肝细胞生成素自分泌循环在诊断和治疗肝癌方面的应用 本发明涉及肝细胞生成素自分泌循环在诊断和治疗肝癌方面的应用。
肝细胞生成素(Hepatopoietin，HPO)是一种新型肝细胞生长因子，在肝实质细胞中表达，具有刺激肝再生、缓解CCl4和D-氨基半乳糖引起的肝损伤及刺激原代肝细胞增殖等作用。
据卫生部统计，在城镇居民中，肝癌已上升为我国第二位癌症杀手，但目前还缺乏诊断和治疗肝癌的有效方法。
本发明的目的是提供一种诊断和治疗肝癌的新靶点。
本发明的发明人以体外培养的肝癌细胞系HepG2、Bel-7402和SMMC-7721为模型，意外地发现并证明肝癌细胞表达肝细胞生成素及其特异性受体，并可分泌肝细胞生成素到细胞培养液中；外加肝细胞生成素对原代培养的肝细胞和肝癌细胞具有增殖刺激作用；肝癌细胞的条件培养基对其自身具有增殖刺激作用，肝细胞生成素中和抗体可降低这种作用；肝细胞生成素中和抗体可部分抑制肝癌细胞的自主性生长。综合这些结果，表明在体外培养的肝癌细胞中存在维持其自主性生长的肝细胞生成素自分泌循环。
用ELISA方法检测到肝细胞生成素在细胞裂解液和条件培养液中均有表达。肝细胞生成素在细胞中的表达量约为3纳克/105细胞，在培养液中的表达量约为1×106细胞培养60小时，分泌肝细胞生成素约5纳克。
利用肝细胞生成素自分泌循环可以为诊断和治疗肝癌的提供新方法。
图1为用RT-PCR检测肝细胞生成素mRNA在肝癌细胞中的表达结果。
图2为用Western blot检测肝细胞生成素mRNA在肝癌细胞中表达结果。
图3为ELISA测定肝细胞生成素方法的标准曲线。
图4显示肝细胞生成素特异性抗体完全封闭了重组人肝细胞生成素对肝癌细胞的增殖刺激作用。
图5显示HepG2细胞的浓缩条件培养液对肝癌细胞有增殖刺激作用。
图6显示肝细胞生成素特异性抗体可降低HepG2细胞地浓缩条件培养液对肝癌细胞的增殖刺激作用。
图7显示肝细胞生成素特异性抗体可抑制肝癌细胞的自主性生长。
下面用实施例对本发明作详细说明。
实施例1：体外培养的肝癌细胞系表达肝细胞生成素
1.肝癌细胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721表达肝细胞生成素mRNA。用肝细胞生成素特异性引物，通过反转录多聚酶链反应(RT-PCR)分别在上述三种肝癌细胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721中扩增出长为375bp的特异性DNA片段。
2.肝癌细胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721表达肝细胞生成素蛋白。用肝细胞生成素亲和纯化的抗体，通过Western blot检测到在上述三种肝癌细胞HepG2、Bel-7402和SMMC-7721中有特异性蛋白表达，分子量约为25KD。
实施例2：ELISA测定肝细胞生成素方法的建立
肝细胞生成素标准品溶解于包被液(含1％BSA的PBS)，加入平底96孔ELISA板，4℃包被过夜。
弃抗原，用TTBS洗板6次；
在室温下用封闭液封闭4小时，用TTBS洗板4次；
在37℃下，抗肝细胞生成素抗体孵育1小时，用TTBS洗板6次；
在37℃下，biotinylated anti-mouse IgG孵育30分钟，用TTBS洗板6次；
在37℃下，horseradish peroxidsce streptavidin孵育30分钟，用TTBS洗板6次；
用ELISASubstrate Kit显色，用microplate spectrophotometer在405纳米读取收据。
以此方法测定样品中肝细胞生成素的含量，肝细胞生成素的含量和相应的吸光值在.0.5纳克到8纳克成线性关系。