说明书光敏感基团保护的功能基团亚磷酰胺及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及亚磷酰胺化合物，尤其涉及光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物及其制备方法，本发明还涉及该亚磷酰胺化合物在寡聚核苷酸固相合成及5′端功能化中的应用，属于寡聚核苷酸的固相合成及功能化领域。
背景技术
光活性基团指在光子激发下，能够通过形成自由基或异裂中间体，发生化学变化的分子结构。它使在复杂体系中，尤其是在生理环境下，利用光控制小分子或生物大分子的变化成为可能。普遍认为，与温度、酸碱度等其它的调控手段相比，光调控具有定位准确，调控及时，对体系影响小等诸多优点。通常所指的光活性基团可分为两类，即：光异构化基团和光可切除基团。前者的光化学过程是可逆的，后者则是不可逆的化学过程。光可切除基团（caged/caging moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出1，这类基团对340‑370nm范围内的光敏感，能够有效地吸收这种能量的光子。最常见的光可切除基团是邻硝基苯基及其衍生物，此外还有对羟基苯乙酰氧基、香豆素类、呫吨酮乙酸类化合物等。由于邻位硝基的存在，在光激发后，邻硝基苯乙醇类化合物形成五元环状中间体，进而得到邻亚硝基苯乙酮类化合物，与化合物中的其它部分断开。由于邻硝基苯乙醇及其衍生物的结构相比其它光可切除基团在合成中或生理环境下较为稳定，因此在大多数生物体系中被广泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白质，适配体等。
寡聚核苷酸可以用来做PCR引物，用于核酸序列检测的探针、等位基因特异的寡聚核苷酸分析（Allele‑specificoligonucleotide，ASO）、单碱基多样性分析（Single nucleotide polymorphism，SNP）、反义寡聚核苷酸，其在分子生物学领域有广泛的应用。
近几十年来，寡聚核苷酸在分子生物学中发挥着越来越重要的作用，逐渐成为一种非常有效的研究工具。特别是近年来，相关的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸从基因水平上研究各种疾病的产生机理及其相关基因的表达网络，并使其通过调节基因的表达量来预防、诊断和治疗相关疾病，作为药物研发的另一种思路。
寡聚核苷酸功能化的传统方法和应用：一般地，5′端的功能化是在寡聚核苷酸合成后加入含磷试剂的小分子带保护基的官能团，脱保护后再经由这些官能团连接其它功能分子。如5′氨基有对甲氧基三苯基（MMTr）保护和三氟乙酰（TFA）保护的模块，选用何种保护基由寡聚核苷酸的后处理决定。连接臂一般为6个碳，12个碳的连接臂用于某些特定情形，如在近距离会发生荧光淬灭的分子内。5′巯基有三苯基（Tr）保护基和二硫键保护两种模块，与MMTr不同，Tr对酸稳定，需小心地用硝酸银将其脱去，过量的硝酸银用TCEP沉淀后离心除去，而此步中过量的TCEP需经脱盐除掉。为保证硫醚键或二硫醚键不被氧化，合成循环中最后一步需用0.2M的碘液。而二硫键保护的模块可用TCEP断开，脱盐后直接使用。末端为巯基的ODN可继续与荧光素、生物素或金属纳米粒结合，用于DNA芯片分析，荧光探针等分子生物学检测。
在一段末端为氨基的寡聚核苷酸中连入含二硫醚的戊酸NHS活化物后能与金、银纳米粒表面结合，形成两个硫‑金键，结合的效率可达91%，而单一巯基则仅48%。这种强的DNA‑金表面结合模式为DNA控制的纳米粒自组装提供了另一种可行的策略。最初引入5′端磷酸基时需使用含有砜的磷试剂，但如果合成最后DMTr在ODN上，则氨水在会将该保护基脱下暴露磷酸基，这样会给反相HPLC的纯化造成困难。
将邻硝基苄醇结构保护的氨基和羧基与胸腺嘧啶单体的碱基连接，寡聚核苷酸合成后并光照处理后，即可暴露氨基和羧基。在链中加入功能分子还可通过修饰的DNA单体实现，即先将光活性基团连入胸腺嘧啶2′位置进行DNA合成，光脱保护后再连入功能分子。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物；
本发明的目的之二是提供一种合成所述亚磷酰胺化合物的方法；
本发明的目的之三是将所述的亚磷酰胺化合物应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
应用于寡聚核苷酸固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物，为式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物：
其中，R1选自氢、CH3、COOCH3；R2选自氢或R3选自氢或烷氧基（alkoxy）；R4选自氢或烷氧基（alkoxy）；或R3‑R4是‑OCH2O；X是氧或氮；Y是碳、氮或硫；Z是CH2或OCH2CH2；n为1‑6的任意整数；
R2选自氢或R3选自氢或烷氧基（alkoxy）；R4选自氢或烷氧基（alkoxy）；或R3‑R4是‑OCH2O；R5是氢，CH3或苯基；Z是CH2或OCH2CH2；n为1‑6的任意整数。
本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物可通过以下方法制备得到：
一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：将邻硝基苯乙酮还原后得到邻硝基苄醇；将邻硝基苄醇在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）条件下进行反应，即得。
一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：（1）将邻硝基苄醇与DSC形成中间体，直接与6‑氨基己醇作用得1‑(2‑硝基苯基)乙基6‑羟基己胺基碳酸酯；（2）将1‑(2‑硝基苯基)乙基6‑羟基己胺基碳酸酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）进行反应，即得。
一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：（1）邻硝基苄醇经过溴代得到1‑(1‑溴乙基)‑2‑硝基苯；将1‑(1‑溴乙基)‑2‑硝基苯（2）和被硅烷保护的6‑羟基己酸在丙酮和无机碱作用下得到6‑(6‑(叔丁基二甲基硅氧)己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯；将6‑(6‑(叔丁基二甲基硅氧)己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯脱去硅烷保护基得到6‑羟基己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯；（2）6‑羟基己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）进行反应，即得。
一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：（1）将1‑(1‑溴乙基)‑2‑硝基苯被6‑巯基己醇亲核取代得到6‑[1‑(2‑硝基苯基)乙巯基]1‑己醇;（2）6‑[1‑(2‑硝基苯基)乙巯基]1‑己醇在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）进行反应，即得。
一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括：（1）邻硝基苄醇的羟基被DSC活化后，得到S‑6‑羟己基O‑1‑(2‑硝基苯)乙基硫代碳酸酯；（2）S‑6‑羟己基O‑1‑(2‑硝基苯)乙基硫代碳酸酯在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）进行反应，即得。
一种合成式Ⅱ所示化合物的方法，包括：（1）邻硝基苯基乙二醇和4‑羟基‑2‑丁酮溶于THF中，在对甲基苯磺酸的催化和分子筛的脱水下，得到4‑羟基丁‑2‑酮1‑(2‑硝基苯基)‑1,2‑乙二醇缩酮；（2）4‑羟基丁‑2‑酮1‑(2‑硝基苯基)‑1,2‑乙二醇缩酮在氮气保护下溶于二氯甲烷，冰浴，再依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯和TEA，在室温（20‑30℃）条件下进行反应，即得。
本发明方法中所述的“室温”的温度范围为20‑30℃，优选为25℃。
本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物均有邻硝基苯乙醇的母体结构，具有光切割活性，在寡聚核苷酸的固相合成中，可作为光活性保护基将其作为最后一个单体加入到ODN的5′端，能够保护磷酸基、氨基、羧基、巯基或羰基；365nm光照后脱去保护基暴露出对应官能团，再接上相应的功能分子(如甾体、酚酞、冠醚、亲水烷基链)或标记物（染料小分子，如芘、罗丹明），实现寡聚核苷酸的功能化，也可通过两端双修饰的产物自身形成环状的寡聚核苷酸。
对于氨基、磷酸基，可以先从固相上切割，去除碱基保护基，纯化后得到带有光活性保护基的ODN，进行光照反应的动力学分析，最后纯化后得到暴露官能团的ODN。二者用高分辨质谱进行表征。进一步，氨基与染料分子5‑TAMRA连接。
对于羧基，如先用氨水进行切割，则也可能也会破坏5′保护基的羧酸酯键，故应先在固相上进行光照，再用氨水去除碱基保护基。光照后应在固相上连接染料分子，以证实是光照而不是氨水水解使保护基脱除。
对于巯基，由于普遍使用的方法是在AgNO3的缓冲溶液中脱三苯基保护基，加入TCEP或DTT去除过量的AgNO3，同时防止生成二硫键。然后脱盐且不经HPLC纯化。
试验结果表明，本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物在寡聚核苷酸的固相合成中作为最后一个单体加入到ODN的5′端所得到的寡聚核苷酸产物经过光照后能够脱去保护，在5′端可接上相应的功能分子(如甾体、酚酞、冠醚、亲水烷基链等)或标记物（例如荧光染料等）。
附图说明
图1本发明光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物的结构式。
图2本发明光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物的合成路线图。
图3ODN1光照前出现的双峰，为一对光学异构的寡聚核苷酸。
图4ODN1/2光照脱保护效率随光照时间变化的曲线。
图5ODN 2随光照时间的HPLC分析结果。
图6邻硝基苯乙硫醚类化合物光照后变化.
图7ODN 5的HPLC分析结果。
图8ODN 6光照前的MALDI‑TOF结果。
图9ODN 2 5'氨基标记示意图。
图10ODN 2标记前后的紫外可见光谱图。
图11ODN 3与芘连接示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
1、二氯甲烷、三乙胺、四氢呋喃、乙腈等溶剂用氢化钙干燥，并在每次使用前蒸馏。所有试剂从阿法埃莎（天津）化学有限公司、西格玛奥德里奇（中国）有限公司、梯希爱（上海）化学工业发展有限公司、韶远化学科技（上海）有限公司等企业购得。所有从商业渠道购得的试剂在使用前均未经进一步纯化。
2、所有混合溶剂以其体积比例报告。
3、所有反应进程通过薄层层析检测，薄层层析板由Merck公司生产，其上有0.24nm厚的F254硅胶。柱层析所用硅胶（200‑300目）由青岛海洋化工厂生产。
4、400MHz1H核磁共振、100MHz13C核磁共振、162MHz31P核磁共振由Bruker AVANCE II 400核磁共振仪在室温下（298K）测定。碳谱和氢谱化学位移（δ,ppm）相对于残留溶剂的公认化学位移而确定，磷谱的化学位移以85%磷酸为外标，耦合常数（J）四舍五入至1Hz。质谱由ESI‑Q‑TOF测得。所述反应和操作均在暗室中进行。
5、寡聚核苷酸固相合成和分离通用方法
寡聚核苷酸由Applied Biosystems Incorporated 394自动合成仪合成。CPG:dG和DNA单体由AuGCT生物科技公司购得。寡聚核苷酸由标准DNA合成循环在CPG:dG或修饰的LCAA‑CPG上进行1μmol规模的合成。对于5′末端的反应，反应时间延长为120秒，并重复一次。
半制备HPLC在Varian Prostar上用Agilent C18 column(5μm,9.4×250mm)进行，条件：溶液A，0.05M三乙胺‑醋酸缓冲液；溶液B，乙腈。起始强度15%B，梯度1%B/min，流速1mL/min，单通道UV检测器，检测波长260nm。流动相在使用前过0.22μm水系/有机系滤膜，缓冲盐溶液超声后使用。
分析HPLC在Watersalliance e2695上用Symmetry C18 column(3.5μm,4.6×75mm)进行，起始强度0%B，梯度1%B/min，流速1mL/min，PAD检测器，检测波长210‑600nm。
质谱由ESI‑Q‑TOF或MALDI‑TOF测得。紫外可见光谱由Beckmann DUSeries 800光谱仪测得。
光解：在UVP高强度紫外灯在365nm波长下进行，为使体系温度保持在30℃以下，必要时将冰袋置于石英池下。若石英池内为固相的混悬液，则加入微小的搅拌子，置于磁力搅拌器上进行光照。
氨解：向有固相粉末或干燥寡聚核苷酸的EP管内加入浓氨水(500μL)，在室温下混悬24小时，取液体蒸干。
醋酸解：为脱去5′端DMTr保护基，向有干燥寡聚核苷酸的EP管内加入80%的醋酸水溶液(500μL)，在室温下混悬30分钟，取液体蒸干。
所加入的小分子偶联剂（BOP，HOBt等）在使用前配成其DMF溶液，即1mL无水DMF中溶解20μmol的偶联剂，取100μL加到固相或干燥寡聚核苷酸中。
实施例1 1‑(2‑硝基苯)乙醇（1‑(2‑nitrophenyl)ethanol）(化合物1a)的制备
1‑(2‑硝基苯)乙酮(3.51g,21.3mmol)溶解于1,4‑二氧六烷(15mL)和甲醇(9mL)的混合溶液，在0℃搅拌10分钟，缓慢加入硼氢化钠(1.60g,42.3mmol)，将反应体系渐升至室温，搅拌1小时后，用丙酮(15mL)淬灭，蒸干溶剂，乙酸乙酯(70mL)溶解剩余物，水洗有机相(3×50mL)后无水硫酸钠干燥，过滤浓缩有机相，蒸干得化合物1a，黄色油状液体(3.52g,21.1mmol,99%产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.84(dd,2H,J=8,11Hz),7.63(t,1H,J=7Hz),7.40(t,1H,J=8Hz),5.39(q,1H,J=6Hz),1.54(d,3H,J=6Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=147.8,141.0,133.5,128.0,127.5,124.2,65.5,24.2.
实施例2 2‑乙腈氧基[1‑(2‑硝基苯基)乙基]二异丙基亚膦酰胺化合物（1b）的制备
化合物1a(0.5mmol,1.0eq)在用四氢呋喃（THF）共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和三乙胺（TEA）(3.0eq)，渐升至室温，TLC（薄层层析）监测反应，反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得到化合物1b，为黄色油状液体。
1b,(R/S，71%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.80(m,2H),7.59(m,1H),7.35(m,1H),5.46(m,1H),3.81(m,1H),3.60(m,2H),3.45(m,1H),2.62‑2.46(m,2H),1.52(m,3H),1.15‑0.86(m,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=146.9(m),140.0(m),133.2(m),128.2(m),127.6(m),123.6(m),117.2(m),67.0(m),58.2(m),42.9(m),24.9‑24.0(m),23.8(m),19.9(m),31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.7(s),147.3(s).
实施例3 1‑(1‑溴乙基)‑2‑硝基苯（1‑(1‑bromoethyl)‑2‑nitrobenzene）(化合物2)的制备
化合物1a(425mg,2.50mmol)，三苯基磷(984mg,3.75mmol)和四溴化碳(1.25g,3.75mmol)溶解于四氢呋喃（THF）(10mL)中，室温下搅拌30分钟。过滤，浓缩母液，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为4/1，得化合物2：棕黄色油状液体(558mg,2.43mmol,97%产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.88(dd,1H,J=1,4Hz),7.81(dd,1H,J=1,4Hz),7.65(dd,1H,J=1,4Hz),7.42(dd,1H,J=1,7Hz),5.80(q,1H,J=7Hz),2.07(d,3H,J=7Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=147.5,137.7,133.3,129.8,128.8,124.2,41.7,27.1.
实施例3 1‑(2‑硝基苯基)乙基6‑羟基己胺基碳酸酯（1‑(2‑nitrophenyl)ethyl 6‑hydroxyhexylcarbamate）(化合物3a)的制备
化合物1a(1.03g,6.17mmol)和N,N'‑二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）(2.37g,9.26mmol)溶解于乙腈(20mL)中，向混合体系中滴加TEA(2.08mL,15.0mmol)。室温下搅拌3小时后加入6‑氨基己醇(1.45g,12.4mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)，室温下搅拌30分钟后，用二氯甲烷(50mL)稀释，用水洗有机相(3×50mL)后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/2，得化合物3a：黄色油状液体(1.78g,5.74mmol,93%产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.90(d,1H,J=8Hz),7.60(d,2H,J=3Hz),7.39(d,1H,J=4Hz),6.20(d,1H,J=6Hz),4.90(s,1H),3.56(t,2H,J=6Hz),3.09(t,2H,J=6Hz),1.83(s,1H)1.59(d,3H,J=6Hz),1.57‑1.24(m,8H,J=7Hz).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ=155.3,147.6,138.7,133.4,128.1,127.0,124.3,68.4,62.5,40.7,32.4,29.8,26.2,25.2,22.2.m/z MS(ESI‑TOF+)实测值[M]+333.1017,C15H22N2O5理论值333.1426.
实施例4（{6‑{[(2‑乙腈氧基)(二异丙基氨基)膦]氧代}已基}氨基碳酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯）（化合物3b）的制备
化合物3a(0.5mmol,1.0eq)在用THF共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和TEA(3.0eq)，渐升至室温，TLC监测反应。反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得到化合物3b，为黄色油状液体。
3b,(59%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.92(d,1H,J=8Hz),7.61(d,2H,J=4Hz),7.40(m,1H),6.22(q,1H,J=6Hz),4.75(br,1H),3.82(m,2H),3.58(m,4H),3.12(m,2H),2.63(t,2H),1.60(d,3H,J=6Hz),1.58(m,2H),1.47(m,2H),1.34(m,4H),1.17(t,12H,J=4Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=155.2,147.5,138.7,133.3,128.0,127.0,124.2,117.6,68.3,63.3(d,J=17Hz),58.1(d,J=19Hz),42.9(d,J=12Hz),40.8,30.9(d,J=7Hz),29.7,26.2,25.4,24.4(d,J=8Hz),22.1,20.2(d,J=7Hz).31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.2(s).
实施例5 6‑(叔丁基二甲基硅氧)己酸（6‑(tert‑butyldimethylsilyloxy)hexanoic acid）(化合物4a)的制备
在无水无氧环境下，叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMS‑Cl）(1.84g,12.2mmol),咪唑(800mg,11.8mmol)溶于二甲基甲酰胺（DMF）(10mL)。向体系中加入6‑羟基已酸乙酯(650μL,4.00mmol)，室温搅拌24小时后加入乙醚(50mL)，用水洗有机相(3×50mL)后无水硫酸钠干燥。浓缩溶剂得黄色油状物，将其溶于Triton B（主要成分是苄基三甲基氢氧化铵）的甲醇溶液(40%w/w,10mL)在室温下搅拌1小时。浓缩体系，加水(20mL)稀释，并用1M HCl调整pH至4。水层用乙醚萃取(5×20mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得化合物4a：黄色油状液体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=3.60(t,2H,J=6Hz),2.36(t,2H,J=7Hz),1.65(m,2H,J=8Hz),1.53(m,2H,J=7Hz),1.40(dd,2H,J=4,6Hz),0.89(s,9H),0.04(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=179.1,62.9,33.9,32.4,26.0,25.3,24.5,18.3,‑5.3.
实施例6 6‑(6‑(叔丁基二甲基硅氧)己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯（1‑(2‑nitrophenyl)ethyl 6‑(tert‑butyldimethylsilyloxy)hexanoate）(化合物4b)的制备
化合物4a,碳酸铯(1.30g,3.99mmol)和碘化钠(1.20g,8.00mmol)溶解于无水丙酮(15mL).将化合物2(1.25g,5.42mmol)溶解于无水丙酮(20mL)后加入至该体系。回流16小时后蒸干溶剂，残留物溶于乙醚(80mL)，用水洗有机相(3×80mL)后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为10/1，得化合物4b：黄色液体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.93(d,1H,J=8Hz),7.61(d,2H,J=4Hz),7.42(m,1H,J=4Hz),6.32(m,1H,J=7Hz),3.58(t,2H,J=7Hz),2.32(m,2H,J=4Hz),1.65(d,3H,J=7Hz),1.62‑1.31(m,6H),0.88(s,9H),0.03(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=172.5,138.1,133.4,128.3,127.1,124.4,67.9,62.9,34.3,32.4,26.0,25.4,24.6,22.0,18.3,1.0,‑5.3.
实施例7 6‑羟基己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯(1‑(2‑nitrophenyl)ethyl6‑hydroxyhexanoate)(化合物5a)的制备
化合物4b溶解于氟化四丁基铵（TBAF）的THF溶液(1M,20mL)。室温下搅拌1小时后浓缩体系，残余物用硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为1/1，得化合物5a：黄色油状物(748mg,2.66mmol,66%从6‑羟基己酸乙酯经三步的产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.92(d,1H,J=8Hz),7.62(d,2H,J=4Hz),7.42(m,1H,J=4Hz),6.32(m,1H,J=7Hz),3.62(t,2H,J=6Hz),2.34(m,2H,J=4Hz),1.64(d,3H,J=3Hz),1.62‑1.32(m,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=172.4,138.0,133.4,128.3,127.1,124.4,67.9,62.6,34.2,32.2,25.2,24.5,21.9.m/z MS(ESI‑TOF+)实测值[M]+304.0825,C14H21NO3理论值304.1161.
实施例8（6‑{[(2‑乙腈氧基)(二异丙基氨基)膦]氧代}己酸1‑(2‑硝基苯基)乙酯）（化合物5b）的制备
化合物5a(0.5mmol,1.0eq)在用THF共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和TEA(3.0eq)，渐升至室温，TLC（薄层层析）监测反应。反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得化合物5b，为黄色油状液体。
5b,(63%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.91(d,1H,J=8Hz),7.61(d,2H,J=4Hz),7.42(m,1H),6.30(t,1H,J=6Hz),3.85‑3.75(m,2H),3.66‑3.53(m,4H),2.62(t,2H,J=6Hz),2.32(m,2H),1.64‑1.34(m,11H),1.16(m,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=172.3,147.8,138.0,133.4,128.3,127.1,117.6,67.8,63.4,63.2(d,J=17Hz),58.2(d,J=19Hz),43.0(d,J=12Hz),34.2,30.8(d,J=8Hz),25.4,24.5(d,J=8Hz),21.9,20.3(d,J=7Hz).31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.3(s).
实施例9 6‑[1‑(2‑硝基苯基)乙巯基]1‑己醇(6‑[1‑(2‑nitrophenyl)ethylthio]hexan‑1‑ol)(化合物6a)的制备
在氮气下，碳酸铯(438mg,1.34mmol),四丁基溴化铵（TBAB）(432mg,1.34mmol)和碘化钠(227mg,1.51mmol)溶于DMF(6mL)，向体系中加入6‑巯基己醇(183μL,2.07mmol)，室温下搅拌1小时后冷却至0℃。将化合物2(302mg,1.31mmol)溶解于DMF(5mL)后滴加入体系.混合物渐升至室温，搅拌12小时后过滤，浓缩滤液，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为2/1，得化合物6a，黄色油状液体(297mg,1.05mmol,80%产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.81(d,1H,J=8Hz),7.69(d,1H,J=8Hz),7.56(t,1H,J=8Hz),7.32(t,1H,J=8Hz),4.55(q,1H,J=7Hz),3.55(t,2H,J=7Hz),2.29(m,2H,J=5Hz),1.56(d,3H,J=7Hz),1.45(m,4H),1.26(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=149.3,139.1,132.8,129.4,127.4,123.5,62.6,38.1,32.4,31.5,29.2,28.4,25.1,22.8.m/z MS(ESI‑TOF+)实测值[M]+306.0832,C14H21NO3S理论值306.1140.
实施例10（2‑乙腈氧基6‑[1‑(2‑硝基苯基)乙巯基]已氧基二异丙基亚膦酰胺）（化合物6b）的制备
化合物6a(0.5mmol,1.0eq)在用THF共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和TEA(3.0eq)，渐升至室温，TLC监测反应。反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得到化合物6b，为黄色油状液体。
6b,(54%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.84(d,1H,J=8Hz),7.71(d,1H,J=8Hz),7.58(t,1H,J=8Hz),7.34(t,1H,J=8Hz),4.56(q,1H,J=7Hz),3.80(m,2H),3.58(m,4H),2.62(t,2H,J=6Hz),2.30(m,2H),1.59(d,3H,J=7Hz),1.54(m,2Hz),1.44(m,2Hz),1.28(m,4Hz),1.16(t,12H,J=7Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=149.4,139.2,132.8,129.4,127.5,123.6,117.6,63.5(d,J=17Hz),58.3(d,J=18Hz),43.0(d,J=12Hz),38.2,31.6,30.9(d,J=7Hz),29.1,28.4,25.4,24.5(t,J=8Hz),22.9,20.3(d,J=7Hz).31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.3(s).
实施例11 S‑6‑羟己基O‑1‑(2‑硝基苯)乙基硫代碳酸酯(S‑6‑hydroxyhexyl O‑1‑(2‑nitrophenyl)ethyl carbonothioate)(化合物7a)的制备
化合物1a(1.28g,7.66mmol)，N,N'‑二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)(2.94g,11.5mmol)在氮气保护下溶解于乙腈(20mL).向混合体系中滴加TEA(1.59mL,11.5mmol)。室温下搅拌1小时后加入4‑二甲氨基吡啶（DMAP）(1.40g,11.5mmol)，6‑巯基己醇(1.45mL,11.5mmol)，室温下继续搅拌15分钟后加入水(80mL)终止反应，用二氯甲烷(3×50mL)萃取水相，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为2/1，得化合物7a：黄色油状液体(1.32g,4.04mmol,57%产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.94(d,1H,J=8Hz),7.64(d,2H,J=4Hz),7.42(m,1H),6.41(q,1H,J=6Hz),3.58(t,2H,J=6Hz),2.78(m,2H),1.78(br,1H),1.65(d,3H,J=7Hz),1.60‑1.49(m,4H),1.33(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=170.3,147.2,137.4,133.8,128.5,127.0,124.4,70.9,62.5,32.3,30.7,29.5,28.2,25.1,22.0.m/z MS(ESI‑TOF+)实测值[M]+350.1514,C14H21NO3S理论值350.1038.
实施例12（S‑{6‑{[(2‑乙腈氧基)(二异丙基氨基)膦]氧代}已基}O‑1‑(2‑硝基苯基)乙基硫代碳酸酯）（化合物7b）的制备
化合物7a(0.5mmol,1.0eq)在用THF共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和TEA(3.0eq)，渐升至室温，TLC监测反应。反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得到化合物7b，为黄色油状液体。
7b，(73%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=7.95(d,1H,J=8Hz),7.64(d,2H,J=4Hz),7.43(m,1H),6.40(q,1H,J=8Hz),3.80(m,2H),3.58(m,4H),2.77(m,2H),2.61(t,2H,J=10Hz),1.65(d,3H,J=8Hz),1.57(m,4H),1.34(m,2H),1.15(t,12H,J=8Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=170.3,147.3,137.5,133.8,128.5,127.1,124.4,117.6,70.9,63.4(d,J=17Hz),58.2(d,J=18Hz),42.9(d,J=12Hz),30.9(d,J=7Hz),30.8,29.5,28.2,25.3,24.5(t,J=8Hz),24.4,22.0,20.3(d,J=7Hz).31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.2(s).
实施例13 4‑羟基丁‑2‑酮1‑(2‑硝基苯基)‑1,2‑乙二醇缩酮(4‑hydroxybutan‑2‑one 1‑(2‑nitrophenyl)‑1,2‑diyl ketal)(8a)的制备
1‑(2‑硝基苯基)乙二醇(183mg,1.00mmol)，4‑羟基‑2‑丁酮(86μL,1.00mmol)，对甲基苯磺酸(3.8mg,0.02mmol)，少量分子筛和THF(15mL)，置于搭架有分水器的反应容器中，回流反应6小时，过滤，浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相石油醚/乙酸乙酯比为3/1，得到化合物8a：黄色油状液体(100mg,0.40mmol,40%产率，含对映异构体)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.07(d,1H,J=8Hz),7.95(d,1H,J=8Hz),7.69(t,1H,J=8Hz),7.47(dt,1H,J=1,8Hz),5.66(t,1H,J=7Hz),4.75(dd,0.1H,J=7,8Hz),4.68(dd,0.9H,J=7,8Hz),3.96(m,1H),3.86(m,1H),3.76(m,1H),2.18(m,2H),1.61(s,0.4H),1.50(s,2.6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=147.3,136.5,134.2,128.6,127.6,127.4,124.8,111.4,73.7,71.2,59.0,41.1,23.0.m/z MS(ESI‑TOF+)实测值[M]+276.0582,C15H22N2O5理论值276.0848.
实施例14（2‑乙氰氧基{2‑[2‑甲基‑4‑(2‑硝基苯基)‑1,3‑氧杂‑2‑缩酮]乙基}二异丙基亚膦酰胺）（化合物8b）的制备
化合物8a(0.5mmol,1.0eq)在用THF共沸除水三次后在反应瓶中定量，在氮气保护下溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴，向其内依次加入2‑氰乙基二异丙氨基膦氯(1.5eq)和TEA(3.0eq)，渐升至室温，TLC监测反应。反应完成时加入二氯甲烷稀释，用10%NaHCO3(2×30mL)洗有机相后无水硫酸钠干燥。浓缩有机相，硅胶柱分离，流动相为石油醚/二氯甲烷并加入3%的TEA，得到化合物8b，为黄色油状液体。
8b,(74%产率):1H NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.04(d,1H,J=8Hz),7.92(d,1H,J=8Hz),7.67(t,1H,J=8Hz),7.45(t,1H,J=8Hz),5.59(m,1H),4.60(t,1H,J=8Hz),3.88‑3.59(m,7H),2.64(t,2H,J=3Hz),2.24(t,0.9H,J=7Hz),2.12(t,1.1H,J=7Hz),1.60(s,1.7H),1.48(s,1.3H),1.19(dd,12H,J=4,6Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ=147.3,137.0,136.6,134.0,128.4,127.6,124.6,117.5,110.5,110.2,74.3,71.3,59.6(d,J=18Hz),58.3(d,J=19Hz),43.1(d,J=12Hz),40.9,39.5(d,J=7Hz),24.6,23.5,20.3.31P NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.7(s)
实施例15 5′端含光活性保护基化合物（1b,3b,5b,6b,7b或8b）的寡聚核苷酸的固相合成
使用DNA自动合成仪，在3′端为鸟苷酸的固相CPG‑G上合成5′XTTT TTC TCT CTC TCT G 3′（表1）。这时5′端最后一个碱基上仍有DMTr保护基。在与磷试剂偶联时，将其与5′羟基在四氮唑活化的反应时间手动延长至120秒，并重复偶联一次。
对于巯基的保护基6b、7b，本实验使用了正常的氧化剂，即0.02M碘的THF/吡啶/水比为7/2/1的溶液，认为其对6b、7b均无不良影响，不会将硫醚氧化为亚砜或砜。
表1 5′端加入光活性保护基（1b,3b,5b,6b,7b或8b）的寡聚核苷酸
试验例1 含5′端光活性保护基ODN的光脱除试验
对于实施例15所制备的5′端含保护基的寡聚核苷酸ODN 1和ODN 2，先用浓氨水水解，使其从固相上切割，同时去除碱基上的保护基。HPLC纯化含有光活性保护基的ODN。由于该光活性基团对紫外辐射敏感，而质辅助激光解吸附质谱技术（Matrix‑assisted laser desorption,MALDI）一般使用336nm波长的激光照射样品，故应避免使用MALDI的方法测定质谱，而使用电喷雾（ESI）方法测定。
考虑到在不同浓度和溶剂的环境下，光照的效率会不同，在光照测定保护基的脱除效率前，需要将ODN用纯水稀释到20μM。在计算吸光度时，只考虑碱基的吸光系数，忽略邻硝基苯在260nm下的吸光系数。通过测定260nm溶液的吸光度和，由计算的吸光系数，即可得到ODN水溶液的浓度。
365nm光照时，为确保实验条件一致，背景光环境为黑色，石英皿与UV光源的相对位置固定。HPLC结果表明，光照后寡聚核苷酸在反相色谱柱上的保留时间缩短，ODN的水溶性变大，提示在光辐射后脱除了末端的非极性基团邻硝基苯。同时，质谱的结果也证实了该结果（表2）。
表2 光照前后寡聚核苷酸的质谱结果和HPLC保留时间
此外，HPLC的结果还表明，体系中几乎没有其它杂峰，表明这种光脱除的过程是洁净的，不会破坏ODN本身的结构。在280nm紫外光照射下，胞嘧啶会形成二聚体，进而破坏DNA的一级结构，而这里所用的365nm紫外光对DNA的破坏作用是很缓慢的。
对于5′端为磷酸基保护基的ODN 1。氨解后HPLC分析发现，出现积分面积近似的两个峰（图3）。分别回收后，二者的ESI结果相同，且与预期一致（实测4983.7与4984.4，理论4980.8），这证实了这两个峰是一对対映体。计算二者峰面积之比，得到其对映体过量百分数在误差范围内（e.e.为5%）。对于不同的保留时间对应何种光学性质的ODN无法获悉。考虑到二者光照后的结果相同，只选其一进行动力学分析。在寡聚物的水溶液浓度为20μM的条件下，研究不同光照时间对保护基脱除效果的影响，即该过程的动力学。在此，用脱除保护基的峰面积与脱除和未脱除保护基两峰面积之和的比做为衡量该效率的参数。该光反应过程两种光学异构在15分钟的转化率分别为98.7±0.8%和96.7±0.4%(n=3)。进行显著性分析t检验SR=0.664，t=3.688，而t0.02,4=3.747，t＜t0.02,4，即两个光学异构体在该浓度下的光反应动力学行为及结果，在99%的置信水平上无显著差异。同时，该过程符合一级反应动力学，反应速率与寡聚核苷酸浓度的一次方成正比，k=0.358min‑1，r2=0.975（图4）。
对于氨基末端寡聚物ODN 2，在水溶液浓度为20μM的条件下，该光反应过程在15分钟时的转化率为95.6±2.2%。据此认为，该光反应在这一浓度下相当高效。在其它浓度下的光脱除效率未进一步研究。该过程也符合一级反应动力学，k=0.293min‑1，r2=0.986（图5）。
对于5′端羧基ODN 3，因为浓氨水在脱除固相和碱基保护基同时，也会水解羧酸酯键，故将固相直接分散与乙腈和水混合溶剂中（乙腈/水比为4/1，3mg/mL）进行30分钟光照。氨水水解固相并用HPLC纯化后，质谱结果与预期的5′端有羧基的寡聚物相对分子质量一致，但是这并不能证明保护基是由于紫外光照脱除的，试验例2中将通过对5′端羧基与芘甲胺的偶联反应得到证明。
对于5′巯基ODN 4，氨解HPLC纯化后的物质经质谱证实为巯基被保护的寡聚物，实测相对分子质量5100。但经光照，HPLC纯化后的主要产物的相对分子质量不变，仍测得5099。据文献认为光照后暴露的巯基与亚硝基苯的氮原子进一步发生了键合，得到1‑硫醚‑二氢苯并异恶唑副产物（图6）。在0.2M的浓度下，15分钟光照后的转化率达94.3±0.4%。随后将该光照中间体（20μM）与DTT水溶液反应12小时，HPLC发现该中间体仍存在，同时生成了很少的巯基修饰的寡聚核苷酸。
为了进一步研究该现象，将硫代碳酸酯修饰的ODN 5氨解，HPLC纯化后，质谱显示得到了巯基与丙烯腈的加成产物。在氨解中加入二硫苏糖醇（DTT）（0.2M），则得到的主要峰为暴露巯基的寡聚核苷酸。即氨水能使硫代碳酸酯类水解，而DTT可与巯基竞争，和从磷酸骨架脱下的丙烯氰反应，使巯基暴露。
如果首先光照ODN 5，然后用DTT的浓氨水溶液（0.2M）将其水解，HPLC和MALDI‑TOF的分析结果显示（图7），产物仅为暴露巯基的寡聚核苷酸（实测4950，理论4948）和寡聚物上巯基与丙烯氰加成后的产物（实测5002，理论5001）。该结果证实，硫代碳酸酯光照后不会生成1‑硫醚‑二氢苯并异恶唑结构，否则不会出现裸露的巯基，亦不会出现巯基与丙烯氰的加成产物。
对于5′端羰基ODN 6，采用与氨基相同的方法，氨解后带有缩酮保护基的寡聚物保留时间为21.85min。而光照后，出现11.75min的主要峰，浓缩前质谱结果与预期的末端含有羰基的寡聚核苷酸吻合。然而，我们意外地发现，浓缩光照前和光照后的ODN，HPLC再次分析则12min的峰均会消失，仅有15min的峰，质谱结果表明，5′仅有磷酸基。据此，认为该部分发生了磷酸二酯键的β消除，脱下2‑丁酮，仅保留磷酸基团。
此外，本实验还发现，将光照前的ODN 6用MALDI测分子量，得到的主要峰比预期少16道尔顿（实测最高峰5055，次高峰5071，理论5067，图8）。然而，用ESI测试则得到预期结果（实测5070，理论5067）。据Zhang等人（Zhang,J.;Frankevich,V.;Knochenmuss,R.;Friess,S.D.;Zenobi,R.J.Am.Soc.Mass S石油醚ctrom.2003,14,42.；Frankevich,V.;Zhang,J.;Friess,S.D.;Deashtiev,M.;Zenobi,R.Anal.Chem.2003,75,6063.）所报告的MALDI基质加氢还原现象推测，我们相信这是由于样品在MALDI的基质（3‑羟基吡啶甲酸）上发生脱氧还原所致。
试验例2 5′端功能基团ODN的标记
1、ODN 2与5‑TAMRA‑NHS连接（图9）：
5‑TAMRA（5‑carboxytetramethylrhodamine），即5‑羧基四甲基罗丹明，是一种荧光染料，多用于标记多肽或寡聚核苷酸，其易溶于DMF，DMSO和水，最大吸收波长548nm，有最大发射波长574nm。本工作中使用其羧基的NHS活化物。在光照后，将5‑TAMRA‑NHS直接与固相ODN 2反应，再用氨水将ODN从固相上切割下，经HPLC纯化后用质谱（表3）和紫外可见光谱（图10）表征，得到的结果与预期一致。
具体试验方法如下：取合成后的5′氨基固相ODN 2(3mg)悬浮于乙腈/水的混合溶液(v/v比为4/1,0.5mL)，365nm UV光照30分钟。混悬液离心，弃上清液，用乙腈(1×500μL)、乙醚(1×500μL)洗固相后干燥。加入10当量于固相上ODN的5′‑TAMRA‑NHS,DMF(500μL),0.1M NaHCO3(500μL)，30℃混悬24小时。随后用DMF(3×500μL)，乙腈(3×500μL)，乙醚(1×500μL)洗固相，干燥，氨解后HPLC分析，由HPLC的峰面积比计算产率为44%。MALDI‑TOF表征，实测值5345，理论值5345（表3）。
由于先前文献均为氨解后的保护基在0.1M的NaHCO3水溶液中反应，但水溶液会使固相自聚。通过尝试发现，在10eq的TAMRA下，在只用DMF做溶剂时加入有机碱TEA时，该偶联效率很低，在使用DMF与0.1MNaHCO3水溶液混合体系时产率为44%。
2、ODN 3被芘(1‑芘甲胺盐酸盐)标记
取合成后的5′羧基固相ODN 3(3mg)悬浮于乙腈/水的混合溶液(v/v比为4/1,0.5mL)，365nm UV光照30分钟。混悬液离心，弃上清液，用乙腈(500μL)洗固相，干燥。固相在EP管中加入10当量于固相上ODN的BOP，HOBt，DIpeA，和1‑芘甲胺盐酸盐的DMSO(100μL)，30℃下混悬24小时。然后用DMF(3×500μL)，乙腈(3×500μL)，乙醚(1×500μL)洗固相并干燥，氨解后HPLC分析，由HPLC的峰面积比计算产率为82%。MALDI‑TOF表征，实测值5163，理论值5162。
5′羧基与芘甲胺盐酸盐连接（图11）：芘是四环芳香烃类化合物，易溶于非极性溶剂，常用做染料，最大吸收波长为340nm，激发波长为376nm和395nm，本发明中使用1‑芘甲胺的盐酸盐。羧基ODN在固相上光照后，直接与该化合物反应。该步固相在DMSO中得到的产率优于DMF，可能由于芘甲胺的盐酸盐在DMF中的溶解度有限。然后，使用氨水从固相上切割，HPLC纯化。质谱（表3）和紫外可见光谱的结果证实了是光照而不是氨解将光活性保护基脱除的。由HPLC的峰面积比计算得，标记产率为82%。
表3标记的寡聚核苷酸质谱和色谱结果（a)为分析柱结果）