一种根际促生菌SXH3及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102827792 A (43)申请公布日 2012.12.19 C N 1 0 2 8 2 7 7 9 2 A *CN102827792A* (21)申请号 201210284747.5 (22)申请日 2012.08.10 CGMCC NO.6298 2012.06.26 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/88(2006.01) C12P 17/10(2006.01) C12P 1/04(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C05G 3/00(2。

2、006.01) C12R 1/22(2006.01) (71)申请人哈尔滨师范大学 地址 150025 黑龙江省哈尔滨市利民经济技 术开发区师大南路1号 (72)发明人郭长虹 史煦涵 刘佳明 蔡洪生 张程 (74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人陆万寿 (54) 发明名称 一种根际促生菌SXH-3及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种根际促生菌SXH-3，其 分类命名为产酸克雷伯菌SXH-3（Klebsiella oxytoca），保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6298。该菌能够合成吲哚乙酸和嗜铁素。

3、，而且 还具有溶磷作用，从而能够帮助植物提供吲哚乙 酸及铁元素，促进磷的吸收，从而起到促植物生长 的作用。该菌对韭菜的株高、鲜重及干重具有显著 的促进作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1页 2 1.一种根际促生菌SXH-3，其特征在于，其分类命名为产酸克雷伯菌SXH-3 （Klebsiella oxytoca），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）， 保藏号为CGMCC 。

4、No.6298。 2.如权利要求1所述的根际促生菌SXH-3，其特征在于，该菌能够在胞内合成ACC脱氨 酶，在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同时将其分解。 3.如权利要求1所述的根际促生菌SXH-3，其特征在于，该菌能够合成吲哚乙酸。 4.如权利要求1所述的根际促生菌SXH-3，其特征在于，该菌能够合成嗜铁素。 5.如权利要求1所述的根际促生菌SXH-3，其特征在于，该菌具有溶磷性。 6.权利要求1所述的根际促生菌SXH-3在促植物生长的应用。 7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在制备促植物生长的制剂的应用。 8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的制剂为抑制ACC生成的。

5、制剂、促吲哚 乙酸合成的制剂、促嗜铁素合成的制剂、促磷吸收的制剂中的一种或几种。 9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在制备促韭菜生长的制剂的应用。 10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。 权 利 要 求 书CN 102827792 A 1/8页 3 一种根际促生菌 SXH-3 及其应用 技术领域 0001 本发明属于植物促生菌技术领域，涉及一种根际促生菌SXH-3及其应用。 背景技术 0002 韭菜（Allium tuberosum Rottl.ex Spr.）为百合科葱属（Allium tuberosum）的 多年生宿根植物，原产中国，国内各地均。

6、有栽培。韭菜富含维生素及各种矿物质，并且因含 有多种硫醚而具有特殊芳香味，可增进食欲，并有一定的药用价值。它的种子和叶等可入 药。具健胃、提神、止汗固涩、补肾助阳、固精等功效。在中医里，韭菜有一个很响亮的名字 叫“壮阳草”，还有人把韭菜称为“洗肠草”，不但如此，韭菜还有很多名字。韭菜还叫草钟乳、 起阳草、长生草，又称扁菜。由于其口感佳，味道鲜美所以受到大家的喜爱，尤其在春节前更 是备受追捧，故而是一种经济植物。 0003 但种植韭菜需要使用大量化肥，这不仅影响了韭菜的品质，也破坏了土壤环境，并 且随着化肥的大量使用，其利用率不断降低已是众所周知的事实。这说明，仅靠大量增施化 肥来提高韭菜产量是。

7、有限的。为此各国科学家一直在努力探索提高化肥利用率达到平衡施 肥、合理施肥以克服其弊端的途径。微生物肥料在解决这方面问题上有独到的作用。所以， 根据我国作物种类和土壤条件，采用微生物肥料与化肥配合施用，既能保证增产，又减少了 化肥使用量，降低成本，同时还能改善土壤及作物品质，减少污染。 0004 微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特 定的肥料效应。在这种效应的产生过程中，制品中活微生物起关键作用。目前一般将微生物 肥料制品分为两大类：一类是狭义的微生物肥料，指通过微生物的生命活动，增加了植物营 养元素的供应量，包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量，导致植。

8、物营养状况的 改善，进而产量增加，这一类微生物肥料的代表品种是根瘤菌肥；另一类是广义的微生物肥 料，指通过其中的微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生 长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作 物病虫害而促进作物产量的增加。与化学肥料相比具有以下特点：不破坏土壤结构、保护生 态、不污染环境，对人、畜和植物无毒无害；肥效持久；提高作物产量和改进作物产品品质； 成本低廉。 0005 近年来，有关植物根际促生细菌(PGPR)的研究日益受到人们的关注。由于化肥、 农药对环境造成严重污染，化肥价格高涨，能源紧缺，澳大利亚、美国、欧共体组织和。

9、日本等 国，都开展了PGPR的专项研究。19881997年已分别在加拿大、瑞士、澳大利亚和日本召 开了四次国际研讨会，并将继续3年一届轮流在世界各大洲举行。表明PGPR研究和应用已 成为当前农业微生物研究的新热点之一，与它有关的方面正在形成一个新的领域。作为微 生物肥料的PGPR能直接为宿主植物提供营养或间接为宿主植物根部的生长提供积极的作 用，或者帮助宿主植物与其它共生体形成有益的共生关系。 发明内容 说 明 书CN 102827792 A 2/8页 4 0006 本发明解决的问题在于提供一种根际促生菌SXH-3及其应用，该菌是一种新的植 物促生菌，可应用于植物促生剂或微生物肥料的制备。 0。

10、007 本发明是通过以下技术方案来实现： 0008 一种根际促生菌SXH-3，其分类命名为产酸克雷伯菌SXH-3（Klebsiella oxytoca），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为 CGMCC No.6298 0009 该菌能够在胞内合成ACC脱氨酶，在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同 时将其分解。 0010 进一步，还具有以下特征： 0011 该菌能够合成吲哚乙酸。 0012 该菌能够合成嗜铁素。 0013 该菌具有溶磷性。 0014 所述的根际促生菌SXH-3在促植物生长的应用。具体的包括： 0015 所述在制备促植物生长的制剂的应用。

11、。 0016 所述的制剂为抑制ACC生成的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促嗜铁素合成的制 剂、促磷吸收的制剂中的一种或几种。 0017 在制备促韭菜生长的制剂的应用。 0018 所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。 0019 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 0020 本发明提供的产酸克雷伯菌SXH-3，是以ACC作为唯一N源的培养基对从韭菜 的根际土中的微生物进行筛选分离，得到的能够以ACC作为唯一N源生长的微生物，检测 结果表明该菌是一种能够合成ACC脱氨酶的新的产酸克雷伯菌，分类命名为Klebsiella oxytoca。 0021 本发明提供的产酸克雷伯菌SXH-3，由于其。

12、合成ACC脱氨酶，所有能够抑制植物体 内ACC的合成，进而降低由于环境胁迫所导致植物体内乙烯的大量积累，从而提高其抗逆 性。 0022 本发明提供的产酸克雷伯菌SXH-3，还能够合成吲哚乙酸和嗜铁素，而且还具有溶 磷作用，从而能够帮助植物提供吲哚乙酸及铁元素，促进磷的吸收，从而起到促植物生长的 作用。因此，虽然该菌是从韭菜根基土中所筛选分离到的，由于上述作用所具有的促植物生 长的共性，所以该菌还能够作为一种广泛的促生菌应用于其他植物当中。 0023 本发明提供的产酸克雷伯菌SXH-3，对韭菜的株高具有显著的促进作用。经产 酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3处理的韭菜，。

13、在14天时，与对照相比，株高增加 73.18%。 0024 产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3活菌对韭菜的植株鲜重及干重、具有 显著的促进作用。经产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3处理的韭菜，与对照相比， 植株鲜重增加230.26%，干重增加179.13%。 0025 保藏说明 0026 本发明所述的产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3进行了下述保藏： 0027 保藏时间：2012年6月26日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 说 明 书CN 102827792 A 3/8页 5 中国科学院微生物研究所。

14、；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， CGMCC；保藏号为CGMCC NO.6298。 附图说明 0028 图1为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3在ADF培养基上的生长状况。 0029 图2为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3合成的生长激素含量。 0030 图3为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3嗜铁素圈的图片。 0031 图4为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3溶磷圈的图片。 0032 图5为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3对韭菜。

15、促生14天时株高。 0033 图6为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3对韭菜促生14天时鲜重（10 株）比较。 0034 图7为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3对韭菜促生14天时干重（10 株）比较。 具体实施方式 0035 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。 0036 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0037 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0038 实施例1、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的分。

16、离和鉴定 0039 1、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的分离 0040 产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的分离包括取样，筛选和纯化两个步 骤，具体方法如下： 0041 1.1、取样 0042 从韭菜的根际土中进行筛选，具体的供试韭菜及土壤取于黑龙江省哈尔滨市呼兰 区双井镇（土壤理化性质如下：pH 8.15，全盐含量1.83%，碱解氮36mg/kg，有效磷8mg/kg， 速效132mg/kg，有机质2.69%）。将韭菜及植物根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中， 带回实验室种植待测。 0043 称取1g根际土样于含50mL PAF培养。

17、液的三角瓶中，室温(21士1)振荡培养 (200r/min)24h。然后，转移lmL菌悬液至另一50mL PAF培养液中，同等条件下培养24h。 第3天，从PAF培养液中转移1mL菌悬液至50mL DF培养液中，相同条件下培养24h。第4 天，再转移1mL菌悬液至50mL ADF培养液中，相同条件下培养48h，用于含ACC脱氨酶活性 细菌的分离纯化。 0044 1.2、筛选和纯化 0045 （1）取1g根际土样于50mL PAF培养基中，28振荡培养24小时。该PAF培养基 中。PAF培养基含有蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO 4 1.5g，K 2 HPO 4 1.5g，甘油10ml。

18、，(1L量 PH=7.5)具体参照Penrose D M,Glick B R.Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteriaJ.Physiologia Plantarum,2003,118(1):10-15来配制。 说 明 书CN 102827792 A 4/8页 6 0046 （2）取1mL上述（1）震荡后的PAF培养液（混悬液），于50mL PAF培养基中，28振 荡培养24小时。 0047 （3）取1mL上述（2）得到的PAF培养液。

19、，于50mL DF盐培养液中，28振荡培养24 小时。该DF盐培养液含有KH 2 PO 4 4g，Na 2 HPO 4 6g，MgSO 4 7H 2 O 0.2g，FeSO 4 7H 2 O 1mg，葡萄糖 2g，葡萄糖酸2g，柠檬酸2g，(NH 4 ) 2 SO 4 2g，微量元素0.1ml(100ml量H 3 BO 3 10mg，MnSO 4 11.2mg， ZnSO 4 124.6mg，CuSO 4 78.2mg，MoO 3 10mg)。 0048 （4）取1mL上述（3）得到的DF盐培养液，于50mL不含(NH 4 ) 2 SO 4 ，但含有3mM 1-氨 基环丙烷-1-羧酸（ACC）。

20、的DF盐培养液中（即以ACC作为唯一N源），28振荡培养24小 时。 0049 （5）取1mL上述（4）得到的培养液，涂布于含3mM ACC的ADF盐琼脂培养基上，28 培养；48小时时间长出菌落。 0050 （6）取上述（5）培养基上生长的菌落，在ADF培养基上划线纯化，得到单一菌落。 0051 这样经过以ACC作为唯一N源的培养基对根际土中能够利用其作为N源生长的细 菌进行筛选，从而得到了单一菌落（纯培养物）。 0052 2、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的鉴定 0053 对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取， 16S rD。

21、NA的扩增和测序。 0054 2.1该菌株在ADF培养基上形成圆形、半透明、乳白色、突起光滑、边缘整齐、有粘 性的菌落，如图1所示。镜检显示无鞭毛，有荚膜，属革兰氏阴性菌。 0055 其他检测项如下： 0056 0057 加号表示阳性，减号表示阴性；阳性表示存在，阴性表示不存在。 0058 2.2利用引物F8和R1541进行扩增16S rDNA，引物序列如下： 0059 F8/20：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3， 0060 R1541/20：5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3。 0061 PCR扩增条件为：943min；9430s，5530s，7290s，30个循环；。

22、7210min。 0062 对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ.ID.NO.1所示。 0063 将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca） SXH-3，并将其保藏，保藏号为CGMCC No.6298。 0064 实施例2、CGMCC No.6298的ACC脱氨酶活性测定 0065 供试菌株在TSB培养液（胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖 2.5g，K2HPO42.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.5）中过夜培养，4离心收集菌体。菌体细胞用 DF培养液洗涤三次，重新悬浮于ADF培养液，室温(21士1)振荡培养2。

23、天后，4离 说 明 书CN 102827792 A 5/8页 7 心收集菌体，用0.1molL -1 Tris-HCl缓冲液（pH=7.6）洗涤离心三次，重悬浮于600L 0.1molL -1 Tris-HCl缓冲液（pH=8.0）中，加入30L甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞，转 移200L含甲苯的细胞提取物至1.5mL离心管中，加入20L 0.5molL -1 ACC混匀，同时 做不添加ACC的空白试验，30培养15min。添加1mL 0.56molL -1 HCl，16000g离心5min， 取1mL悬浮液至试管中，加入800L 0.56mol L -1 HCl和300L 2,4-二硝基苯。

24、肼，30孵 育30min，加入2mL 2molL -1 NaOH，540nm波长测吸光度。以1mL浓度为0、0.1、0.3、0.7、1 和2molL -1 的-丁酮酸为标准液，测540nm波长下吸光值。 0066 蛋白质测定采用BioRad蛋白质微量测定法，以牛血清白蛋白为蛋白质(Pr)标 准。ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每小时形成-丁酮酸的量表示，单位为 mol-KA(mgPrh) -1 。酶活性测定均扣除样品对照空白后计算，重复3次。 0067 采用-丁酮酸标准品代替以上细胞提取物进行步骤4的实验组相同的实验并制 作标准曲线，标准曲线方程（方程甲）如下：y=192x-1.78。

25、64，R 2 =0.9713，x代表OD 540nm 数值， y代表a-丁酮酸（mol/L）。 0068 根据制作标准曲线和检测结果，即可获得ACC脱氨酶活性的活性。检测结果表 明CGMCC NO.6298的细胞破碎物中具有ACC脱氨酶活性，酶活性最高可达0.198mol -KA(mg Prh) -1 ，这表明CGMCC NO.6289能够胞内合成ACC脱氨酶。 0069 ACC是乙烯合成的前体，乙烯的过多存在会抑制植物的生长，而ACC脱氨酶的存在 却可以减少ACC的存在，从而减少乙烯的生成，近而促进植物生长。 0070 实施例3、CGMCC NO.6298生长激素IAA合成含量的测定 007。

26、1 供试菌株产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3先在DF培养液中培养 2d，再微量转入添加不同浓度色氨酸(L-Trp)的DF培养液(含0、50、100、200和500g L-TrpmL -1 )中继续培养2d，取样测菌液OD 600 ，其余培养液室温下8000g离心，取500L上 清液，添加2mL Salkowski试剂(含150mL H 2 SO 4 、250mL ddH 2 O和7.5mL 0.5mol/L FeC1 3 )， 室温黑暗培养20min后，在535nm处测吸光度(OD 535 )。无菌培养基同上做相同的处理作为 对照调零。以浓度为0、0.01、0.0。

27、5、0.25、0.5mgmL -1 的IAA标准液同方法做标准曲线。IAA 含量单位为g (mLOD 600 ) -1 ，IAA标准曲线平行2次，样品重复3次。标准曲线方程如 下：y=0.0784x-0.0139，R 2 =0.9792，x代表OD 535nm 数值，y代表IAA浓度（gmL -1 ）。 0072 根据制作标准曲线和检测结果，即可获得CGMCC NO.6298的IAA合成量；而且检测 结果还表明，产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3能够利用色氨酸产生吲哚乙酸， 而且随着L-Trp浓度的不同，产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3。

28、的吲哚乙酸合成 量也随之增加，如图2所示，产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的IAA合成量在 L-Trp浓度为500gmL -1 范围内与L-Trp的增加成正比。 0073 CGMCC NO.6298以色氨酸（L-Trp）为前体合成植物生长激素吲哚乙酸（IAA），由于 其吸附在种子和根的表面，从而被植物所利用，同时也可以和植物内生的IAA共同作用刺 激植物细胞生长和增殖，可促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，同 时对植物的其他生命活动进行调节。 0074 实施例4、CGMCC NO.6298的嗜铁素合成量测定 0075 铬天青CAS(chrome a。

29、zurol S)培养基的配制 0076 A：蓝色染液 说 明 书CN 102827792 A 6/8页 8 0077 a.0.06gCAS溶于50ml去离子水。b.0.0027g FeCl6H 2 O溶于10ml,10mMHCl(36% 的浓HCl浓度为11.6mol/L,配10ml 10mM需浓HCl 8.6l)用去离子水。C.0.073g HDTMA(CTAB)溶于40ml去离子水。a与9ml b混合，再混合c，此时为蓝色，高温灭菌， （12120min） 0078 B：混合液 0079 A MM915g KH 2 PO 4 ,25g NaCl,50g NH 4 Cl溶于500ml去离子水。

30、 （0.6gKH 2 PO 4 ,1gNaCl,2g NH4Cl,溶于20ml去离子水中），b.20%葡萄糖溶液，110单独灭 菌，20g溶于100ml去离子水,c.NaOH溶液，25g NaOH溶于150ml去离子水，PH约为12，（5g NaOH溶于30ml）d.酪蛋白水解物溶液滤膜过滤。3g酪蛋白水解物溶于27ml去离子水， c.CAS琼脂板准备（1L量）a.100mlMM9加到750ml去离子水，b.溶解32.24g piperazine- N,N-bis(2-ethanesulfonic acid)PIPES(6.448g PIPES)。c.加入细菌培养用琼脂15g。 d.高温灭菌（。

31、121，20min）,冷却到50。e.加入30ml过滤灭菌的水解酪蛋白，10ml 20% 的葡萄糖溶液到MM9/PIPES混合液中（6ml+2ml）。f.缓慢加入，100ml(蓝色染液，沿玻璃瓶 壁加入，充分混匀)。g.倒板。将已分离保存的细菌接于铬天青CAS(chrome azurol S)培 养基上,28培养4872h,观察菌落周围的颜色变化，以及产生的橘黄色的透明晕圈的直 径。 0080 对其进行嗜铁素合成定性实验。将产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3接 于铬奥醇CAS（chro me azurol S）固体培养基上，28培养48h，观察菌落周围的颜色变化， 。

32、有橘黄色圈产生即可产生嗜铁素。 0081 结果表明，在CAS固体培养基上，CGMCC NO.6298菌落周围有橘黄色晕圈产生，即 产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3可产生嗜铁素。结果如图3所示，其直径比值 为（D/d）1.508。 0082 CAS检测液的配制 0083 10mM HDTMA（CTAB）50ml:0.182g溶于50ml去离子水。10mM HCl20ml:17.2ul 浓HCl定溶到20ml 1mM FeCl6H 2 O 20ml:0.0054g溶于20ml10mM HCl中，得到Fe 3+ 溶液。 2mM CAS 50ml:0.0605g溶于50m。

33、l去离子水。1.5ml与7.5ml混合，再与6ml 混合，得到混合液。4.307gPIPES用去离子水（约20-30ml）溶，加6.25ml浓HCl,调 PH5.6(用NaOH调)。将与混合，定溶100ml。 0084 将CGMCC NO.6298的菌液用50ml离心管离心，10000rpm/min,10min,28。取上清 3ml+CAS检测3ml。反应1h，体积1:1.OD630测吸光值，样品值为A。未接种培养基3ml+CAS 检测液3ml。反应1h.OD 630 为Ar。A/Ar值越小，说明合成嗜铁素能力越强，低于0.5最强。 结果表明，产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca。

34、）SXH-3的A/Ar值为1.894，说明其能够合 成嗜铁素。 0085 嗜铁素是微生物和部分作物在低铁应激条件下产生的一种能够高效率结合三价 铁离子的低分子量有机化合物。嗜铁素的能力强弱可以影响植物对三价铁离子的吸收。这 样CGMCC NO.6298能通过产生和分泌对铁具有高亲和力的嗜铁素，溶解并结合土壤中的铁 元素供植物细胞利用，增加铁营养，促进植物生长。 0086 实施例5、CGMCC NO.6298的溶磷性测定 0087 溶磷圈：用灭过菌的牙签将菌株点接在NBRIP固体培养基上，30培养3-5天，测 说 明 书CN 102827792 A 7/8页 9 量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d。

35、）。 0088 NBRIP固体培养基1L量配制方式：葡萄糖10g,Ca 3 (PO 4 ) 2 5g,MgCl 2 5g,MgSO 4 7H 2 O 0.25g,KCl 0.2g,(NH4) 2 SO 4 0.1g,琼脂15g,PH=7.0110灭菌。检测结果如图4所示，产酸 克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的D/d值为1.958。 0089 溶磷量：将具溶磷性的菌株按1%的接种量接种于NBRIP液体培养基中，30振荡 培养（170r/min）7天。发酵液经10000r/min离心10min，上清含磷量用钼锑抗比色法测定。 配制方式：1）置35ml培养基于200ml三。

36、角瓶中，灭菌，摇5天。2）离心后，取上清。3）用 比色法测定滤液中的有效磷量。（a）取滤液5-10ml（视滤液中磷含量而定），置于50ml量瓶 中，加入7.5N硫酸钼锑抗混合显色剂5ml，加去离子水定容至刻度，充分摇匀，静置30min。 （b）30min后在分光光度计比色（波长660nm），比色时须同时做空白测定。（c）与此同时绘 制磷标准曲线，分别吸取5ppm磷酸标准溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于50ml容量瓶 中，每一量瓶磷的浓度即为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ppm,再个加入7.5N硫酸钼锑抗，混合 显色剂5ml,然后与待测液一样进行比色。绘制标准曲线。

37、。（d）结果计算pmg/100g磷源 =(ppm比色体积分取倍数)/(培养基中加入磷化合物克数10)，结果表明，产酸克雷 伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的溶磷值为4.481，溶磷能力较强。这样CGMCCNO.6298 将有助于植物将土壤中的难溶磷，转换成易于吸收的磷，使植物更易于吸收。 0090 实施例6、CGMCC NO.6298对韭菜的促生效果 0091 分别采用两种方式对韭菜进行促生实验，一种是采用菌液对韭菜进行浸种实验； 另一种方式是对多年生韭菜进行灌根实验。为期一个月，期间浇灌一次菌液，观察浇灌菌液 的韭菜的株高，地上鲜重和地上干重与未浇灌菌液的韭菜相比较生长。

38、的状况。 0092 用于韭菜促生实验的土壤取于黑龙江省哈尔滨市呼兰区双井镇，采集样品时在每 个区域内设置5个样方，样方面积为10.3m 2 ，收集表层土壤（020cm），土壤混合后，装入 事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回实验室，土壤经碾碎，混匀，风干后过筛保存。 0093 将CGMCC NO.6298接种于TSB液体培养基中，28下振荡培养，4离心收集菌体， 用无菌水洗涤离心2次后重悬浮于无菌水中，使活菌数在无菌水中的终浓度达10 9 CFU/mL。 将韭菜种子用0.5%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤，然后用CGMCC NO.6298 浸泡1h，使其附着在种子表面。。

39、以不用CGMCC NO.6298浸泡处理的韭菜种子作为对照（CK）， 均匀种在盆中，每盆20株，重复5次，于培养室内（25）培养，隔天浇水，于七天后浇灌 CGMCC NO.6298菌液（对照正常浇水），每次50ml，每隔7天浇灌一次。于发芽后14天测定 植株高，14天后测量10株植株鲜重及干重、根鲜重及干重。具体的检测结果如表1所示： 0094 表1CGMCC NO.6298对韭菜的促生效果 0095 菌名鲜重（g/10株）干重（g/10株）株高（cm） CGMCC NO.6298 5.450 0.614 16.767 空白 13.097 1.343 23.697 0096 检测结果表明，CG。

40、MCC NO.6298活菌对韭菜的株高具有显著的促进作用。测定经 CGMCC NO.6298处理的韭菜，在14天时，与对照相比，株高增加38.96%，其统计结果如图5 说 明 书CN 102827792 A 8/8页 10 所示。 0097 而且，CGMCC NO.6298活菌对韭菜的植株鲜重及干重、具有显著的促进作用。测定 经CGMCC NO.6298处理的韭菜，与对照相比，植株鲜重增加108.5%，干重增加121.67%，其统 计结果如图6、图7所示。 0098 综上检测表明，CGMCC NO.6298其合成ACC脱氨酶，所以能够抑制植物体内ACC的 合成，进而降低由于环境胁迫所导致植物体。

41、内乙烯的大量积累，从而提高其抗逆性；尤其是 还能够合成吲哚乙酸和嗜铁素，从而能够帮助植物提供吲哚乙酸及促进铁、磷元素的吸收， 起到促植物生长的作用。因此，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以虽然该菌从 韭菜的根际土中分离，该菌还能够作为一种广泛的促生菌应用于植物促生长当中。 0099 具体的检测结果表明产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3能够从多个方面 促进植物的生长，对比检测结果表明产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）SXH-3的株高、鲜 重及干重均具有显著的促进作用，可应用于韭菜促生制剂或微生物肥料的制备。 说 明 书CN 102827792 A 10 1/2页 11 0001 0002 序 列 表CN 102827792 A 11 2/2页 12 序 列 表CN 102827792 A 12 1/3页 13 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102827792 A 13 2/3页 14 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102827792 A 14 3/3页 15 图5 图6 图7 说 明 书 附 图CN 102827792 A 15 。