面，以引物对nptII 5’引物5′-CCCCTCGGTATCCAATTAGAG-3′(SEQID NO：9)及nptII 3’引物5′-CTGGAGTTCTTCGCCA-3′(SEQ ID NO：10)扩增nptII基因，并以凝胶电泳分析PCR产物。依据凝胶电泳结果分析，以前述PCR方式扩增出预期片段的为转化成功的植株。结果确认已转入HC-Pro全长基因的有15个株系、转入HC-Pro N片段基因的有31个株系以及转入HC-Pro C片段基因的有14个株系。
实施例4.转基因木瓜温室抗病毒能力的评估
将转化成功的60个株系植株经微体大量繁殖后，进行温室病毒抗性评估试验，同一株系分别以机械接种超强病原性的PRSV 5-19分离株及PRSVYK分离株，接种7个星期后，选出无病征发展且抗性良好的株系，其中转基因木瓜对病毒抗感病反应分为三种：
(1)易感株系(Susceptible lines，S)：接种14天后有严重花叶病征为易感株系。
(2)延迟抗性株系(delayed-type resistant line，DR)：比对照组非转基因木瓜(non-transgenic papaya plants，NT)具有1至2个星期延迟病征者为延迟抗性株系。
(3)高抗性株系(highly resistant line，HR)：在接种28天后无病征发生为高抗性株系。
图2示出前述所得的60个转基因株系中的部分株系分别于温室中接种PRSV 5-19及PRSVYK病毒四星期后的病征发展情形，所述的部分株系包括一高抗株系F3-2-2及一易感株系F3-12-1以及18-2-4(YK-CP转基因株系)及非转基因木瓜(NT)，其中A区显示F3-2-2、F3-12-1、18-2-4(YK-CP转基因株系)及非转基因木瓜(NT)经接种PRSV 5-19病毒株的病征，其中对照组NT具有严重萎蔫型的病征(图2的A区-a列，以下标记为A-a，其余同理类推)，另一对照组PRSV YK-CP转基因植株18-2-4也产生严重花叶型病征(图2的A-b)，而对照组18-2-4接种PRSV YK具有良好抗性(图2的B-b)。
前述所得的60个株系中经评估所得的结果如表一所示，其中有31个转基因株系(包括4个pBI-519HCF转基因株系、20个pBI-519HCN转基因株系以及7个pBI-519HCC转基因株系)产生花叶病征。
该60个株系中，有31个转基因株系对于PRSV 5-19是易感株系(S)，如F3-12-1(如图2的A-c所示)，而该31个株系中有30个株系对PRSV YK易感(S)，因而产生与NT一样花叶型病征(如图2的B-a以及-c所示)，另1个株系N10-3-1对PRSV 5-19为易感株系(S)，但对于PRSV YK具有延迟抗性，为延迟抗性株系(DR)。
该60个株系中，有10个转基因株系对于PRSV 5-19具有抗性，其中7个株系对PRSV YK为延迟抗性株系(DR)，然而另外3个株系对PRSV YK则为高抗性株系(HR)。
该60个株系中，其他19个株系在接种PRSV 5-19及PRSV YK后皆没有病征产生(图2的A-d及图2的B-d)，为高抗性株系(HR)。进一步对前述株系进行接种病毒，接种后7周，共23个品系对PRSV YK均无病征产生，而其中有19个品系同时对5-19也无病征产生。
如表一所示，15个pBI-5-19HCF转基因木瓜株系有7个株系对5-19及YK具高度抗性，抗病比为46.6％，31个pBI-5-19HCN转基因木瓜株系有9个株系对此两种病毒具高度抗性，抗病比为29％，14个pBI-5-19HCN 转基因木瓜株系有3个株系对此两种病毒具高度抗性，抗病比为21.4％，基于上述结果可见，三种构建体均能提供木瓜抗木瓜环斑病毒超强病毒株PRSV 5-19及典型病毒株PRSV YK的抗性。
表一5-19HC-Pro转基因木瓜对PRSV 5-19及PRSV YK的抗性分析
apBI-519HCF、pBI-519HCN及pBI-519HCC三个构建体分别得到15、31、14个株系木瓜，每个株系五棵木瓜植株分别以PRSV 5-19及PRSV YK机械接种，在接种后28天记录结果。
b以非转基因木瓜(NT)及另一PRSV YK外壳蛋白转基因木瓜植株18-2-4(Bau et al.，2003)当作对照组，此株系对于PRSV YK具有高度抗性但对PRSV 5-19易感。
c转基因木瓜株系攻击接种PRSV 5-19或PRSV YK的结果，接种14天后有严重花叶病征为易感株系(susceptible lines，S)，比对照组(NT)具有2个星期延迟病征的为延迟抗性株系(delayed-type line，DR)，而在接种28天后均无病征发生为高抗性株系(highly resistant line，HR)。
d所有对PRSV 5-19具有高度抗性的株系木瓜对于PRSV YK均具有高度抗性。
实施例5.间接酶联免疫吸附测定(ELISA)
以Yeh及Gonsalves的方法(Yeh and Gonsalves，1984)实施间接酶联免疫吸附测定。从每一经PRSV感染的木瓜株系的叶片获取叶部组织，收集接种后42天的材料并以包被缓冲液(coating buffer)(含有0.01％叠氮化钠的50mM碳酸纳缓冲液稀释100倍，并加入ELISA 96孔板，于37℃反应1小时，使抗原附着于板上，并以稀释2000倍的抗PRSV CP的兔多克隆抗血清(Yeh et al.，1984)反应，进行间接酶联免疫吸附测定分析。将碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG(Alkaline Phosphatase-conjugated Goat anti-rabbitimmunoglobulin G，AP-Goat anti-rabbit Ig G)(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD，USA)稀释5000倍后作为第二抗体以检测兔抗体。在加入碱性磷酸酶底物(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO，USA)显色，以酶标仪(SLT LabInstruments，Salzburg，Austria)测量405nm的吸收光谱。将各株系的每一植株，以抗PRSV的CP蛋白的多克隆抗体以ELISA分析。分析结果发现，在高抗性的植株中并无法检测到病毒的CP蛋白，读数与健康植株相同，非转基因木瓜接种PRSV 5-19或YK有两倍以上的读数。
实施例6.DNA印迹法(Southern blotting)分析转基因插入拷贝数
选取对PRSV 5-19及PRSV YK具高抗性的16个转基因木瓜株系，其中包含5个pBI-519HCF株系，9个pBI-519HCN株系以及2个pBI-519HCC株系，并以下列方式进行转基因插入拷贝数的分析。
首先，以DNeasy Plant Mini kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)提取具病毒抗性的转基因木瓜的基因组DNA，以限制酶Ase I酶切后，以0.8％琼脂糖凝胶电泳分离DNA，将凝胶经缓冲液去嘌呤、解旋及酸碱中和，然后将凝胶上DNA转移至Hybond-N+膜(Amersham Phamacia Biotech，UK)，于UV灯下交联5分钟，在60℃预杂交1小时，以519HCStopA/519HCSacB引物对扩增出pBI-519HCF的HC-Pro全长片段。取25ng HC-Pro全长片段，加入以Primer It II random primer labeling kit(Stratagene，Lajolla，CA，USA)制备的α-32P标记的PRSV 5-19HC-Pro基因的特异性探针，于60℃进行杂交反应，经漂洗后，将尼龙薄膜放入含增强隔板的自动显影片夹(HyperscreenTM，Amersham Phamacia Biotech)以X-ray胶片(Hyperfilm MP，Amersham Phamacia Biotech，UK)于-80℃曝光48小时，比较抗性、易感品系转基因插入拷贝数的差异。
结果如图3所示，转基因插入拷贝数(copy No.)标示于图下，其中以非转基因木瓜(NT)作对照组，所测植物中有四株系F2-1-4、F2-1-7、F3-2-2及N11-1具有单一拷贝数转基因插入，其他株系则为两个拷贝数以上的转基因插入。
实施例7.抗木瓜环斑病毒能力分析
将高抗性转基因木瓜植株接种台湾PRSV不同株系(5-19及YK)或其他不同地区的PRSV，包括墨西哥(MX)、泰国(TH)及夏威夷(HA)分离株，经HC-Pro及CP序列比对，筛选出具广谱抗这些病毒的木瓜品系。
参见表二以及图5A至5D所示，这些病毒YK、MX、TH、HA的HC-Pro基因与5-19HC-Pro基因有86.1至96.8％的序列相同性，这些病毒CP基因与5-19CP基因则有89.4至95.9％的序列相同性。所测植物为具有单一转基因插入拷贝数的F2-1-4、F2-7-1、N11-1及F3-2-2，并以NT及18-2-4作为对照组。
在接种病毒14、28及42天后观察其病征发展，结果如表三所示，NT接种不同株病毒于14天全部发病，18-2-4对YK具高度抗性，对其他病毒株系如MX、TH及HA具延迟抗性，但对5-19为易感性；F2-1-4、N11-1 对YK及5-19具良好抗性，对其他病毒株系TH及HA具延迟性抗性，但对MX较为易感；而F3-2-2对所有病毒皆具非常良好的抗性，显示以HC-Pro作为靶基因可以达到对抗超强病毒株且能同时广谱对抗其他木瓜环斑病毒的能力，包括只有86.1％相同性的病毒。
表二比较PRSV 5-19与其他地区PRSV病毒株的HC-Pro(up corner)及CP(down corner)基因的核甘酸及氨基酸序列相同性及相似性
表三对PRSV 5-19及PRSV YK具高度抗性之5-19HC-Pro转基因木瓜，分析其对其他地区PRSV之广谱抗性
a四个对PRSV 5-19及PRSV YK具高度抗性的5-19HC-Pro转基因木瓜品系F2-1-4、F2-1-7、N11-1、F3-2-2，每个株系以不同病毒分别接种5棵植物，接种病毒为PRSV台湾5-19及永康(YK)病毒株、墨西哥(MX)、泰国(TH)、夏威夷(HA)病毒株，于接种后14、28、42天记录其发病结果。本实验以非转基因木瓜(NT)及另一PRSV YK外壳蛋白转基因木瓜植株18-2-4(Bau et al.，2003)当做对照组。
实施例8.RNA印迹法(Northern blotting)检测转基因转录物(mRNA)及siRNA表达量
选取12个包含由前述构建体所得的转基因株系，其中每个构建体的转基因木瓜包含3个高抗性品系及一个易感品系，以下列方式检测它们的转基因转录物以及siRNA表达量。
以ULTRASPECTMRNA系统(Biotecx Laboratories，Houston，TX，USA)抽取转基因木瓜总RNA，每个样品以15μg总RNA来增测，以含有甲醛的1.2％琼脂醣凝胶电泳胶片分离之。RNA转移至Hybond-N+膜(AmershamPhamacia Biotech，UK)以UV灯交联5分钟，然后在60℃预杂交1小时，加入以Primer It II random primer labeling kit(Stratagene)制备的α-32P标记的5-19HC-Pro基因编码区域的特异性探针于60℃反应16小时，经漂洗将未杂交的探针去除后。将尼龙薄膜放入含增强隔板的自动显影片夹(HyperscreenTM)，以X-ray胶片(Hyperfilm MP)于-80℃曝光48小时。根据RNA印迹法结果，比较抗性、易感品系的转录物表达量，并推测抗性机制是否由转录后基因沉默(PTGS)所导致。
以相同的总RNA用来检测其转基因siRNA的表达量，每个样品以30μg总RNA来检测，以聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％聚丙烯酰胺(29％，19∶1)，1×TBE(8.9mM Tris，8.9mM硼酸，20mM EDTA)，8M尿素)使RNA分离，并将RNA转移至Hybond-N+膜(Amersham Phamacia Biotech，UK)以UV灯交联5分钟，然后加入ULTRAHyb-Oligo溶液(Ambion Inc.，Austin，TX)在42℃预杂交1小时，加入α-32P标记的5-19HC-Pro基因编码区域的特异性探针于42℃反应16小时，经漂洗后将尼龙薄膜放入含增强隔板的自动显影片夹，以X-ray胶片于-80℃曝光48小时。比较抗性品系转基因siRNA累积量的差异。本分析是以The Prestain Marker(BioDynamicsLaboratory Inc.，Tokyo，JAPAN)作为分子标记(marker)。
图4A区显示转基因转录物表达量的分析结果，其中高抗性转基因木瓜的转基因转录物累积量均较少或测不到转录物，而C9-4-1、C9-5-3及C10-13虽有较高转录物累积，但其转录物为拖曳状况，推测为mRNA被分解所致。图4B区显示siRNA表大量的分析结果，其中易感植株均测不到siRNA表达，而F3-2-2、C9-4-1及C9-5-3具有大量的siRNA累积(如图4B区)。此结果显示，利用非翻译性构建体的HC-Pro能借助植物基因沉默的方式达到抗病毒能力。
实施例9.HC-Pro转基因遗传至子代且提供抗性
选取两个含有单一转基因插入拷贝数的株系(F2-1-4及F3-2-2)进行自交，自交后得到自交子代R1，此两株系自交90天后，将所得的自交子代R1的未成熟种子置于含100mg/l卡那霉素的MSNB培养基进行培养，以鉴定子代是否遗传到nptII基因，若nptII基因遗传至子代，培养两个星期后，未成熟种子会产生绿色芽点并可成功育成木瓜苗，若种子无nptII基因则维持白色且不发芽，此木瓜苗移至温室以PRSV 5-19接种分析其抗病毒能力。
分析结果发现F2-1-4共117颗未成熟种子有88颗具有抗卡那霉素的能力，3-2-2共102颗未成熟种子有77颗具有抗卡那霉素的能力，这些木瓜移至温室后进行接种PRSV 5-19，也具有良好抗性，显示利用非翻译性构建体的HC-Pro，能借助植物基因沉默方式达到抗病毒能力，且此抗病能力会遗传到子代中。
虽然本发明已参考上述特定的所描述的具体例子，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。
参考文献
Anandalakshmi，R.，Pruss，G.J.，Ge，X.，Marathe，R.，Mallory，A.C.，Smith，T.H.，and Vance，V.B.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13079-13084.
Bau，H.J.，Cheng，Y.H.，Yu，T.A.，Yang，J.S.，and Yeh，S.D.，2003，Phytopathology 93：112-120.
Bau，H.J.，Cheng，Y.H.，Yu，T.A.，Hsiao，C.H.，and Yeh，S.D.，2004，Plant Dis88：594-599.
Brigneti，G.，Voinnet，O.，Li，W.X.，Ji，L.H.，Ding，S.W.，and Baulcombe，D.C.，1998，EMBO J 17：6739-6746.
Cheng，Y.H.，Yang，J.S.，and Yeh，S.D.，1996，Plant Cell Rep 16：127-132.
Fitch，M.M.M.，Manshardt，R.M.，Gonsalves，D.，Slightom，J.L.，and Sanford，J.C.，1992，Bio/Technology 10：1466-1472.
Kung，Y.J.，Bau，H.J.，Wu，Y.L.，Huang，C.H.，Chen，T.M.and Yeh，S.D.，2009a，Phytopathology 99：1312-1320.
Kung，Y.J.，Yu，T.A.，Huang，C.H.，Wang，H.C.，Wang，S.L.，and Yeh，S.D.，2009b，Transgenic Res.(online DOI：10.1007/s11248-009-9344-2).
Sanford，J.C.，and Johnston，S.A.1985，J Theor Biol.113：395-405.
Shi，X.M.，Miller，H.，Verchot，J.，Carrington，J.C.，and Vance，V.B.，1997，Virology 231：35-42.
Tennant，P.，Fermin，G.，Fitch，M.M.，Manshardt，R.M.，Slightom，J.L.，andGonsalves，D.，2001，Eur J Plant Pathol 107：645-653.