说明书用抗-CD19抗体治疗多发性硬化症
背景
多发性硬化症(“MS”)是一种中枢神经系统的慢性炎性疾病。特征性病 理学特性以及仍用作诊断MS的主要基础的特性是中枢神经系统中的神经元 髓鞘的脱髓鞘作用。MS在美国影响了多达400,000人并且在全世界影响大约 1百万人。典型地，MS作为具有相关症状(例如，各种形式的神经炎)的周 期性发作的一种复发性缓解性疾病(RRMS)开始。通常RRMS最终变为进 行性疾病病程，即继发性进行性MS(SPMS)，其特征在于导致更衰弱症状 的更大CNS组织损害。然而，在10％至20％的个体中，疾病初始是以被称为 原发性进行性MS(PPMS)的进行性形式发展。此外，存在该疾病的一种更 少见形式：进行性复发性(PR)MS。
目前的假说偏爱以下概念：T细胞在多发性硬化症(MS)的发病机理中 起到关键性作用，这最初是基于观察到T细胞是存在于MS病变中的主要淋 巴细胞类别(温德哈根(Windhagen)等人，细胞因子，髓磷脂碱性蛋白反应 性T细胞在患有多发性硬化症的患者中的分泌(Cytokine,secretion of myelin basic protein reactive T cells in patients with multiple sclerosis.)，神经免疫学杂 志(Journal of Neuroimmunology)，91:1-9,1998；哈弗D.A.(Hafler,D.A.) 等人，髓磷脂的口服给予在患有多发性硬化症的患者体内诱导抗原-特异性 TGF-β1分泌细胞(Oral administration of myelin induces antigen-specific TGF- beta 1secreting cells in patients with multiple sclerosis.)，纽约科学研究院年报 (Annals of the New York Academy of Science)，835:120-131,1997；洛维特- 拉克A.E.(Lovett-Racke,A.E.)等人，在多发性硬化症患者体内髓磷脂碱性 蛋白反应性T细胞对CD28介导的共同刺激的减小的依赖性(Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated co- stimulation in multiple sclerosis patients)，临床研究杂志(Journal of Clinical Investigation)，101:725-730,1998)。这继续发展为该疾病的主要特点并且 由多种观察所支持。例如，具有抗髓磷脂T细胞受体(TCR)的活性CD4+T 辅助细胞存在于患有MS的患者的脑脊液(CSF)中。此外，在患有MS的患 者的CSF中检测到提高水平的Th1样细胞因子并且这在一些情况下与疾病的 恶化相关联(卡拉布雷西(Calabresi)等人，源于多发性硬化症患者的CSF 中的细胞中的细胞因子表达(Cytokine expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients.)，神经免疫学杂志，89:198-205,1998)。
有证据表明B细胞可能涉及MS疾病过程的发展和持续，包括：(1)在 MS患者的CSF中的提高的免疫球蛋白水平(林克H.(Link,H.)等人，多发 性硬化症中的免疫球蛋白和神经系统的感染(Immunoglobulins in multiple sclerosis and infections of the nervous system)，神经学档案(Archives of Neurology)，25:326-344,1971；林克H.等人，通过琼脂糖凝胶电泳和免疫固 定确定的多发性硬化症的CSF中的免疫球蛋白类别和寡克隆带轻链类型 (Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation.)，神经病学年鉴(Ann Neurol)，6(2):107-110,1979；佩 雷斯L(Perez,L)等人，B细胞能够在来自患有多发性硬化症的患者的脑脊 液中自发进行IgG分泌：对于局部IL-6产生的依赖性(B cells capable of spontaneous IgG secretion in cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis:dependency on local IL-6production.)，临床实验免疫学(Clinical Experimental Immunology)，101:449-452,1995)；(2)MS患者的CSF中的寡 克隆带(林克H.等人，通过琼脂糖凝胶电泳和免疫固定确定的多发性硬化症 的CSF中的免疫球蛋白类别和寡克隆带轻链类型，神经病学年鉴，6 (2):107-110,1979)；(3)抗髓磷脂抗体在MS患者的CSF中的存在(孙J. H.(Sun,J.H.)等人，在多发性硬化症中B细胞响应于髓磷脂少突胶质细胞 糖蛋白(B cell responses to myelin-oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis)，免疫学杂志(Journal of Immunology)，146:1490-1495,1991)； (4)证实来自MS患者的CSF的抗体可以促成这些患者中的组织损伤的总体程 度(拉斯曼H.(Lassmann,H.)等人，实验性变应性脑脊髓炎：致脑炎T淋 巴细胞与脱髓鞘抗体之间的平衡决定脱髓鞘病变的大小和结构(Experimental allergic encephalomyelitis:the balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies determines size and structure of demyelinated lesions.)，神经病理学学报(Acta Neuropathology)，75:566-576,1988)；以 及(5)CD19+B细胞和CD19+138+浆母细胞在MS患者的CSF中的存在(韦 恩斯KM(Winges,KM)等人，多发性硬化症脑脊液的分析揭示主要为浆母 细胞的克隆相关抗体分泌细胞的一个连续体(Analysis of multiple sclerosis cerebrospinal fluid reveals a continuum of clonally related antibody-secreting cells that are predominantly plasma blasts.)，神经免疫学杂志，192:226-234,2007, Cepok S等人(2005).脑128(Pt 7)：1667-76)。
因此，对于可以用于在个体体内；具体地在患有疾病病状的个体体内通 过靶向B细胞(包括浆母细胞/浆细胞)来治疗性地治疗MS的方法存在需 要。
发明概述
在一个方面，本披露提供治疗多发性硬化症的方法，这些方法包括向有 需要的受试者给予治疗有效量的一种抗体，其中该抗体是结合CD19抗原的 一种人源化抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，多发性硬化症疾病是选自下组，该组由以下各项组 成：复发性缓解性(RR)MS、原发性进行性(PP)MS、继发性进行性 (SP)MS、复发性进行性(RP)MS以及进行性复发性(PR)MS。在一个 实施例中，多发性硬化症是RRMS。在一个替代实施例中，多发性硬化症是 选自以下各项的MS的进行性形式：PPMS、SPMS、以及PR MS。
在某些实施例中，该抗体包括一个VH和一个VL，其中该VH包括具有 SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一个VH CDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸 的一个VH CDR2以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施例中，该抗体包括一个VH和一个VL，其中该VL包括具有 SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个VL CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸 的一个VL CDR2以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL CDR3。
在其他实施例中，该VH包括SEQ ID NO:7的一个氨基酸序列。在某些 实施例中，该VL包括SEQ ID NO:8的一个氨基酸序列。
在替代实施例中，该抗体包括一个Fc变体，其中该Fc变体对选自下组 的一个或多个Fc配体具有改变的亲和力，该组由以下各项组成：C1q、 FcRI、FcRIIA、FcRIIB以及FcRIIIA。在某些实施例中，该Fc变体对Fc受体 FcγRIIIA具有一个亲和力，该亲和力比可比较的分子的亲和力低至少约5 倍，并且其中所述Fc变体对Fc受体FcγRIIB具有一个亲和力，该亲和力处于 相应非变体Fc分子的亲和力的约2倍以内。
在一些实施例中，该抗体具有一个增强的ADCC活性。
在某些实施例中，治疗多发性硬化症的方法包括消减选自下组的B细 胞，该组由以下各项组成：循环B细胞、血液B细胞、脾脏B细胞、边缘区 B细胞、滤泡B细胞、腹膜B细胞以及骨髓B细胞。在某些实施例中，该方 法包括消减选自下组的B细胞，该组由以下各项组成：祖B细胞、早期祖B 细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟的B细胞、成熟的 B细胞、抗原刺激的B细胞、浆母细胞以及浆细胞。
在一些实施例中，该消减将B细胞水平减小了至少约20％、至少约 30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、 至少约90％、至少约95％、或约100％。
在其他实施例中，该消减持续选自下组的一个时间段，该组由以下各项 组成：至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至 少7周、至少8周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至 少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或者至少 12个月。
在一些实施例中，该抗体偶联到一种细胞毒素剂上。在一些实施例中， 该抗体是与一种抗-CD20抗体、抗-CD52抗体或者抗-CD22抗体共同给予的。 在一些实施例中，该抗体是与一种干扰素-β、克帕松(Copaxone)TM、皮质 类固醇、环孢霉素、钙调磷酸酶抑制剂、硫唑嘌呤、雷帕鸣(Rapamune) TM、骁悉(Cellcept)TM、甲氨蝶呤或米托蒽醌共同给予的。
本披露还提供了治疗人的多发性硬化症的方法，这些方法包括向有需要 的患者给予一种包括结合CD19抗原的多种单克隆抗体的组合物，其中80％ 至100％的抗体是无岩藻糖基的(afucosylated)。
在一些实施例中，该抗体包括一个VH和一个VL，其中该VH包括具有 SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一个VH CDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸 的一个VH CDR2以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR3。
在其他实施例中，该抗体包括一个VH和一个VL，其中该VL包括具有 SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个VL CDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸 的一个VL CDR2以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL CDR3。
在替代实施例中，该VH包括SEQ ID NO:7的一个氨基酸序列。在一些 实施例中，该VL包括SEQ ID NO:8的一个氨基酸序列。
本披露期望任何前述方面和实施例的所有组合，以及与在详细描述中提 出的任何实施例和实例的组合。
附图简要说明
图1：CD19在来自人CD19转基因(huCD19Tg)小鼠的浆细胞中 的表达
图2：在卵清蛋白(ova)免疫的人CD19转基因(huCD19Tg)小鼠 中16C4-aFuc对抗体滴度和浆细胞数目的作用
图3：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对血液和组织B细 胞的作用
图4：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对脾脏和骨髓浆细 胞的作用
图5：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对抗-dsDNA自身抗 体的作用
图6：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–随着时间对血清免 疫球蛋白的作用
图7：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–减少血清中的自身 抗体
图8：对CD19呈阳性的CD27+CD38高(CD38high)细胞具有一种 浆细胞表型并且分泌IgG(8A FACS图；8B形态学；8C总IgG ELISpot)
图9：在不同人组织中的CD19(左列)和CD20(右列)表面表达 水平。
图10：来自BM的CD19阴性ASC群包含对疫苗抗原的大部分体液 记忆。
图11：在16C4afuc治疗之后全血中的浆细胞特征标记(Signature) 的抑制(至第85天)。在用16C4afuc或安慰剂治疗之后第3天、29天以及 85天通过整个基因组阵列评价在来自硬皮症患者的WB中的PC特征标记的 转录物水平。对于所有的患者在每次评价的时间点显示与WB中的基线相比 的中位倍数变化值。误差条是中位绝对偏差。*指示基线与给予后的值之间的 统计学显著性差异(p<0.01；曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验)。
图12：在16C4afuc治疗之后皮肤中的浆细胞特征标记的抑制。在治 疗之前和在16C4afuc或安慰剂治疗之后第29天通过TaqMan qPCR评价皮肤 中的PC特征标记的转录物水平。使用管家基因的表达水平、然后通过与每位 患者的PC特征标记基线表达相比来计算倍数变化值。点线代表基线倍数变化 值(设定为1)。黑条代表中位倍数变化值。*指示基线与治疗后的值之间的 统计学显著性差异(p<0.05)。
图13：来自CP200患者的血液与皮肤之间的浆细胞特征标记的一致 性抑制。如以上所述地计算在16C4afuc治疗之后第29天的血液和皮肤中的 PC特征标记的中位倍数变化值。显示在CP200中登记的患有硬皮症的受试者 的皮肤(y轴)与全血(x轴)之间的PC特征标记抑制的相关性散点图。r＝ 斯皮尔曼(Spearman)等级相关系数。p<0.05指示显著相关。
图14：体外分化的PC的16C4afuc依赖的杀伤作用。A.示出在非分 化的或PC分化的条件下在培养6.5天之后PC(CD27高CD38高)的相对缺 乏或充足的代表性数据。B.在培养6.5天之后体外分化的PC的CD19和 CD20表达。C.ADCC测定之后每孔的活浆细胞的平均数目。绘制每个单个供 体并且显示每组的平均值(±S.D.对于测试条件n＝6次重复并且对于无抗体 对照n＝10次重复)。***指示在与无抗体对照的成对比较中p-值≤0.001。
图15：从同一天运输的骨髓中新鲜分离的人浆细胞的16C4afuc依赖 的杀伤作用。A.示出B细胞富集之后PC(CD27高CD38高)的鉴别的代表 性数据。B.来自每个供体的PC的CD19和CD20表达。C.在ADCC测定之 后每孔的活浆细胞的平均数目。绘制每个单个供体并且示出每组的平均值(± S.D.n＝6次重复)。***指示在与无抗体对照的成对比较中p-值≤0.001。
图16：结果显示在RRMS患者的CSF中富含CD19+CD20-浆母细胞 和浆细胞。图17示出了3个代表性流式细胞计数图。
详细说明
本披露涉及结合人CD19抗原的人、人源化或嵌合抗-CD19抗体。本披 露还涉及包含可以介导以下各项中的一个或多个的人、人源化或嵌合抗-CD19 抗体的组合物：补体依赖的细胞介导的细胞毒性(CDC)、抗原依赖的细胞 介导的细胞毒性(ADCC)、以及程序性细胞死亡(细胞凋亡)。本披露还涉 及包含IgG1和/或IgG3人同种型的人、人源化或嵌合抗-CD19抗体的组合 物，以及涉及包含可以介导人ADCC、CDC、或细胞凋亡的IgG2和/或IgG4 人同种型的人、人源化、或嵌合抗-CD19的组合物。本披露进一步涉及使用 人、人源化、或嵌合抗-CD19抗体治疗MS的方法。
“多发性硬化症”是指慢性的并且常常是致残性的中枢神经系统疾病，其 特征在于髓磷脂的进行性破坏。如以上所讨论的，存在四种国际上公认的MS 形式，即原发性进行性多发性硬化症(PPMS)、复发性-缓解性多发性硬化 症(RRMS)、继发性进行性多发性硬化症(SPMS)、以及进行性复发性多 发性硬化症(PRMS)。
“复发性-缓解性多发性硬化症”或者“RRMS”的特征在于在完全恢复的情况 下或者在具有后遗症以及疾病复发之间的恢复时段(特征在于疾病进展的缺 乏)的残余缺陷的情况下的明确定义的疾病复发(也被称为加重)。RRMS 的定义要素是神经功能急性恶化的发作、之后可变化的恢复程度，在攻击之 间具有一个稳定的病程(卢布林F.D.(Lublin,F.D.)和莱因戈尔德S.C (Reingold,S.C)(1996)神经病学(Neurology)(46)907-911)。复发可 以持续数天、数周或数月并且恢复可以是缓慢且逐渐的或者几乎是瞬间的。 患有MS的绝大多数人是首次被诊断患有RRMS。这典型地是在他们二十多 岁或三十多岁的时候，尽管已知有更早或更晚出现的诊断。患有这种亚类型 的MS的女性是男性的两倍。在复发过程中，在中枢神经系统(CNS)白质 区内神经纤维(神经元)周围的一种保护性绝缘鞘管髓磷脂可以在通过身体 自身免疫系统的炎性反应中受到损害。这引起很多神经学症状，这些症状根 据所损害的CNS的区域而有很大不同。在紧接着复发之后，炎性反应逐渐消 失并且CNS中的特定类型的胶质细胞(被称为少突胶质细胞)发起髓鞘再生- -可以恢复轴突周围的髓鞘的一个过程。这种髓鞘再生可能是缓解的原因。大 约50％患有RRMS的患者在疾病发病的10年内转变为SPMS。在30年之 后，这个数字上升至90％。在任一时间，疾病的复发缓解形式占所有患有MS 的患者的大约55％。
原发性进行性多发性硬化症或PPMS的特征在于其中神经功能从发病开 始持续恶化，允许偶尔的稳定和神经功能偶尔的微小改善的疾病进展。PPMS 中的必需要素是允许微小波动但是没有明显复发的一个逐渐且几乎持续的恶 化功能(卢布林F.D.和莱因戈尔德S.C(1996))。PPMS与RRMS和SPMS 的不同之处在于，发病比RRMS平均晚约10年，典型地在快四十岁或四十岁 出头，在于男性受到影响的频率与女性一样多，并且在于初始疾病活动常常 是在脊髓中而不是在大脑中。PPMS常常转移到大脑中，但是比RRMS或 SPMS更少可能损害大脑区域。例如，患有PPMS的人比患有RRMS或 SPMS的人更少可能发展认知问题。PPMS是MS的亚型，它在MRI扫描中最 不可能显示炎性(钆增强)病变，然而，最近试验已表明这些是会发生的 (霍克(Hawker)，神经病学年鉴2009)。该疾病的原发性进行性形式影响 了10％与15％之间的所有患有多发性硬化症的人。PPMS可以根据麦克唐纳 (McDonald)等人，神经病学年鉴50:121-7(2001)中的标准进行定义。 (波尔曼(Polman)等人，2010，多发性硬化症的诊断标准：麦克唐纳标准 的2010修订版(Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis:2010Revisions to the McDonald Criteria)，神经病学年鉴2011；69:292–302)患有在此所治疗的 PPMS的受试者通常是可能或确定性诊断PPMS的受试者。
“继发性进行性多发性硬化症”或者“SPMS”的特征在于继初始RRMS疾病 病程之后的进展、偶然复发或未偶然复发、微小缓解、以及停滞或稳定时 段。SPMS可以被视为RRMS的长期结果，因为大部分SPMS患者初始以在 此所定义的RR疾病开始。然而，一旦复发之间的基线开始进行性恶化，该患 者就从RRMS转变为SPMS(卢布林F.D.和莱因戈尔德S.C(1996))。发展 SPMS的人可以具有持续从两年至四十年或更多年的任何时间的一个RRMS 时段。从疾病的继发性进行性阶段发病开始，残疾开始比它在RRMS过程中 快很多地推进，尽管进程在一些个体中可以是仍然很缓慢。在10年之后， 50％患有RRMS的人将发展成SPMS。SPMS倾向于与比RRMS中更低的炎 性病变形成水平有关，但是疾病的总负荷继续进展。在任一时间，SPMS占所 有患有多发性硬化症的患者的大约30％。
“进行性复发性多发性硬化症”是指“PRMS”，其特征在于从发病开始的进 行性疾病，具有清楚的急性复发，在完全恢复或未完全恢复的情况下；复发 之间的时段，其特征在于继续进展。PRMS是一种另外(虽然罕见)的临床 病程(卢布林F.D.和莱因戈尔德S.C(1996)。PRMS影响所有患有多发性硬 化症的人的大约5％。一些神经病学家认为PRMS是PPMS的一种变体并且患 有PRMS的患者常常被认为具有与患有PPMS的人相同的预后。
多发性硬化症也可以被定义为“良性MS”或者“恶性MS”。良性MS可以 被定义为其中患者在所有神经系统中保留全部功能的一种疾病状态。典型 地，这在发病之后可以持续至少约15年。恶性MS可以被定义为一种疾病状 态，其特征在于快速进行性病程，这导致多个神经系统的重大残疾或者在疾 病发病病程之后相对短时间内的死亡(卢布林F.D.和莱因戈尔德S.C (1996))。
虽然MS长期被视为一种T细胞介导的疾病，但对B细胞在MS中的作 用的重视和理解逐渐增加。在RRMS患者中的开放标记和对照临床研究中， 用抗-CD20 MAb(即，利妥昔单抗(rituximab)和奥瑞珠单抗 (ocrelizumab))消减B细胞引起炎性病变和复发率显著减少(豪泽 (Hauser)等人，2008；巴奥(Bar-Or)等人，2008；卡波斯(Kappos)等 人，2011)。在关于消减B细胞的MAb的这些临床研究中证实的效力已确认 B细胞在MS发病机理中的重要性。利妥昔单抗和奥瑞珠单抗消减表达CD20 的B细胞，同时根据本发明使用的抗体靶向表达CD19的B细胞。然而，仍 存在对替代治疗的一种未满足的临床需要。本发明提供了抗-CD19抗体在多 发性硬化症的治疗中的用途。从概念上讲，预期的是，能够消减B细胞的一 种抗-CD19抗体将会具有本领域已知的用于治疗MS的抗-CD20抗体的所有优 点，这是考虑到CD19在表达CD20的所有B细胞中表达，然而靶向CD19可 能赋予另外的优点，因为它也在不表达CD20或者不表达大量水平的CD20的 B细胞中表达。表达CD19的较广泛范围的B-细胞亚群包括前期前体细胞和 后期分化细胞，包括浆母细胞和一些浆细胞，它们是抗体产生的主要来源 (达拉卡斯(Dalakas)，2008；特德(Tedder)，2009)。
CD19在此较广泛范围的B细胞内的表达在治疗MS的背景下是重要 的，因为在机理上，B细胞在MS中似乎具有抗体依赖的作用和非抗体依赖的 作用。这是基于在患有MS的患者脑脊液(CSF)和中枢神经系统(CNS)中 B细胞、抗体分泌浆细胞以及对CNS组分的自身抗体的观察，其中>90％的 MS患者在其CSF中具有免疫球蛋白的寡克隆带。因此，通过靶向此较广泛 范围的B细胞，消减B细胞的抗-CD19抗体在MS的治疗中可能具有更大的 影响，因为它还杀死在MS中的浆母细胞和浆细胞(产生更多近似抗体的细 胞)。此外，已提出为CD20-、CD19和CD138+的浆母细胞是涉及患有MS 的患者中正在进行的活动炎症的主要效应子B-细胞群(Cepok S等人 (2005).大脑128(Pt 7):1667-76)。
另外，B细胞可以在作为MS疾病过程的一部分的CNS中的抗原呈递和 原初CNS反应性T细胞的激发中发挥作用(塞勒比耶里(Sellebjerg)等人， 1998)。来自研究的在CNS干细胞中的B细胞抗原呈递细胞功能的证据显 示，CNS中的B细胞和浆细胞已经历快速且广泛的T细胞介导的、抗原驱动 的克隆扩增和体细胞高变(秦(Qin)等人，2003；蒙森(Monson)等人， 2005)。重要的是，CD19+CD20-短命浆母细胞被认为是涉及患有MS的患 者中的正在进行的活动炎症的主要效应子B-细胞群(Cepok等人，2005)。 另外，CNS原住型B细胞还有助于产生促炎性细胞因子，这些细胞因子吸引 其他破坏性免疫细胞并且支持这些免疫细胞的存活。克拉兹塞克(Krzysiek) 和同事们(克拉兹塞克等人，1999)观察到，B-细胞受体信号发送诱导原初 B细胞、记忆B细胞、以及生发中心B细胞表达两种T-细胞趋化因子，巨噬 细胞炎性蛋白(MIP)-1a和MIP-1b。最近的研究表明，在MS的大脑的脑膜 层和亚脑膜层中观察的淋巴新生可能是由邻近微环境中的细胞因子和趋化因 子驱动。高尔肖娜(Corcione)和同事们(高尔肖娜等人，2004)鉴定了MS 患者的CSF和CNS组织中的淋巴毒素-α、CXCL12以及CXCL13。另外，肿 瘤坏死因子家族表达的B-细胞活化因子(BAFF)在MS大脑病变中是显著上 调的(克鲁姆布霍尔兹(Krumbholz)等人，2005)。尽管埃-巴二氏 (Epstein-Barr)病毒在MS中的作用仍有争议，但已报道了在白质病变中可 检测的潜伏感染的B细胞。潜伏蛋白LMP-1和LMP-2A的表达促进了B细胞 的存活和分化并且可以促成这些细胞在MS中调节异常，从而通过增加抗体 产生和对CD4和CD8 T细胞的抗原呈递来导致疾病过程放大(塞拉菲尼 (Serafini)等人，2010)。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是通过用来自患病动物的髓磷脂组 分或脊髓均浆进行免疫从而引起CNS定向的免疫反应的形成来诱导的一种 MS动物模型。在EAE模型中，用抗-CD20 MAb消减活动疾病过程中的B细 胞已显示将EAE症状显著抑制50％至100％(松下(Matsushita)等人， 2008；蒙森等人，2011)。这些啮齿动物数据通过B-细胞消减来支持，从而 在人髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白诱导的EAE狨猴模型中预防疾病的临床表现 和病理发现二者(卡普(Kap)等人，2010)。目前，来自临床试验的具有 CD20 B-细胞消减的人的经历提供了关于B细胞在MS中的重要性和靶向这些 细胞以改进转归的效用的最好证据(豪泽等人，2008；巴奥等人，2008；卡 波斯等人，2011)。
基于复发和缓解的存在或缺乏或者神经缺陷的进展，MS患者可以被分 为四种临床类型之一。原发性进行性(PP)MS呈现为“具有偶然稳定和暂时 的微小改善的从发病开始的疾病进展”，但是在其病程过程中没有复发或缓 解。继发性进行性(SP)MS患者以复发性-缓解性(RR)MS的形式开始， 稍后经历向具有或不具有叠加复发的进行性病程的一个转变。据报道，PP患 者在其临床特征、遗传特征、实验室特征、成像特征、以及病理特征、以及 它们对治疗剂的反应方面不同于患有RR和SP MS的那些患者。据报道PP类 型的发生率为患有MS的患者中的8％与37％之间。PPMS在晚年(40岁之 后)患者中相对更常见并且在男性中更常见。在PP疾病中的最常见表现是慢 性进行性脊髓病。在病理上，PPMS与SPMS相比具有更少的围管现象和实质 细胞浸润。PPMS具有重大且严重残疾的预后并且没有治疗性干预被证明可以 停滞或减慢其持续进行性病程。
最近的病理学研究提供了对浆细胞和浆母细胞的可能作用和此类CD19 阳性而CD20阴性的B-细胞谱系来源的细胞的可能作用的关键性理解。
在费彻(Frischer)研究(大脑2009)中，T-细胞和B-细胞渗透物二者 均与脱髓鞘病变的活性有关联，同时清楚地浆细胞(CD19+和CD20-)渗透 物在患有继发性进行性多发性硬化症(SPMS)和原发性进行性多发性硬化症 的患者中是最明显的。当T-细胞和B-细胞渗透物随着时间降低至年龄匹配的 对照中所观察到的水平时，存在这些浆细胞渗透物。在总体多发性硬化症群 体以及多发性硬化症的进行性形式中观察到炎症与轴突损伤之间的显著相关 性。
简言之，在B细胞和它们在MS病理生理学中的作用的理解方面的进步 提供了B-细胞靶向疗法的强大基本原理并且抗-CD19可以对继发性进行性 MS的确立具有另外的作用并且可以具有靶向涉及PPMS的CD19+CD20-B- 细胞的独特能力。
本披露提供了一种治疗罹患多发性硬化症的受试者的多发性硬化症的方 法，该方法包括向该受试者给予一个治疗有效量的结合CD19抗原的人、人 源化或嵌合抗-CD19抗体。该人、人源化、或嵌合抗-CD19抗体可以足以消 减循环B细胞的量介导ADCC、CDC、和/或细胞凋亡。
术语
在继续进一步详细描述本披露之前，应当理解的是，本披露并不局限于 特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意 的是，除非上下文中清楚地指出，如在本说明书及所附权利要求中所使用的 单数形式“一种/一位”、“一个”和“该”包括复数指示物。
除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的 领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，《生物医学与分子生 物学简明词典》(the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo，Pei-Show，第二版，2002，CRC出版社；《细胞与分子生物 学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第三版，1999，学 术出版社(Academic Press)；以及《生物化学与分子生物学牛津词典》(the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000， 牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了在本披露中使用 的许多术语的常用词典。
在此的氨基酸可以通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC- IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号而被提及。同样地，核苷酸可以通过它们的 普遍公认的单字母代码而被提及。
如在此使用的，术语“抗体”(antibody)和“抗体(antibodies)”(免疫球 蛋白)涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个 完整抗体形成的多特异抗体(例如，双特异抗体)、人抗体、人源化抗体、 骆驼抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab 片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段、二硫化物连接 的Fv(sdFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括(例如)针对本披露的抗 体的抗Id抗体)、细胞内抗体，以及任何以上的表位结合片段。具体来说， 抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有一个 抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA、以及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1、以及IgA2)或子类。
天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻 (L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条 重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条 重链和轻链还具有规律性间隔的链间二硫键。每条重链在一端具有一个可变 结构域(VH)，之后跟随多个恒定结构域。每个轻链在一端具有一个可变结 构域(VL)并且在另一端具有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的 第一恒定结构域对准，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。基 于该轻链恒定区的氨基酸序列，轻链被分类为λ链或κ链。一个κ轻链的可 变结构域在此还可以表示为VK。术语“可变结构域”也可以用于描述一条重链 或轻链的可变结构域。具体氨基酸残基被认为形成轻链可变结构域与重链可 变结构域之间的一个连接。此类抗体可以源自任何哺乳动物，包括但不限于 人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等。
术语“可变的”是指以下事实：在抗体之中可变结构域的某些部分的序列 存在广泛不同并且是每个特定抗体对其特定抗原的结合特异性的原因。然 而，可变性不是均匀地分布于抗体的可变结构域内的。它被集中在轻链和重 链可变结构域二者中的被称为互补决定区(CDR)的区段中。可变结构域的 更高保守性部分称为框架区(FW)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含 由三个CDR连接的四个FW区域，这四个FW大体上采用β-片层构型，这三 个CDR形成连接-片层结构的环并且在一些情况下形成β-片层结构的部分。 在每个链中的CDR由FW区域保持紧靠在一起，并且与来自另一条链的CDR 促成抗体的抗原结合位点的形成(参见卡巴特(Kabat)等人，具有免疫学意 义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版， 公共卫生服务(Public Health Service)，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.) (1991))。恒定结构域通常不直接涉及抗原结合，但是可以影响抗原结合 亲和力并且可以展示各种效应子功能，如抗体在ADCC、CDC、和/或细胞凋 亡中的参与。
在此所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体中获得的 一种抗体，即单个抗体，这些抗体包括除了可能自然发生的突变(可能少量 存在)之外其他均相同的群体。单克隆抗体是高特异性的，针对一个单一抗 原位点的。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规 (多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体是针对该抗原上的一个单一决定 簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处在于，它们可以通过未被 其他免疫球蛋白产生细胞污染的杂交瘤细胞合成。替代的产生方法是本领域 熟练技术人员所已知的，例如，单克隆抗体可以由用编码单克隆抗体的重链 和轻链基因稳定或瞬时转染的细胞所产生。
术语“嵌合”抗体包括这样的抗体：其中重链和/或轻链的至少一部分与源 自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源， 而这个或这些链的至少另一个部分与源自另一物种的或属于另一个抗体类别 或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列一致或同源，只要它们展 现出所希望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；莫里森(Morrison)等 人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:6851-6855 (1984))。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，这些抗体包含源自 一个非人灵长类(例如，旧世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构 域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是包含从非人免疫球蛋白衍生 的最小序列的嵌合抗体。在多数情况下，人源化抗体是其中天然CDR残基被 来自一种非人物种(供体抗体)(例如具有所希望的特异性、亲和力以及能 力的小鼠、大鼠、兔或非人的灵长类动物)的相应CDR的残基替换的人免疫 球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的FW区域残基被相应 的非人残基替换。而且，人源化抗体可以包括在该受体抗体或供体抗体中未 发现的残基。进行这些修饰以便使抗体性能进一步改进。通常，该人源化抗 体重链或轻链将包括基本上所有的至少一个或多个可变结构域，其中所有或 基本上所有的CDR与一种非人免疫球蛋白的CDR相对应，并且所有或基本 上所有的FW是具有人免疫球蛋白序列的FW。在某些实施例中，该人源化抗 体将包括一个免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该免疫球蛋白恒定区 典型地是一种人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。更详细内容，参见琼斯 (Jones)等人，自然(Nature)321:522-525(1986)；里奇曼(Riechmann) 等人，自然332:323-329(1988)；以及普雷斯塔(Presta)，结构生物学 (Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。
“人抗体”可以是源于人的抗体或者是从一种转基因有机体中获得的抗 体，该转基因有机体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体并且可以 通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的 元素引入到源于胚胎干细胞系的有机体菌株中，这些细胞系中包含靶向的内 源性重链和轻链基因座破坏。转基因有机体可以合成对人抗原特异的人抗 体，并且有机体可以用于产生人抗体分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗 体，其中重链和轻链是由源于一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。 完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建， 或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。
术语“Fc受体”或者“FcR”被用来描述结合抗体Fc区域的受体。在一个实 施例中，该FcR是天然序列人FcR。而且，在某些实施例中，该FcR是结合 IgG抗体的一种FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII、以及 FcγRIV亚类的受体，这些受体包括等位基因变体以及这些受体的可选择剪接 形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受 体”)，两者具有主要在其胞质结构域上不同的相似氨基酸序列。活化受体 FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受 体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参 见，戴隆(Daeron)，免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)，15:203-234 (1997))。FcR在以下各项中进行综述：拉文奇(Ravetch)和基内特 (Kinet)，免疫学年度评论，9:457-92(1991)；卡博尔(Capel)等人，免 疫方法(Immunomethods)，4:25-34(1994)；以及德哈斯(de Haas)等 人，实验室和临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)，126:330-41(1995)。在 此的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括有待在将来鉴定的那些FcR。该术语还包 括新生儿受体FcRn，其负责将母源IgG转移至胎儿(盖耶(Guyer)等人， 《免疫学》(Immunol.)，117:587(1976)以及金姆(Kim)等人，《免疫 学杂志》(J.Immunol.)，24:249(1994))。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指这样一种细胞介导的反 应：其中非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细 胞、以及巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞裂解。 在一个实施例中，此类细胞是人细胞。虽然不希望被限制于任何具体的作用 机制，但介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介 导ADCC的主要细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、 FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达概述于拉文奇和基内 特，免疫学年度评论，9:457-92(1991)中。为了评定分子的ADCC活性， 可以进行例如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外ADCC测 定。用于这类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤 (NK)细胞。可替代地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以例如在如 克莱因斯(Clynes)等人，美国国家科学院院刊，95:652-656(1998)中披露 的动物模型中进行体内评定。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应子功能的白细胞。这些 细胞表达至少FcγRI、FCγRII、FcγRIII和/或FcγRIV并且执行ADCC效应子 功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然 杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞以及嗜中性粒细胞。
“补体依赖的细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下的靶细胞的裂解。通过 使补体系统的第一组分(C1q)结合例如与同源抗原复合的分子(例如，抗 体)来开启补体活化途径。为了评定补体活化，可以进行如在加扎诺-太郎 (Gazzano-Santaro)等人，1996，《免疫学方法杂志》(J.Immunol. Methods)，202:163中描述的CDC测定。
抗-CD19抗体
本披露涉及结合人CD19抗原的人、人源化或嵌合抗-CD19抗体并且涉 及包含此类抗体的组合物。在某些实施例中，人、人源化、或嵌合抗-CD19 抗体可以介导抗原依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其他实施例中， 本披露涉及包含IgG1和/或IgG3人同种型的人、人源化、或嵌合抗-CD19抗 体的组合物，并且涉及可以介导ADCC、CDC、和/或细胞凋亡的IgG2和/或 IgG4人同种型的人、人源化、或嵌合抗-CD19抗体。在其他实施例中，人、 人源化、或嵌合抗-CD19抗体可以抑制抗-IgM/CpG刺激的B细胞增殖。
作为实例，在此提供特异性结合CD19的示例性人源化抗体。在某些示 例性实施例中，该抗-CD19抗体包括一个重链可变区VH，该VH包含选自下 组的至少一个CDR序列，该组由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、以及SEQ ID NO:3组成。在某些实施例中，该VH包括含有SEQ ID NO:1的氨基酸序 列的一个CDR1序列、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个CDR2序列、 以及含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR3序列。在另外的实施例中，该 抗-CD19抗体包括一个重链可变区VL，该VL包含选自下组的至少一个CDR 序列，该组由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、以及SEQ ID NO:6组成。在一 些实施例中，该VL包括含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一个CDR1序 列、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一个CDR2序列、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的一个CDR3序列。
在一些实施例中，该抗-CD19抗体包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列 的一个VH和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的一个VL。
在某些示例性实施例中，该抗-CD19抗体包括一个重链可变区VH，该 VH包含选自下组的至少一个CDR序列，该组由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、以及SEQ ID NO:11组成。在某些实施例中，该VH包括含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的一个CDR1序列、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的 一个CDR2序列、以及含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR3序列。在 另外的实施例中，该抗-CD19抗体包括一个重链可变区VL，该VL包含选自 下组的至少一个CDR序列，该组由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、以及 SEQ ID NO:14组成。在一些实施例中，该VL包括含有SEQ ID NO:12的氨 基酸序列的一个CDR1序列、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的一个CDR2 序列、以及含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的一个CDR3序列。
在一些实施例中，该抗-CD19抗体包括含有SEQ ID NO:15的氨基酸序 列的一个VH和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的一个VL。
变体Fc区
已知Fc区的变体(例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失)增强或减小 抗体的效应子功能(参见，例如，美国专利号5,624,821；5,885,573； 6,538,124；7,317,091；5,648,260；6,538,124；WO 03/074679；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 99/58572；美国公开号2006/0134105； 2004/0132101；2006/0008883)并且可以改变该抗体的药代动力学特性(例 如，半衰期)(参见，美国专利6,277,375和7,083,784)。因此，在某些实施 例中，本披露的抗-CD19抗体包含改变的Fc区(在此也被称为“变体Fc 区”)，其中已经在该Fc区做出一种或多种改变以便改变这些抗体的功能特性 和/或药代动力学特性。此类改变可以导致Clq结合和补体依赖的细胞毒性 (CDC)或者对于IgG的FcγR结合以及抗体依赖的细胞的细胞毒性 (ADCC)、或者抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)的减少或增加。 本披露涵盖在此所述的具有变体Fc区的抗体，其中已经做出变化以便调整效 应子功能，并且提供所希望的效应子功能。因此，在本披露的某些实施例 中，本披露的-CD19抗体包括一个变体Fc区(即，如下所讨论的已经改变的 Fc区)。本披露的包含变体Fc区的抗-CD19抗体在这里还被称为“Fc变体抗 体”。如在此使用的，天然的是指未修饰的亲本序列，并且包含天然Fc区的抗 体在此被称为“天然Fc抗体”。Fc变体抗体可以通过本领域已熟知的多种方法 产生。非限制性实例包括分离抗体编码区(例如，从杂交瘤)以及在分离的 抗体编码区的Fc区中形成一个或多个所希望的取代。可替代地，可以将抗- CD19抗体的抗原结合部分(例如，可变区)亚克隆到编码一个变体Fc区的 载体中。在某些实施例中，如与天然Fc区相比的，变体Fc区展现出相似的 诱导效应子功能的水平。在另一个实施例中，如与天然Fc相比的，变体Fc 区展现出较高的效应子功能的诱导作用。在此详述了变体Fc区的一些具体实 施例。用于测量效应子功能的方法在本领域是已熟知的。
应理解，如在此使用的Fc区包括含有抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结 构域之外的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD、以及IgG的最后两个恒 定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构 域、以及在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括 J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及 Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的界限可以改变，人IgG 重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包括残基C226或P230，其中编号是根 据如卡巴特(Kabat)中列出的EU索引进行的。Fc可以是指孤立地这个区， 或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的环境中的这个区。已在多个不同Fc位 置处观察到多态性，包括但不限于如由EU索引编号的位置270、272、312、 315、356、以及358，并且因此所呈现的序列与现有技术序列之间可能存在略 微的差异。
本披露涵盖Fc变体蛋白，这些变体蛋白相对于可比较分子(例如，具有 野生型Fc序列的分子或者具有非变体Fc序列的分子)对于Fc配体(例如， Fc受体，C1q)具有改变的结合特性。结合特性的实例包括但不限于结合特 异性、平衡解离常数(KD)、解离和缔合速率(分别为koff和kon)、结合亲 和力和/或亲合力。一般理解的是，具有低KD的一个结合分子(例如，一个 Fc变体蛋白，如一个抗体)可能优于具有高KD的一个结合分子。然而，在一 些情况下，与KD的值相比，kon或koff的值可能更加有意义。本领域技术人员 可以确定对一个给定抗体应用来说最重要的动力学参数。
一个Fc结构域对其配体的亲和力和结合特性可以通过本领域中已知用于 测定Fc-FcγR相互作用(即，一个Fc区与一个FcγR的特异性结合)的多种 体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，包括但不限于平衡 法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或放射免疫测定(RIA))，或动 力学方法(例如，分析)，以及其他方法如间接结合测定、竞争 性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶 过滤)。这些方法和其他方法可以利用所检验的一个或多个组分上的一个标 记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或 同位素标记。结合亲和力和动力学的详述可以见于保罗W.E.(Paul,W.E.) 编辑，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第4版，利平科特-雷文 (Lippincott-Raven)，费城(Philadelphia)(1999)，该文献着重于抗体-免 疫原相互作用。
在一些实施例中，相对于可比较分子，Fc变体蛋白对一种或多种Fc配 体具有增强的结合。在另一个实施例中，该Fc变体蛋白对Fc配体具有一个 亲和力，该亲和力比可比较分子的亲和力大至少2倍、或至少3倍、或至少5 倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、 或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或 至少100倍、或至少200倍。在一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受 体具有增强的结合。在另一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受体 FcγRIIIA具有增强的结合。在另一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受 体FcγRIIB具有增强的结合。在又一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受 体FcRn具有增强的结合。在又一个特定实施例中，与可比较分子相比，该 Fc变体蛋白对C1q具有增强的结合。
在一些实施例中，本披露的抗-CD19抗体包括一个变体Fc结构域，其中 与可比较的非变体Fc结构域相比，所述变体Fc结构域对Fcγ受体IIB具有增 强的结合亲和力。在另一个实施例中，本披露的抗-CD19抗体包括一个变体 Fc结构域，其中所述变体Fc结构域对Fcγ受体IIB具有一个亲和力，该亲和 力比可比较的非变体Fc结构域的亲和力大至少2倍、或至少3倍、或至少5 倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、 或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或 至少100倍、或至少200倍。
在一些实施例中，相对于可比较分子，Fc变体蛋白对一种或多种Fc配 体具有减小的结合。在另一个实施例中，该Fc变体蛋白对Fc配体具有一个 亲和力，该亲和力比可比较分子的亲和力低至少2倍、或至少3倍、或至少5 倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、 或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或 至少100倍、或至少200倍。在一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受 体具有减小的结合。在另一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc受体 FcγRIIIA具有减小的结合。在另一个特定实施例中，在此所述的Fc变体对Fc 受体FcγRIIIA具有一个亲和力，该亲和力比可比较的分子的亲和力低至少约 5倍，其中所述Fc变体对Fc受体FcγRIIB具有一个亲和力，该亲和力处于可 比较分子的亲和力的约2倍内。在又一个特定实施例中，该Fc变体蛋白对Fc 受体FcRn具有减小的结合。在又一个特定实施例中，与可比较分子相比，该 Fc变体蛋白对C1q具有减小的结合。
可以测定任何具体Fc变体蛋白通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为 了评定ADCC活性，将感兴趣的Fc变体蛋白与免疫效应细胞组合添加至靶细 胞，这些免疫效应细胞可以通过抗原抗体复合物来激活，从而导致靶细胞的 细胞裂解。细胞裂解通常通过从裂解的细胞释放标记(例如，放射性底物、 荧光染料或天然细胞内蛋白)来检测。用于这类测定的有用效应细胞包括外 周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定的特定实 例描述于：怀斯卡沃(Wisecarver)等人，198579:277-282；布吕格曼 (Bruggemann)等人，1987，实验医学杂志(J Exp Med)166:1351-1361；威 尔金森(Wilkinson)等人，2001，免疫学方法杂志(J Immunol Methods) 258:183-191；帕特尔(Patel)等人，1995免疫学方法杂志184:29-38。感兴趣 的Fc变体蛋白的ADCC活性也可以例如在如克莱因斯(Clynes)等人， 1998，美国国家科学院院刊95:652-656中披露的动物模型中进行体内评定。
在一些实施例中，与可比较分子相比，一个Fc变体蛋白具有增强的 ADCC活性。在一个特定实施例中，一个Fc变体蛋白具有比可比较分子大至 少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100 倍的ADCC活性。在另一个特定实施例中，与可比较分子相比，一个Fc变体 蛋白对Fc受体FcγRIIIA具有增强的结合并且具有增强的ADCC活性。在其 他实施例中，与可比较分子相比，该Fc变体蛋白具有增强的ADCC活性和增 大的血清半衰期二者。
在一些实施例中，与可比较分子相比，一个Fc变体蛋白具有减小的 ADCC活性。在一个特定实施例中，一个Fc变体蛋白具有比可比较分子低至 少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100 倍的ADCC活性。在另一个特定实施例中，与可比较分子相比，一个Fc变体 蛋白对Fc受体FcγRIIIA具有减小的结合并且具有减小的ADCC活性。在其 他实施例中，与可比较分子相比，该Fc变体蛋白具有减小的ADCC活性和增 大的血清半衰期二者。
在一些实施例中，本披露提供了Fc变体，其中Fc区在选自下组的一个 或多个位置处包含一个非天然存在的氨基酸残基，该组由以下各项组成：如 通过在卡巴特中列出的EU索引来编号的234、235、236、237、238、239、 240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、 264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、 299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、 334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440以及 443。可任选地，Fc区可以在本领域技术人员已知的另外的和/或替代的位置 处包含一个非天然存在的氨基酸残基(参见，例如，美国专利号5,624,821； 6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217，WO 05/092925 以及WO 06/020114)。
在某些实施例中，本披露提供了一个Fc变体，其中该Fc区包含至少一 个选自下组的非天然存在的氨基酸残基，该组由以下各项组成：如通过在卡 巴特中列出的EU索引来编号的234D、234E、234N、234Q、234T、234H、 234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、 235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、 239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、 240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、 243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、 256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、 264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、 265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、 266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、 270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、 296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、 298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、 305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、 325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、 328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、 329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、 330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、 331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、 331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、 332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、 421K、440Y和434W。可任选地，该Fc区可以包含本领域技术人员已知的另 外的和/或替代的非天然存在的氨基酸残基(参见，例如，美国专利号 5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT专利公开WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752以及WO 05/040217)。
抗体的糖基化
许多多肽(包括抗体)经过涉及碳水化合物部分的多种翻译后修饰，如 用寡糖进行糖基化。存在可以影响糖基化的若干因素。已显示种类、组织和 细胞类型在糖基化发生的方式上都很重要。此外，通过改变培养条件如血清 浓度的细胞外环境可以直接影响糖基化。(莱弗利(Lifely)等人，1995，糖 生物学(Glycobiology)5(8):813-822)。
所有的抗体在重链恒定区的保守位置上都包含碳水化合物。每种抗体同 种型都具有多种不同的N-连接的碳水化合物结构。IgG在CH2结构域的 Asn297上具有一个单一的N-连接的双触角碳水化合物。对于来自血清的或在 杂交瘤或改造细胞中离体产生的IgG，该IgG相对于Asn297连接的碳水化合 物是异源的(杰佛瑞(Jefferis)等人，1998，免疫学评论(Immunol.Rev.) 163:59-76；赖特(Wright)等人，1997，生物技术趋势(Trends Biotech) 15:26-32，二者均通过引用全部结合在此)。对于人IgG，核心寡糖通常由具 有不同数目的外部残基的GlcNAc2Man3GlcNAc组成。
本披露的碳水化合物部分将根据用于描述寡糖的常用命名法进行描述。 使用此命名法的碳水化合物化学的综述见于哈伯德(Hubbard)等人，1981， 生物化学年评(Ann.Rev.Biochem.)50:555-583，该文献通过引用结合全部 结合在此。此命名法包括例如Man，代表甘露糖；GlcNAc，代表2-N-乙酰基 葡糖胺；Gal，代表半乳糖；Fuc，代表岩藻糖；以及Glc，代表葡萄糖。通过 简化符号NeuNAc(代表5-N-乙酰基神经氨酸)和NeuNGc(代表5-羟乙酰 基神经氨酸)描述唾液酸。
本披露涵盖了包括修饰的糖型或改造的糖型的抗体。在此使用的“修饰的 糖型”或“改造的糖型”一词意指一种碳水化合物组合物，该碳水化合物组合物 共价连接至一种蛋白质，例如一种抗体，其中所述碳水化合物组合物在化学 上不同于亲本蛋白的碳水化合物组合物。改造的糖型可以适用于多种目的， 包括但不限于增强或减小FcγR-介导的效应子功能。在一些实施例中，对本披 露的抗体进行修饰，以便减小共价连接至Fc区的岩藻糖基化寡糖的水平。已 证实，具有共价连接至Fc区的岩藻糖基化寡糖的减小的水平的抗体可具有增 加的ADCC活性。
本领域已熟知多种用于产生修饰的糖型的方法(新川(Shinkawa)等 人，2003，生物化学杂志(J Biol Chem)278:3466-3473)；(PCT WO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1)；山根-大贯 (Yamane-Ohnuki)等人，2004，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)87(5):614-621；(PotelligentTM技术[Biowa公司，普林斯顿 (Princeton)，新泽西州(N.J.)]；所有这些文献均通过引用明确结合在 此)。这些技术控制了共价连接至Fc区的岩藻糖基化寡糖的水平，例如通过 在改造的或其他的不同有机体或细胞系(例如Lec-13 CHO细胞或大鼠杂交瘤 YB2/0细胞)中表达IgG，或者通过调节涉及糖基化途径的酶(例如FUT8 [α1,6-岩藻糖转移酶]。
本披露提供一种组合物，该组合物包含具有一个Fc区的多种糖基化单克 隆抗-CD19抗体，其中约51％-100％的糖基化抗-CD19抗体在CH2结构域的 Asn297处包含无岩藻糖基核心碳水化合物结构，例如缺乏岩藻糖的一个核心 碳水化合物结构。在一些实施例中，约80％-100％、或约90％-99％、或约 100％的糖基化抗体在CH2结构域的Asn297处包括无岩藻糖基核心碳水化合 物结构。
前述是用于在本披露的方法中使用的抗-CD19抗体的实例。在美国公开 2008-0138336中提供了另外的示例性抗体，该公开的披露内容通过引用全部 结合在此。
在hCD19转基因大鼠模型系统中，在此所述的抗-CD19抗体可以有效地 消减表达重组人CD19分子的B细胞(参见，例如，谷沢(Yazawa)等人， 美国国家科学院院刊102(42):15178-83(2005)以及赫布斯特(Herbst)等 人，335(1):213-22(2010))。在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体可消 减循环B细胞、血液B细胞、脾脏B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、 腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体可以 实现以下细胞的消减：祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细 胞、小前B细胞、未成熟的B细胞、成熟的B细胞、抗原刺激的B细胞、和/ 或浆细胞。在某些实施例中，由本披露的抗-CD19抗体导致的B细胞消减可 以持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至 少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25 天、或至少30天。在一些实施例中，由本披露的抗-CD19抗体导致的B细胞 消减可以持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6 周、至少7周、至少8周、至少9周、或至少10周。在一些实施例中，由本 披露的抗-CD19抗体导致的B细胞消减可以持续至少1个月、至少2个月、 至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个 月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月。
在此所述的抗-CD19抗体也可以有效地消减人受试者中的B细胞。在某 些实施例中，本披露的抗-CD19抗体可以实现至少约20％、至少约30％、至 少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约 90％、至少约95％、或约100％B的细胞消减。在一些实施例中，本披露的抗- CD19抗体可以消减人受试者中的B细胞亚群。在一些实施例中，本披露的 抗-CD19抗体可以消减循环B细胞、血液B细胞、脾脏B细胞、边缘区B细 胞、滤泡性B细胞、腹膜B细胞、和/或骨髓B细胞。CD19存在于所有发育 阶段的B细胞表面上。抗-CD19抗体因此可以消减所有发育阶段的B细胞。 在一些实施例中，本披露的抗-CD19抗体可以实现以下细胞的消减：祖B细 胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟的B 细胞、成熟的B细胞、抗原刺激的B细胞、和/或浆细胞。B细胞的消减可以 持续延长的时间段。在某些实施例中，由本披露的抗-CD19抗体导致的B细 胞消减可以持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少 6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20 天、至少25天、或至少30天。在某些实施例中，由本披露的抗-CD19抗体 导致的B细胞消减可以持续至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至 少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、或至少10周。在某些 实施例中，由本披露的抗-CD19抗体导致的B细胞消减可以持续至少1个 月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少 7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个 月。
在一些实施例中，在此所述的抗-CD19抗体消减了至少约20％、至少约 30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、 至少约90％、至少约95％、或者约100％的循环B细胞、血液B细胞、脾脏 B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、腹膜B细胞、骨髓B细胞、祖B细 胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟的B 细胞、成熟的B细胞、抗原刺激的B细胞、和/或浆细胞。
B细胞的消减可以持续延长的时间段。在某些实施例中，由本披露的抗- CD19抗体导致的B细胞消减可以持续至少1天、至少2天、至少3天、至少 4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、 至少15天、至少20天、至少25天、或至少30天。在另一个实施例中，由 本披露的抗-CD19抗体导致的B细胞消减可以持续至少1周、至少2周、至 少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、 或至少10周。在另一个实施例中，由本披露的抗CD19抗体导致的B细胞消 减可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个 月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至 少11个月或至少12个月。
在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒 性(ADCC)、补体依赖的细胞介导的细胞毒性(CDC)、和/或细胞凋亡。 在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性 (ADCC)和/或细胞凋亡。在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体具有增 强的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)。在某些实施例中，本披露的抗- CD19抗体包含一个变体Fc区，该区介导增强的抗体依赖的细胞的细胞毒性 (ADCC)。在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体包含具有连接至 Asn297的多个复杂的N-糖苷连接的糖链的一个Fc区，其中岩藻糖未结合还 原端中的N-乙酰葡糖胺，其中所述Fc区介导增强的抗体依赖的细胞的细胞毒 性(ADCC)。
免疫偶联物和融合蛋白
根据本披露的某些方面，可以将多种治疗剂或毒素偶联到用于在本披露 的组合物和方法中使用的嵌合、人、或人源化抗-CD19抗体上。在某些实施 例中，这些偶联物可以作为融合蛋白产生。治疗剂和毒素的实例包括但不限 于烯二炔分子家族的成员，如卡里奇霉素(calicheamicin)和埃斯培拉霉素 (esperamicin)。化学毒素还可以从下组中获得，该组由以下各项组成：倍 癌霉素(duocarmycin)(参见，例如，美国专利号5,703,080和美国专利号 4,923,990)、甲氨蝶呤、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、 苯丁酸氮芥、ARA-C、长春地辛(vindesine)、丝裂霉素C、顺铂、依托泊 苷、博来霉素以及5-氟尿嘧啶。化学治疗剂的实例还包括阿霉素 (Adriamycin)、多柔比星(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara- C)、环磷酰胺、噻替派(Thiotepa)、泰素帝(Taxotere)(多西他赛 (docetaxel))、白消安(Busulfan)、细胞毒素(Cytoxin)、紫杉酚、甲氨 蝶呤、顺铂、美法仑、长春花碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂 霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素 (Daunomycin)、洋红霉素(Caminomycin)、氨蝶呤(Aminopterin)、更 生霉素(Dactinomycin)、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见，美国专利号 4,675,187)、美法仑、以及其他相关氮芥类。
在某些实施例中，将抗-CD19抗体偶联到细胞抑制剂、细胞毒素剂或者 免疫抑制剂上，其中细胞毒素剂选自下组，该组由以下各项组成：烯二炔、 来红霉素(lexitropsin)、贝癌霉素、紫杉烷、嘌呤霉素、尾海兔素 (dolastatin)、美登醇(maytansinoid)、以及长春花生物碱。在某些更具体 的实施例中，细胞毒素剂是紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓扑替康 (topotecan)、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、尾海兔 素-10、棘霉素、康普立停(combretastatin)、卡里奇霉素、美登素、DM-1、 奥瑞斯他汀(auristatin)E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(参见，美国专利 申请序列号10/983,340)、或者纺锤菌素。
在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体-细胞毒素剂偶联物的细胞毒素 剂是一种抗-微管蛋白剂。在特定实施例中，细胞毒素剂是选自下组，该组由 以下各项组成：长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、隐 花素(cryptophysin)、美登醇、康普立停、以及尾海兔素。在其他实施例 中，细胞毒素剂是长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16、喜树 碱、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、 秋水仙胺、雌氮芥、西马多丁(cemadotin)、圆皮海绵内酯 (discodermolide)、美登素、DM-1、AEFP、奥瑞斯他汀E、AEB、AEVB、 AEFP、MMAE或艾榴素(eleutherobin)。
在某些实施例中，抗-CD19抗体经由一个接头偶联至细胞毒素剂上，其 中该接头是一个肽接头。在其他实施例中，抗-CD19抗体经由一个接头偶联 至细胞毒素剂，其中该接头是一个val-cit接头、一个phe-lys接头、一个腙接 头、或一个二硫化物接头。
在某些实施例中，抗-CD19抗体-细胞毒素剂的抗-CD19抗体经由一个接 头偶联至细胞毒素剂，其中该接头在小于5.5的pH下是可水解的。在一个特 定的实施例中，该接头在小于5.0的pH下是可水解的。
在某些实施例中，抗-CD19抗体-细胞毒素剂的抗-CD19抗体经由一个接 头偶联至细胞毒素剂，其中该接头是通过一种蛋白酶可裂解的。在一个特定 实施例中，该蛋白酶是一种溶酶体蛋白酶。在其他实施例中，该蛋白酶尤其 是一种膜相关的蛋白酶、一种细胞内蛋白酶、或者一种内体蛋白酶。
在某些实施例中，抗-CD19抗体-细胞毒素剂偶联物的细胞毒素剂是一种 酪氨酸激酶抑制剂。示例性酪氨酸激酶抑制剂化合物包括ABT-869(雅培 (Abbott))、索坦(Sutent)(辉瑞(Pfizer))、KI-20227(麒麟啤酒 (Kirin Brewery))、CYC-10268(Cytopia)、YM-359445(安斯泰来制药 (Astellas Pharma))、PLX-647(Phenomix Corp./Plexxikon)、JNJ- 27301937(强生公司(Johnson&Johnson))、以及GW-2580(葛兰素史克 (GlaxoSmithKline))。
在其他实施例中，酪氨酸激酶抑制剂是一种Syk抑制剂。一个示例性 Syk抑制剂包括但不限于福他替尼(Fostamatinib)。在一些实施例中，酪氨 酸激酶抑制剂是一种Lyn抑制剂。一个示例性Lyn抑制剂包括但不限于巴氟 替尼(bafetinib)。在一些实施例中，酪氨酸激酶抑制剂是一种布鲁顿 (Bruton)酪氨酸激酶(Btk)抑制剂。一个示例性Btk抑制剂包括但不限于 PCI-32765(Pharmacyclics)。
可以用于本披露的免疫偶联物中的其他毒素包括有毒的凝集素、植物毒 素(如蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴莲根毒素)、肉毒毒素a(botulina)、以 及白喉毒素。当然，不同毒素的组合也可以连接至一个抗体分子，从而调节 可变的细胞毒性。适合用于本披露的组合疗法中的毒素例证是蓖麻毒素、相 思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋 白、白树毒素、白喉菌素毒素、假单胞菌外毒素、以及假单胞菌内毒素。参 见，例如，帕斯坦(Pastan)等人，细胞(Cell)，47:641(1986)；以及戈 尔登贝格(Goldenberg)等人，针对临床医师的癌症杂志(Cancer Journal for Clinicians)，44:43(1994)。可以使用的酶活性毒素以及其片段包括白喉A 链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻 毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、 石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻 风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托毒素 (mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、以及单端孢霉烯类。参 见，例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。
适合的毒素和化学治疗剂描述于雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第19版，(马克出版公司(Mack Publishing Co.)，1995)；以及古德曼和吉尔曼的治疗剂药理基础(Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第7版，(麦克米伦出 版公司(MacMillan Publishing Co.)，1985)中。其他适合的毒素和/或化学 治疗剂是本领域技术人员已知的。
组合疗法
在此所述的抗-CD19免疫疗法可以与其他B-细胞表面受体抗体组合来共 同给予，这些B-细胞表面受体抗体包括但不限于抗-CD20MAb、抗-CD52 MAb、抗-CD22抗体、以及抗-CD20抗体，如RITUXANTM(C2B8； RITUXIMABTM；IDEC制药公司)。
在此所述的抗-CD19免疫疗法可以与对选自下组的Fc受体特异的一种抗 体组合来共同给予，该组由以下各项组成：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、和/或 FcγRIII。在某些实施例中，在此所述的抗-CD19免疫疗法可以与对FcγRIIB 特异的一种抗体组合来给予。适用于这个目的的抗-FcγRIIB抗体已描述于美 国专利申请公开号2004185045、PCT公开号WO05051999A、WO05018669以 及WO04016750中。
在某些实施例中，抗-CD19和抗-CD20和/或抗-CD22mAb和/或抗-CD52 mAb可以任选地在相同药物组合物中以任何适合比率共同给予。为了进行说 明，抗-CD19和抗-CD20抗体的比率可以是约1000:1、500:1、250:1、100: 1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18: 1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、 7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、 1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1: 17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1: 90、1:100、1:250、1:500或1:1000或更大的一个比率。同样地，抗- CD19和抗-CD22抗体的比率可以是约1000:1、500:1、250:1、100:1、90: 1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17: 1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6: 1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1: 8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、 1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、 1:250、1:500或1:1000或更大的一个比率。类似地，抗-CD19和抗-CD52 抗体的比率可以是约1000:1、500:1、250:1、100:1、90:1、80:1、70: 1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15: 1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4: 1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1: 10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1: 20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:250、1: 500或1:1000或更大的一个比率。
用于治疗在此所述的MS的一种抗-CD19免疫疗法还可以与在治疗多发 性硬化症中可以是有活性的一种或多种另外的药物组合来共同给予。这些包 括干扰素-β，如阿沃纳斯(Avonex)TM和利比(Rebif)TM。在治疗多发性硬 化症中可以是有活性的其他药物包括克帕松(Copaxone)TM；皮质类固醇， 如泼尼松(prednisone)或甲基泼尼松；免疫抑制剂，如环孢霉素(或其他钙 调磷酸酶抑制剂，如普乐可复(Prograf)TM)；硫唑嘌呤，雷帕鸣 (Rapamune)TM和骁悉(Cellcept)TM；抗代谢物，如甲氨蝶呤；以及抗肿瘤 药，如米托蒽醌。
药用配制品
可以用一种药学上可接受的载体配制一种抗-CD19抗体组合物。术语“药 学上可接受的”意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性 材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任 选地其他治疗剂。此类药学上可接受的制剂常规地还可以含有适合给予人的 相容固体或液体填料、稀释剂或包封物质。当在药物中使用时，盐应该是药 学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以常规地用于制备其药学上可接 受的盐并且未被排除在本披露的范围之外。此类药理学上和药学上可接受的 盐包括但不限于从以下酸制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷 酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。而 且，药学上可接受的盐可以被制备为碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐 或钙盐。术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，活性成分与该载体 组合以促进应用。药物组合物的组分还能够与本披露的抗体以及与彼此以这 样一种方式共混：该方式使得不存在会实质性地减损所希望的药物疗效的相 互作用。
根据本披露的某些方面，可以通过以冻干制剂或水溶液的形式混合具有 所希望的纯度的抗体或免疫偶联物与任选生理学上可接受的载体、赋形剂或 稳定剂(雷明顿的医药科学，第16版，奥瑟A.(Osol,A.)编辑(1999)) 来制备抗-CD19抗体组合物以用于储存。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂 在所用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且它们包括缓冲液，例如磷酸 盐、柠檬酸盐、以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防 腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；氯化苄烷铵、氯化苯 乙铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，例如对羟苯甲酸甲酯或乙 酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少 于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血浆白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲 水性聚合物，例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、以及其他碳水化合物，包括 葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、 海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合 物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICS.TM.或聚 乙二醇(PEG)。
该抗-CD19抗体可以通过任何适合的方式来给予，这些方式包括肠胃外 给予、颅内给予、局部给予、皮下给予、腹膜内给予、肺内给予、鼻内给 予、和/或病灶内给予。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、或腹膜 内。此外，可以通过脉冲输注，例如以下降剂量的抗体来给予抗体。优选 地，抗体可以静脉内给予、颅内给予、皮下给予或鞘内给予，最优选地是静 脉内给予或皮下给予。
一些药物制剂包括但不限于：
(a)在100mg(10mL)或500mg(50mL)的单次使用的小瓶中以10 mg/ml的浓度供应的用于静脉内(i.v.)给予抗-CD19抗体的一种无菌、无防 腐剂液体浓缩物。可以使用氯化钠、柠檬酸钠二水合物、聚山梨醇酯以及无 菌注射用水配制该产品以进行i.v.给予。例如，可以9.0mg/mL氯化钠、7.35 mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80、以及无菌注射用水配 制该产品。将pH调节至6.5。
(b)在单次使用的小玻璃瓶中用于皮下(s.c.)注射的一种无菌、冻干粉 末。可以使用蔗糖、盐酸L-组氨酸一水合物、L-组氨酸以及聚山梨醇酯20配 制该产品。例如，每个单次使用的小瓶中可以包含150mg抗-CD19抗体、 123.2mg蔗糖、6.8mg盐酸L-组氨酸一水合物、4.3mg L-组氨酸、以及3mg 聚山梨醇酯20。单次使用的小瓶用1.3ml无菌注射用水重组来获得大约1.5 ml溶液，以递送125mg/1.25ml(100mg/ml)的抗体。
(c)用于静脉内(i.v.)给予的一种无菌、无防腐剂的冻干粉末。可以 用，α,α-海藻糖二水合物、盐酸L-组氨酸、组氨酸以及聚山梨醇酯20 (USP)配制该产品。例如，每个小瓶中可以包含440mg抗-CD19抗体、400 mg，α,α-海藻糖二水合物、9.9mg盐酸L-组氨酸、6.4mg L-组氨酸、以及1.8 mg聚山梨醇酯20(USP)。用20ml含有1.1％苄醇作为防腐剂的注射用抑菌 水(BWFI)(USP)进行重组，获得在大约6的pH下的含有21mg/ml抗体 的一种多剂量溶液。
(d)用于静脉内输注的一种无菌、冻干粉末，其中用蔗糖、聚山梨醇酯、 磷酸二氢钠一水合物、以及磷酸氢钠二水合物配制抗-CD19抗体。例如，每 个单次使用的小瓶可以包含100mg抗-CD19抗体、500mg蔗糖、0.5mg聚山 梨醇酯80、2.2mg磷酸二氢钠一水合物、以及6.1mg磷酸氢钠二水合物。不 存在防腐剂。在用10ml无菌注射用水(USP)重组之后，所得的pH是大约 7.2。
(e)用于皮下给予的一种无菌、无防腐剂溶液，用单次使用的、1ml预填 充注射器或自动注射器供应。可以用氯化钠、磷酸二氢钠二水合物、磷酸氢 钠二水合物、柠檬酸钠、柠檬酸一水合物、甘露醇、聚山梨醇酯80以及注射 用水(USP)配制该产品。可以添加氢氧化钠以将pH调节至约5.2。
例如，每个注射器可以被配制来递送0.8ml(40mg)的药物产品。每 0.8ml包含40mg抗-CD19抗体、4.93mg氯化钠、0.69mg磷酸二氢钠二水合 物、1.22mg磷酸氢钠二水合物、0.24mg柠檬酸钠、1.04柠檬酸一水合物、 9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨醇酯80以及注射用水(USP)。
(f)在单次使用的小瓶中含有的一种无菌、无防腐剂、冻干粉末，用无菌 注射用水(SWFI)(USP)重组并且作为皮下(s.c.)注射液给予。可以使用 蔗糖、盐酸组氨酸一水合物、L-组氨酸以及聚山梨醇酯配制该产品。例如， 75mg小瓶可以包含129.6mg或112.5mg的抗-CD19抗体、93.1mg蔗糖、 1.8mg盐酸L-组氨酸一水合物、1.2mg L-组氨酸、以及0.3mg聚山梨醇酯 20，并且被设计为在用0.9ml SWFI(USP)重组之后以0.6ml递送75mg抗 体。150mg小瓶可以包含202.5mg或175mg的抗-CD19抗体、145.5mg蔗 糖、2.8mg盐酸L-组氨酸一水合物、1.8mg L-组氨酸、以及0.5mg聚山梨醇 酯20，并且被设计为在用1.4ml SWFI(USP)重组之后以1.2ml递送150 mg抗体。
(g)用于以注射用水重组的一种无菌、冻干产品。可以使用甘露醇、组氨 酸和甘氨酸将该产品配制为用于肌肉(IM)注射的单次使用的小瓶。例如， 每个单次使用的小瓶可以包含100mg抗-CD19抗体、67.5mg甘露醇、8.7mg 组氨酸以及0.3mg甘氨酸，并且被设计为当用1.0ml无菌注射用水重组时以 1.0ml递送100mg抗体。作为另一个实例，每个单次使用的小瓶可以包含50 mg抗-CD19抗体、40.5mg甘露醇、5.2mg组氨酸以及0.2mg甘氨酸，并且 被设计为当用0.6ml无菌注射用水重组时递送50mg抗体。
(h)用于肌肉内(IM)注射的一种无菌、无防腐剂溶液，以100mg/ml的 浓度供应。可以在单次使用的小瓶中用组氨酸、甘氨酸、以及无菌注射用水 配制该产品。例如，每个单次使用的小瓶可以被配制为在1.2ml体积中具有 100mg抗-CD19抗体、4.7mg组氨酸、以及0.1mg甘氨酸，被设计成以1ml 递送100mg抗体。作为另一个实例，每个单次使用的小瓶可以被配制为在 0.7ml或0.5ml体积中具有50mg抗体、2.7mg组氨酸、以及0.08mg甘氨 酸，被设计成以0.5ml递送50mg抗体。
给药
本领域技术人员将了解，可以基于多个因素选择剂量和治疗方案，这些 因素包括受试者的年龄、性别、种族以及疾病状况(例如，MS的阶段和/或 形式)。例如，可以由本领域技术人员针对一位患者或患者群体中的特定阶 段和/或形式的MS确定适当剂量和治疗方案。可以使用本领域的标准方案生 成剂量反应曲线，以便确定本披露的组合物用于治疗患有不同阶段和/或形式 的MS的患者的有效量。例如，可以从剂量反应曲线来源的体外测试系统或 从动物模型(例如，棉鼠或猴)测试系统推测本披露的组合物的有效量。用 于评价抗体作用的模型和方法是本领域已知的(伍尔德里奇(Wooldridge)等 人，血液(Blood)，89(8):2994-2998(1997))，该文献通过引用整体结合 在此)。通常，患有更晚期的和/或更严重形式的MS的患者将需要更高的剂 量和/或更频繁的剂量，这些剂量与患有更早期和/或形式的MS的患者相比可 给予更长时间段。在某些实施例中，用于抗体疗法的本领域标准的治疗方案 可以与本披露的组合物和方法一起使用。
CD19密度测量(例如，CD19在患者B细胞表面上的密度)也可以帮助 确定受试者的适当治疗方案和剂量。确定结合细胞的抗体密度的方法是本领 域技术人员已知的(参见，例如，萨托(Sato)等人，免疫学杂志(J. Immunology)165:6635-6643(2000)；该文献披露了一种评定特异性CD抗 原的细胞表面密度的方法)。其他标准方法包括斯卡查德(Scatchard)分 析。例如，可以分离、放射性标记抗体或片段，并且确定放射性标记的抗体 的比活性。然后将该抗体与表达CD19的靶细胞接触。可以测量与细胞有关 的放射性并且基于比活性，确定结合细胞的抗体或抗体片段的数量。
用于测定CD19密度的另一种适合的方法采用荧光活化的流式细胞术。 大体来说，使抗体或抗体片段结合表达CD19的靶细胞。然后添加结合该抗 体的第二试剂，例如荧光物标记的抗免疫球蛋白抗体。然后可以测量荧光物 染色并且将其用于确定结合该细胞的抗体或抗体片段的密度。
在某些实施例中，以mg/kg患者体重为单位测量包含抗-CD19抗体的一 种组合物的剂量。在其他实施例中，以mg/kg患者瘦体重(即，体重减去体 脂肪含量)为单位测量包含抗-CD19抗体的一种组合物的剂量。仍在某些实 施例中，以mg/m2患者体表面积为单位测量包含抗-CD19抗体的一种组合物 的剂量。仍在某些实施例中，以给予患者的每剂量mg数为单位测量包含抗- CD19抗体的一种组合物的剂量。剂量的任何测量可以结合本披露的组合物和 方法来使用并且通过本领域标准的方式转换剂量单位。
在本披露的一些实施例中，抗-CD19抗体结合B细胞并且可以导致B细 胞的高效率(即，以低剂量)消减(如在此所述的)。可以实现较高的结合 程度，其中人CD19在患者B细胞表面上的密度是高的。在某些实施例中， 抗体(任选地在作为药物组合物的部分的药学上可接受的载体中)的剂量是 至少约0.0005mg/m2、0.001mg/m2、0.05mg/m2、0.075mg/m2、0.1mg/m2、 0.25mg/m2、0.375mg/m2、0.5mg/m2、1mg/m2、2.5mg/m2、5mg/m2、10 mg/m2、20mg/m2、37.5mg/m2、或50mg/m2和/或小于约500mg/m2、475 mg/m2、450mg/m2、425mg/m2、400mg/m2、375mg/m2、350mg/m2、325 mg/m2、300mg/m2、275mg/m2、250mg/m2、225mg/m2、200mg/m2、175 mg/m2、150mg/m2、125mg/m2、100mg/m2、75mg/m2、60mg/m2、50 mg/m2、37.5mg/m2、20mg/m2、15mg/m2、10mg/m2、5mg/m2、2.5mg/m2、 1mg/m2、0.5mg/m2、0.375mg/m2、0.1mg/m2、0.075mg/m2或0.01mg/m2。 在某些实施例中，该剂量是在约0.0005mg/m2至约200mg/m2之间、约0.001 mg/m2与150mg/m2之间、约0.075mg/m2与125mg/m2之间、约0.375mg/m2与100mg/m2之间、约2.5mg/m2与75mg/m2之间、约10mg/m2与75mg/m2之间、以及约20mg/m2与50mg/m2之间。在相关实施例中，使用的抗-CD19 抗体的剂量是至少约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5 mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2 mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5 mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9 mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、10.5mg/kg、11mg/kg、11.5mg/kg、12 mg/kg、12.5mg/kg、13mg/kg、13.5mg/kg、14mg/kg、14.5mg/kg、15 mg/kg、15.5mg/kg、16mg/kg、16.5mg/kg、17mg/kg、17.5mg/kg、18 mg/kg、18.5mg/kg、19mg/kg、19.5mg/kg、20mg/kg、20.5mg/kg患者体 重。在某些实施例中，使用的抗-CD19抗体的剂量是至少约0.1mg/kg至1 mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg、10 mg/kg至20mg/kg、或者15mg/kg至25mg/kg患者体重。在某些实施例中， 使用的抗-CD19抗体的剂量是至少约0.1mg/kg至1mg/kg、1mg/kg至5 mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、或者5mg/kg至10mg/kg 患者体重。在其他实施例中，使用的抗-CD19抗体的剂量是至少约5mg/kg、 6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、或10mg/kg患者体重。在某些实施例 中，抗体(任选地在作为药物组合物的部分的药学上可接受的载体中)的单 个剂量单位可以是至少约0.5mg/m2、1mg/m2mg/m2、2mg/m2、4mg/m2、6 mg/m2、8mg/m2、10mg/m2、12mg/m2、14mg/m2、16mg/m2、18mg/m2、20 mg/m2、22mg/m2、24mg/m2、26mg/m2、28mg/m2、30mg/m2、32mg/m2、 34mg/m2、36mg/m2、38mg/m2、40mg/m2、42mg/m2、44mg/m2、46 mg/m2、48mg/m2、50mg/m2、52mg/m2、54mg/m2、56mg/m2、58mg/m2、 60mg/m2、62mg/m2、64mg/m2、66mg/m2、68mg/m2、70mg/m2、72 mg/m2、74mg/m2、76mg/m2、78mg/m2、80mg/m2、82mg/m2、84mg/m2、 86mg/m2、88mg/m2、90mg/m2、92mg/m2、94mg/m2、96mg/m2、98 mg/m2、100mg/m2、102mg/m2、104mg/m2、106mg/m2、108mg/m2、110 mg/m2、112mg/m2、114mg/m2、116mg/m2、118mg/m2、120mg/m2、122 mg/m2、124mg/m2、126mg/m2、128mg/m2、130mg/m2、132mg/m2、134 mg/m2、136mg/m2、138mg/m2、140mg/m2、142mg/m2、144mg/m2、146 mg/m2、148mg/m2、150mg/m2、152mg/m2、154mg/m2、156mg/m2、158 mg/m2、160mg/m2、162mg/m2、164mg/m2、166mg/m2、168mg/m2、170 mg/m2、172mg/m2、174mg/m2、176mg/m2、178mg/m2、180mg/m2、182 mg/m2、184mg/m2、186mg/m2、188mg/m2、190mg/m2、192mg/m2、194 mg/m2、196mg/m2、198mg/m2、200mg/m2、204mg/m2、206mg/m2、208 mg/m2、210mg/m2、212mg/m2、214mg/m2、216mg/m2、218mg/m2、220 mg/m2、222mg/m2、224mg/m2、226mg/m2、228mg/m2、230mg/m2、232 mg/m2、234mg/m2、236mg/m2、238mg/m2、240mg/m2、242mg/m2、244 mg/m2、246mg/m2、248mg/m2、或250mg/m2。在其他实施例中，抗-CD19 抗体的剂量是高达每单个剂量单位1g。在其他实施例中，抗-CD19抗体的剂 量范围是每单个剂量单位从10mg至1000mg。在一些实施例中，抗-CD19抗 体的剂量范围是每单个剂量单位从10mg至100mg、15mg至150mg、100 mg至200mg、150mg至250mg、200mg至300mg、250mg至350mg、300 mg至400mg、350mg至450mg、400mg至500mg、450mg至550mg、500 mg至600mg、550mg至650mg、600mg至700mg、650mg至750mg、700 mg至800mg、750mg至850mg、800mg至900mg、850mg至950mg、或 900mg至1000mg。
所有以上剂量是示例性的并且可以与本披露的组合物和方法结合来使 用。然而，在一种抗-CD19抗体与毒素或放射治疗剂结合使用的情况下，可 以优选以上所述的较低剂量。在某些实施例中，在患者具有较低CD19密度 水平的情况下，可以优选以上所述的较低剂量。
在本披露的方法的一些实施例中，可以低于约375mg/m2的一个剂量； 以低于约37.5mg/m2的一个剂量；以低于约0.375mg/m2的一个剂量；和/或 以约0.075mg/m2与约125mg/m2之间的一个剂量给予本披露的抗体和/或组合 物。在本披露的方法的某些实施例中，剂量方案包括以重复的间隔给予的低 剂量。例如，在一个实施例中，可以在大约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、 175、或200天的间隔内以低于约375mg/m2的剂量给予本披露的组合物。
指定剂量在使用本披露的组合物和方法治疗的患者中可以导致B细胞消 减持续至少约1、2、3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150 或180天或更长的时间段。在某些实施例中，消减前-B细胞(未表达表面免 疫球蛋白)。在某些实施例中，消减成熟B细胞(表达表面免疫球蛋白)。 在其他实施例中，所有非恶性类型的B细胞可以展现消减。任何这些类型的 B细胞可以用于测量B细胞消减。可以在体液如血清中或者在组织如骨髓中 测量B细胞消减。在本披露的方法的某些实施例中，与在使用本披露的组合 物和方法之前治疗的患者体内的B细胞水平相比，B细胞消减至少30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。在本披露的方法的其他实施 例中，与人的典型标准B细胞水平相比，B细胞消减至少30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％、或100％。在相关实施例中，使用就年龄、性别、 重量、以及其他因素而言与正在治疗的患者可比较的患者确定人的典型标准 B细胞水平。
在本披露的某些实施例中，可以增大或减小剂量以便在血液或组织(例 如但不限于骨髓)中维持一个恒定剂量。在相关实施例中，将剂量增大或减 小约2％、5％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、以及95％，以便维持所希望的水平的本披露的组合物和方法中的 抗体。
在某些实施例中，基于患者对本披露的组合物和方法的免疫原性反应， 可以调整剂量和/或减小输注速率。
根据某些实施例，剂量方案(例如，治疗方案)包括向MS受试者给予 一个有效量的CD19抗体以提供0.1至1、1至5、1至10、5至15、10至 20、或15至25mg/kg患者体重的初始抗体暴露，随后提供0.1至1、1至5、 1至10、5至15、10至20、或15至25mg/kg患者体重的第二CD19抗体暴 露，该第二CD19抗体暴露直到从初始抗体暴露起约15周至60周才提供。在 一些实施例中，剂量方案包括向MS受试者给予10mg至1000mg、10mg至 200mg、100mg至300mg、200mg至400mg、300mg至500mg、400mg至 600mg、500mg至700mg、600mg至800mg、700mg至900mg、或800 mg至1000mg的CD19抗体的初始抗体暴露，随后给予10mg至1000mg、 10mg至200mg、100mg至300mg、200mg至400mg、300mg至500mg、 400mg至600mg、500mg至700mg、600mg至800mg、700mg至900 mg、或800mg至1000mg的CD19抗体的第二抗体暴露，第二CD19抗体暴 露直到从初始抗体暴露起约15周至60周才提供。在一些实施例中，第二次 暴露直到从初始暴露起从约15-20周、从约17-23周、从约20-25周、从约 23-27周、从约25-30周、从约27-33周、从约30-35周、从约33-37周、从约 35-40周、从约37-43周、从约40-45周、从约43-47周、从约45-50周、从约 47-53周、从约50-55周、从约53-57周、或者从约55-60周才给予。出于本 披露的目的，第二CD19抗体暴露是在初始抗体暴露之后下一次用CD19抗体 治疗受试者的时候，在初始暴露与第二暴露之间不存在介入的CD19抗体治 疗或暴露。
在一些实施例中，第二CD19抗体暴露直到从初始暴露起约20周至30 周才提供，任选地随后提供约1至10、5至15、10至20、或15至25mg/kg 患者体重的第三CD19抗体暴露。在一些实施例中，该第三CD19抗体暴露包 括10mg至1000mg、10mg至200mg、100mg至300mg、200mg至400 mg、300mg至500mg、400mg至600mg、500mg至700mg、600mg至800 mg、700mg至900mg、或800mg至1000mg。在其中给予第三次暴露的实 施例中，该第三次暴露直到从初始暴露起从约40至60周、或从约40至46 周、或从约43-47周、或从约45-50周、或从约47-53周、或从约50-55周、 或从约53-57周、或从约55-60周才给予。在某些实施例中，另外的CD19抗 体暴露直到从初始暴露起至少约70-75周才提供。
可以作为单个剂量的抗体或者作为两个单独剂量的抗体(即，构成第一 和第二剂量)向患者提供在此所述的抗体暴露中的任何一个或多个。每次抗 体暴露所采用的具体剂量数目(一个或两个)是依赖于例如所治疗的MS类 型、所采用的抗体类型、是否采用第二药物和采用的第二药物的类型、以及 给予的方法和频率。在给予两个单独剂量的情况下，优选从给予第一剂量的 时间起的从约3至17天、从约6至16天、从约13至16天、或者15天给予 第二剂量。在给予两个单独剂量的情况下，抗体的第一和第二剂量优选是约1 至10、5至15、10至20、或者15至25mg/kg患者体重。在一些实施例中， 第一和第二剂量包括对MS受试者的10mg至1000mg、10mg至200mg、 100mg至300mg、200mg至400mg、300mg至500mg、400mg至600 mg、500mg至700mg、600mg至800mg、700mg至900mg、或800mg至 1000mg的一种CD19抗体。
制造的物品
在某些实施例中，提供了一种含有适用于治疗上述多发性硬化症的物质 的制造的物品。在一些实施例中，该制造的物品包括：(a)一个包含一种组合 物的容器，该组合物在该容器内包含结合CD19的一种抗体和一种药学上可 接受的载体或稀释剂；以及(b)具有说明书的一个包装插入物，该说明书用于 向罹患多发性硬化症的受试者给予该组合物，以提供约1至10、5至15、10 至20、或15至25mg/kg受试者体重的初始抗体暴露，随后提供约1至10、5 至15、10至20、或15至25mg/kg受试者体重的至少一个第二抗体暴露，该 至少第二暴露直到从该初始暴露起从约16周至60周才提供。
该制造的物品包括一个容器和在该容器上或与该容器相关联的一个标签 或包装插入物。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。这些容器可以由 多种材料(例如玻璃或塑料)形成。该容器容纳或包含对治疗多发性硬化症 有效的一种组合物，并且可以具有一个无菌进入孔(例如该容器可以是静脉 内溶液袋或具有皮下注射针可穿透的塞子的小瓶)。在组合物中至少一种活 性剂是该抗体。标签或包装插入物指示，以所提供的关于抗体与任何其他药 物的给药剂量和间隔的具体指导来将该组合物用于治疗罹患多发性硬化症的 受试者的多发性硬化症。该制造的物品可以进一步包括第二个容器，该第二 个容器包含药学上可接受的稀释缓冲剂，例如注射用抑菌水、磷酸盐缓冲盐 水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。该制造的物品可以进一步包括从商业以及 使用者立场上来看所希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、 针、以及注射器。
实例
实例1.300B4-CD19结合测定
可以在一种基于细胞的CD19结合测定中评定嵌合、人源化、或人抗- CD19抗体结合hCD19的能力，该结合测定利用表达重组细胞表面人CD19以 作为捕获剂的300B4细胞。根据标准方案，在1mg/ml G418存在下在含有L- 谷氨酰胺并补充有10％胎牛血清、β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中培养 300B4细胞。一种标准ELISA方案可以用于该基于细胞的CD19结合测定。 例如，将1×105 300B4细胞接种在96孔U底板的个别孔中并且孵育过夜。在 冰上用人、人源化、或嵌合抗-CD19抗体孵育之前将细胞用ELISA缓冲液洗 涤一次。以重复三份对每个测试的抗体浓度进行结合反应。在该测定中应包 括使用无相关特异性的同种型匹配的抗体的阴性对照孔。在用抗体孵育之 后，将300B4细胞用200微升ELISA缓冲液洗涤三次。可以根据标准方案， 使用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人κ抗体检测结合300B4细胞的嵌合、 人源化、或人抗-CD19抗体的数量。
实例2.体外ADCC测定
CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(普洛麦格(Promega))是51Cr 释放细胞毒性测定的一个测热替代方案。CytoTox 96TM测定定量地测量乳酸 脱氢酶(LDH)，该乳酸脱氢酶是在细胞裂解时释放的一种稳定胞质酶。使 用一种30-分钟偶合酶学测定测量培养上清液中释放的LDH，该测定导致四 唑盐(INT)转化为红色的甲产物。形成的颜色的量与裂解的细胞数量成比 例。
根据制造商的指导进行这些测定。简言之，用PBS洗涤靶细胞，以0.4× 106/ml的细胞密度将其重悬于RPMI-5无苯酚培养基中。将NK效应细胞在 PBS中洗涤一次并且以细胞密度1×106/ml将其重悬于RPMI-5无苯酚培养基 中。在U底部96孔板中进行测定。每个测定板包括实验孔和对照孔的组合。 实验孔通过合并50μl适当抗体稀释液、50μl靶细胞悬浮液以及50μl效应细 胞悬浮液来建立。以上所述的细胞密度引起靶细胞与效应细胞的1:2.5比 率；如果需要不同的靶细胞与效应细胞比率，可以进一步稀释或浓缩效应细 胞储备液。若干不同类型的对照孔用于说明(i)来自靶细胞的自发性LDH释 放(靶自发性)、(ii)来自效应细胞的自发性LDH释放(效应子自发性)、 (iii)来自靶细胞的最大LDH释放(靶最大值)、以及(iv)污染物在培养基中 的存在(背景)。在96孔板上使用的所有孔包含相同的最终体积。重复三份 地建立反应。建立之后，以120×g将板旋转3分钟，以使细胞成团。在37℃ 和5％CO2下将板孵育4小时。在结束孵育之前45分钟时，将15μl制造商提 供的裂解缓冲液添加到靶细胞最大释放对照孔中。孵育之后，在120×g下将 板离心4分钟。将来自每个孔的50μl上清液转移到新平底96孔板中。添加 50μl的重组底物混合物(由制造商提供的组分组合)并且在室温下将板避光 孵育10-20分钟。添加50μl制造商提供的终止缓冲液并且在板读数器中测量 490nm或492nm的吸光度。％细胞毒性＝(实验-效应子自发性-靶自发性)/ (靶最大值-靶自发性)。在计算％细胞毒性之前，所有其他值均减去背景。
实例3.体外FcγRIIIA受体结合测定
可以使用ELISA测定确定不同人源化抗-CD19抗体制剂对人FcγRIIIA受 体(CD16)的相对结合亲和力。在4℃下用50μl抗体制剂(50μg/ml)涂覆 微量滴定板过夜。在37℃下用PBS缓冲液(封闭缓冲液)中的4％脱脂奶将 任何剩余结合位点封闭1h。在洗涤这些孔之后，将50μl连续稀释的单体 FcRIIIA-标签蛋白添加到每个孔中并且在37℃下孵育60min。将50μl的2.5 μg/ml抗-标签-ME-生物素(西格玛公司(Sigma))添加到每个孔中并且在 37℃下孵育30min。在用每一种以下试剂进行孵育之间洗涤孔。将50μl的 0.1μg/ml抗生物素蛋白偶联的HRP(倍捷公司(PIERCE))添加到每个孔中 并且在37℃下孵育30min。通过添加30μl四甲基联苯胺(TMB)底物(倍 捷公司)、之后用30μl的0.2M H2SO4进行中和来进行检测。在450nm下读 出吸光度。
还可以在BIAcore 3000仪器(BIAcore AB，乌普萨拉(Uppsala)，瑞 典(Sweden))上确定不同人源化抗-CD19抗体制剂对不同人和鼠FcγR的相 对结合亲和力。简言之，使用如仪器制造商列出的一种标准氨基偶合化学反 应，将岩藻糖基化和无岩藻糖基化形式的IgG1人源化的CD19mAb固定到 CM5传感器芯片上的单独的流动细胞上。还在每个传感器芯片上制备没有 mAb的参考流动细胞。使用仪器缓冲液(含有0.01M HEPES、pH 7.4、0.15 M NaCl、3mM EDTA、以及0.005％P-20去垢剂的HBS-EP缓冲液)连续稀 释FcγR的储备溶液(奥加尼西安(Oganesyan)等人，2008)。以5μl/min 的流速将FcγR注入到IgG和参考细胞表面二者上。持续50min收集结合数 据，随后在各个注射之间对5mM HCl进行60秒脉冲以便从IgG表面除去结 合的FcγR。在收集所有结合数据之后，对各个浓度下的结合(在平衡状态下 的反应)的个别数据集合取平均值，并且然后将其拟合至1:1结合等温(在 平衡状态下的反应对比浓度)图。由此，得到KD值。使用BIA评价软件4.1 版(BIAcore AB)进行此类计算。
实例4：CD19在来自人CD19转基因(huCD19Tg)小鼠的浆细胞中的表达
在BLIMP gfp小鼠中，改造浆细胞以表达绿色荧光蛋白(GFP)，从而 易于鉴别这些细胞。通过育种来形成BLIMPgfp+huCD19Tg小鼠，从这些小 鼠中收获脾脏和骨髓细胞并且将这些细胞制备成用于流式细胞术的单一细胞 悬浮液。用抗-CD45R/B220(AlexaFluor 700)、抗-鼠CD19 (PerCPCy5.5)、以及抗-人CD19(APC Cy7)对细胞进行染色。在小鼠 中，浆细胞在细胞表面上表达鼠CD19、以及转基因人CD19。huCD19在浆 细胞上的水平略低于在脾脏和骨髓中的B220+B细胞并且muCD19在浆细胞 上的水平也是低的。
实例5：在卵清蛋白(ova)免疫的人CD19转基因(huCD19Tg)小鼠中 16C4-aFuc对抗体滴度和浆细胞数目的作用
检测无岩藻糖基MAb 16C4(16C4-aFuc)对Ova特异性和总IgG的作 用。使用100μg卵清蛋白(ova)和CFA皮下(s.c.)免疫HuCD19Tg小鼠。 在免疫后四周，当生发中心反应平息时，用10mg/kg 16C4-aFuc或同种型对 照(R347aFuc)静脉(IV)注射小鼠。在免疫前的一周和免疫之后每两周将 血液框后收集到肝素管中，直到10周的研究终点。遵循用于小鼠Ig同种型试 剂盒(密理博公司(Millipore))的制造商方案，通过进行Luminex测定来 确定总IgG。通过ELISA确定Ova特异性IgG。简言之，在40℃下将Ova涂 覆到NUNC高结合板上，过夜。在封闭之后在RT下将样品和标准品(圣克 鲁兹公司(Santa Cruz))孵育一个小时。洗涤板，然后用山羊抗小鼠总IgG HRP(南生物技术公司(Southern Biotech))涂覆这些板。最后，在添加 TMB底物之后确定OD值。在图2A中的图表示出抗体的平均值+/-SE μg/mL。
在免疫之后，所有小鼠均证实在第2周的100倍增大的Ova特异性IgG 抗体滴度和增大的总IgG滴度。在用16C4-aFuc治疗之后，血清中的总IgG 和Ova特异性IgG滴度与用同种型对照抗体处理的小鼠相比显著减小。
检测对来自骨髓的产生IgG(总量和Ova特异性)的浆细胞的作用：用 ova和CFA皮下(s.c.)免疫C57Bl/6xhCD19Tg+/-小鼠。在免疫后四周，用 10mg/kg 16C4-aFuc、非-Fcγ受体结合对照(16C4-TM)、或PBS静脉(IV) 注射小鼠。在MAb治疗后两周，从小鼠中收集骨髓(BM)细胞。遵循一般 制造商方案(MABTECH)，通过ELISpot检测抗体形成细胞(AFC)。然后 遵循相同的一般方案，通过用Ova涂覆板来检测Ova特异性AFC。图2B显 示用16C4-aFuc进行治疗显著减少了骨髓中的总IgG和Ova特异性IgG AFC 的数量，而非-Fcγ受体结合对照(16C4TM)没有作用。
实例6：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对血液和组织B细胞的作 用
遵循医疗免疫(MedImmune)动物使用政策，通过使用hCD19Tg小鼠 育种SLE1+/+小鼠来形成SLE1xhCD19Tg+/-小鼠。在第0周，用10mg/kg 16C4-aFuc或相同剂量的对照抗体(16C4-TM)IV给药SLE1xhCD19Tg+/-小 鼠。小鼠在第2周接受相同治疗并且随后以6周开始持续多至10周每两周以 300μg/小鼠用16C4-aFuc进行IP注射。通过在整个实验持续时间内每2周框 后放血到肝素管中来收集血液。当研究在第12周终止时，回收脾脏、血液和 骨髓细胞并且使其经受FACS和ELISpot分析。通过ELISA分析血清样品。 在图3A中示出了在SLE1xhCD19Tg+/-小鼠中的16C4的纵向研究示意图。
在用抗-CD45R/B220和抗-鼠CD19 MAb染色之后通过FACS检测总循 环B细胞。在图3B中的图表代表在研究中的每只小鼠的B220+mCD19+B细 胞数目，无论小鼠是用16C4-aFuc(橙色圆圈)治疗还是用非-Fcγ受体结合对 照16C4-TM(黑色正方形)治疗。用16C4-aFuc治疗的所有小鼠初始具有> 90％的循环B细胞消减。在IV注射后6周，一部分小鼠具有瞬时B细胞恢 复，但是所有小鼠在IP注射之后再次消减B细胞，直到研究结束。
在用16C4-aFuc多次治疗之后的第十二周检测16C4-aFuc对 SLE1xhuCD19Tg小鼠脾脏中的总的和生发中心的B细胞的作用。与对照 MAb治疗的小鼠相比，SLExhCD19Tg小鼠在脾脏中具有>90％的B细胞减 少。在图3C中的图表描绘了通过FACS染色检测的总B细胞或生发中心B 细胞数目。用抗-CD45R/B220(AlexaFluor 700)检测总B细胞。作为PNA+ (FITC)和IgD-(Alexa 647)检测生发中心B细胞。
还检测了16C4-aFuc对SLE1xhuCD19Tg小鼠的骨髓中的B细胞群的作 用。通过FACS染色确定用16C4-aFuc治疗SLExhCD19Tg小鼠之后的骨髓B 细胞数目。在研究开始之后第12周从相同小鼠中收集两根股骨并且使用以下 抗体通过FACS分析细胞的单一细胞悬浮液：CD43(FITC)、IgM(PE- Cy7)、IgD(亚莉克莎(Alexa)647)、CD45R/B220(A700)。与对照相 比，在16C4治疗的小鼠中总B细胞(B220+)数目减少了68％，如图3D所 示。剩余的大部分B细胞被认为是祖B细胞(CD43+IgM-)，这些细胞具有 非常低的转基因CD19表达。
实例7：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对脾脏和骨髓浆细胞的作 用
在用16C4-aFuc治疗之后通过CD138(PE)染色或通过ELISpot检测 SLExhCD19Tg脾脏和骨髓浆细胞。(参见图4A和图4B)将FACS数据绘制 为CD138+B细胞总数。在12周，脾脏中的浆细胞减少98％，而骨髓 (BM)中的浆细胞数目没有显著变化。(参见图4C和图4D)总IgG和IgM 抗体形成细胞(AFC)的ELISpot数据证实一个相似的模式，借此脾脏AFC 存在显著减少并且在BM中没有检测到差异。
实例8：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–对抗-dsDNA自身抗体的作 用
在16C4-aFuc治疗的12周之后使用ELISpot测定检测SLExhCD19Tg小 鼠的脾脏和BM中的抗-dsDNA AFC。BM中的抗-dsDNA特异性AFC水平没 有差异，而对抗-dsDNA特异的脾脏AFC中存在显著减少(参见图5)。
实例9：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–随着时间对血清免疫球蛋 白的作用
持续12周每两周从用16C4-aFuc 2x/月治疗的SLExhCD19Tg小鼠中收集 血清。遵循用于小鼠Ig同种型试剂盒(密理博公司)的制造商方案，通过进 行Luminex来检测血清Ig水平。图6示出了作为基线(第0天)水平百分比 绘制的所得数据。与治疗之前的水平相比，在用16C4-aFuc治疗的小鼠中血 清IgM、IgG1、IgG2a、以及IgG2b显著减少。然而，同种型抗体治疗之前和 之后的水平是相似的。IgG3和IgA没有显著不同。
实例10：用16C4-aFuc治疗SLE1xhuCD19Tg小鼠–减少血清中的自身抗体
持续12周(给药2x/月)用16C4-aFuc或阴性对照MAb(16C4TM)治 疗SLExhCD19Tg小鼠。使用来自阿尔法诊断公司(Alpha Diagnostics)的预 先制备的ELISA试剂盒(遵循制造商方案)检测血清中的自身抗体水平。图 7示出了用图表表示为基线(第0天)百分比的抗-ANA、抗-组蛋白以及抗- dsDNA滴度的数据。在8周和12周，自身抗体滴度减少40％-80％。
实例11：在来自人组织的浆母细胞和大多数浆细胞上的CD19表达
对CD19呈阳性的CD27+CD38高细胞具有一种浆细胞表型并且分泌IgG
在BD FACSAria II细胞分选仪上经由FCM分选骨髓单核ASC (CD38hiCD27+CD19+CD20-)和B细胞(非-PC门控的，CD19+CD20+)。 基于CD38和CD27表达将细胞分成两部分。在CD19+CD20-上进一步门控 CD38hiCD27+(PC)并且将非-PC细胞进一步门控到CD19+CD20+未成熟B 细胞中(FACS图，图8A)。分选这2个群体并且进一步通过形态学进行表 征(图8B)。赖特氏(Wright)染色分选的细胞的一个实例显示具有良好限 定的大细胞核的两个部分，然而CD19+PC分选的部分展示不存在于 CD19+CD20+非-PC部分中的PC的特征性细胞核周围细胞质特征。
分选细胞的总IgG ELISpot显示CD19+PC门控细胞分泌在10细胞/孔下 可检测的IgG(图8C)。该CD19+CD20+非-PC部分没有显示任何实际的细 胞斑点。从这些结果可以看出，对CD19呈阳性的CD27+CD38高细胞具有一 种浆细胞表型并且分泌IgG。
在来自血液和淋巴器官的CD27+CD38高抗体分泌细胞(ASC)上表达CD19
通过流式细胞术，针对CD19和CD20的相对表达分析来自血液 (PBMC)和淋巴器官(扁桃体、脾脏、骨髓)的CD38高CD27+细胞。
作为实线绘图，示出在CD38hiCD27+ASC上的CD19(图9的左列)和 CD20(图9的右列)表面表达的代表性覆盖图。在阴影灰色曲线下示出每个 组织的活单核细胞用于比较。
CD19在来自分析的血液和生发组织的大多数ASC上表达。仅脾脏和骨 髓包含对CD19呈阴性的一种不同CD38高CD27+群。在血液和大多数组织 中，分析的CD38高CD27+细胞对CD20呈阴性。
来自BM的CD19阴性ASC群包含对疫苗抗原的大部分体液记忆
BM包含可以基于它们的CD19表达来分化的两种不同PC群。大多数 BM PC表达CD19，而小量细胞群是CD19阴性的(FACS图，图10顶 部)。
通过ELIspot，针对总IgG分泌和对于特异性疫苗抗原的抗体产生，分析 CD19阳性和阴性PC(图10底部)。与CD19+PC相比，BM CD19-PC示出 具有增加的频率的对于疫苗抗原的记忆样特异性。CD19+和CD19-在总IgG ELISpot上显示相似的斑点数目(500个分选的抗体分泌细胞(ASC))。然 而，在CD19-部分中，来自对Fluzone或Daptacel特异的ASC的ELISspot数 目有所增加(3000个分选的ASC)。
实例12：浆细胞特征标记
使用来自健康志愿者的分选的细胞部分和纯化PC的全基因组微阵列分 析，开发特征标记得分来整合多个PC富含的基因(IGHA、IGJ、IGKC、 IGKV、以及TNFRSF17)的表达水平，以评估患者样品中的PC计数。使用 这种新开发的基于基因表达的PC特征标记来监控在MI-CP200中登记的患者 中的这种细胞群的变化，该MI-CP200是硬皮症中的16C4afuc第I期剂量增 加试验(NCT00946699)。在16C4afuc的单个剂量之后的不同时间点(在第 3天、第29天、第85天在全血中；第29天在皮肤中)，在血液和皮肤样品 中评价PC和B细胞特征标记的基因表达变化。相对于每位患者的基线(第1 天)样品计算这些特征标记的变化。
结果指示，16C4afuc引起WB中的PC基因特征标记的稳健减少，其中 最大消减是大约98％并且持续消减直到治疗后第85天(图A-1)。在第85 天，测量的最后时间点，PC特征标记恢复至基线的大约65％(图11)。在所 有测量的时间点，在基线与WB中的PC特征标记的MEDI-551治疗后的值之 间的差异在统计学上是显著的(p<0.01)。还观察到在16C4afuc治疗之后在 皮肤样品中的PC基因特征标记在统计学上显著减少(p<0.05)，从而达到 90％的最大水平和大约55％的中值(图12)。此外，在具有匹配的血液和疾 病组织样品的患者中，在WB和皮肤中不存在PC基因特征标记的一致性抑制 (斯皮尔曼(Spearman)等级相关r＝0.72，p＝0.002；图13)。
实例13：介导的人浆细胞(PC)消减
评价16C4afuc介导人浆细胞(CD27高CD38高)的抗体依赖的细胞介 导的细胞毒素死亡的能力。
对于体外PC分化测定，在收到知情同意之后，从健康供体(n＝3)中 获取新鲜人血。将样品抽入到含有肝素钠的CPT管中并且在收集的两个小时 内进行处理。根据由产品插入物提供的标准方案，从全血中分离PBMC。使 用MACS细胞分离试剂阴性选择原初和记忆B细胞，以除去非-B以及先已存 在的PC群。在非分化(未补充的)或浆细胞分化(抗-IgM/抗-CD40/IL-21补 充的)条件下铺板所得的B细胞。在培养6.5天之后，经由标准4h ADCC测 定方案评定以下抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱发可能 性：16C4afuc(针对CD19的非岩藻糖基化hIgG1)、16C4TM(为减小的效 应子活性调节的针对CD19的三重突变体hIgG1)、hIgG1afuc(非岩藻糖基 化的非特异性hIgG1对照)以及美罗华(Rituxan)(针对CD20的 hIgG1)。简言之，交换消耗的培养基并且以含有适当抗体的培养基重悬于孔 中。以2:1的E:T比率添加IL-2预先活化的KC1333NK细胞。在孵育4-6 小时之后，经由用英杰公司(Invitrogen)可固定的活/死鉴别物和B细胞标记 物(CD19、CD20、CD27、以及CD38)进行染色来评定细胞毒性效力。在 48h内对所有样品进行染色、固定并且在LSR II流式细胞仪上流动。
对于主要骨髓来源的PC消减测定，从龙沙公司(Lonza)获得新鲜健康 供体(n＝2)人骨髓。将样品收集50ml锥形管中，在冷冻条件下在同一天 装运并且在收集的两个小时内进行处理。使用STEMCELL细胞分离试剂阴性 选择原初、记忆以及PC B细胞，以除去非-B细胞群。铺板所得的B细胞并 且经由如上所述的标准ADCC测定方案评定测试和对照抗体的ADCC诱发可 能性，不同之处在于：测定孵育时间延长至6小时并且以1:1的E:T比率添 加KC1333NK细胞。
ADCC数据显示hPBMC分化的PC(图14)以及从人骨髓中新鲜分离的 PC(图15)二者的16C4afuc介导的显著消减。在两个测定中，将浆细胞以 流式细胞术鉴别为纯化的B细胞群内的CD27高CD38高淋巴细胞(图14A 和图15B)。
正如预期的，向CD27高CD38高PC的稳健分化是依赖于PC分化培养 基(图14A)和大部分所得的PC共表达的CD19和CD20(图15B)的包 含。使用大量淋巴细胞群(数据未显示)设定象限门控。在3个供体的3个 中，通过所有测试剂量的16C4afuc，使PC显著消减(p-值≤0.001)。以1 ug/ml给药的美罗华还介导体外分化的PC的显著消减，尽管来自无抗体对照 的减小比用相似剂量的16C4afuc接种更温和。以1ug/ml添加16C4TM和 hIgG1afuc对照抗体具有最小的影响。
在从人骨髓中新鲜分离的CD27高CD38高PC上的CD19表达在两种供 体中大于83％。CD20表达仅由少于4％的总PC微弱地表达(图15B)。在 100％供体中，通过所有测试剂量的16C4afuc，使PC显著消减(p-值≤ 0.001)。以1ug/ml给药的美罗华还介导新鲜分离的骨髓PC的显著的(尽管 不是稳健的)消减。以1ug/ml添加16C4TM和hIgG1afuc对照抗体具有最小 的影响。
实例14：在来自多发性硬化症(MS)患者的全血(WB)和(脑脊液) (CSF)中的免疫细胞FACS表型分析
评价在RRMS患者的CSF对比WB中的浆细胞和浆母细胞的存在，并 且通过FACS检测它们与CD20表达模式相比的CD19表达模式。
从RRMS患者收集WB和CSF。使用一组可商业获得的、荧光偶联的抗 体对用于流式细胞术分析的细胞进行染色。洗涤细胞并且然后将其重悬于 PBS/FCS中以供获取。为了确定CD19对比CD20的表达，将细胞在大小、单 峰和CD45(造血干细胞系标记物)上门控。
结果显示在RRMS患者的CSF中富含CD19+CD20-浆母细胞和浆细胞。 图16示出了3个代表性流式细胞图。可以在来自WB和CSF的B细胞的表 面上检测CD19(上象限)。虽然大多数CD19+细胞也表达CD20，但在CSF 中的一个小CD19+细胞亚群不表达CD20(上左象限)。这些细胞在CSF中 比在WB中更普遍。据报道CD19+CD20-B细胞是分泌抗体的浆母细胞和浆 细胞。在这些细胞的表面上的其他标记物(CD138，CD27)支撑这个表示 (数据未显示)。