幽门螺杆菌vacA-B基因表达工程菌的构建及其产物的制备方法 本发明是关于幽门螺杆菌(Hp)细胞空泡毒素A基因片段(vacA-B)表达工程菌的构建及其产物的制备方法，具体内容为：采用PCR方法获取vacA基因的片段B，构建vacA-B基因的表达工程菌，并选择合适的培养基及培养方法得到表达活力高、表达水平高及纯度高的目的蛋白。
幽门螺杆菌细胞空泡毒素A(VacA)具有较高的抗原性；传统的幽门螺杆菌(Hp)培养方法一般需5-7天，浪费时间，且从菌体中提取该蛋白的工艺烦琐，回收率低，故采用基因重组技术制备该蛋白是获得抗原的重要途径。
本发明的目地是构建幽门螺杆菌vacA-B基因表达的工程菌及其产物的制备方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种幽门螺杆菌vacA-B基因表达工程菌的构建，其特殊之处在于：选取幽门螺杆菌DNA中vacA基因5’-端909bp的片段B，其核苷酸序列如下：ATGGCCTTTTTCACAACCGTGATCATTCCAGCCATTGTTGGGGGTATCGCTACAGGCACCGCTGTAGGAACGGTCTCAGGGCTTCTTAGCTGGGGGCTCAAACAAGCCGAAGAAGCCAATAAAACCCCAGATAAACCCGATAAAGTTTGGCGCATTCAAGCAGGAAAAGGCTTTAATGAATTCCCTAACAAGGAATACGACTTATACAGATCCCTTTTATCCAGTAAGATTGATGGAGGTTGGGATTGGGGGAATGCCGCTAGGCATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAACAGAATAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGACGCTGTAGGGACTTATACCTTATCAGGGCTTAGAAACTTTACTGGTGGGGATTTAGATGTCAATATGCAAAAAGCCACTTTACGCTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTTACAAGCTATAAGGATAGTGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTGTAGAAATCAACAATCGTGTGGGTTCTGGAGCCGGGAGGAAAGCCAGCTCTACGGTTTTGACTTTGCAAGCTTCAGAAGGGATCACTAGCGATAAAAACGCTGAAATTTCTCTTTATGATGGTGCCACGCTCAATTTGGCTTCAAGCAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAATACGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTAACAGGGGAAGTGAATTTTAACCACCTCACTGTTGGCGATAAAAACGCCGCTCAAGCGGGCATTATCGCTAATAAAAAGACTAATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCCGGGTTAAACATTATCGCTCCTCCAGAAGGTGGCTATAAGGATAAATAA
上述幽门螺杆菌vacA-B基因表达工程菌构建的步骤如下：
1)从幽门螺杆菌中提取总DNA；
2)用PCR方法从基因组DNA中扩增vacA基因的片段B；
3)将vacA基因的片段B连接在表达载体pRSETA上；
4)将重组载体vacA-B-pRSETA转化入大肠杆菌BL21DE3中得到工程菌。
上述用PCR方法从基因组DNA获取vacA基因的片段B，其PCR引物序列设计如下：
上游引物：5’GC GGA TCC ATG GCC TTT TTC ACA ACC GTG AT 3’
下游引物：5’GC CTG CAG TTA TTT ATC CTT ATA GCC ACC TTC 3’
上述vacA-B基因与表达载体pRSETA的连接如下：
1)PCR所采用两个引物是根据vacA的基因序列设计的；
2)vacA基因片段B的5′端连在表达载体pRSETA的BamH I位点上，3′端连在表达载体pRSETA的Pst I位点上，从而构成重组表达载体vacA-B-pRSETA；
一种幽门螺杆菌vacA-B基因表达工程菌的表达产物的制备方法如下：
1)VacA-B抗原的化学诱导及表达；
2)VacA-B的分离及纯化；
3)VacA-B活性鉴定。
下面结合具体实施例；详细描述如下
一、制备模板：在Hp培养平板上挑取生长良好的菌落，提取Hp总DNA，溶于100μL无菌水中，稀释5倍作为模板。
二、目的片段的扩增：PCR反应的总体积为25μL，其中含模板2μL，每种引物各10pmol，2.5mmol/L dNTP混合物2μL，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl2 2.5μL，耐热DNA聚合酶0.75U，加H2O到25μL。PCR扩增反应条件为94℃预变性2min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，共循环40次。反应结束后在10g/L琼脂糖凝胶上检查扩增结果，电泳缓冲液为0.5XTAE，溴化乙锭染色，并在紫外灯下切下目的条带。
三、PCR产物克隆：回收PCR产物，溶于40μL的NE溶液中。取0.5ml的EP管2支，其中一支加入目的片段DNA 20μL，另一支加入含有1μg pGEM-3Zf(-)溶，然后各加入10xBuffer 2.5μL，BamH I 1μL(12U)，Pst I 1μL(15U)30℃温育2h之后37℃温育2h。反应结束后进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，同前切下目的条带。将含双酶切目的片段的琼脂糖凝胶与含双酶切pGEM-3Zf(-)的凝胶按3∶1的比例放在同一1.5ml的EP管中，回收DNA溶于30μL NE溶液中，向回收产物中加入4μL T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase，于12℃保温16h。将连接产物5μL转入JM109感受态细胞，同时以水作空白对照，pGEM-3Zf(-)作阴性对照，在含有Amp(100mg/mL)的LB平板上加入20μL 0.1mol/L IPTG和16μL 5％X-Gal做蓝白筛选，挑取白色克隆，培养后提取质粒，同前双酶切鉴定重组质粒。
四、序列测定：选择经双酶切鉴定阳性的含重组vacA-B-pGEM-3Zf(-)的菌株，测定vacA-B的序列。
五、表达载体的构建：将含重组质粒的细菌扩大培养，提取重组质粒，用BamH I和Pst I双酶切后，获得909 bp大小的目的片段。将其与同样双酶切处理的载体pRSETA连接，转入BL21DE3菌，获得重组表达载体vacA-B-pRSETA，并对其进行双酶切鉴定。
六、目的蛋白的诱导表达：挑取含有vacA-B-pRSETA的单个菌落，接种子LB(含Amp 100mg/L)培养液中，在37℃振摇至A600＝0.4。加入IPTG使终浓度达0.5mmol/L，37℃振摇4h，离心收菌。
七、目的蛋白的表达形式和溶解性分析：经分级分离及12％SDS-PAGE分析，表达产物主要以包含体及可溶性蛋白两种形式存在。表达量占菌体蛋白40％，包含体占菌体蛋白30％，可溶性蛋白占菌体蛋白10％。
八、Western blot分析：将诱导菌的全菌做SDS-PAGE，使凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维素膜(NC膜)靠近阳极一侧，转移缓冲液为25mmol/L Tris-192mmol/LGlycine-200ml/L甲醇，在100V条件下转移45min，使蛋白从凝胶电转移至NC膜上。电转移结束后，取出NC膜，依次进行亮绿(1g/L亮绿-100ml/L冰乙酸-500ml/L甲醇)染色和三蒸水冲洗终止染色，并用铅笔在目的条带两端作标记。加封闭液(含100g/L脱脂奶粉和0.5mL/L Tween 20的pH7.5 TBS)室温2h封闭非特异性结合位点后，用TBS洗涤液室温洗膜4次，每次15min。然后依次加兔抗Vac A多抗(37℃作用1--1.5h，用TBS洗涤液室温同上洗膜)和HRP标记的羊抗兔二抗(37℃作用1--2h，用TBS洗涤液室温洗膜6次)。最后，将NC膜浸入DAB显色液中染色，以蒸馏水冲洗终止反应。
九、目的蛋白纯化：
用Ni-NTA亲和层析纯化诱导菌的上清和包含体，获得的目的蛋白纯度高。
(1)样品制备：离心收集诱导菌，超声碎菌，离心收集沉淀和上清
(2)上清的纯化：将上清与Ni-NTA充分混匀装柱，用含咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白
(3)包含体的纯化：将沉淀用含8mol/L脲的缓冲液变性，离心收集上清，将上清与Ni-NTA充分混匀装柱，用pH梯度洗脱目的蛋白。