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1、(10)申请公布号 CN 102888353 A (43)申请公布日 2013.01.23 C N 1 0 2 8 8 8 3 5 3 A *CN102888353A* (21)申请号 201210275810.9 (22)申请日 2012.08.06 CGMCC NO.6106 2012.05.11 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人常州大学 地址 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1 号 (72)发明人张文艺 陈雪珍 李秋艳 韩有法 李仁霞 (74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限 公司 。
2、32200 代理人楼高潮 (54) 发明名称 溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法 (57) 摘要 本发明溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方 法，属于环保水处理技术领域。提供了纺锤形赖 氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillusfusiformis）， 保藏编号为CGMCCNO.6106。本发明还 提供了利用上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 （Lysinibacillusfusiformis）降解铜绿微囊藻的 方法。本发明筛选的溶藻细菌对蓝藻水华中的优 势藻种铜绿微囊藻具有一定的溶解作用，且对光 周期不敏感，溶藻特性几乎不受光周期影响，不随 光周期变化而有所波动，这一特点使得该菌能够 更好地在天然水体中发挥溶。
3、藻特性，在大面积水 体蓝藻水华污染治理中的应用前景更为广阔。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书6页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1页 2 1.溶藻细菌F8，建议的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），保藏编号为CGMCC NO.6106。 2.利用权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）降解 铜绿微囊藻的方法，其特征在于按照下述步骤进行： 将赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于营养肉汤液体培养基中于温。
4、度30、摇床转速130 r/ min条件下培养16 h至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培 养基中，相同条件下培养16 h至对数期，备用； 将上述对数期赖氨酸芽孢杆菌按照菌藻比1：2-1：20的体积比例接种到新鲜铜绿微囊 藻液中，在温度28、光强2500 lux的光照培养箱菌藻共同培养即能够去除铜绿微囊藻， 光周期分别设置全黑暗、光循环12 h：12 h、全光照。 3.根据权利要求2所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）降解 铜绿微囊藻的方法，其特征在于其中所述的对数期赖氨酸芽孢杆菌为未处理菌液、无菌上 清液、菌体和高温灭活处。
5、理菌液。 4.根据权利要求2所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）降解 铜绿微囊藻的方法，其特征在于其中所述的新鲜铜绿微囊藻液属于低浓度藻液，初始叶绿 素a浓度为71.17-92.61 mg/m 3 。 5.根据权利要求2所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）降解 铜绿微囊藻的方法，其特征在于上述降解铜绿微囊藻的方法为以菌藻比1：2-5的体积比例 接种到的新鲜铜绿微囊藻液中，在温度28、光强2500 lux、光循环12 h：12 h的光照培养 箱菌藻共同培养96 h。 权 利 要 求 书CN 102888353。
6、 A 1/6页 3 溶藻细菌及其去除铜绿微囊藻的方法 技术领域 0001 本发明属于环保水处理技术领域，具体涉及一种从太湖流域野生白鲢肠道内筛选 的溶藻细菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法。 背景技术 0002 随着经济的发展、社会的进步，人们对生活品质的要求越发提高，生产生活所造成 的污水也越来越多，在经济发达的长三角地区，大量含有氮、磷等污染物的废水皆就近排入 天然水体，导致河流、湖泊等水体蓝藻频繁暴发，严重破坏水体的生态环境，威胁水生生物 的生存，影响人类对水资源的利用。 0003 目前国内外学者对如何治理蓝藻水华展开了一系列的研究，其处理方法主要包括 三个方向：一是物理方法，包括以打捞的方。
7、式机械除藻，在水华区域覆盖板料或薄膜等遮光 抑藻，以填料吸附藻类等，这种方法工作量大、耗时长、效率低；二是化学方法，如投加CuSO 4 等杀藻剂，这种方法的缺点是投加的化学药剂对水生生物有毒害作用；三是生物方法，种群 竞争抑藻、鱼类吞噬除藻、微生物除藻和综合防治法都是针对湖泊富营养化的生物控制技 术。如：武汉植物学研究2005年第23卷第1期53-57页报道了李修岭的发现：水龙可 以漂浮于水面生长，去除氮磷的能力强，抑藻效果好且可操作性强。环境科学学报2002 年第22卷第6期732-737页报道了陆开宏的研究成果：罗非鱼能够大量摄食并消化蓝藻。 中国给排水2011年第27卷第13期63-66。
8、页报道了闵智的研究成果：草履虫对铜绿微囊 藻具有吞噬能力。对于大面积水体来说，物理、化学方法均不利于实施，而生物法则利用生 物物种间的“相克”和生物自然繁殖，可有效实现大面积水体的除藻控藻。 0004 目前，越来越多的研究人员在细菌的筛选与鉴定、溶藻特性、混合菌群构建等方面 对溶藻细菌进行了研究，从不同环境中分离出了多种溶藻细菌。中国环境与科学2008 年第28卷第5期461-465页报道汪辉等从青岛市黄岛边的某富营养化池塘中分离得到 1株具有溶解铜绿微囊藻作用的无色杆菌属细菌；微生物学通报2012年第39卷第5 期677-682页报道崔璐璐等从水库水体中筛选出1株溶藻细菌，经鉴定为黄单胞菌科。
9、的 寡养单胞菌。分离的溶藻细菌应用于预防与控制蓝藻暴发依然存在一定的局限性。据统 计，溶藻细菌的来源主要是富营养化水体。如：公开号CN101139140A的发明专利，公开了 一种利用微生物降解铜绿微囊藻的方法，从深度富营养化城市湖泊水体中分离纯化得到 Brevibacillus spp.FDK2，该细菌对铜绿微囊藻有较好的去除作用，去除率达到90%以上。 公开号CN101955904A的发明专利，公开了一种自然水环境中的溶藻细菌分离方法，从富营 养水体中分离出了高效溶藻细菌DC1，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，该方法分离的溶藻细菌能 够有效控制鱼腥藻的生长。由于蓝藻的暴发不仅限于城市湖泊，大面积的自。
10、然水体如太湖、 滇池、巢湖等更是值得研究的对象，且蓝藻水华的优势藻种是铜绿微囊藻，因此，上述两种 方法筛选到的溶藻细菌对铜绿微囊藻的去除存在一定的局限性，蓝藻水华污染的难题尚未 有有效的解决方法。 0005 近几年为解决太湖、滇池等富营养化严重的湖泊蓝藻水华问题，相关渔业管理部 说 明 书CN 102888353 A 2/6页 4 门企业及市民等每年都组织、启动放养“食藻鱼”花白鲢活动，运用“生物链”攻克蓝藻。 花白鲢终生以蓝藻等浮游植物为食物，是蓝藻天生的克星。昆明市水产科学研究所通过对 投放在滇池中四五个月的鲢鱼和鳙鱼解剖发现，鱼肠内95%以上是蓝藻，微囊藻得不到完 全消化，在前、后肠道内。
11、分别呈多细胞群体和零星的小数量群体状态，且淡水鱼类肠道细菌 种类多，数量大，约为10 5 -10 8 。因此推断：太湖流域食藻性鱼类的白鲢肠道内可能含有可以 溶解藻类的细菌。 0006 本发明以江苏省太湖流域的野生白鲢作为溶藻细菌的菌种分离源，通过4-5次液 体感染富集，从中筛选出去除铜绿微囊藻的细菌。本发明首次从白鲢前、后肠道内分离得到 溶藻细菌，为肠道共生菌，无生物毒性，该菌通过分泌胞外非蛋白酶类杀藻物质间接溶藻， 且对光周期敏感度低，在全光照、光循环12 h：12 h、全黑暗条件下溶藻效果相差无几，溶藻 性能不受光周期影响，有利于该菌在自然条件下的水体中充分发挥溶藻特性，使得以铜绿 微囊。
12、藻为处理对象的蓝藻水华污染得到有效控制成为可能。 发明内容 0007 本发明的目的是克服上述现有技术方法中的不足，针对太湖优势藻种铜绿微囊藻 而提供的一种从野生白鲢前、后肠道内筛选的具有溶藻性能的赖氨酸芽孢杆菌，并利用其 降解铜绿微囊藻的方法。 0008 本发明所采用的技术方案如下： 本发明提供了溶藻细菌F8，建议的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 （Lysinibacillus fusiformis）。已于2012年5月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.6106。 。
13、0009 利用上述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）降解铜绿微囊藻 的方法，按照下述步骤进行： 将赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于营养肉汤液体培养基中于温度30、摇床转速130 r/ min条件下培养16 h至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培 养基中，相同条件下培养16 h至对数期，备用； 将上述对数期赖氨酸芽孢杆菌按照菌藻比1：2-1：20的体积比例接种到新鲜铜绿微囊 藻液中，在温度28、光强2500 lux的光照培养箱菌藻共同培养即能够去除铜绿微囊藻， 光周期分别设置全黑暗、光循环12 h：12 h、全光照。 0010 其中所述。
14、的对数期赖氨酸芽孢杆菌为未处理菌液、无菌上清液、菌体和高温灭活 处理菌液。 0011 其中所述的新鲜铜绿微囊藻液中初始叶绿素a浓度为71.17-92.61 mg/m 3 。 0012 上述降解铜绿微囊藻的方法优选：以菌藻比1：2-5的体积比例接种到的新鲜铜绿 微囊藻液中，在温度28、光强2500 lux、光循环12 h：12 h的光照培养箱菌藻共同培养96 h。 0013 本发明的主要优点： 1、本发明以太湖流域野生白鲢鱼为菌种分离源，截取鱼的前、后肠，采用液体感染法以 富集得到具有稳定溶藻能力的细菌混合菌群，采用价格低廉的营养肉汤培养基平板划线分 说 明 书CN 102888353 A 3/。
15、6页 5 离纯化溶藻细菌，具有成本低、简便、安全等优点。 0014 2、本发明筛选的溶藻细菌对蓝藻水华中的优势藻种铜绿微囊藻具有一定的溶解 作用，且对光周期不敏感，溶藻特性几乎不受光周期影响，不随光周期变化而有所波动，这 一特点使得该菌能够更好地在天然水体中发挥溶藻特性，在大面积水体蓝藻水华污染治理 中的应用前景更为广阔。 具体实施方式 0015 菌株的分离筛选及鉴定 1、溶藻材料的选取 选取江苏省太湖流域个体活跃的白鲢鱼，在实验室条件下用2%的生理盐水将其浸洗 5-10 min，进行消毒，再在超净台上无菌操作将白鲢解剖，取其前、后肠约10 g，加入90 mL 无菌水，于温度30、转速130 。
16、r/min的摇床中振荡1-2 h，使鱼肠组织液混合均匀，静置1 h，收集上清液。 0016 2、培养基配制 铜绿微囊藻培养液：称取NaNO 3 1.5 g，K 2 HPO 4 0.04 g，MgSO 4 7H 2 O 0.075 g，CaCl 2 2H 2 O 0.036 g，柠檬酸 0.006 g，柠檬酸铁铵 0.006 g，EDTA-Na 2 0.001 g，NaCO 3 0.02 g及微量 元素溶液1 mL于烧杯中，加入1000 mL蒸馏水搅拌溶解后调pH至7.1，于高压锅中121 灭菌20 min。 0017 微量溶液：称取硼酸2.86 g，MnCl 2 4H 2 O 1.86 g，Z。
17、nSO 4 7H 2 O 0.22 g， Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.39 g，CuSO 4 5H 2 O 0.08 g，Co(NO 3 ) 2 6H 2 O 0.05 g，加入1000 mL蒸馏水， 搅拌溶解。 0018 营养肉汤培养基：称取牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g于烧杯中，加入1000 mL 蒸馏水，加热搅拌至溶解，调节pH 7.0-7.2，分装100 mL于锥形瓶中，用纱布及牛皮纸封闭 后置于高压锅中，121灭菌20 min。固体培养基添加琼脂粉2.4%。 0019 3、分离筛选方法 （1）富集驯化 将步骤1溶藻材料的选取中所获得的上清液，经孔径0.8 。
18、m微孔滤膜过滤，滤液再经 孔径0.22 m的滤膜过滤，截留肠道内的细菌，在无菌条件下将截留细菌的滤膜剪碎后投 加到50 mL新鲜的铜绿微囊藻液中，置于28、光强2500 lux、光循环12 h：12 h的光照培 养箱静置培养，黄化后按1：5的比例转接至新鲜的藻液中再次进行富集培养，重复4-5次， 以富集得到具有稳定溶藻能力的细菌菌群。 0020 （2）梯度稀释与划线分离 将富集驯化后的菌液，通过梯度稀释，分别接种10 -13 、10 -14 、10 -15 稀释度的菌液0.1 mL 于营养肉汤固体培养基，30培养24 h后，观察菌落形态特征，挑取不同的单菌落，采用平 板划线分离法，进一步纯化菌。
19、种，每隔48 h划线分离1次，重复5次后得到纯化的菌株，并 将分离得到的纯菌株接种于斜面培养基中保存备用。 0021 （3）溶藻 每个试管加入5 mL营养肉汤液体培养基，121灭菌20 min后置于超净台冷却备 用。 说 明 书CN 102888353 A 4/6页 6 0022 制备菌悬液：用接种环挑取保存的菌株，接种到营养肉汤液体培养基中，放入摇 床中30、130 r/min培养至对数期（16 h），再以5%的接种量转接至新鲜的细菌培养基中， 培养至对数期（16 h）以获得菌悬液。 0023 接种藻液：用移液枪吸取2.5 mL菌悬液加入到25 mL新鲜铜绿微囊藻藻液中， 并以不加菌液为空白。
20、对照，混匀后于28、光强2500 lux、光循环12h ：12 h的光照培养箱 中静置培养1周。 0024 在上述步骤中测定藻液初始叶绿素a浓度，以及1周后的叶绿素a浓度。从 而对分离得到的各菌株溶藻性能进行判定，得到1株溶藻效率较高的溶藻细菌。 0025 4、菌株形态及生理生化性能 通过对菌株进行形态观察、染色反应和生理生化测定， 并根据科学出版社常见细菌系统鉴定手册（2001）对其进行鉴定。结果如下： 菌落形态特征：菌落形状为圆形、较小，呈淡黄色，不透明，边缘平滑整齐，表面平坦微 湿润。油镜下观察，菌体为杆状。 0026 菌落生理生化特征：革兰氏阴性，接触酶阳性，乙酰甲基醇试验（V.P）阴。
21、性，甲基 红试验（M.R）阴性，糖或醇类发酵产酸，淀粉水解阳性，硝酸盐还原、产硫化氢试验均为阴 性，葡萄糖氧化发酵试验弱氧化产酸。 0027 5、菌株的16S rDNA序列同源性分析 通过将菌株的16S rDNA序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank中的已知 序列比对，该菌株与序列登录号为HQ259954的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R2（Lysinibacillus fusiformis）相似度高达97.0%，且在基于距离法构建的系统发育树中两菌株处于同一分 支，自展值为88，其中重复数设置为1000，可信度较高。 0028 本发明提供了溶藻细菌F8根据16S rDNA序列同源性分。
22、析，结合菌株的形态 学特征及生化特性，初步鉴定本发明所筛选出的溶藻细菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌 （Lysinibacillus fusiformis）。该菌在NCBI的GenBank中所申请的序列登录号为 JQ991003，建议的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）。已 于2012年5月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.6106。 0029 以下提供本发明利用上述菌株处理铜绿微囊藻的5个实施例： 其中所述的藻液为实验室铜绿。
23、微囊藻纯培养液，藻种为铜绿微囊藻FACHB-905，购自中 科院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库，因此，叶绿素a浓度的变化可很好地表征铜绿 微囊藻的去除效果。 0030 实施例1 本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液1，叶绿素a浓度为91.72 mg/m 3 ，pH值为 7.2。具体实施步骤如下：首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30、摇床转速130 r/min条件下 培养至对数期（16 h），然后按菌藻比1：2的投菌量，将50 mL对数期菌液接种到藻液中，以 无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为61.2 mg/m 3 ，置于28、光强2500 lux、 光循环12 h：12 h的光照。
24、培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述 方法处理的藻液，96 h时叶绿素a浓度为34.2 mg/m 3 ，去除率为44.12%，能够较好溶解藻细 说 明 书CN 102888353 A 5/6页 7 胞。 0031 实施例2 本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液2，叶绿素a浓度74.76 mg/m 3 ，pH值为 7.2。具体实施步骤如下：首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30、摇床转速130 r/min条件下 培养至对数期（16 h），然后按菌藻比1：5的投菌量，将20 mL对数期菌液接种到藻液中，以 无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为62.3 mg/m 3 。
25、，置于28、光强2500 lux、 光循环12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述 方法处理的藻液，96 h时叶绿素a浓度为40.64 mg/m 3 ，去除率达34.77%，此时的溶藻效果 依然保持高水平。 0032 实施例3 本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液3，叶绿素a浓度71.17 mg/m 3 ，pH值为 7.2。具体实施步骤如下：首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30、摇床转速130 r/min条件下 培养至对数期（16 h），然后按菌藻比1：10的投菌量，将10 mL对数期菌液接种到藻液中，以 无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度。
26、为64.71 mg/m 3 ，置于28、光强2500 lux、 光循环12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述 方法处理的藻液，96 h时叶绿素a浓度为51.45 mg/m 3 ，去除率达20.49%，此时的溶藻效果 一般，由此，菌藻比1：5的投加量可达到较好溶藻效果。 0033 实施例4 本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液4，叶绿素a浓度为77.19 mg/m 3 、80.33 mg/m 3 、83.54 mg/m 3 ，pH值为7.0-7.5。具体实施步骤如下：首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度 30、摇床转速130 r/min条件下培养至对数。
27、期（16 h），然后按菌藻比1：5的投菌量，将20 mL对数期菌液分别接种到3份藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度 为64.31 mg/m 3 、67.48 mg/m 3 、69.62 mg/m 3 ，置于28、光强2500 lux光照培养箱中静置培 养，其中光周期分别为全黑暗、光循环12 h：12 h、全光照，5 d后取样测定叶绿素a浓度。 经过上述方法处理的藻液，5 d后叶绿素a去除率分别为44.77%、44.12%、45.10%，可见该赖 氨酸芽孢杆菌对光照条件不敏感，这一特点可能与其来源于肠道有关，对光照敏感度较低， 在光照条件弱的水体液面以下依然能够保持较好的溶藻效。
28、果，有利于该菌在实际工程中的 应用。 0034 实施例5 本实施例处理的是100 mL新鲜铜绿微囊藻液5，叶绿素a浓度92.61 mg/m 3 ，pH值为 7.2。具体实施步骤如下：首先将赖氨酸芽孢杆菌于温度30、摇床转速130 r/min条件下 培养至对数期（16 h）；然后按照以下4种方式处理对数期菌液：菌源液（T1）；将菌液 高速离心（12000 r/min，10 min）取上清液，经0.22 m滤膜过滤除菌，平板验证上清液中 无菌（T2）；收集中离心后的菌体，经无菌水洗涤3-4次，制备无菌水菌悬液（T3）；将 菌液高温（121）灭活处理30 min（T4）；再以菌藻比1:5的投菌量取2。
29、0 mL上述4种 不同方式处理过的菌液，将其分别接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿 素a浓度为77.18 mg/m 3 ，置于28、光强2500 lux、光循环12 h：12 h的光照培养箱中静 置培养，5d后取样测定叶绿素a浓度。经过上述4种方法处理的藻液，5 d后叶绿素a浓 度为分别44.20 mg/m 3 、47.12 mg/m 3 、70.60 mg/m 3 、51.84 mg/m 3 ，而对照组叶绿素a浓度为 说 明 书CN 102888353 A 6/6页 8 76.80 mg/m 3 ；当菌液处理方式为时，叶绿素a的去除率为42.73%；当处理方式为时，叶 绿素a的去除率为38.95%；当处理方式为时，叶绿素a的去除率仅为8.53%；当处理方式 为时，叶绿素a去除率为32.83%。由此可见，赖氨酸芽孢杆菌通过分泌胞外非蛋白酶与少 量胞外蛋白质类杀藻物质间接溶藻从而发挥溶藻性能。 说 明 书CN 102888353 A 。