抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定.pdf

本发明涉及抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定。本发明披露了用于在体外在脊椎动物宿主细胞中产生、表达以及筛选多样的结合蛋白(例如，抗体或其片段)集合的新颖方法、用于鉴定和分离配体特异结合蛋白或抗原特异性结合蛋白的新颖方法。在此披露的这些方法允许从至少一种载体构建体表达多样的结合蛋白集合，这些载体构建体任选地可以在转移并且原位表达到脊椎动物宿主细胞中时产生多样结合蛋白集合。

1.  用于分离并且鉴定至少一种稳定转导的脊椎动物宿主细胞的方法，所述至少一种稳定转导的脊椎动物宿主细胞在其细胞表面重组表达对于令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段，所述方法包括以下步骤：
(a)通过使用无复制能力的逆转录病毒颗粒将至少一种逆转录病毒表达构建体转导到脊椎动物宿主细胞中，该表达构建体编码了抗体或其片段，其中所述至少一种构建体稳定地整合到宿主细胞基因组中，从而转导的宿主细胞能够在其细胞表面表达和展示所述抗体或其片段，且其中所述脊椎动物宿主细胞是前体B淋巴细胞，其内源性地表达了促进所述抗体或其片段的膜沉积的Igα以及Igβ分子，且不能表达内源抗体多肽类和至少一种替代轻链组分；
(b)将所述抗体或其片段稳定表达于所述脊椎动物宿主细胞中且将其展示于所述细胞的细胞表面；
(c)通过将展示特异性抗原结合的细胞从未结合的细胞群中分离出来，从而选择性地分离对所述令人希望的抗原或配体具有高亲和力的强抗体结合物，基于其与所述令人希望的抗原或配体相结合的能力将表达所述抗体或其片段的脊椎动物宿主细胞富集；并且
(d)从这些经逆转录病毒转导的并且富集的脊椎动物宿主细胞分离并且鉴定所述至少一种稳定转导的脊椎动物宿主细胞，所述至少一种稳定转导的脊椎动物宿主细胞在其细胞表面表达所述对于令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段。

2.  由权利要求1所述的方法获得的或可获得的至少一种前体B淋巴细胞。

3.  至少一种前体B淋巴细胞，其在其基因组中稳定整合了至少一种逆转录病毒表达构建体，且包含编码了对于令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段的至少一种核苷酸序列，从而所述至少一种前体B淋巴细胞能够在其细胞表面表达和展示所述抗体或其片段，其中所述至少一种前体B淋巴细胞内源 性地表达了促进所述抗体或其片段的膜沉积的Igα以及Igβ分子，且其中所述至少一种前体B淋巴细胞不能表达内源抗体多肽类和至少一种替代轻链组分。

抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定
本申请是国际申请日为2009年3月4日的国际申请PCT/EP2009/001525进入中国、申请号为200980107592.4的题为“抗原特异性结合蛋白或配体特异性结合蛋白的鉴定”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明披露了用于在体外在脊椎动物细胞中产生、表达并且筛选多样的结合蛋白集合的新颖方法，允许鉴定并且分离配体反应性或抗原反应性的结合蛋白。具体地，本发明涉及用于逆转录病毒的表达、分离并且鉴定至少一种核苷酸序列的方法，该核苷酸序列编码了一种结合蛋白，例如对于一种令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段。
背景技术
展示技术在分离特异性的高亲和力结合蛋白、用于在多种紊乱和疾病中进行诊断性和治疗性应用方面发挥一种重要的作用。这些技术延伸到抗体工程化处理、合成酶类、蛋白质组学、以及无细胞的蛋白质合成的广阔领域内。生物分子展示技术(这些技术允许模块化地编码生物分子的大库的构建、它们针对特性选择的展示、以及它们结构的快速表征(解码))对于大规模地评估并且分析蛋白的多样性是特别有用的。近来，体外展示技术已经变得引人注目，这是由于通过噬菌体展示、核糖体展示以及微生物展示来分离抗体的缘故，它们现在已经变成主流的抗体和蛋白质工程平台。然而，微生物表达和展示系统受到多种限制，特别是对于表达大的二聚体脊椎动物蛋白质而言，例如抗体。这是由于在此类表达系统中一般没有表达全长抗体的能力(这要求展示工程化处理的抗体片段)，而且还由于缺少糖基化作用、缺乏伴侣蛋白、缺少亚细胞区室以及真核细胞特异性蛋白质运输，这些单独地并且共同地在微生物表达的哺乳动物蛋白中导致蛋白质折叠的假象(artefact)。近来，采用真核宿主细胞(包括酵母、植物、以及哺乳动物细胞)还已经开发了多种体外展示方法。酵母和植物细胞的表达系统也受到缺少糖基化作用、以及特异性脊椎动物和哺乳动物细胞特异性分子伴侣的困扰，这样使得对于蛋白质折叠的同样限制施用于脊椎动物蛋白在此类系统中的表达。大的重组蛋白(像抗体)的表达、适当的蛋白质折叠 以及翻译后修饰仅能够预期在脊椎动物表达系统中以合理的效率和质量发生，在种系发育方面最接近相关细胞的系统中理想地表达多种蛋白。
因此，在治疗方面感兴趣的蛋白(像来自啮齿动物或人类的抗体)理想地表达于啮齿动物细胞或人类细胞中，并且并非出乎意料的是监管机构仅批准来自此类物种的表达系统用于临床级全长治疗性抗体的生产。然而，基于脊椎动物以及哺乳动物细胞的表达系统是费力的，要求长时间期限来建立稳定生产的细胞系和克隆，并且此类细胞的一种有效的并且可控的遗传修饰通常并非是微不足道的并且因此使这些系统对于多种筛选和展示方法吸引性欠佳。例如，DNA转染方法不能用来控制被瞬间地或稳定地结合到经转染的细胞中的DNA构建体的数目，这排除了蛋白质文库的克隆表达并且因此将一种干净的基因(clean gene)用于表型筛选。这些替代性病毒系统缺少对于克隆表达的适当控制、对于这些遗传构建体的稳定维持，和/或经受以下事实：此类系统经常在这些靶细胞中引起细胞致病作用(例如，痘苗病毒表达)，这样使得蛋白质克隆不能得到展示和/或被顺序地富集用于一种特定的表型，像例如特异性结合到一种抗原上。
因此，本发明的一个目的是提供一种方法，该方法明显地克服了现有技术中原核和真核基因表达以及选择系统的所有以上提到的限制和缺点。根据本发明的方法利用了结合蛋白的稳定的逆转录病毒表达，例如(特别是)哺乳动物细胞中、特别是B淋巴细胞系中的抗体，这样使得当存在适当的糖基化作用、侣伴蛋白质以及蛋白质运输时实现了抗体蛋白的稳定的并且优选的克隆表达，确保适当的蛋白质折叠并且允许有效地并且重复地筛选(若希望的话)结合抗原的抗体克隆。因为根据本发明的方法的优选实施方案是基于在前体淋巴细胞中抗体或其片段的逆转录病毒表达的，在此披露的技术被称为‘逆转录细胞展示’(‘Retrocyte Display’)(全称为逆转录病毒前体B淋巴细胞展示)。
发明内容
本发明总体上涉及治疗性或诊断性抗体或其片段的规定。具体地，它涉及具 有完全人类氨基酸序列的抗原反应性抗体的鉴定以及选择，这些序列对于治疗性应用是令人感兴趣的。本发明的这些实施方案涉及能够在脊椎动物(优选哺乳动物)细胞中表达多样的结合蛋白(包括抗体或其片段)集合的逆转录病毒表达载体、以及用于将配体反应性或抗原反应性分子有效分离的多种方法。本发明提供了用于产生多样的结合蛋白(例如抗体或其片段)集合的新颖方法，这是通过三种替代性方法来进行的。首先，通过至少一种重链或轻链分子对一个多样的轻链或重链集合(文库)进行链改组，(链改组方法)，或其次，通过由逆转录病毒转导的表达构建体的体细胞突变(体细胞突变方法)在原位逆转录病毒转导进入脊椎动物细胞之后进行的一种抗体重链与轻链的至少一种组合的多样化，或第三，通过逆转录病毒转导的表达构建体(这些构建体含有针对抗体的可变结合域的编码区)的V(D)J重组称为“准胚系”(“quasi-germline”)构型的，例如仍然分成V、可任选地D以及J基因片段(V(D)J的重组方法。应当理解，多样的结合蛋白(包括抗体或其片段)集合还可以通过以上提及的方法中的任何组合而产生。优选地，所述结合蛋白或抗体或其片段在前体淋巴细胞的表面上展示。
与本领域已知的可替代的、基于质粒或基于非整合性病毒的脊椎动物表达系统相比，本发明特别地提供了允许使用逆转录病毒转导在脊椎动物细胞中稳定地(并且可任选地克隆地)表达的多样的结合蛋白(优选抗体)集合的方法，这种逆转录病毒转导显著地促进了编码结合蛋白的基因的扩增、分离、以及克隆。作为一种代表性的但不并非限制性的实例，在此披露了不能表达内源性抗体的鼠前体淋巴细胞的逆转录病毒的转导，这样使得在这些宿主细胞中只有异源性的重组抗体被表达为膜结合型抗体。而且，本发明说明了怎样可以分离表达配体反应性或抗原反应性结合蛋白(例如，抗体或其片段)的细胞、并且将其任选地在体外进行扩展，以便反复地富集一个抗原反应性结合物细胞群，随后可以将来自这些细胞的、编码了抗原反应性或配体反应性结合蛋白的基因进行克隆并且通过本领域中已知的标准的分子生物学操作进行测序(图1)。
尽管根据本发明的方法的一个优选实施方案是针对结合蛋白(优选人类全长 抗体)的逆转录病毒表达的，它同样可以用于表达它们的任何片段(例如，抗体的单链F_v或F_ab片段)。在此披露了逆转录病毒转导的科学试验方案，该方案可任选地允许(i)将编码单一结合蛋白的构建体递送到单一的靶细胞中，以便确保结合蛋白在这些宿主细胞中的克隆表达；(ii)将编码一种第一多肽链的至少一种表达构建体与编码一种第二多肽链的至少一种表达构建体进行改组，由此产生一种功能性的多聚体结合蛋白(例如，一种抗体分子)；(iii)当在原位对脊椎动物细胞进行转导时对编码至少一种结合蛋白的至少一种表达构建体的体细胞进行突变；以及(iv)当原位逆转录病毒转导进入脊椎动物细胞时通过V(D)J重组的机理从至少一种表达构建体中产生结合蛋白表达。
为了原位实现编码构建体的结合蛋白的体细胞突变，在此披露了逆转录病毒表达载体以及它们的应用，其中所述载体含有将体细胞超突变(hypermutation)靶向到编码蛋白的序列上的顺式调控基因元件，这是优选地经由一种活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)途径(Papavasiliou&Schatz，2002)、或使用将体细胞突变靶向到编码结合蛋白的序列上的其他酶类来进行的。为了通过V(D)J原位重组来产生多样的结合蛋白(优选抗体或其片段)集合，在此披露了多种逆转录病毒载体构建体以及它们的应用，其中所述构建体包含以“准胚系”构型安排的可变区(V)、可任选地多变区(D)以及连接区(J)的基因片段，允许通过被称作V(D)J重组的过程、经由这些基因片段的重组活化基因(RAG)-介导的重排、将针对免疫球蛋白或免疫球蛋白样结合蛋白的编码区进行装配(Grawunder et al.，1998)。
根据另一个方面，本发明进一步说明了稳定地表达多样的重组结合蛋白集合的逆转录病毒转导细胞是如何随后通过与感兴趣的至少一种配体或抗原相结合来得到标记的，以及与以上提及的感兴趣的配体或抗原相结合的细胞是如何通过适当的二级试剂(secondary reagent)检测到的。在此说明了用于特异性地标记配体反应性细胞或抗原反应性细胞、以及它们的富集或分离的方法，优选通过高速荧光激活细胞分选(FACS)。由于逆转录病毒转导细胞的稳定表达表型，说明的是如何可以任选地将抗原反应性细胞分离、并且通过组织培养(in tissue  culture)再次进行扩展，这样可以进行任选反复循环的抗原标记、抗原定向的富集、以及配体反应性或抗原反应性细胞的扩增，直到进行这些细胞的亚克隆，允许通过多种标准的PCR克隆方法来鉴定针对抗原反应性抗体的核苷酸编码区(图1)。
在此披露的这些方法允许从至少一种载体构建体中表达多样的抗体链或其片段的集合，该载体构建体当转移并且原位表达到脊椎动物的细胞中时可任选地能够产生多样结合蛋白集合。抗体链在脊椎动物细胞中的表达是优选地由逆转录病毒转导所介导的。
这样，本发明的第一个方面涉及用于分离并且鉴定至少一种核苷酸序列的方法，该核苷酸序列编码了对一种令人希望的抗原或配体特异的抗体或其片段，包括以下步骤：
(a)将至少一种编码了抗体或其片段的逆转录病毒表达构建体转导到脊椎动物宿主细胞中；
(b)将所述抗体或其片段表达于所述脊椎动物宿主细胞中；
(c)基于它们结合到所述令人希望的抗原或配体的能力将表达所述抗体或其片段的脊椎动物宿主细胞富集；并且
(d)将所述至少一种编码了所述抗体或其片段的核苷酸序列从这些逆转录病毒转导的并且富集的脊椎动物宿主细胞中进行分离并且鉴定。
除了以上提及的步骤之外，步骤(d)之前可以是将这些富集的脊椎动物宿主细胞通过组织培养进行扩展的一个步骤。而且，步骤(c)之后可以跟随将这些富集的脊椎动物宿主细胞通过组织培养进行扩展的一个步骤，在这之后在执行步骤(d)之前将步骤(c)重复至少一次。
为了实现至少一种抗体的克隆表达，优选的是控制这种逆转录病毒转导，这样逆转录病毒转导的细胞中大多数细胞是通过每条整合到宿主细胞基因组内的抗体链中仅有的一个重组逆转录病毒构建体进行遗传修饰的。因此，在本发明的一个实施方案中，逆转录病毒转导是以等于或小于0.1的感染复数(MOI)进行的。
根据本发明的一种方法的一种抗体优选地是一种全长抗体。一种抗体的片段可以选自下组，其组成为：一条重链、一条轻链、一种V_H单域、一种V_L单域、一种scFv片段、一种Fab片段、以及一种F(ab’)2片段。该抗体或它的一个或多个片段可以具有一种自然发生的氨基酸序列、一种人工工程化处理的氨基酸序列或它们的组合。
尽管本发明的方法优选地用于分离并且鉴定对一种抗体链进行编码的至少一种核苷酸序列，对于本领域内的普通技术人员而言清楚的是本发明的方法还可以用于分离并且识别至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码了属于Ig-超级家族的任何一种单体或多聚体的细胞表面受体以及其任何功能片段、或属于TNFα-受体超家族的一种单体或多聚体的细胞表面受体或其任何片段。
而且，其中这种结合蛋白是一种全长抗体，该全长抗体选自下组，其组成为：一种完全人类抗体、一种人源化抗体(其中一种或多种非人类抗体的CDR区已经被移植到一种人类抗体的框架上)、以及一种嵌合抗体(其中来自一种脊椎动物物种的可变区结构域与另一种脊椎动物物种的恒定区结构域相结合，其中该嵌合体抗体的恒定区结构域优选地衍生自一种或多种人类抗体)。
在此处披露的这些方法的一个实施方案中，这些脊椎动物宿主细胞可以衍生自一组物种，这些物种包括：软骨鱼类、硬骨鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、以及哺乳动物类。这组哺乳动物物种可以包括猪、羊、牛、马以及啮齿动物。这组啮齿动物可以进一步包括小鼠、大鼠、兔、以及豚鼠。在本发明的一个优选实施方案中，这些脊椎动物宿主细胞物种是小鼠(Mus musculus)。
在本发明的一种方法中所使用的脊椎动物宿主细胞可以衍生自任何脊椎动物器官，但优选地衍生自淋巴细胞系细胞。用于本发明的优选的淋巴细胞是B细胞系，因为这些细胞表达了抗体特异性伴侣蛋白质，并且因为介导抗体的细胞表面锚定所要求的辅助分子(像Igα和Igβ)表达于这些细胞中。更优选地，这些B细胞是前体B淋巴细胞，因为可以发现不表达任何内源性抗体链的前B细胞。实际上，如在本发明中所使用的这些优选的淋巴细胞不能表达内源性抗体多肽，这些多肽包括所谓的替代轻链(surrogate light chain)成分，该替代轻 链是由基因λ-5、VpreB1以及VpreB2编码的。因此，这些优选的淋巴细胞表达了促进抗体分子的膜沉积的辅助膜蛋白，例如B细胞特异性Igα和Igβ分子，但是它们缺少任何内源性抗体多肽或替代轻链成分的表达。然而应当注意，有可能的是通过本领域中已知的方法(例如，使用针对这些蛋白的表达载体进行稳定地转染)异位地表达Igα和Igβ分子。在本发明的一个优选实施方案中，抗体分子是经由内源性地表达的Igα和Igβ蛋白而被锚定到淋巴细胞的细胞膜上的，这些Igα和Igβ蛋白是自然地表达于鼠前B淋巴细胞中的。
在此披露的这些方法包括以下操作，这些操作允许分离出展示针对感兴趣的一种配体或抗原的所希望的结合特征的细胞、以及分离对感兴趣的一种所希望的结合蛋白进行编码的基因。与本领域内已知的可替代的、基于质粒的或基于非整合性病毒的脊椎动物表达系统相比较，在此披露的在脊椎动物细胞中逆转录病毒表达一种抗体的优选方法允许对抗体进行稳定地并且优选地克隆表达，这些抗体显著地促进了编码抗体的基因的扩增、分离、以及克隆。所披露的方法允许通过以下两者之一在体外有效地产生多样的结合蛋白集合：
(i)将对一种多聚体结合蛋白的至少一种多肽链(像例如，一个抗体的重链)进行编码的至少一种表达构建体与对至少一种匹配的多肽链(像例如，一个抗体的轻链)进行编码的至少一种表达构建体进行改组，产生一种功能性多聚体结合蛋白(像例如一种抗体)；
(ii)当原位转移到脊椎动物细胞中时将对至少一种结合蛋白进行编码的至少一种表达载体进行体细胞突变；
(iii)当通过被称为V(D)J重组的操作原位转移到脊椎动物细胞中时将编码了包含在至少一种表达载体中的免疫球蛋白以及免疫球蛋白样分子的可变区结合域的V(可变区)、可任选地D(多变区)，以及J(连接区)的基因片段进行体细胞重组；或
(iv)通过操作(i)、(ii)、以及(iii)的任何组合。
根据一种优选的实施方案，该至少一种核苷酸序列是多种核苷酸序列，这些核苷酸序列包括一种抗体重链序列以及多种抗体轻链序列，或在替代方案中包 括一种抗体轻链序列以及多种抗体重链序列。
根据另一种优选的实施方案，该抗体或其片段包括由能够进行V(D)J重组的至少一种逆转录病毒表达构建体编码的一种可变结合域，以便当逆转录病毒转导时产生针对一种可变结合域的编码序列，或者
在另一个优选的实施方案中，在诱变处理的条件下进行以上方法中的步骤(b)，优选地经由活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的表达，这种酶是内源性表达的或异位地表达的，其中AID的异位表达是在可诱导的条件下进行的。
在以上方法的一个方面，对所述抗体或其片段进行编码的至少一种逆转录病毒表达构建体包含了顺式调控启动子与多个增强子元件的组合，该组合允许将AID介导的体细胞突变靶向到由该表达构建体编码的一种可变结合域上，其中该启动子以及多个增强子元件是选自下组，其构成为：
(a)免疫球蛋白重链启动子、内含子增强子(EμH)以及3’α增强子元件，
(b)免疫球蛋白κ轻链启动子、κ内含子增强子(κiE)以及3’κ增强子(3’κE)元件，
(c)免疫球蛋白λ轻链启动子、λ2-4以及λ3-1增强子元件，以及
(d)它们的任何功能性组合。
附图说明
图1：该图展示了“逆转录细胞展示”的原理，允许鉴定并且分离对于一种令人希望的抗原或配体特异的结合蛋白，例如抗体。第一步，将可以产生多样的结合蛋白集合的表达的至少一种逆转录病毒表达构建体稳定地转导到适合的脊椎动物宿主细胞(“选择细胞”(“selector cells”))中。这是通过将编码了至少一种结合蛋白的至少一种逆转录病毒载体转染到逆转录病毒包装细胞中来实现的(步骤1)，该逆转录病毒包装细胞可以组成型地或瞬时地表达逆转录病毒蛋白Gag、Pol以及Env。然后，转染了该至少一种逆转录病毒结合蛋白构建体的包装细胞将会在转染后24-72小时内产生重组逆转录病毒颗粒，这些颗粒含有该至少一种逆转录病毒表达构建体。所得到的逆转录病毒颗粒累积在这些逆转录 病毒包装细胞的细胞培养上清液中，并且可以用于转导适合的脊椎动物宿主细胞(“选择细胞”)(表2)，这些选择细胞接着表达这种结合蛋白。在这种优选的方法中，这些结合蛋白(例如，抗体或其片段)表达于这些“选择细胞”的细胞表面上，并接着将这些细胞用一种令人希望的抗原或配体进行标记(步骤3)。然后，优选地通过荧光激活细胞分选(FACS)来分析结合抗原的细胞或结合配体的细胞，并且优选地通过制备型、高速FACS将展示特异性抗原结合的细胞从未结合的细胞群中分离出来(步骤4)。可以任选地通过组织培养再次将抗原反应性或配体反应性细胞进行扩展，并且由于逆转录病毒转导的细胞的稳定表达表型，可以重复抗原定向的细胞分选以及组织培养扩展的循环，直到获得一种可检出的抗原反应性或配体反应性细胞群时。这个抗原反应性或配体反应性细胞群可以经受一个最终的、优选的、单细胞分选步骤，或可以在群落的基础上直接用于对编码结合蛋白的基因进行克隆。在下一个步骤中(步骤5)，从这些抗原选择的或配体选择的细胞库或细胞克隆中对相关结合区域的编码区进行克隆，这是通过RT-PCR或基因组PCR、使用与一些序列相结合的引物对(这些序列是对于这个结合蛋白文库特异的和/或对于其他载体序列特异的)、通过本领域内已知的标准方法来进行的。然后，可以将针对结合蛋白的经克隆并且测序的编码区任选地作为重组蛋白表达于被选为进行进一步功能性表征的任何表达系统中、并且从而证实抗原结合或配体结合的特异性(步骤6)。
图2：(a)该图展示了抗体或免疫球蛋白、以及它们的片段的示意性结构，根据所披露的发明这些抗体或免疫球蛋白、以及它们的片段是优选的结合蛋白。图2a)显示了一种IgG抗体的示意性结构(左侧)，它的特征为一个特征性Y型结构、并且是由两个完全相同的免疫球蛋白(Ig)重链和轻链组成的，这些免疫球蛋白重链和轻链对应地包括4个免疫球蛋白结构域(V_H-C_H1-C_H2-C_H3)以及2个免疫球蛋白结构域(V_L-C_L)。V结构域是IgH和IgL链的高度可变的抗原结合区域，其中C_H和C_L结构域代表恒定区结构域。IgH链的可变区结构域是由V、D以及J基因片段编码的，而IgL链的可变区结构域仅仅是由V和J基因片段编码的，这些结构需要通过被称为V(D)J重组的过程、在早期B淋巴 组织产生过程中从胚系免疫球蛋白基因座(图.2b和2c)进行装配。
抗体IgH和IgL链是由二硫桥(disulphide bridge)共价结合在一起的，这些二硫桥在靠近柔性铰链区的一个位置上(例如，在C_H1和C_H2结构域之间)将这些完全相同的IgH链连接在一起，然而在C_H1和C_L结构域之间额外的二硫桥(如所描绘)与IgH和IgL链进行共价连接(图.2a左侧)。
Fab片段是仅含有由一个天然二硫桥连接的V_H-C_H1/V_L-C_L结构域的全长抗体的单价片段，它可以是通过酶促木瓜蛋白酶酶切从全长抗体得到的、或者它可以通过将C_H2-C_H3缺失的IgH链与IgL链一起表达而被表达为重组蛋白。额外的完全人类抗体片段是单链可变结构域片段(scFv片段)，这些片段仅包括IgH和IgL链的可变区结构域，这些可变区结构域是通过一种合成接头或一种人工二硫桥连接的。全长抗体或抗体片段的表达(如所描述的Fab和scFv片段)还可以被表达为结合蛋白以便实现本发明。
图2b)示意性地描述了在一种胚系IgH链等位基因上发生的V(D)J重组过程，这导致了抗体V_H结构域的编码区的装配。在脊椎动物物种中IgH链的可变结构域是由多个V、D和J基因片段进行编码的，这些基因片段以胚系构型而被分开。在早期B淋巴组织产生期间发生的V(D)J重组过程中，将V、D和J基因片段选出的一个进行位点特异性地重排以产生针对一个抗体V_H结构域的独特的编码区。IgH链基因座中的V(D)J重组是一个有序过程、并且起始是将一种所选的D重排到一种所选的J基因片段上，通常在这两个IgH链等位基因上。只有在D至J的基因重排之后，将一个所选的V区位点特异性地连接到这个已经装配好的DJ区上，从而产生编码该V_H结构域的一个V-D-J ORF。V(D)J重组过程是依赖于前体淋巴细胞特异性的重组活化基因(RAG)1和2的表达的。
图2c)示意性地描述了在一种胚系IgL链等位基因上发生的V(D)J重组过程，这导致了抗体V_L结构域的编码区的装配。脊椎动物物种中的IgL链的可变域仅仅是由V和J基因片段进行编码的，这些基因片段以胚系构型而分开，这与在IgH链基因座中的基因片段相类似。一种抗体V_L结构域的产生仅要求一个 位点特异性V(D)J重排事件，如所描绘。
图3：该图示意性地展示了对靶细胞进行稳定的基因修饰、用于通过逆转录病毒转导来表达一种感兴趣的结合蛋白(BPOI)(例如，一种抗体)(可替代地标记为“X”)的原理。
图3a)描绘了一种野生型逆转录病毒基因组的示意性组织结构(上左)，其中对于结构性和功能性蛋白Gag、Pol和Env的基因位于在该逆转录病毒基因组侧翼的、在所谓的5’和3’长末端重复(LTR)序列之间。5’LTR对于这些逆转录病毒基因的表达是重要的，并且对于在所感染的宿主细胞中复制该逆转录病毒基因组也是重要的。在该逆转录病毒基因组中另一个重要的区域是ψ(Psi)包装信号，该包装信号是在复制和/或生产逆转录病毒颗粒的过程中对该逆转录病毒RNA进行包装所要求的。
为了产生重组逆转录病毒颗粒，可以将gag、pol和env基因从一个野生型逆转录病毒基因组中去除，这样仅留下5’和3’LTR、以及ψ(Psi)包装信号。为了构建重组逆转录病毒载体，接着方便的是引入一个多克隆位点(MCS)，该位点含有几种独特的并且方便的限制性酶切位点。这种设计(如以上/右侧所描绘)代表了最简单的逆转录病毒转移载体。
为了表达重组逆转录病毒(这些重组逆转录病毒允许表达一种重组蛋白(例如，感兴趣的一种结合蛋白(BPOI)“X”)，例如一种抗体)，最低程度是需要将一种BPOI的一个开放阅读框(ORF)插入到一种“空”逆转录病毒转移载体中，因为该5’LTR区具有能够驱动定位于下游的任何基因的表达的一种启动子活性。然而，为了改进表达水平，一种感兴趣的基因(例如，一种BPOI-“X”)的表达可以是任选地由一种额外的异源启动子(Prom.)驱动的，并且任选地加入一种标记基因(例如，5’LTR启动子以及ψ包装信号的下游)(如在此所描绘)可以允许对逆转录病毒转导的构建体进行选择和/或跟踪。
图3b)示意性地展示了对靶细胞进行逆转录病毒转导的操作，导致了BPOI-“X”的稳定表达，例如抗体。为此，首先将含有针对一种BPOI-“X”的表达盒的重组逆转录病毒构建体瞬时地转染到一种逆转录病毒包装细胞系(PCL) 中，该细胞系表达了一种野生型逆转录病毒的结构性和功能性逆转录病毒蛋白Gag、Pol和Env(左侧)。可以通过将针对Gag、Pol和Env蛋白的表达构建体稳定地或瞬时地转染到一种适当的并且易于转染的细胞系中(例如，标准的人类293HEK细胞、或小鼠NIH 3T3成纤维细胞)来产生逆转录病毒PCL。转染后2至3天，将含有BPOI-“X”基因的重组逆转录病毒基因组包装到无复制能力的逆转录病毒颗粒中，它们在PCL的细胞培养上清液中累积。这些逆转录病毒颗粒是无能力复制的，因为它们缺少针对功能性逆转录病毒Gag、Pol和Env蛋白的基因，并且因此它们仅能将它们的遗传有效载荷递送到一种靶细胞中一次，一个被称作逆转录病毒转导或单轮感染的过程。在逆转录病毒转导过程中，将一种重组逆转录病毒的包装RNA引入到这些靶细胞中，其中它被反转录成cDNA，该cDNA然后被稳定地整合到靶细胞基因组中。在逆转录病毒转导之后2至3天，接着由这些靶细胞永久地表达一种感兴趣的基因(例如，BPOI-“X”)，这是由于将cDNA逆转录病毒构建体整合到该宿主细胞基因组中的缘故。
图4：该图显示了可以用于实现本发明的优选类型的逆转录病毒表达构建体的示意性设计。该图描述了逆转录病毒载体的示意性设计，这些逆转录病毒载体包含在一个标准的DNA克隆质粒的主链中(封闭的黑线)；突出显示了针对该逆转录病毒基因组的相关基因和区域。在图片(panel)(a)中所描绘的一种优选的载体生成(其详细克隆描述于图5和6中，并且在实例1中提供)包含了针对人类Igγ₁H链和IgκL链的cDNA编码区，这些区域是由强组成型CMV启动子(Prom)驱动的、并且上游和下游的侧翼为Igκ内含子增强子(κiE)以及3’κ增强子(3’κE)元件，促进了对于IgH和IgL链的V编码区的体细胞超突变。这些逆转录病毒IgH和IgL链表达构建体额外地含有对应地针对抗生素抗性标志物潮霉素B(hygro^R)和嘌呤霉素(puro^R)的开放阅读框，允许对IgH和IgL链构建体的稳定整合进行选择(这些IgH和IgL链构建体将对应的抗生素药物选择施用至逆转录病毒转导的脊椎动物细胞培养物中。)此外，突出显示了方便的、独特的限制性内切酶位点，允许用HindIII和Eco47III直接替换V编码区、或通过使用限制性内切酶HindIII和NotI来替换整个IgH和IgL链编 码区。这样，从一个现有的IgH或IgL链表达构建体中可以容易地将不同的V区和甚至全部的V区集合克隆到所披露的表达载体中。
(b)在该图片中，描述了另一类优选的载体，它们带有由一个DNA片段进行的可变编码区的替换，其中该可变编码区仍然被分成处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段(对于IgH构建体)以及V和J基因片段(对于IgL链构建体)。尽管与在(a)中所提供的逆转录病毒表达载体在其他方面是相同的，这些能够进行V(D)J重组的逆转录病毒载体首先需要经历V、可任选地D以及J基因片段的位点特异性重排，从而产生针对一条IgH或IgL链的可变结合域的一个编码区。这种在V(D)J重组之后允许表达IgH链的详细克隆描述于图11中。
这些构建体的一个独特的特征是它们在原位在V(D)J重组活性细胞中(例如，在表达内源性RAG1和RAG2蛋白的前体淋巴细胞中)产生多样的V结构域编码区的能力。因为V(D)J重组的过程并不精确，一个多样的可变编码区序列集合可以在一组给定的V、D和J基因片段之内(对于IgH)或在一组给定的V、D和J基因片段之内(对于IgL)由一个单独的逆转录病毒载体产生。接合V、可任选地D以及J基因片段的多样性是由于外切核酸酶的活性、TdT介导的N-区加成、以及P核苷酸产生相组合的缘故，这些都可以逐个地或共同地贡献编码连接的多样性。因为这些V、D和J基因片段已经按照一种方式得到克隆(这种方式是不同的V、D和J基因片段家族成员可以容易地被独特的限制性内切酶位点替换)，所产生的并且引入到能够进行V(D)J重组的宿主细胞中的有限数目的构建体可能导致巨大多样的原位产生的结合蛋白多样性。因为这些载体含有额外的κiE和3’κE元件，将体细胞超突变赋予一个V(D)J重排的V域编码区，一种主要的原位产生的多样结合蛋白集合可以任选地进一步通过一种AID依赖的体细胞超突变方法进行诱变。这样，在体内产生抗体多样性的整个过程可以被概括为原位地并且在体外使用所披露的逆转录病毒构建体、以及展示出V(D)J重组活性的宿主细胞(例如，前体淋巴细胞)，并且其中AID介导的体细胞超突变是活性的、或可以被活化的。
(c)然而，该图片示意性地描绘了可以用于实现本发明的逆转录病毒构建体 的另一种设计。在此，这些IgH和IgL编码区的表达是由该逆转录病毒主链的5’LTR启动子所驱动的，并且IgH和IgL的表达对应地与GFP和YFP自身荧光标志物的表达相偶联，允许仅通过对所转导的细胞分析绿色和黄色荧光来对表达IgH和IgL的细胞进行示踪和分离。这些构建体对于无需另外标记操作来控制“选择细胞”的多重感染是非常有用的。
在此提供了在图4a)至c)中使用的、针对包含在该构建体中的重要DNA序列的符号图例。为了更好地理解这些图，在此提供了将IgH和IgL编码区再分成多个可变结构域(V_H和V_L)，它们都含有内源性引导序列(L)、铰链区(H)、恒定区(C_H1、C_H2、C_H3、C_L)，以及跨膜编码区(M1/2，因为该区是由两个外显子编码的)。
图5a-e展示了用于构建一种逆转录病毒IgH(人类Igγ₁同种型)表达载体的克隆策略，这是在实例1中详细披露的，并且在图4(a)中以基础性设计来提供。在此描绘了针对膜结合型IgG以及分泌型IgG的表达构建体的克隆，正如在实例1中所详述-出于通常参比目的，在此提供了在这些质粒图谱中独特的限制性内切酶位点。基于这种最终的逆转录病毒Igγ₁H链表达构建体，如在此在图5e中所披露的，可以将任何其他的V_H结构域编码区、或一个多样V_H结构域编码区的集合(文库)引入到使用独特的HindIII和Eco47III限制性内切酶位点的这些载体中，这是通过将现有的V_H区替换为所述任何其他的V_H结构域编码区来进行的。图5a描述了第一个制备型克隆步骤，其中通过定点突变将一个Eco47III限制性内切酶位点(画圈)从可商购的pLHCX载体主链上去除，如在实例1中所说明。这就产生了逆转录病毒载体主链pLHCXm1，其中可以随后将Eco47III限制性内切酶位点再次引入用于克隆、以及V_H结构域编码区的替换。出于这一目的使用Eco47III的优点是基于以下事实：Eco47III是可以直接引入到人类V_H与Cγ₁编码区之间的边缘上、而不改变所表达的人类Igγ₁H链的氨基酸组成的仅有的限制性内切酶位点。图5a基因进一步展示了使用存在于pLHCXm1的MCS中的独特的HindIII和ClaI限制性内切酶位点、怎样将人类γ₁恒定区基因的片段(具有或没有跨膜外显子M1/M2)克隆到pLHCXm1主链 中。出于以后克隆的目的，将这些片段设计为含有额外的位于侧翼的Eco47III和NotI限制性内切酶位点，如在实例1中所详述。图5b)显示了无V_H结构域编码区的克隆中间体的质粒图谱，并且显示的是侧翼为HindIII和Eco47III位点的一种特定的V_H编码区是如何被克隆到这些构建体中的。由此所产生的这些构建体描绘于图5_c中，并且在原则上足以在任何受体细胞系中提供提供人类Igγ₁H链的表达。然而，以一种AID依赖的方式对V_H编码区进行额外地突变的概率是本发明的一个方面，并且在此披露了额外的两个克隆步骤，其中将带有额外的侧翼序列的核心κiE元件克隆到一个独特的BglII位点内、这种表达盒的CMV启动子的上游(图5c底部和图5d)，并且其中将带有一些侧翼DNA序列的3’κE元件克隆到针对人类Igγ₁H链的表达盒下游的独特的ClaI位点中。这就产生了最终的、用于膜结合型或分泌型人类Igγ₁H链的表达载体，为此在图5e中提供了这些质粒图谱。这些构建体对应于已经在图4a中披露的示意性质粒图谱，但是在此采用了精确的限制性内切酶图谱、并且按比例作图。
图6a-d展示了在实例1中提供的详细的克隆策略，用于构建逆转录病毒IgL(人类IgκL同种型)表达构建体，它的基本设计已经提供于图4(b)中。如在此在图6d中所披露的，基于最终的逆转录病毒IgκL链表达构建体，可以将任何其他V_L结构域编码区、或多样V_L结构域编码区的集合(文库)引入到使用独特的HindIII和Eco47III限制性内切酶位点的载体中，这是通过将用现有的V_L区替换为所述的任何一个或多个其他的V_L结构域编码区来进行的。用于这些逆转录病毒IgL链表达载体的克隆策略要求制备型克隆步骤，从而产生一种经修饰的逆转录病毒载体主链，可以如所描绘的使用便利的限制性内切酶位点将这些所希望的元件克隆到其中。第一步，如在实例2中所说明的，从可商购的质粒pLPCX中通过定点突变将一个不希望的Eco47III位点从ψ(Psi)包装信号中去除，产生了经修饰的质粒pLPCXm1(图6a)。第二步，通过将来自可商购的质粒pLHCX的一个大的AscI-BlpI酶解的片段与来自pLPCXm1的一个AscI-NcoI片段相连接，产生了一种新颖的pLPCXm2主链(图6b)。对于这两个片段，不相容的BlpI和NcoI DNA末端需要使用Klenow片段用核苷酸填满， 如实例1中所说明。向所得的pLPCXm2主链、经由HindIII和ClaI插入一个人类κL链(Cκ)的恒定区，如所示(图6b)。与针对人类IgH链的克隆策略相类似，这些人类Cκ片段进一步位于Eco47III和NotI位点的侧翼以促进额外的克隆操作。在插入人类Cκ片段之后，经由独特的HindIII和Eco47III位点将一种所选的人类Vκ元件克隆到该构建体中(图6c)。该构建体原则上在任何受体细胞系中可以足以提供人类IgκL链的表达。然而，与对于IgH链表达构建体的情况(图5a-e)一样，将额外的κiE和3’κE元件克隆到该构建体中、进入该IgκL链表达盒的上游和下游的独特的BglII和ClaI位点中，这与这些IgH链构建体的克隆策略相同(图6c和6d)。在最终的构建体中，该Vκ结构域编码区接着还能成为用于AID介导的体细胞超突变的靶标。最终的构建体对应于示意性质粒图谱(该图谱在图4(b)中详述)，但是在此包括并且按比例绘出精细的限制性内切酶图谱。
图7：该图展示了针对用于活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的逆转录病毒表达构建体的克隆策略。如所描绘，使用了可商购的pLPCX逆转录病毒载体主链，并且将来自小鼠脾cDNA的含有AID编码区的一个特异性RT-PCR片段克隆到pLPCX载体的独特的XhoI限制性内切酶位点中，这是使用插入到这些PCR扩增引物中的相容的XhoI限制性内切酶位点来进行的，如在实例2中所说明。
图8：该图(8a并且连续至8b)展示了详细的克隆策略(还提供于实例2中)，这是针对具有和没有IgκL链增强子元件的逆转录病毒报告基因构建体的，允许通过将一种限定的EGFP终止突变进行回复突变来鉴定并且定量体细胞突变。
图9：该图提供了一种实验性的概念性证据(proof-of-concept)，即所披露的逆转录病毒载体允许对序列进行的AID介导的体细胞突变，这些序列像优选的抗体V编码区、所克隆的这些V启动子元件的下游。图片(a)显示了通过对5种所选的FA-12A-MuLV转化的细胞克隆进行蛋白印迹来进行的AID表达分析，这些细胞克隆已经稳定地转染了一种逆转录病毒AID表达构建体，其克隆描绘于图7中。这种蛋白印迹分析显示了在FA-12转染子克隆1至4中的一种能够 区分的AID特异性信号(大约25kD)，但在转染子5中没有，并且在非转染的阴性对照物(NC)中也没有。转染子3用于对逆转录病毒报告基因载体进一步测试AID-介导的体细胞超突变(SHM)，这种体细胞超突变描绘于图片(b)中：在此，将图8的逆转录病毒报告基因构建体(一次使用了并且一次未使用Igκ增强子元件)逆转录病毒地、对应地转导到表达AID以及不表达AID的FA-12转染子3和5中。如所预期，只有当含有这些增强子元件的报告基因构建体转导到表达AID的FA-12转染子克隆3中时，才有可能在转导之后10天检测到0.2％频率的绿色逆转株转导子。在这些0.2％的绿色细胞中，通过单细胞分选将100个单独的细胞克隆分离，并且在扩展后之通过FACS对这些克隆再次分析绿色荧光。这些单细胞分选的克隆中大多数(95％)都展示出均匀的绿色荧光表达，这种绿色荧光表达具有与最初分选的0.2％绿色细胞的中等绿色荧光信号相同的荧光强度、并且与在图9b的左下方图片中提供的代表性GFP表达模式相类似，这证实了最初的绿色细胞群是由于对这种EGFP终止突变进行回复突变的缘故。4个克隆显示了一种双模态的绿色荧光模式，正如在中间的FACS直方图代表性地描绘，并且在100个分选的、经克隆的单细胞中只有1个几乎没有展示任何绿色荧光(右手FACS直方图)。
图10：该图展示了具有一种工程化处理的终止突变的EGFP编码区序列，该序列用于克隆一种EGFP报告基因构建体用于对体细胞超突变进行定量。在图片(a)中已知的是，在EGFP开放阅读框的密码子107和108中这四种核苷酸究竟是哪一种已经发生突变，从而在密码子107中产生一种终止密码子、并且在密码子108中产生赖氨酸到苏氨酸氨基酸的改变。这四种核苷酸的改变额外地导致了独特的SpeI限制性内切酶位点的引入，正如所指示它可以在体细胞超突变时作为一种诊断型标志物用于终止密码子回复突变。将TAG终止密码子的G核苷酸植入到所谓的RGYW序列基序中，该基序已知是用于体细胞超突变的一个热点。在24个通过SpeI限制性内切酶酶解所分析的逆转株克隆中，能够证实的是该位点成为对SpeI酶解具有抗性的(并且因此被突变)。在这些克隆的10个克隆中，序列分析揭示出在初始TAG终止密码子中的G核苷酸已经被 突变为一个C核苷酸，产生了一个TAC密码子，从而证实了限制性内切酶分析、并且证明AID介导的体细胞突变已经被靶向到RGYW基序中的G上。
(b)这个图片显示了所突变的EGFP的全部ORF(这种EGFP已经被克隆到逆转录病毒Igγ1H链构建体中(已经在图5(e)中披露))，而不是VH结构域编码区。
图11(a)和(b)：一种能够进行V(D)J重组的逆转录病毒IgH链表达载体的详细的克隆策略的展示，如在实例4中详细披露。
图12：概念性证据，要求处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段进行V(D)J重组的逆转录病毒构建体当转导引入RAG1/RAG2阳性前体淋巴细胞时可以产生显著的、重排的重链表达构建体和Ig+细胞。图片(a)包含以下数据，这些数据显示了表面免疫球蛋白阳性细胞的产生(0.04％，左FACS图的上右四分之一图)，这是在将一种能够进行V(D)J重组的逆转录病毒表达载体(克隆的详细说明，参见图11)转导进入A-MuLV转化的前B细胞系230-238之后进行的。使用如在图4c中示意性展示的构建体将该免疫球蛋白的表达是与EGFP表达相偶联。因此，可以仅在这群绿色(即稳定转导的)细胞中产生表达免疫球蛋白的细胞。右侧染色图片显示了对表面免疫球蛋白表达的再次分析，这是在一次单轮FACS富集以及稀少(0.04％)的表面免疫球蛋白通过组织培养扩展8天之后进行的。在这轮富集之后，免疫球蛋白阳性细胞的结合频率已经增加到17.8％(正如在这些绿色细胞群(即稳定转导的细胞群)中预期可检测到的)，已经从中获得了PCR扩增子并且进行测序。(b)作为一个代表性的实例，该图片显示了在一轮富集(该富集已经转导了能够进行“准胚系”V(D)J重组的逆转录病毒载体)之后从衍生自表面免疫球蛋白细胞的一个PCR扩增子获得的DNA序列(克隆225，在上方具有氨基酸翻译)。作为一种参比，在(b)中的上方提供了V、D和J基因片段的编码区序列，在这些V和J基因片段的上方还具有氨基酸翻译，因为这种D片段序列可以按照三种不同的阅读框进行读取，这取决于V(D)J重组之后连接的多样性。在处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段之间的插入序列用虚线描绘。所回收的克隆225的序列清楚地代表了一种真正的V(D)J重排， 具有以下典型的特征：在所装配的V、D和J基因片段之间在编码连接处可以清楚地检出的核苷酸缺失和TdT催化的N-序列加入(所有插入序列已经从克隆225缺失)。克隆225的序列展示出一个开放阅读框，并且除了在这些编码结点的以上所提及的变化之外，在V、D和J序列中不含有额外的体细胞突变。
图13：显示了对一组不同的A-MuLV转化的鼠前B细胞系测定对于嗜亲性MLV衍生的载体基因转移的敏感性的数据。以0.5的MOI、使用已经包被报告基因EGFP(包含转移载体LEGFP-N1)的一种载体制备物转导了1x10⁵个细胞。如实例5中所详述进行转导。转导之后2天，使用FACS、通过表达EGFP来检测基因转移。除了前B细胞系18/81之外，所有其他所测试的A-MuLV转化的前B细胞系在所采用的条件下、在40％至60％的频率范围内对转导是敏感的，并且原则上可以用于本发明。未经处理的幼稚靶细胞充当阴性对照物，并且没有显示出绿色荧光(未显示)。
图14：一组鼠前B细胞系的针对内源性IgM重链(cy-μH)的细胞内表达的特征，从而鉴定缺乏内源性鼠抗体表达的细胞，这些细胞可作为选择细胞用于逆转录细胞展示。细胞是可渗透的，并且使用与FITC相偶联的抗鼠IgM重链抗体对其进行染色(FL1)。未经处理的细胞充当阴性对照物。该实验显示：细胞系FA-12、1624-5、1624-6、18/81-c18-11和40E1实际上具有不能检出的内源性抗体表达，并且因此可以用于本发明的方法中。
图15：展示了遵循着在图4(c)中所披露的设计的逆转录病毒表达载体的复杂性、以及对于产生一种IgH和IgL链改组的抗体文库的实验性原理。(a)逆转录病毒载体文库IgH(650)-LIB-IRES-GFP和IgL(245)-LIB-IRES-YFP涵盖了所限定的、针对全人类抗体的重链(HC)和轻链(LC)的编码区集合，这些全人类抗体对应地具有复杂度为650和245的、不同的全测序的克隆。这两种载体均具有包装序列Psi(ψ)、位于侧翼的长末端重复(LTR)以及一种内部核糖体进入序列(IRES)。与由5’LTR中的病毒启动子所介导的抗体多肽链的表达相平行，这种IRES能够对应地使得报告基因gfp的yfp的表达相偶联。当病毒基因转移进入选择细胞中时，这就允许使用FACS方便地检测并且富集了成功转导 的、并且表达免疫球蛋白链的细胞。
(b)在转化前B细胞中产生一个全人类抗体集合。为了产生瞬时包装细胞，将对人类抗体(IgH(650)-LIB-IRES-GFP)的重链进行编码的逆转录病毒转移载体文库的文库使用与一种包装构建体(pVPack-GP)以及一种包膜构建体(pVPack-Eco)共转染到适当的受体细胞中。转染之后2天，收集了所产生的已经包装对应的转移载体文库的载体颗粒文库，并且将其用于转导选择前B细胞。使用FACS将表达这些转移的重链和报告基因gfp的经转导的细胞进行扩展富集。扩展之后，将细胞经受二次转导。这时，IgL(245)-LIB-IRES-YFP文库被转移，之后跟随采用FACS对表达YFP以及人类轻链的细胞进行扩展和富集。所得到的群落由一种全人类抗体组成，该抗体展示出一种所限定的、由1624-5细胞表达的人类抗体文库，含有最大159’250克隆的复杂度。
图16：本图显示在确保转导的条件下如何用IgH-IRES-GFP和IgL-IRES-YFP文库进行一种两步转导，这在大多数经转导的细胞中产生多肽链的克隆表达。将1.5x10⁶个1624-5鼠A-MulV转化的前B细胞悬浮于1ml的组织培养基中，该培养基添加了不同量的载体颗粒上清液(以1∶1、1∶5、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200稀释)，这些细胞含有对应地编码了IgH和IgL链文库IgH-LIB-IRES-GFP或IgL-LIB-IRES-YFP的重组逆转录病毒载体，这已经在图15中进行了说明。为了确保这些经转导的细胞中有大多数细胞接受了整合到该宿主细胞基因组中的单拷贝的转移载体，感染之后4天使用FACS分选将展示出低于10％的基因转移效率(MOI＜0.1，如通过偶联的GFP或YFP报告基因的表达所检测)的细胞进行富集。将细胞扩展6天，并且经受第二次转导，这是采用已经包装着抗体的轻链编码区的载体颗粒、如以上所述以1∶5稀释来进行的。在此，使用转导IgL-LIB-IRES-YFP文库的载体颗粒来感染选择用于重链表达的GFP阳性细胞，并且反之亦然。感染之后4天，使用FACS将表达GFP和YFP的经转导的细胞进行富集。第二次转导后，大约20％的细胞显示GFP和YFP表达。为了确保每个细胞仅发生单一载体的整合，富集了大约三分之一的这些群落，这显示在第二轮中所转导的报道基因的仅仅低的或中等的表达(约8％)。
图17：通过FACS、使用表达一种抗-IL-15参比抗体的前B细胞群进行定IL_-15染色滴定，从而限定允许最佳的IL-15抗原染色条件用于逆转录细胞展示实验的最佳条件。这种染色操作(如在实例7中详细披露)包括如所指示的、以两个不同浓度的多克隆的、生物素酰化的抗-IL-15二抗在2.5μg/ml-0.1μg/ml范围内滴定IL-15抗原，这是通过FACS用抗生蛋白链菌素PE偶联物进行检测的。使用抗-IgκL chain-APC抗体对表面Ig+细胞进行复染。如所见，以0.1或0.5μg/mlIL-15抗原的浓度、并且使用3μg/ml的二抗的多克隆抗-IL-15抗体实现了最佳的IL-15染色。
图18：表达前B细胞系的一种抗IL-15参比抗体(PC＝阳性对照)的FACS鉴定的分析，这种细胞系以不同的稀释被刺入到表达抗体的前B细胞的多样抗体文库中，这是通过使用在图17中展示并且确定的优化的IL-15染色条件来进行的。左上方图片显示出用IgH和IgL链文库的组合所转导的对照前B细胞的IgκL链-APC/IL-15双重染色，该组合的产生已经显示在图16中(NC＝阴性对照物)。右上方的图片显示了用编码一种参比IL-15抗体的IgH和IgL链的逆转录病毒表达载体(PC＝阳性对照)所转导的前B细胞的IgκL链-APC/IL-15双重染色，如在实例7中详细地披露。这些NC细胞的FACS图显示出Ab文库转导的细胞中有大约50％是表面-Ig+的，如通过抗-IgκL链-APC染色所检测。然而，没有表面Ig+的细胞展示出与IL-15相结合。相反，PC细胞(其中超过90％的细胞表达了表面Ig，一种特异性IL-15抗原结合)通过x轴上的一种特异性信号是清楚的。如所预期，PC细胞上表面Ig的表达越高，这种特异性的IL-15信号的偏移就越明显，这就产生了表面Ig+/IL-15结合细胞的对角线染色模式，该模式通过一种椭圆形的门(gate)得到突出显示，正如所指示。底部的图片(显示出在五种不同稀释的、被刺入到表达NC随机抗体文库的细胞群中的PC细胞中对表面-Ig和IL-15-结合的双重FACS染色)，显示了表达一种特异性抗-IL-15参考抗体的PC细胞可以按照接近刺入该NC细胞库的PC细胞的百分数的频率检测到。
图19：从一个多样抗体文库中通过逆转录细胞展示对IL-15反应性细胞群进 行富集的概念性证据，如在实例7中详细披露。上方的图片显示了对于GFP/YFP表达的FACS染色(y轴)(指示了Ig逆转录病毒载体转导的细胞的频率)，以及IL-15/抗-IL-15-bio(x轴)(指示了特异性的IL-15染色)。左上方的图片显示了未经转导的对照前B细胞(NC＝阴性对照物)的双色FACS分析，中上部的图片显示了使用一种抗-IL-15参比抗体作为阳性对照物(PC)所转导的前B细胞的双色FACS分析。右上方的图片显示了一群细胞的相同的双色FACS染色，这些细胞已经用一条IgH单链进行转导，该Ig单链编码了逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体编码了参比抗-IL15抗体的IgH链与一个多样的、大于7x10⁴的不同的IgκL链文库的结合。因此，这种IgL链改组的文库潜在地含有大于7x10⁴的不同的抗体，并且可预期地甚至通过对表达抗体的、以及IL-15反应性的细胞进行非常窄的门控(如在右上方FACS图中指示)，可以检测到非常少的IL-15反应性细胞(在此为2.42％，由于该门控靠近阴性群落，如所指示)。通过组织培养将所富集的群落进行扩增，并且将完全相同的染色操作和FACS分选重复三次，正如在下方的三个FACS图片中针对在完全相同条件下的三种FACS染色所显示。如所见，连续地富集/细胞扩增循环产生一群细胞，这些细胞对于阳性抗体表达几乎是100％的，并且与初始的PC细胞系相比对IL-15反应性甚至具有更高的阳性。这些数据清楚地显示：通过反复进行FACS分选和扩展，使用三轮连续的逆转录细胞展示可以将一个高抗原反应细胞群从几乎不能检出的抗原反应细胞群中成功地富集成一个基本上100％抗原反应性的细胞群。
图20：该图展示并且证实：在从3倍IL-15抗原富集的细胞群中进行单细胞分选之后所建立的24个单独的细胞克隆中的4个代表性细胞克隆的特异性IL-15抗原反应性，如图19中所说明。这4个选出的细胞克隆被命名为克隆F、H、V以及W，并且所有克隆在GFP/YFP阳性细胞上都显示出特异性的IL-15反应性，这指示了经稳定转导的、编码Ig的逆转录病毒载体。如所预期，较高的GFP/YFP表达细胞(表达较高的抗体水平)显示出较高的IL-15特异性，这在Ig/IL-15双重染色中产生了特征性的对角线染色信号。所有细胞克隆都显示出特异性的IL-15反应性，如通过在染色中忽略IL-15抗原所证明的，这导致 IL-15特异性的反应性减少(未示出)。这些数据提供了以下概念性证据：逆转录细胞展示是从最初显示几乎不能检出的抗原反应性细胞群中以高频率获得抗原反应性细胞克隆的一种有效方法。
图21：该图为对抗原反应性细胞进行的成功的逆转录细胞展示富集提供了第二个概念性证据，这是通过以在初始细胞群中的一种最低限度的IL-1β反应性细胞群为起点、使用连续三轮逆转录病毒细胞展示细胞富集/组织培养扩增、展示了将IL-1β抗原反应性细胞成功地富集成一种基本上40％抗原反应性细胞群来进行的。在此提供了对于GFP/YFP表达(指示抗体表达)的双重染色以及IL-1β反应性。上方的FACS染色是针对未经转导的前B选择细胞(作为对照物＝NC，左上)、以及使用逆转录病毒载体(编码了一种抗人类IL-1β特异性参比抗体SK48-E26)共转导的细胞(作为阳性对照物＝PC，右上)来提供的，如所指示。底部的图片显示了对一种抗体文库的抗体表达以及IL-1β反应性进行的FACS染色，这是在1、2和3轮逆转录细胞展示富集之前(0倍富集)以及之后、通过将具有超过2x10⁵个单独的IgL链克隆的一个多样IgL链文库与SK48-E26参比抗体的IgH链进行改组来进行的，如所指示并且如在实例8中详细地披露的。这些数据为使用第二种抗原提供了一种独立的概念性证据，即逆转录病毒细胞展示表达和富集对于从最初几乎不能检出的水平来富集一个抗原特异性细胞群是一种有力的手段。
图22：该图显示了通过逆转录细胞展示所鉴定的一种新颖抗体的IL-1β抗原反应性的确认，如在实例8种详细披露的。在这种三倍富集的细胞群(示于图21)，通过单细胞分选已经建立了24个单独的细胞克隆。在这些24个细胞克隆中，12个克隆具有一条新颖的IgL链，被称为LCB24，如在实例8中所披露。当所克隆的、并且序列表征IgL和IgH链的逆转录病毒表达载体被再次转导到初始的选择细胞系中时，通过FACS分析了IL-1β特异性参比抗体SK48-E26的共表达的新颖LCB24IgκL链IgH链以及IgH链的IL-1β特异性(参见实例8)。这些FACS染色图显示了通过双色FACS对抗体表达(经由GFP/YFP)以及IL-1β反应性进行的分析，如所指示。如所预期，在未经转导的选择细胞中没有 检测到IL-1β反应性(NC＝阴性对照物，左)，然而在表达参比抗体SK48-E26的IgH和IgL链的阳性对照细胞中检测到一种清楚的IL-1β特异性染色(中)。一种类似的IL-1β特异性信号在表达抗体的选择细胞中是可检出的，这些选择细胞转导了SK48-E26参比抗体IgH链载体、以及由IL-1β特异性逆转录病毒展示细胞克隆所克隆的新颖的完全人类LCB24IgκL链(右)。
图23：与由LCB24IgkL链/SK48-E25IgH链所编码的新颖抗体的IL-15缺乏交叉反应性的确认。左侧这两个FACS染色图显示了对于IL-15FACS染色测定的阴性对照物和阳性对照物，如所指示(NC＝阴性对照物、未经转导的选择细胞，PC＝阳性对照物、使用编码了一种抗-IL-15参比抗体的IgH和IgL链载体所转导的选择细胞)。右侧这两个FACS染色图显示在表达抗体的细胞(这些表达抗体的细胞编码了由SK48-E26IgH和LCB24IgL链组成的新颖抗体)上没有IL-15反应性，或者在表达这种初始的SK48-E26IgH/IgL组合的细胞上没有IL-15反应性。这证明：这种新颖的、由SK48-E26IgH和LCB24IgL链组成的抗体不仅对IL-1β是特异的，而且它对其他蛋白(像IL-15)大体上没有交叉反应性(或粘性)。
图24：该图展示了通过三轮连续的逆转录细胞展示细胞富集/组织培养扩增、来自一种抗体文库的抗生蛋白链菌素-APC-Cy7抗原反应性细胞的成功富集，该抗体文库是如在实例9中所披露通过将一种多样IgH链文库与一种多样的IgL进行改组而产生。抗生蛋白链菌素-APC-Cy7反应性细胞是通过三轮连续的高速细胞分选、之后跟随细胞培养扩增进行富集的，如所指示。针对这种抗生蛋白链菌素-APC-Cy7抗原的、表达抗体的细胞的结合特异性是通过在存在(下方图片)和缺少(上方图片)该抗原时分析这些顺序地富集的细胞群的FACS图来证明的。这为在缺少任何参比抗体时、通过逆转录细胞展示进行的特异性抗原的有效富集提供了一种概念性证据，这可以用于链改组方法。
图25：对于针对该抗生蛋白链菌素-APC-Cy7串联染料的Cy7荧光染料的特异性反应性，在该图中所呈现的数据为在图24中所披露的3倍逆转录细胞展示富集的细胞群的特异性提供了证据。为此，通过FACS对未经转导的选择细胞 、表达一种IgH/IgL链文库组合的未富集的细胞、以及一种三倍抗生蛋白链菌素-APC-Cy7富集的细胞群分析了抗体表达(由GFP/YFP荧光进行指示)以及对于不同的抗生蛋白链菌素-荧光染料偶联物的反应性，如所指示。这种三倍抗生蛋白链菌素-APC-Cy7富集的细胞群只与抗生蛋白链菌素-APC-Cy7相结合，而不结合抗生蛋白链菌素-APC或抗生蛋白链菌素-APC-Cy5.5，并且抗生蛋白链菌素-APC-Cy7的非特异性染色对于这些选择细胞、或表达一种多样抗体文库的选择细胞而言也是不可检出的。这就为从表达一个多样抗体文库的细胞中对特异性抗体进行有效的并且高度特异的逆转录细胞展示富集、而无需来自抗原特异性参比抗体的抗体IgH或IgL链提供了的概念性证据。
图26：共享同样IgH链的、通过逆转录细胞展示所鉴定的两种新颖的人类抗体显示出于抗原抗生蛋白链菌素-APC-Cy7的特异性结合。如在实例9中所披露的，在三轮逆转录细胞展示富集之后，可以从单一分选的细胞克隆中鉴定出两种不同的IgH链序列(HC49和HC58)以及两种不同的IgL链序列(LC4和LC10)。在这个图中，对IgL链LC4和LC10与HC49和HC58的所有可能配对进行检查，测定对于靶抗原抗生蛋白链菌素-APC-Cy7的反应性。为此，将编码了不同IgH和IgL链的逆转录病毒表达载体的组合转导到选择细胞中，如在实例9中指出的并且如在实例9中所披露。如所展示，新颖抗体HC58/LC4和HC58/LC10(这两者共享相同的IgH链)展示了与抗生蛋白链菌素-APC-Cy7抗原的特异性结合，然而由HC49/LC4和HC49/LC10编码的抗体没有显示出显著的结合活性。这两种新颖的抗体克隆与抗原抗生蛋白链菌素-APC-Cy7的特异性结合在再次转导进入选择细胞时提供了结论性的证据：可以的是如在此所披露的使用逆转录细胞展示用于在复杂的抗体文库中鉴定稀少的抗体结合物(antibody binder)。
具体实施方式
术语
在此方便地指出：其中在此使用的“和/或”应当被理解为这两种明确的特征或组分各自(具有或没有另一个)的具体披露。例如，“A和/或B”应当非理解为(i)A，(ii)B以及(iii)A和B各自的具体披露，就如同各自在此逐个列出一样。
亲和力饱和：通过抗原刺激的B淋巴细胞所产生的、抗原驱动的改进抗体结合特异性的高调控的免疫过程，主要发生在生发中心。该过程是由体细胞超突变引起的，这种超突变主要靶向到一些抗体的可变区的编码区上(这些抗体与这种选择性扩展以及B淋巴细胞的存活相关联)，产生了更高亲和力的抗体。
抗体：该术语说明了一种免疫球蛋白，无论是天然的、还是部分或全部合成产生的。该术语还覆盖了包括一种抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白质，像来自(例如)骆驼或美洲驼的只有重链的抗体。一种全长抗体包括两个完全相同的重链(H)和两个完全相同的轻链(L)。在它的单体形式中，两个IgH和两个IgL链装配成一种对称的Y型二硫键连接的抗体分子，该抗体分子具有通过IgH和IgL链的可变区的组合所形成的两个结合域。
抗体可以被分离、或通过从自然来源纯化而获得，或者还通过基因工程、重组表达或通过化学合成而获得，并且然后它们可以含有并非由胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸。一种全人类抗体包括人类重链和轻链，例如来自人类物种的可变区和恒定区。一种嵌合抗体包括来自一种脊椎动物物种的可变区结构域与另一种脊椎动物物种的恒定区结构域的组合。一种嵌合抗体的恒定结构域通常是衍生自一种或多种人类抗体的。通过将非人类抗体的CDR移植到人类起源的IgH和IgL可变区的框架区中可以产生人源化的抗体。
抗体片段：已经显示一种全抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(i)由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(iii)由一种单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段，它是由一个VH或VL结构域组成的；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，包括两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中一个V_H结构域和一个V_L结构域是通过一个肽连接物连接的，该肽连接物允许这两个域相关联以便形成一个抗原结合位点；(viii)双特异性单 链Fv二体；以及(ix)“双抗体”，通过基因融合所构建的多价或多特异性片段。Fv、scFv或双抗体分子可以是通过将连接V_H和V_L结构域的二硫桥进行结合而稳定的。还可以制备包括接合到一个CH3结构域上的scFv的最小抗体。结合片段的其他例子是Fab′(通过在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基将其与Fab片段相区别，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)，以及Fab′-SH(它是一种Fab′片段，其中恒定区的一个或多个半胱氨酸残基才有一个游离的巯基基团)。在一些情况下，一条重链或轻链也可以被认为是一种抗体片段。正如普通技术人员应该容易理解的，以上所有的抗体片段都展示了衍生出所述片段的全天然抗体的至少一种功能，并且因此被称为“功能”片段。
抗原：可以通过免疫球蛋白(或抗体)的可变结构域进行结合的任何生物分子或化学实体。
结合蛋白：该术语定义了彼此相结合的一对分子的一种蛋白。一种结合蛋白的结合配偶体通常被称为一种配体。一种结合对的蛋白可以是自然衍生的、或全部或部分地合成产生的。该对分子中的一种蛋白在它的表面具有一个区域、或一个腔，该区域或腔与该对分子的另一种蛋白的一个特定的空间和极性组织结构相结合、并且因此与其互补。结合对的类型的例子是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明优选地涉及抗原-抗体类型的反应。
互补决定区(CDR)：该术语是指一种免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。CDR是以下区域，这些区域处于与抗体直接建立接触的一种免疫球蛋白的三维结构中。一种抗体典型地包含3种重链CDR和3种轻链CDR。这些CDR通常是抗原受体的最为多样化的部分。
结构域：一种生物分子的一种结构部分，其特征为一种特定的三维结构(例如，结构相关的免疫球蛋白的可变区或恒定区结构域，例如Ig-样结构域，它们可以在免疫系统的许多分子中发现，它们属于所谓的Ig-超家族)。
生发中心：在外周淋巴器官(例如，淋巴结或脾)中的一种能够区分的组织学结构，其中在抗原呈递细胞之间以及在不同的淋巴细胞群之间发生同源相互 作用，导致抗原反应性淋巴细胞的增殖性扩展、连同由抗原反应性B淋巴细胞产生抗体的亲和力突变以及类别转变重组。
胚系构型：基因和基因座的未重排的构型(当它们是从亲本遗传得到时，并且当它们将通过该胚系传到另一代时)。在体细胞中发生的DNA重组事件(像例如，在淋巴细胞中的V(D)J重组)导致了重新改组或在某些基因座上遗传信息的缺失、并且因此导致来自该胚系构型的基因的改变。
前B淋巴细胞：前B淋巴细胞的特征是表达了特定的前B细胞特异性基因(像例如，λ5和V_preB1和V_preB2基因)，以及表达了参与V(D)J重组的前淋巴样特异性因子(例如，RAG-1、RAG-2)。此外，前B淋巴细胞的特征是在这两个重链等位基因上DJ_H的存在、或在至少一个免疫球蛋白重链等位基因上至少一个V_HDJ_H重排的存在，尽管这些轻链基因座仍然处于未重排的胚系构型，这样使得这些前B细胞不能表达完全的抗体。
初级淋巴组织：在小鼠以及人类的体内造血干细胞发育成淋巴细胞所处的器官，例如骨髓、胸腺、以及在胚胎期间、肝脏。
“准胚系”(“Quasi-germline”)构型：V、可任选地D、以及J基因片段的人工安排，其中位于侧翼的重组信号序列从胚系免疫球蛋白基因座中克隆进入到人工基因构建体中，这样在此类人工基因构建体中V、可任选地D、以及J基因片段的安排仍允许通过V(D)J重组过程将这些基因片段位点特异性地重组到一个可变编码区中。
体细胞突变：在体细胞中的一种过程，该过程导致将点突变引入基因组的特异性区域内。当该过程以高频率(每次细胞分裂每个碱基对大于10^-4次突变)发生时，它被称为体细胞超突变。
V(D)J重组：这是用于产生抗体以及T细胞受体多样性的方法，并且是产生功能性抗体基因所采用的方法。它涉及多种基因片段的重新安排(这些片段编码了免疫球蛋白的重链和轻链蛋白)，并且它仅发生在淋巴细胞中。
进行转染/转染：在真核细胞的背景中，这是将核酸序列引入真核细胞的过程，通常是与使用化学和/或物理的方法相关联的。
进行转化/转化：在真核细胞的背景中，这是使细胞无限增殖化用于建立一种连续增殖的细胞系的过程。
转导：经由重组病毒的产生将DNA递送到脊椎动物细胞中的过程。为此，表达针对病毒颗粒的结构蛋白的一种包装细胞系转染了一种重组的病毒DNA构建体，该病毒DNA构建体包括用于将这种病毒DNA构建体包装到这些病毒结构蛋白中的调节元件。通过这种方法，产生了重组病毒，这些重组病毒可用于感染(哺乳动物)靶细胞，这导致将所克隆的遗传信息引入该重组病毒基因组中。
载体/构建体：一种人工产生的核酸序列，该核酸序列可以用于在不同的生物体以及物种之间穿梭多种核酸元件，并且该核酸序列可以进一步用于扩布、扩增并且保持基因组信息。
详细说明_＜0}
抗体、或免疫球蛋白，是最普遍的结合蛋白类型，它们已经被证明对于治疗性和诊断性应用是特别有用的。治疗性抗体已经发展成为商业上最为成功的一种生物药类别，并且在开发以抗体为基础进行治疗的新颖并且有效的方法方面存在着持续的兴趣(Baker，2005)。
抗体由两条完全相同的重链(H)和轻链(L)糖蛋白组成，这些糖蛋白是经由二硫键共价连接的(图2a)。每条免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgL)多肽包括一个N端可变域(该可变域在不同的抗体之间是不同的)，以及一个C端的恒定域(该恒定区在属于相同免疫球蛋白亚型(同种型)的不同抗体之间是完全相同的)(图2a)。IgH和IgL链可变结构域的组合产生了一种抗体的抗原结合口袋、并且决定了它的特异性，然而这些恒定域确定了一种抗体的免疫效应子功能。免疫球蛋白在它们的可变结构域中的变异性是源自以下事实：V_H和V_L结构域是由多个基因片段编码的，这些片段被称为V(可变区)、D(多变区)、以及J(连接区)基因片段。在B淋巴细胞分化过程中，在每个细胞中随机选出一个V、一个D(只存在于IgH链基因座上)以及一个J基因片段，并且对其进行位点特异性重排以便产生针对V_H和V_L结构域的编码区。这种位点 特异性基因重组过程仅发生在前体淋巴细胞中，并且被称为V(D)J重组(Grawunder et al.，1998)(也参考图2b和2c)。基因片段的重排是由重组活化基因(RAG)和2的产物所介导的。由于大量的V、D、以及J基因片段，以及在基因片段连接时的不精确，每天通过由免疫系统产生的数百万的B淋巴细胞可以产生不同V区特异性的巨大表达谱(Grawunder et al.，1998)。因为免疫球蛋白重链基因座含有V、D和J基因片段，针对一种抗体的V_H结构域的编码区要求两个连续的V(D)J重排，然而这些免疫球蛋白基因座缺乏D基因片段、并且该V_L编码区是通过V至J的重排而产生的(图2c)。因此，通过在IgH链的CDR3区中的V(D)J重组所产生的连接多样性比仅由针对这些IgL链的重排事件所产生的CDR3连接多样性更多。此外，在早期B细胞分化阶段(在这一阶段发生IgH链基因重排)，表达了末端酶脱氧核苷酸转移酶(TdT)，它能够在D至J以及V至D的连接上(所谓的N-序列多样性)添加非模板的核苷酸，额外地将这种IgH链CDR3表达谱多样化。相比之下，这种IgL链的CDR3表达谱(该表达谱是在B细胞分化过程中当V至J的基因片段随后连接时形成的)在TdT表达主要被向下调节时(Li et al.，1993)在某种程度上具有更少的复杂性。除了在V_H和V_L编码区中产生CDR3多样性之外，IgH和IgL这两者的链表达谱可以在一种T细胞依赖性免疫反应的过程中、由在成熟B细胞中触发的体细胞超突变过程进一步被多样化(Papavasiliou&Schatz，2002)。这些体细胞突变是特异性地靶向V_H和V_L编码区的，并且是由B细胞系特异性酶活化诱导的胞嘧啶核苷脱氨酶(简写为AID，参见Papavasiliou&Schatz，2002)介导的。作为在免疫过程中发生的体细胞超突变的结果，表达对抗该免疫原的更高亲和力抗体突变体的细胞在通常发生于生发中心的免疫过程中被阳性选择出，并且引起了产生更高亲和力抗体的细胞的富集。这些抗体现在还在CDR 1和2中累积突变，这是被称为该抗体表达谱的亲和力突变的一个过程。通过顺式调控基因元件或基序的存在，特别是位于邻近所重排的V_H和V_L编码区中的IgH和IgL链基因座的增强子元件的存在，这种AID介导的多样性以及特异性靶向到这些V_H和V_L编码区得到显著性地增加(Bachl&Olsson，1999)。
除了经典的全长治疗性抗体之外，额外的结合蛋白形式(包括全人类抗体片段，例如所谓的F_ab片段(图2a)、单链F_v片段(图2a)、纳米抗体，仅由V_H单域组成，等等)也越来越多地被开发作为治疗性和诊断性试剂。然而，对于本领域普通技术人员应该清楚的是，此类功能性抗体片段可以通过基于蛋白的标准的生物化学方法、或通过常规的分子生物学方法容易地由全长抗体衍生，条件是一种令人希望的全长抗体的编码信息是可获得的。
传统上，定向对抗感兴趣的一种分子或表位(抗原)的单克隆抗体是通过对应地免疫小型实验室动物、或家畜(例如，小鼠、大鼠、兔、或山羊和驴)而产生。反复免疫之后，将这些动物取血用于从它们的血清中分离多克隆抗体、或者为了产生单克隆抗体将这些动物处死以便从次级淋巴样器官(像，淋巴结或脾)中分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞进行融合用于产生杂交瘤，随后将这些杂交瘤亚克隆并且筛选展示出所希望的功能特性(像例如，与一种特定的抗原或靶标相结合)的单克隆抗体的分泌。
从抗体工程化处理的第一个突破(被称为由和Milstein进行的用于产生所谓的单克隆抗体的杂交瘤技术研究(&Milstein，1975))开始，经历了相当长的时间单克隆抗体才可以用于治疗人类疾病。
抗体进入临床缓慢的主要原因是最初与使用啮齿动物抗体用于治疗人类患者相关联的挫折。如果将此类抗体输注到患者的免疫系统中，免疫系统将这些啮齿动物的抗体识别为一种外来的蛋白并且对这些抗体产生一种免疫应答，包括产生中和抗体(被称为HAMA＝人-抗-小鼠抗体应答)。HAMA应答可以导致半衰期的显著性降低、以及由此的所用抗体疗效的降低，并且若免疫系统对所注射的非人类蛋白反应过度则可能甚至导致严重的副反应。
因此，具有很大的医学和商业兴趣的是开发出与人类抗体更加相似的治疗性抗体。首先，这是借助于对现有的啮齿动物抗体进行基因工程化处理而实现的，引起了嵌合抗体或人源化抗体的开发(Clark，2000)。嵌合抗体是通过使用标准的基因工程和克隆技术、将一种啮齿动物抗体的可变结合域与一种人类抗体的恒定区相融合而产生的。相比之下，人源化抗体是仅通过将来自一种啮齿动物 抗体的一个可变结构域的互补决定区(CDRs)转移到一种人类抗体的可变区框架上而产生的，这也是通过标准的分子生物学技术完成的。尽管产生嵌合抗体的操作是直接的，这些抗体仍含有33％的异种序列、并且对免疫原性具有一种显著的潜力(Clark，2000)。实际上，针对一种嵌合抗体的小鼠部分的免疫应答已经得到良好地记载，并且被称为HACA应答(HACA＝人类抗嵌合抗体)。
与以上所提及的相比，人源化抗体的免疫原性潜力被进一步降低。然而，基因工程化处理人源化抗体、并且同时在CDR移植之后维持这些啮齿动物抗体的初始的结合亲和力和特异性的方法并不是琐碎的，并且通常要求通过反复诱变和筛选循环进行广泛的额外的优化。由于以上提及的原因，在近年来嵌合方法以及人源化方法逐渐不太被认为是选择用于开发治疗性抗体的一种方法。
远离嵌合抗体和人源化抗体、用于开发治疗性抗体的的开发还受到允许开发“全人类”抗体(它的氨基酸序列与人类血清抗体相一致)的创新技术平台的开发的驱动。理论上，全人类抗体被认为在人类患者中引起了最小的免疫原性和副反应。
这两种建立最多的“全人类抗体”开发平台是：
A)人类免疫球蛋白转基因小鼠技术，其中已经将胚系人类免疫球蛋白重链和轻链基因座的大量转基因引入到小鼠基因组中(Green&Jakobovits，1998；Jakobovits et al.，WO98/24893 A2)。为了使用这些转基因小鼠用于人类抗体的开发，已经将这些转基因小鼠品系与基因敲除小鼠品系进行杂交，这些基因敲除小鼠品系在它们的内源性小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座中具有功能性缺失。因此，这些人类免疫球蛋白的转基因小鼠在免疫接种时产生了大量的人类体液免疫应答，除了这些产生抗体的细胞中大约半数仍具有内源性小鼠λ轻链这种例外，所以这些轻链对于进一步的治疗性抗体开发是无用的、并且需要被去除。
B)噬菌体展示技术，它是基于高度多样的抗体片段文库(例如像，单链F_v或F_ab片段)在大肠杆菌的噬菌体表面上的表达(展示)(Clackson et al.，1991；McCafferty et al.，WO 92/01047 A1)。为了鉴定特异性结合物，将具有适当的复 杂性、性质以及起源的噬菌体文库结合到固定的抗原上(“淘选”)，从而富集与所固定的抗原相结合的噬菌体克隆。几轮淘选之后，确定出所选择的结合克隆的序列。该方法的一个变体是完全无细胞的核糖体展示技术，其中抗体片段没有在噬菌体上展示，而是在经翻译的结合物仍然“粘”到核糖体上所处的条件下、通过体外转录和翻译进行表达的(Hanes&Plückthun，1997)。对于噬菌体展示或核糖体展示，一个至关重要的步骤是将结合的片段重新工程化为全长抗体，然后将该全长抗体在脊椎动物细胞中表达。将噬菌体选择的克隆再次工程化处理成为全长抗体形式并且脊椎动物细胞表达之后，需要对它进行分析：这些抗体是否能够得到充分地表达、以及这些初始噬菌体结合特征是否仍得到保留(在这种情况下这可能不是必须的)。
尽管人类免疫球蛋白转基因小鼠以及噬菌体展示技术已经对治疗性抗体的发展产生了很大的影响，但是这两种技术平台具有与它们相关联的优点和缺点。
转基因小鼠技术的一个优点是它能够递送高亲和力抗体，这是由于在进行免疫时在这些小鼠体内所发生的自然亲和力饱和的缘故，并且已经证明人类抗体对来自人类转基因小鼠的一种给定抗原的亲和力特性是可以与野生型小鼠的情况相比的。然而，与这些人类免疫球蛋白的转基因动物相关联的几个缺点是：1)如果这些转基因动物对该抗原是耐受的，最通常是由于与内源地表达的宿主蛋白的高结构相似性，对抗此类“保守”抗原的高亲和力抗体的产生可能变得非常困难或甚至不可能。2)与在正常的野生型动物中一样，来自人类免疫球蛋白转基因动物的抗体是优选地对抗强抗原表位而产生的，这可以使得开发一种对抗功能性、但是缺少治疗价值表位的抗体成为一项具有挑战性的任务。3)最后，不能使用人类免疫球蛋白转基因动物用于现有抗体的亲和力优化。这种现象的原因是转基因动物的产生所要求的时间期限(仅用于一种给定抗体克隆的优化)是相当长的。这种方法将涉及产生针对一种特定抗体的两条IgH链和IgL链转基因小鼠品系，并接着会额外地要求将这两种转基因品系与对于这两个内源性免疫球蛋白重链以及对于κ轻链表达缺陷的至少两种敲除动物品系进行遗传回交， 这是将会要求几个育种世代以及延长的时间期限的一个过程。
如以上所说明的类似限制施用于一个最近说明的基于小鼠开发的技术平台，其中小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因座的胚系可变的(V)、多样的(D)以及连接(J)的基因片段已经通过位点特异性基因靶向、由(部分的)人类种系V、D和J基因区替换(Murphy&Yancopoulos，WO 02/066630 A1)。在这些“免疫球蛋白基因敲入”小鼠中，鼠V、D以及J基因片段已经在小鼠胚系中经由同源重组、由人类免疫球蛋白基因重链和轻链基因座的那些片段进行位点特异性替换。与人类免疫球蛋白转基因小鼠(这些小鼠产生了全长人类抗体)相比，这种小鼠品系因此产生了“反嵌合”抗体，在一个小鼠恒定区主链上带有人类抗原结合区。
噬菌体展示和/或核糖体展示方法具有成为非常快速的技术平台的可理解的优点，因为从粘合蛋白的复杂文库中鉴定第一种结合物可以在几周内实现。然而，噬菌体展示还与多个显著的缺点相关联。1)由于在该系统中缺少任何亲和力饱和，从一种噬菌体展示筛选或核糖体展示筛选鉴定高亲和力结合物并不是琐碎的。为了着手解决这个问题，已经开发了代表着超过10¹²个克隆的极为复杂的噬菌体文库。但是即使使用了这些复杂文库，初始的结合克隆通常与该抗原具有亚优化的亲和力，并且此类结合物通常仍然需要使用额外冗长的、并且耗时的优化操作进行优化。2)在噬菌体展示中，仅表达了抗体片段(例如，scF_v或F_ab片段)，因为噬菌体基因组只能容纳相对小尺寸的分子的编码区。3)结合蛋白必须融合到载体蛋白上(例如，噬菌体gIII蛋白)。所产生的融合蛋白与它们的亲代抗体或结合活化蛋白相比经常显示出更低的抗原反应性(Hoogenboom&Chames，2000)。4)噬菌体展示不能容易地允许对蛋白进行受控装配(这些蛋白通过形成同型多聚体和异型多聚体形式获得了一种结合表型)，这是由于例如二聚体蛋白是通过共价连接分子被迫装配的。然而，在工程化处理抗体的情况下，免疫球蛋白重链和轻链的适当调节的装配是必需的，因为并不是每条抗体重链均能够与任何一条轻链配对的。5)基于细菌或基于细菌噬菌体的系统不能提供感兴趣的展示蛋白的适当的翻译后修饰(糖基化作用、豆蔻酰化作用、以 及类似作用)，这通常负面地影响了所表达的蛋白的结合特征。6)与脊椎动物细胞相比，原核表达导致蛋白的不同蛋白折叠，因为这种细胞质环境是与真核或脊椎动物宿主细胞显著地不同的(例如，在氧化还原电位以及缺少分子伴侣方面)。7)随后将噬菌体展示系统进行抗原结合或捕获测定，从而在相当地非生理“淘选”条件下富集反应细胞，这些条件可以导致鉴定大百分数的最终需要丢弃的假阳性结合物。
作为以上提及的缺点的一种结果，许多噬菌体展示所选的抗体片段具有中等的亲和力和/或可以带有结构性假象(artefact)。此外，当在脊椎动物细胞中噬菌体展示所选的结合物被再次工程化并且表达为全长抗体时，可能发生的是噬菌体选择抗体是表达欠佳的、或根本不能表达、或它们展示出改变的结合特征。
为了着手解决人类免疫球蛋白转基因/敲入小鼠技术以及噬菌体展示的限制中的一些限制，近来已经开发了一种可替代的技术，该技术涉及在体外对原代鼠前B细胞进行遗传修饰(产生出表达人类抗体的细胞)、之后跟随将它们移植到缺少一种功能化B细胞区室的免疫缺陷的受体小鼠中(Grawunder&Melchers，WO 03/068819 A1)。这就导致在这些移植小鼠中表达人类抗体的B细胞亚群的部分重建，这些小鼠随后用任何所希望的抗原或配体进行免疫。该技术可用于开发新颖的抗体或结合蛋白，或者考虑到它们对抗一种限定靶标的亲和力来优化现有的抗体(Grawunder&Melchers，WO 03/068819 A1)。
在这种方法中使用逆转录病毒表达系统是优选的，因为可以将单拷贝的表达构建体的基因转移转移到单独的前B细胞中(Kitamura et al.，1995；Stitz J et al.，2005)，并且还因为对于哪些抗体表达构建体正被用于移植小鼠中存在着彻底的选择自由(例如，抗原预先选择的抗体文库、来自得病患者的抗体文库、或单独的抗体克隆)。因此，本技术的一种特别的优点是它的灵活性，即它能够用于抗体的从头开发、连同用于对现有的治疗性抗体候选者进行优选。
已经说明了其他基于啮齿动物的、用于开发全长人类抗体的系统，这些系统涉及将从人类供体分离的人类造血祖细胞移植入免疫缺陷型小鼠中(Mosier&Wilson，WO 89/12823 A1)。在此类人类细胞移植的小鼠中，人类B细胞可以发育 到一定程度；然而，尽管近来改进了这种方法(Traggiai et al.，2004)，涉及人类抗体的亲和力饱和的一种令人满意的体液免疫应答在此类“人源化小鼠”中并没有实现。此外，与在人类免疫球蛋白转基因或“敲入”小鼠的情况一样，不能对现有的抗体进行优化。
任何种类的、基于小鼠的抗体技术平台通常要求体内免疫，当与体外法比较时体内免疫仍然是一个耗时的过程。
因此，除了以上提及的有关小鼠的方法之外，近来已经开发了多种可替代的体外技术。然而，仍然需要证明在开发高品质、高亲和力的抗体产品方面这些系统将是如何有效的。一种体外系统是基于从患有一种特定疾病的人类患者中分离富集抗原的记忆B细胞，这些记忆B细胞可以被分离出并接着在体外被爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化进行无限增殖，之后跟随针对抗原反应性EBV细胞系进行筛选(Lanzavecchia，WO 04/76677 A2)。在概念上类似、但在方法学上不同的是以下方法，其中首先从外周血中分离出来自带有一种急性疾病状态的患者的产生抗体的浆细胞、并接着通过与非生产性杂交瘤相融合进行无限增殖，之后随后针对所希望的抗体生产者进行筛选(Lang et al，WO 90/13660 A2)。可替代地，已经说明了旨在从接种的或免疫的个体中分离B细胞、之后跟随从细胞群(Lawson&Lightwood，WO 04/106377 A1；Schrader，WO 92/02551 A1)或通过单细胞PCR(Muraguchi et al.，WO 04/051266 A1)分离并且克隆特异性抗体基因的方法。然而，所有这些技术都依赖于在人类患者中相关B细胞群落的可获得性、并且在它们的通常应用中受到相当地限制，并且因此主要用于鉴定抗感染治疗性抗体候选者。此外，使用任何一种基于人类B细胞的筛选方法，亲和力饱和、或抗体的抗原定向开发、或对现有抗体进行优化都是不可能的。
因此，最近已经说明了额外的可替代的体外方法，涉及使用瞬时表达系统在真核细胞中表达和筛选重组抗体(Zauderer&Smith，WO 02/102855 A2and Beerli et al，WO 08/055795 A1)。尽管这些系统规避了转基因小鼠、噬菌体展示以及人类B细胞衍生的技术的一些瓶颈，这些系统的特点仍然是许多限制。首先，已知的基于真核细胞的抗体表达/筛选技术没有赋予针对重组抗体的一种稳定的表 达模式，这预先排除了具有所希望的结合特异性的表达抗体的细胞的反复富集循环。其次，已知涉及基于真核细胞的抗体表达的方法中没有一种允许对结合物克隆的克隆表达进行控制，在治疗性抗体开发的情况下这使得鉴定一个匹配的、具有所希望的抗原或配体结合活性的IgH链和IgL链成为一项挑战性的任务。第三，在Zauderer和Smith(WO 02/102855 A2)中所描述的技术不允许任何体外诱变、或所表达的抗体的基因重组，该方法是一种纯粹的筛选操作。因此，结合蛋白的亲和力成熟方面不能由该技术解决。最后，这些真核表达/筛选系统中没有一种系统是与多样抗体表达谱的原位产生相容的，这些抗体表达谱来自采用免疫球蛋白重链和轻链V、D和J片段的V(D)J重组机制的单独的抗体表达构建体。
用于鉴定生物学活性的肽和核酸的一种可替代的方法已经由Jensen et al(EP 1 041 143 A)提出。在EP 1 041 143 A中所说明的优选方法包括一个起始的筛选操作，其中可以将大量的逆转录病毒载体引入细胞中，这样单独的细胞能够表达大量的不同的RNA或肽。随后将显示一种表型变化的细胞分离，并且可以通过PCR将该克隆中的逆转录病毒DNA分离。然后可以将这种PCR产物用于再次转染病毒包装细胞以产生其他的逆转录病毒载体。然后，可以将这些逆转录病毒载体用于转导不同的细胞，并且最终在第二个克隆步骤之后可以对这种活性物质进行鉴定。通过输入生物学活性的肽或核酸，这种方法实质上导致细胞表型的非直接变化。这是与本发明的方法相反的，由此这些逆转录病毒转导的构建体直接编码了该筛选所指向的结合蛋白，优选抗体。还应当注意到，在EP 1 041 143 A中所说明的肽和核酸在大小方面是与由本发明的方法所鉴定的抗体或抗体片段差异很大的。
用于基于逆转录病毒基因组筛选的另外的方法在WO 03/083075 A2(Bremel等人)中列出。该方法涉及了表达并且筛选对未经表征的基因和蛋白进行编码的基因组DNA序列。在此说明了一个过程，其中一个细胞系用一种逆转录病毒表达构建体进行转导，这样一种基因组DNA病毒被插入到该细胞系的基因组中(作为一种原病毒)，并接着直接分析来自这种前病毒多肽的表达。这种方法没 有提供对于富集该细胞系的机会、也没有对于分离的机会，并且在分析之前进行了所表达的多肽的鉴定，它将从由Bremel和合作者所开发的高通量筛选的技术中减去。
一个最近公布的来自Beerli和合作者的专利申请(WO 08/055795 A1)说明了用于分离人类抗体的一种筛选平台，它使用了辛德毕斯病毒表达系统。这个平台的一个基本特征是产生起始文库，其中将对一种感兴趣的抗原特异的B细胞从人类供体的外周血单核细胞(PBMC)中直接分离出。从这个B细胞库中产生了重组的抗原反应性scFv文库，并且通过使用辛德比斯病毒表达系统、通过哺乳动物细胞表面展示进行筛选。与噬菌体展示相类似，这个系统的缺点之一是需要对感兴趣的scFvs重新进行工程化处理，并且在脊椎动物细胞中表达为全长IgG。这个过程可以是与在转化时感兴趣的抗体的亲和力缺失相关联的，因为这些抗体可能在脊椎动物细胞中没有很好地表达和/或可能展示出改变的结合特征。
相比之下，在此披露的本发明包括独特的并且极为有力的多种方法的组合，这些方法用于结合蛋白(优选抗体或其片段)的开发和优化。与基于小鼠的技术相比，在此披露的本发明的主要优点是在抗体的优化和从头开发方面的彻底灵活性、以及在短时间内鉴定特异性结合物的速度。因为本发明的所有方面已经在体外得到实现，对于开发对抗抗原的抗体不存在限制，这些抗原在不同物种中是高度保守、或在实验动物中可能是有毒的。
与基于噬菌体展示技术相比，在此披露的本发明的主要优点是这些结合蛋白(特别是抗体)能够在脊椎动物细胞中、并且优选在B淋巴细胞环境(即，抗体的天然宿主细胞)中表达为全长抗体，确保大多数天然的以及适当的蛋白折叠、正确的翻译后修饰、以及对于重链和轻链配对的质量控制。
与人类B细胞方法相比，所披露的发明的关键性优点是考虑到开发对抗任何所希望的目标的抗体的彻底灵活性、对现有抗体进行亲和力优化的可能性、对于哪种类型的抗体表达于该系统中进行选择的彻底自由(富集抗原的、人造的、来自患者的、在IgH和IgL链改组的条件下，等等)。
与其它基于真核细胞的、涉及到基于质粒的表达构建体或非整合的病毒载体的表达系统相比，所披露的“逆转录细胞展示”发明的关键性优点是稳定的、持续的并且克隆的表达可以通过使用逆转录病毒基因转移技术来实现。在这些靶细胞中稳定的、持续的并且克隆的表达重组抗体允许抗原特异性或配体特异性细胞的反复富集循环，包括分离并扩展单克隆细胞用于鉴定这些抗体基因的可能性。然而，在此披露的本发明额外地允许额外产生遗传多样性，这是当原位逆转录病毒转导进入脊椎动物宿主细胞时、通过采用V(D)J重组的淋巴细胞特异性机制或采用体细胞超突变的方法用于进一步诱变结合蛋白来进行的。
因此，与在本领域内已知的、用于开发治疗性抗体的已知技术相比，在此披露的逆转录细胞展示的方法提供了独特的新颖的并且有力的、针对以前存在的技术所具有的许多明显限制的解决方案。
在此披露的本发明可以广泛应用于表达、筛选并且鉴定与感兴趣的一种配体或抗原进行特异性结合的结合蛋白。尽管本发明可以用任何结合蛋白(包括但不限于单体的、同型多聚体或异型多聚体膜结合型受体(像T细胞受体、细胞因子受体、或趋化因子受体)，而且用其他支架蛋白进行，根据本发明优选的结合蛋白是全长抗体，其中全人类抗体是特别优选的。然而，应当理解，一种抗体的任何(功能)片段(包括但不限于单链Fv片段(scF_v)、Fab片段、F(ab’)2、V_H或V_L单域、单一的重链或轻链、或它们的任何组合，具有任何天然发生的或人工工程化处理的修饰)可以用于实现本发明。对于全长抗体，本发明特别适用于抗体结合区的任何种类的人工工程化处理或设计的修饰，例如通过定位诱变或定区诱变、来自不同抗体的自然发生的序列的融合、CDR序列的随机化、DNA改组、易错PCR、仅通过说明提及一些方法。
根据本发明用于表达结合蛋白的一种优选的方法是使用逆转录病毒载体介导的脊椎动物宿主细胞转导。
逆转录病毒载体的使用已经在基因治疗领域中研究了许多年。例如，为了工程化处理可以靶向到特异性细胞类型上的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，Perabo等人(WO 03/054197 A2)已经在对于与初级细胞受体相结合至关重要的一个位 点上将编码靶肽的随机序列插入到病毒衣壳基因中，并且产生AAV文库，这些文库在这种病毒衣壳的背景中展示了这些肽。由培养环境所提供的选择性压力借助于这些病毒克隆在传染过程中实现每个步骤的能力(即结合、摄入、脱壳、核转位、复制、以及基因表达)驱动这种选择。通过使用这种技术，产生了有效地转导白血病细胞的载体。尽管这种技术可以用于产生病毒突变体(这些病毒突变体感染了之前对抗由野生型AAV进行的感染的靶细胞)时，它没有提供体外产生的多样的结合蛋白集合。
这样，与本领域中已知的、用于在真核和/或脊椎动物宿主细胞中表达重组蛋白的任何其他方法相比，在本申请中所说明的、用于表达结合蛋白的方法具有几个关键性的优势。
1)重组的逆转录病毒构建体稳定地整合到该宿主细胞基因组中。并且由此提供了该结合蛋白的一种稳定并且持续的表达表型。2)通过使用适当比例的逆转录病毒颗粒与靶细胞(被称为“感染复数”(MOI))，优选地以等于或小于0.1的MOI进行，可以控制这种逆转录病毒的转导，这样逆转录病毒转导的细胞中大多数细胞得到了遗传修饰，这是仅通过一种重组逆转录病毒构建体整合到该宿主细胞基因组中导致至少一种希望的结合蛋白的克隆表达来进行的。因为结合蛋白的克隆表达显著地促进了单独的结合蛋白的鉴定和克隆，所以这个方面代表了本发明的一种优选的实施方案。然而，在一个可替代的实施方案中，还可以使用逆转录病毒、以大于0.1的MOI来实现本发明。
尽管以上提及的逆转录病毒转导的优点是逆转录细胞展示的基础，在脊椎动物宿主细胞中重组结合蛋白的表达还可以通过替代性方法来实现，这些方法像例如但不限于：瞬时或稳定的DNA转染、RNA转染、或通过转移基于DNA的病毒载体(像基于腺病毒或基于痘病毒的载体)-尽管以上提及的替代性方法中没有一种允许在脊椎动物宿主细胞中的一种可以容易控制地、稳定地并且克隆地表达的结合蛋白。
用于实现本发明的优选的脊椎动物宿主细胞是B淋巴细胞系的细胞，特别是前体B淋巴细胞，这些前体B淋巴细胞通常缺少内源性抗体表达，但它表达了 有利的辅助蛋白(像例如用于适当的蛋白折叠以及抗体装配的分子伴侣)，或有助于抗体分子(像例如B细胞特异性Igα或Igβ蛋白)膜沉积的辅助膜蛋白。
在脊椎动物宿主细胞中通过逆转录病毒转导来表达重组蛋白的原则是一种已建立的方法，并且涉及重组逆转录病毒载体的构建，这些重组逆转录病毒载体相对较小(有待加入的重组DNA的最大尺寸：8-10kB)，并且它们可以通过标准的细胞生物学方法作为质粒载体进行克隆和操作，逆转录病毒RNA基因组可以从这些质粒载体中进行转录。野生型逆转录病毒基因组仅含有三个基因，gag、pol和env，它们对应地编码了这些核心蛋白(一种逆转录病毒整合酶、蛋白酶、RNA酶)、以及一种逆转录酶，以及多种包膜蛋白(图3a)。此外，这个逆转录病毒基因组含有顺式调控序列，像用于将该逆转录病毒RNA基因组包装到病毒颗粒中所要求的Psi(ψ)序列、用于逆转录病毒转录终止的一种polyA信号、以及最后的含有所谓的5’-和3’-长末端重复(LTR)启动子元件以及用于逆转录病毒整合到该宿主细胞基因组中的信号(图3a)。为了构建重组逆转录病毒，将一种野生型逆转录病毒的gag、pol和env编码区替换为用于感兴趣基因的任何表达盒，包括相关的顺式调控元件(像启动子或增强子)(图3a)。为了将此类重组逆转录病毒基因组稳定地整合到一个宿主基因组中，需要将含有一个逆转录病毒基因组的质粒载体瞬时或稳定地转染到一种所谓的逆转录病毒包装细胞系(PCL)中，该细胞系以瞬时或稳定的方式表达由gag、pol和env反式编码的病毒结构蛋白，并且因此允许将这种重组病毒基因组(转移载体)包装到没有复制能力的逆转录病毒颗粒中(图3b)。这些逆转录病毒颗粒允许对靶细胞进行单独一轮感染(转导)(图3b)。使逆转录病毒颗粒进入靶细胞是由Env蛋白与该靶细胞上的一种特异性受体的特异性相互作用介导的。因此，Env蛋白的本质决定了这些逆转录病毒颗粒到表达该同源受体的特异性宿主细胞的趋向性。亲嗜性逆转录病毒局限于啮齿动物细胞，兼嗜性逆转录病毒可以感染不同的物种(包括啮齿动物和人类细胞)，并且泛嗜性逆转录病毒可以感染具有细胞膜的任何复制性细胞，因为细胞进入是经由存在于所有真核细胞膜上的结构而发生的。具有多种不同趋向性的逆转录病毒载体颗粒还可以使用其他病毒 的(例如，长臂猿白血病病毒(GaLV)、囊泡性口炎病毒(VSV)或HIV和SIV)的异源包膜蛋白、或甚至细胞膜蛋白来产生，仅通过说明一种被称为“假型化”技术来提及一些。进入细胞后，一种逆转录病毒可以将病毒基因组递送到宿主细胞中，其中这些病毒蛋白介导了将该基因组逆转录到cDNA中并且最终将它稳定地整合到宿主细胞基因组中，允许将递送的基因进行稳定表达(图3b)。在本发明的一个优选的实施方案中，亲嗜性MLV颗粒用于介导基因转移到鼠B细胞中。然而，本领域的任何普通技术人员应当理解用任何其他包膜蛋白或跨膜蛋白假型化的任何感染性逆转录病毒载体可以用于实现本发明，条件是它在任何适当的靶选择细胞中介导了转导(这种细胞独立于它们亲代供体物种、细胞类型)或它们对介导载体细胞进入的一种同源受体的表达。
为了实现逆转录病毒载体介导的基因转移，可以从稳定表达或瞬时表达的转移载体的包装细胞的细胞培养上清液中收集含有载体的逆转录病毒颗粒(含有重组逆转录病毒基因组的转录本、或转移载体)(图3b)。这可以在本领域中的普通技术人员已知的广阔的科学试验方案范围内以及它们的变体中实现。本发明优选的实施方案包括：1)使用穿过一种适当的过滤器或一个离心步骤(将包装细胞与载体颗粒分开)来制备含有无细胞的逆转录病毒颗粒的上清液。随后，通过共孵育一段可变的时间期限或通过进行所谓的“旋转感染”将这些逆转录病毒颗粒制备物用于转导脊椎动物宿主细胞。这里，靶细胞悬液与含有逆转录病毒颗粒的介质相混合，并且进行低速离心(图3b)。2)可替代地，通过一种膜(该膜允许逆转录病毒颗粒通过、但是不允许包装细胞通过)将靶细胞与包装细胞进行的共培养(能够使这两个细胞群进行细胞-细胞接触或分离)是可以进行的，从而能够使靶细胞进行转导。
作为用于逆转录病毒转导的宿主靶细胞，本方法的一个优选的实施方案是使用来自啮齿动物的B淋巴细胞系细胞，这些细胞不表达内源性鼠免疫球蛋白，并且它们可以用嗜亲性宿主范围的逆转录病毒进行转导。这种B淋巴细胞系的细胞具有以下优点：它们已经表达了B细胞特异性Igα和Igβ蛋白，这些蛋白对于细胞表面表达以及膜结合型全长免疫球蛋白的锚定是有利的。在这一方面， 由免疫球蛋白阴性血浆细胞所衍生的细胞(像例如骨髓瘤细胞，作为举例，但不限于Sp2/0、NSO、X63和Ag8653)通常缺少用于膜免疫球蛋白沉积的辅助Igα和Igβ蛋白。在这些情况下并且在任何其他脊椎动物宿主细胞中(其中Igα和Igβ蛋白是不表达的)，仍可以采用该方法，条件是当转染或转导针对Igα和Igβ的表达载体时赋予了Igα和Igβ蛋白的表达(对于本领域内的普通技术人员而言的一种标准过程)。因此，当异位表达Igα和Igβ这两种蛋白时，该方法可以用任何脊椎动物宿主细胞系来实现，条件是产生了具有适当趋向性的逆转录病毒颗粒，它们能够转导所述脊椎动物宿主细胞系。为了说明清楚，在此披露的创新可以用任何脊椎动物宿主细胞来实现，条件是泛嗜性逆转录病毒颗粒(例如，但不限于具有VSV的G蛋白假型颗粒)与一种宿主细胞结合使用，该宿主细胞已经被修饰为异位地表达免疫球蛋白锚定分子Igα和Igβ。
这种B淋巴细胞系的优选细胞是例如但不限于：来自任何脊椎动物物种的前B淋巴细胞、B-白血病细胞或B-淋巴瘤细胞，以及可以通过组织培养生长很长时间的原代前B细胞。前B淋巴细胞可以代表用于逆转录病毒表达免疫球蛋白的理想的宿主细胞，因为大多数此类细胞系不表达内源性免疫球蛋白。具体地，因为鼠前B细胞系可以容易地从转化了艾贝尔逊白小鼠白血病病毒(A-MuLV)的任何小鼠品系中获得。然而，原代长期增殖的前B细胞、连同A-MuLV转化的前B细胞表达了前B细胞特异性蛋白VpreB和λ5，这些蛋白在一起形成了所谓的替代轻链，这种替代轻链在缺少常规轻链时可以形成免疫球蛋白重链与替代轻链的前B细胞受体复合物。因为所希望的是表达由重组重链和轻链组成的免疫球蛋白，前B细胞是优选的，这些细胞缺乏替代轻链组分的表达，包括λ5、或VpreB1、或VpreB2基因(单基因敲除、双基因敲除或三基因敲除)的基因产物。因为已知替代轻链可以与异源重链相结合，所预期的是替代轻链的表达可能在不同程度上干扰IgH/IgL对的筛选，但由于通常在前B细胞中替代轻链蛋白的表达水平很低，该方法还可以使用表达替代轻链组分的野生型前B细胞来实现。总之，表达Igα和Igβ、并且不表达内源性免疫球蛋白的任何脊椎动物细胞系可以用作靶宿主细胞用于本方法，其中替代轻链缺陷型前B细胞是用 于实现本发明的优选宿主细胞。
有待表达、筛选并且鉴定的优选结合蛋白是全长抗体，并且在氨基酸序列方面是全人类免疫球蛋白。然而，应当理解，在脊椎动物细胞中能够进行细胞表达的任何结合蛋白可以经受筛选、并且根据所披露的方法选择特异性配体或抗体结合。例如，此类结合蛋白可以包括来自任何脊椎动物物种的抗体的片段，像例如单链Fv、Fab片段(图2a)或V_H或V_L单域、或一条重链或轻链，优选地按照能够在细胞表面膜上进行沉积的方式进行表达。这可以例如通过融合到其他I型跨膜蛋白的膜锚定分子上、使用GPI-锚定结构域、或本领域已知的其他方法来实现。而且，该方法还可以适用于其他膜结合型蛋白，例如但不限于单体或多聚体细胞因子受体、或二聚体T细胞受体、以及类似受体。逆转录病毒表达免疫球蛋白重链和轻链是优选通过顺序地转导针对重链和轻链的单独的逆转录病毒表达构建体而实现的。然而，本发明还能够通过进行靶细胞共转导而实现，其中使用了针对IgH和IgL链的单独的逆转录病毒构建体。单独表达来自不同逆转录病毒载体的IgH和IgL链提供了以下优点：编码了多样的免疫球蛋白重链集合的逆转录病毒载体集合可以与编码了多样的免疫球蛋白轻链集合的逆转录病毒表达载体集合进行随机组合。这种所谓的重链和轻链改组可以产生高度多样性的不同的免疫球蛋白结合特异性，甚至当重链和轻链集合的总数受到限制时(例如，10⁴条不同的重链，随机与10⁴条不同的轻链组合，理论上产生10⁸种不同的抗体特异性)。IgH和IgL链载体的集合的改组优选地用一种单边改组进行，即一种抗体的多肽链是编码一种单独的抗体链的单独构建体。
然而，应当理解，逆转录病毒IgH和IgL链表达也是可以实现的，条件是这两种蛋白是在同一个逆转录病毒主链上编码的(见以下)。以其最容易的构型，通过将重链和轻链cDNA克隆到一个空的逆转录病毒载体中赋予了重链和轻链的表达，其中表达是由5’LTR的启动子活性驱动的并且适当的RNA加工是由3’LTR序列介导的(图3a)。这些重链构建体应当优选地含有它们内源性跨膜编码区，从而允许这些重组免疫球蛋白的最佳膜沉积。然而，对于本领域普通技 术人员，应该清楚的是其他跨膜蛋白的跨膜区域也可以与抗体的恒定区相融合，从而确保所表达的经修饰的免疫球蛋白的表面沉积。特别地，在表达抗体片段、或表达非免疫球蛋白结合蛋白的背景中，膜结合型蛋白的不同跨膜区对于细胞表面表达这些结合物可以是有利的。
然而，细胞表面表达抗体或其片段是本发明的一种优选的实施方案，这些生物分子还可以被替代性地表达为可溶的、分泌型蛋白，这样使得在流动相中进行这种抗体的检测。这种形式的表达可能是有利的，条件是筛选单独的生产者克隆以及结合物涉及一种要求可溶性抗体的测定，或者条件是该测定是在半固体介质中进行的，其中一种测定允许对单细胞克隆上的表达水平和结合特异性进行定量。用于重组免疫球蛋白的表达载体可以用于编码所有已知的免疫球蛋白重链和轻链同种型，这在全人类抗体的情况下允许表达IgM、IgD、IgG₁、IgG₂IgG₃、IgG₄、IgA₁、IgA₂以及IgE抗体，这些抗体含有Igκ链或Igλ轻链。在针对人类重链和轻链的所有逆转录病毒表达载体中，优选的是只有一条人类重链以及轻链的可变编码区可以使用独特的限制性内切酶(像例如，但不限于HindIII和Eco47III)进行替换，如在逆转录病毒抗体表达载体的示意性图中所描绘(4a和4b))。这将允许在逆转录病毒表达载体中容易地克隆和替换可变编码区(使用V区文库或单独的V区编码区)，与针对免疫球蛋白重链和轻链的恒定编码区形成阅读框(in-frame)。这种只交换可变区结构域的方案(旨在产生编码了一种单一特异性的表达载体、或旨在产生一个结合蛋白集合)应该是有利的。在这个方面，可以表达全长抗体，这些抗体含有由不同物种所衍生的可变区结构域和恒定区结构域(嵌合抗体)。
通过将针对感兴趣的结合蛋白或基因的一个cDNA编码区插入到一种“空”逆转录病毒表达载体主链中可以构建最简单的针对结合蛋白的逆转录病毒表达载体(图3a)。即使在缺少允许直接检测所转导的细胞的任何选择标志物和/或筛选标志物(例如，增强的绿色荧光蛋白，EGFP)时，本发明是可以实现的，因为稳定表达来自这些逆转录病毒载体的结合蛋白的细胞是可以基于这些结合蛋白的稳定表达(以分泌形式或以膜结合形式)而进行鉴定和分离的。然而， 在逆转录病毒表达载体中所包括的不同的特征是优选的。第一个是驱动这些重组结合蛋白表达的一个强组成型或诱导型的启动子元件，它直接位于该编码cDNA区的上游。(图4a，b)。这些启动子可以是例如但不限于组成型启动子(像立即早期CMV启动子、β-肌动蛋白启动子、EF-1α启动子)、或诱导型启动子(像四环素或任何其他抗生素可诱导的启动子)，通过加入或去除四环素或其他抗生素以及其衍生物(例如多西环素)可以使这些启动子向上调节或者向下调节表达。在这些逆转录病毒表达构建体中所包括的诱导型启动子元件是另一个优选的实施方案，因为已知在一些逆转录病毒表达载体主链中5’LTR启动子或甚至强组成型启动子可能被沉默。
除了启动子元件，一个优选的实施方案是在这些逆转录病毒表达构建体中包括标志物基因，这些标志物基因随后允许对稳定地逆转录病毒转导的宿主细胞进行选择和/或监测、而无需检测这些重组结合蛋白(图4a，b)选择和/或筛选标志物对于这种优选的两步逆转录病毒转导科学试验方案(涉及到顺序地转导免疫球蛋白重链和轻链逆转录病毒表达载体)是特别有用的。在一个两步转导的科学试验方案中，一种脊椎动物宿主细胞首先转导了至少一种逆转录病毒表达构建体(该构建体编码了一种或多种第一免疫球蛋白多肽链)，并且在第一次稳定地表达至少一种多肽链之后，用至少一种逆转录病毒表达构建体(该构建体编码了相应的其他一种或多种免疫球蛋白多肽链)进行第二次转导，然后允许产生一种完全抗体或抗体集合。如果使用一种选择或筛选标志物用于选择或筛选成功的第一次转导事件，非常有用的是对至少两种逆转录病毒表达构建体的共转导频率进行优化，这些构建体编码了一种多聚体结合蛋白的单独的链(例如抗体)。因此，使用选择和/或筛选标志物是强烈优选的。
赋予抗生素抗性的、用于选择哺乳动物细胞的选择标志物包括但不限于：例如，针对嘌罗霉素、新霉素、潮霉素B、霉酚酸、组氨醇、博来霉素、以及腐草霉素抗性的基因。为了表达由单独的逆转录病毒构建体编码的多亚基蛋白(例如抗体)，优选地将不同的多肽链的表达与不同的选择标志物相连接，从而允许对稳定转导地相应表达构建体进行分开选择。
允许监测逆转录病毒转导到宿主细胞中的标志物基因包括但不限于：将自身荧光赋予所转导的细胞的基因，像例如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)以及红色荧光蛋白(RFP)。可替代地，可以使用细胞表面标志物，例如CD7或其截短的变体、CD34或其截短的变体、或低亲和力神经生长因子受体。在一个优选的实施方案中，这些抗生素选择标志物、荧光标志物或细胞表面标志物的表达是与经由所谓的内部核糖体进入序列(IRES)的重组结合蛋白的表达相偶联的，在脊椎动物细胞中这些序列允许对来自一个单一启动子元件的两种基因进行偶联共表达(图4b)。然而，本领域内的普通技术人员还可以通过从在逆转录病毒构建体中含有的一种单独的表达盒(由一种额外的启动子元件驱动)表达一种选择和/或标志物基因来实现本发明。为了从单独的逆转录病毒载体中表达多亚基蛋白(像免疫球蛋白)，优选的是将不同的结合蛋白链连接到不同的选择和/或筛选标志物上，从而允许分开监测这些不同的表达构建体的稳定转导。
在该重组结合蛋白的表达是由如以上概述的一种单独的启动子驱动的情况下，还可以将任何选择或筛选标志物基因克隆到5’LTR的下游、以及5’LTR和ψ包装信号的下游，这样它的表达是由5’LTR启动子来驱动的(参见图3和4)。
如以上所提及的，本发明的一个优选的实施方案是在B淋巴细胞系的细胞中(优选地在前B淋巴中)表达重组抗体或其片段。因此，进一步优选通过启动子和增强子的组合来驱动重组抗体的表达，该组合已知在B细胞系的细胞中赋予了选择性的高水平表达。此类启动子/增强子组合可以是例如但不限于：免疫球蛋白κ轻链启动子、κ-内含子和3’κ增强子的组合、或免疫球蛋白重链、重链内含子和3’α增强子的组合。免疫球蛋白κ轻链启动子、κ内含子和3’κ增强子组合的组合是优选的(图4a，b)，因为已知该组合允许在B细胞系细胞中高水平表达免疫球蛋白链，并且因为顺式调控基因元件的这种组合能够以一种调控的方式(由活化的B细胞特异性酶AID(活化诱导的胞苷脱氨酶)所介导)向抗体的编码区促进体细胞超突变，这是本发明的一个实施方案，如以下进一步 详述。
然而，本领域内的普通技术人员应该意识到为了实现本发明在逆转录病毒载体中表达一种特定的重组抗体是可以受到顺式调控启动子/增强子元件以及允许在所希望的脊椎动物宿主细胞中在细胞表面膜上或以分泌形式表达该抗体的编码区的任何组合的影响。
尽管本发明的一个优选的实施方案是从单独的逆转录病毒表达构建体中表达多亚基结合蛋白(例如抗体)(图4a和b)，本发明还是可以实现的，条件是多亚基结合蛋白的不同蛋白链的表达是在相同的逆转录病毒表达构建体上连接的。在免疫球蛋白的情况下，这可以通过(但不限于)来自一种启动子的重链和轻链的表达以及通过IRES序列将针对重链和轻链的编码区分开而实现的。在这种替代方案中，优选将该重链直接克隆到该启动子的下游以及IRES的轻链下游，因为与该IRES上游的基因相比已知IRES之后的一个基因通常在某种程度上以更低的水平进行表达。因为轻链是较小的分子，预计的是实现了经由IRES连接所表达的重链和轻链的一种更好的化学当量表达，条件是轻链表达是经由IRES控制的。
可替代地，一种二聚体结合蛋白(例如抗体)的两条链的共表达可以通过将两种单独的表达盒克隆到一个单独的逆转录病毒主链中来实现，这样就分开地控制了每条单个的结合蛋白链的表达。作为这种方法的替代方法，还有可能的是通过使用将转录活性赋予至相反方向的双向启动子将两种不同结合蛋白链的表达连接到相同的载体中。后一种选择具有潜在的优点，即不发生启动子干扰(它在邻近位置上负面地影响了启动子的表达水平)。
应该强调的是，独立于具有两个结合蛋白编码区(例如，免疫球蛋白的重链和轻链)的逆转录病毒载体的详细的基因组织结构，该方法允许将结合蛋白对的单一逆转录病毒基因转移到靶细胞中，这允许促进了二聚体结合蛋白的克隆表达的控制、并且与两步逆转录病毒转导的科学试验方案相比减少了用于产生一种表达结合物的细胞群的时间限度。
除了顺式调控基因元件(像启动子和增强子)、以及可选择的或可筛选的标 志物基因(像抗生物抗性标志物)、以及编码自身荧光蛋白的基因之外，可以在不同的背景中将针对免疫球蛋白重链和轻链的编码区克隆到逆转录病毒表达载体中。
在本发明的一个优选的实施方案中，将免疫球蛋白重链和轻链编码区作为连续的cDNA序列克隆到逆转录病毒表达构建体中，包括适当的表面表达和/或分泌所要求的引导序列。针对此类具有增强子元件的表达载体的基本设计的实例在图4a中描绘。优选地，这些重链编码了人类γ1重链同种型以及轻链κ轻链同种型，然而应当理解可以使用人类或其他脊椎动物物种的任何其他重链和轻链同种型以实现本发明。在此类逆转录病毒cDNA表达载体中，优先的是在可变编码区与恒定编码区之间的接合处包括一种独特的限制性内切酶，这将允许仅替换V_H和V_L编码区以便改变所表达的抗体的特异性、或这允许插入多个V_H和V_L编码区用于在靶细胞中表达多样的逆转录病毒抗体文库。在一个优选的实施方案中，在V_H-Cγ1和V_L-Cκ边缘引入的限制性内切酶位点是一个Eco47III位点(图4a，b)，它没有改变所表达的重链的氨基酸组成并且只能导致在恒定κ编码区的第一个位置上的一个保守的苏氨酸向丝氨酸的氨基酸的改变，这不影响逆转录病毒表达的人类IgG₁分子的结合特性。
作为含有异源的、优选处于cDNA构型的全人类抗体的编码信息的逆转录病毒构建体的一种替代方案，可以使用在基因组结构中含有编码区的逆转录病毒表达载体，其中在胚系中发现了针对免疫球蛋白重链和轻链的典型的外显子-内含子结构。因为当逆转录病毒颗粒包装时逆转录病毒载体将被转录为mRNA，表达构建体的这种组织结构要求这些编码区的转录组织结构沿相反的方向移动到该逆转录病毒基因组的5’LTR的转录起始位点，因为否则该逆转录病毒转移载体将已经被剪接，此时在转导并且将重组的构建体稳定地整合到靶细胞中之前该外显子-内含子结构会丢失。然而，这些构建体提供了抗体可以被表达为膜结合型抗体或分泌型抗体表达的功能性，这取决于用于转导的靶细胞的本性、以及靶细胞在针对所分泌的抗体的内部终止密码子上终止转录的能力、或通过可替代地剪接针对所分泌的抗体的终止密码子上游的一个剪接供体的能力以便 剪接膜结合型免疫球蛋白的跨膜外显子受体的能力。
本发明的一个优选的方面是产生并且使用针对人类抗体或任何异源抗体或其片段的逆转录病毒表达构建体，其中该重链和/或轻链的可变编码区仍然需要在这些靶细胞中通过V(D)J重组的过程从处于“准胚系”构型的V、可任选地D、以及J基因片段进行装配。此类表达载体的基本设计的图示描绘于图4b中，它仍然具有不可重排的构建体的特征，即针对重链和轻链的“胚系”V-D-J或V-J盒可以被独特的限制性内切酶位点替代，包括优选的在J-元件编码区的3’边缘的Eco47III。在这些载体中含有的这些V、D和J元件其侧翼是已知为针对重组活化基因(RAG)1和2的识别基序的保守的重组信号序列(RSS)。当RAG1和RAG2在任何脊椎动物细胞中共表达时，此类载体将位点特异性地重组V、可任选地D以及J基因片段从而产生对应地编码抗体重链和轻链的可变结构域的V_H和V_L区。RAG-1和RAG-2基因的表达，以及由此的V(D)J重组活性通常限定为早期前体淋巴细胞。因此，优选地使用前体淋巴细胞来实现本发明自动地提供了用于V(D)J重组的活性。然而，已知当RAG-1和RAG-2过量表达时，可能导致任何体细胞脊椎动物细胞系适合用于V(D)J重组，并且因此本领域中任何普通技术人员也可以使用任何非前体淋巴细胞系、通过提供RAG-1和RAG-2的异位表达来实现本发明的这个方面。作为一种可替代的方案，甚至可以使用RAG-1或RAG-2缺陷型细胞系，其中RAG-1或RAG-2缺陷是通过过量表达相应的RAG基因或其一种片段来互补的。
此类V(D)J可重排的构建体具有以下优点：从稳定地转导到一种脊椎动物宿主细胞中的一种单一逆转录病毒表达构建体中，可以经由RAG-1和RAG-2介导的V(D)J重组产生多样的抗体特异性表达谱。
尽管已知V、D和J基因元件的连接涉及到很大程度的不精确性，这种不精确显著地导致在V_H和V_L互补决定区(CDR)3中发现的多样氨基酸序列，优选的是使用V-D-J-Cγ1和V-J-Cκ逆转录病毒构建体的集合，该集合代表几种V区家族，D和J元件，从而增加在所提供的胚系基因片段序列的水平上已有的变异性。尽管如此，优选使用逆转录病毒构建体(允许体细胞装配由V(D)J重 组过程所介导的V、可任选地D、以及J基因片段)当转导原位进入前体淋巴细胞时允许产生可变域结合区的大多样性，这样可以从单一的或有限数量的构建体产生多种的IgH和IgL链集合。
通过不精确地连接V、D和J基因片段所产生的多样性是通过前体淋巴细胞特异性表达的基因末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的存在而显著地增加的，这种酶是仅有的能够将核苷酸加入到3’DNA末端、而无需一条互补的模板DNA链的DNA聚合酶。为了增加连接的多样性，优选的是使用具有高内源性TdT表达水平的细胞、或可替代地通过本领域中已知的方法在用于逆转录细胞展示的靶宿主细胞中异位地表达TdT。
本发明的另一个实施方案是使用含有超过一个的V、或D或J基因片段的V(D)J可重排逆转录病毒构建体，这样通过V(D)J重组过程可以将不同的V、D和J基因片段用于不同的来自相同构建体的重排的克隆中。将多种不同的V、D和J基因片段结合到此类构建体中仅仅是由逆转录病毒载体接受DNA的总能力所限制的，这种能力据报道最大在8-10kb的范围内。
尽管使用了能够进行V(D)J重组的逆转录病毒构建体(图4a，b下方图片)用于表达异源抗体或其片段是本发明的一个方面，清楚的是经由这种方法产生一个多样表达谱主要局限于在免疫球蛋白重链和轻链的CDR3区中产生多样性，与在早期B淋巴细胞增殖过程中产生的一种一抗表达谱的特征非常类似。
适应性的免疫系统的真质标记(hallmark)是它的亲和力饱和抗体可变域的能力，这是基于可变域编码区的体细胞超突变的。体细胞超突变已知被活化诱导胞苷脱氨酶(AID)这种酶强烈地增强。高水平的体细胞超突变额外地取决于来自免疫球蛋白基因座的顺式调控增强子元件的存在，并且有益的作用已经被最清楚地描述用于Igκ内含子和3’κ增强子元件的组合。因此，本发明的一个方面是通过本领域中已知的方法、组成型或诱导型地使用含有这些顺式调控元件的逆转录病毒以便在内源性或异位地表达AID酶的靶细胞中逆转录病毒地表达此类免疫球蛋白表达构建体。
在能够进行体细胞超突变的逆转录病毒构建体的背景中以及在表达AID的 宿主细胞的背景中使用“逆转录细胞展示”在转导到表达AID的宿主细胞中之后允许对一种抗体进行进一步原位多样化。
本发明的这些方面的组合概括为在适应性免疫系统中所发生的所有分子和遗传事件(被称为从一种或有限数量的含有有限数量的V、D和J基因片段的构建体中产生一种一抗抗体表达谱)、以及额外的AID介导的用于抗体的抗原结合可变域的编码区的体细胞超突变。
针对所希望抗原的更高亲和力抗体结合物的特异性选择是可以通过逆转录细胞、经由通过基于标准FACS的技术所检测的增加与所选择的希望的抗体、之后跟随高速制备型细胞分选强抗原结合物来实现的。由此可将强结合物将选择性地分离，并且由逆转录病毒载体编码的抗体基因可以通过本领域内已知的标准分子生物学方法(包括但不限于基因组PCR以及RT-PCR)从所选的细胞或细胞克隆进行再分离、克隆和测序。
在一个优选的实施方案中，最终的细胞分选步骤是以单细胞分选来进行的，允许这种克隆分离并且抗原反应性细胞克隆的最终扩展，这促进了来自所选择的结合物的同源IgH就IgL链对的编码区的克隆和序列测定。
若希望，富含FACS的细胞可以通过培养进行扩展、并且可以再次任选地经由抗原结合并且重复高度反应性细胞的高速细胞分选，可任选地重复使用的一个过程，直到达到了所希望的染色强度以及由此对于一种所希望的抗原的结合特异性(图1)。抗原反应性细胞的这种选择性富集和体外扩展模拟了在T细胞依赖性免疫反应中所发生的更高亲和力结合物的选择性结果。
应当注意到，高速细胞分选仪辅助富集抗原反应性细胞仅仅是实现本发明的一种优选的方法，但是也可以采用针对抗原活性来选择并且分离细胞的其他方法(像例如但不限于淘洗法)，其中细胞结合到固定在一种固体支撑物的抗原上。此外，可能的是通过显微操作的方法将抗原反应性细胞富集，这些显微操作的方法例如但不限于：在微孔板中或作为细胞克隆在半固体培养基中在有限稀释条件下使细胞生长，这允许特异性抗原染色和/或标记细胞克隆、并且它们通过显微镜辅助方法的鉴定之后跟随手动和/或机械手辅助挑选抗原反应性克隆。
本发明的另一个实施方案是在诱变条件的存在下(特别是将突变特异性地靶向可变抗原结合域的编码区)进行抗原-反应性细胞的抗原-选择/FAS-分选/扩展的反复循环。通过这种方法在每一轮细胞增殖中产生了原位产生的更高亲和力突变体。当细胞分选时以及在逆转录细胞展示时将显示增加的抗体结合进行富集时，可以选择性地富集和扩展更高亲和力突变体。靶向抗体可变区域的超突变率是通过在表达抗体的细胞中过量表达AID酶而实现，特别是当这些表达构建体含有顺式调控启动子和多个增强子元件时(包括但不限于：已知为抗体可变区提供AID介导的体细胞超突变的免疫球蛋白κ内含子以及3’κ增强子元件(图4a和b))。尽管这种方法可以内源地或异位地使用组成型表达AID的细胞来实现，本发明的一个方面使用了AID表达载体，其中使用诱导型启动子(例如但不限于四环素和/或强力霉素诱导型启动子系统(Gossen&Bujard，1992))可以诱导并且再次关闭AID表达，其中一种感兴趣的基因表达是由侧翼为原核tet-操纵子的串联重复的最小CMV启动子控制的，并且它是可以使用HSV-VP16-Tet-抑制子进行诱导或抑制用于表达，该融合蛋白结合到tet-操纵子上是由四环素或四环素衍生物变构控制的。
在以下非限制性的实例中，本发明得到了更详细地地解释。
实例1
对应地克隆含有潮霉素B和嘌罗霉素抗生素药物筛选标志物的全人类免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(IgL)的逆转录病毒表达载体
如之前所提及，本发明可以与逆转录病毒表达载体一起来实现与不同设计的蛋白的结合(与例如图4a-c相比)。作为可以用于实现本发明的载体设计之一的一个实例，在此说明了逆转录病毒表达载体的详细的克隆策略，允许表达全人类IgG₁/κL抗体，并且使用抗生素抗性标志物来选择在靶细胞中稳定维持的这些载体。
a)构建针对人类免疫球蛋白重链(IgH)的逆转录病毒表达载体
作为构建逆转录病毒人类免疫球蛋白重链表达载体的一个起始点，使用可 商购的逆转录病毒载体pLHCX(BD-Clontech，Mountain View，CA)(图5a)。pLHCX含有一种由该逆转录病毒主链的5’LTR启动子驱动的潮霉素B抗性标志物基因。此外，pLHCX含有CMV立即早期启动子，之后跟随简单的多克隆位点(MCS)用于有待表达的感兴趣基因的插入。此外，pLHCX主链在CMV启动子的上游含有一个方便的独特的BglII限制性酶切位点(图5a)，额外的基因元件可以克隆到该酶切位点中。
本发明的一个优选的实施方案是使用Eco47III限制性内切酶用于将人类V_H编码区框内克隆到这些人类恒定的γ1重链编码区中，因为可以将这个特定的限制性酶切位点引入V_H和Cγ1编码区之间的接合处，而不改变所表达的IgH链的氨基酸组成。然而，pLHCX在ψ包装信号中含有一个Eco47III限制性内切酶位点(图5a)，这将排除直接使用Eco47III用于以上提及的V_H区克隆策略。为了将这个不方便的Eco47III限制性内切酶位点从pLHCX载体主链中去除，执行以下第一个预备克隆步骤，如在图5a中所详述。通过定点诱变将ψ包装信号中的Eco47III位点去除，这是使用一种商业性Quikchange^TM试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将Eco47III识别序列AGCGCT的第三个C核苷酸替换为A、使用提供令人希望的突变的特异性引物对、根据制造商的说明书来进行的。所修饰的载体被命名为pLHCX-m1，并且已证实在该ψ(Psi)包装信号中这种单碱基对的取代不影响所修饰的载体pLHCX-m1的逆转录病毒转导效率(数据未显示)。
已经平行地将编码人类Cγ1恒定区(具有或没有跨膜编码区M1和M2)的cDNA克隆到pLHCX-m1主链中。使用人类外周血淋巴细胞的cDNA作为模板、以及正向和反向引物Seq-ID1、Seq-ID2、Seq-ID3(见以下)通过RT-PCR将Cγ1-m和Cγ1-s DNA片段扩增。为了对这种膜结合形式的人类Ig进行RT-PCR扩增，使用了Seq-ID1和Seq-ID2的引物组合，并且为了克隆分泌型人类IgG，使用了Seq-ID1和Seq-ID3的引物组合。这些正向和反向PCR扩增引物对应地含有HindIII和ClaI限制性酶切位点，允许将这些PCR扩增的片段定向克隆到pLHCX-m1中CMV启动子的独特的HindIII和ClaI位点下游(图5a)。该正向 PCR扩增引物额外含有用于将V_H区框内融合到这些恒定区的一个内部的Eco47III位点，而不改变这些已表达的全长IgG₁重链的氨基酸组成。反向PCR扩增引物Seq-ID2和Seq-ID3含有额外的内部NotI位点，这些位点允许在该编码区的下游直接对这种构建体进行限制性内切酶酶解用于一般进行克隆的目的，例如交换编码该恒定区的区域用于表达不同的Ig同种型。
            
引物Seq-ID2被用作一种反向引物用于分泌型人类IgG₁连同Seq-ID1的PCR扩增，并且含有一种独特的NotI位点(加下划线)用于克隆目的。
            
引物Seq-ID3被用作一种反向引物用于膜结合型人类IgG₁连同Seq-ID1的PCR扩增，并且含有一种独特的NotI位点(加下划线的)用于克隆目的。
            
将得到的PCR产物(对于分泌型人类Cγ1大约1.0kb，以及对于膜结合型人类Cγ1大约1.2kb)用HindIII和ClaI限制性内切酶进行酶解，并且平行地定向克隆到适合的限制性酶切位点pLHCX-m1中，对应地得到质粒pLHCX-m1-Cγ1-s和pLHCX-m1-Cγ1-m(还参见图5b)。然后，使用独特的限制性内切酶HindIII和Eco47III将V_H链区域框内克隆到分泌型或膜结合型人类Cγ1的编码区，侧翼为V_H区片段(图5b)。这些限制性内切酶的组合在所有7种人类V基因片段家族的人类V_H编码区中极少被发现。
为了构建一种全人类IgG1重链表达载体，将来自一种之前鉴别的全人类抗体、对NIP-卵白蛋白特异的一种人类V_H编码区作为一种HindIII-Eco47III片段插入到构建体pLHCX-m1-Cγ1s和pLHCX-m1-Cγ1m中，对应地得到质粒 pLHCX-m1-VHCγ1s和pLHCX-m1-VHCγ1m(图5c)。在Seq-ID4中提供了NIP-卵白蛋白特异的人类抗体的V_H编码区，包括前导序列以及5’-HindIII和3’Eco47III克隆位点。应当注意到，两种额外的C核苷酸已经加到该起始-ATG的上游用于改进的翻译(一种Kozak-共有序列的近似)：
Seq-ID4：
      AAGCTTCCATGGAGTTTGGGCTcAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATGGTCGACCACGCGGAAAGCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTAGCGCT
在Seq-ID4中将用于克隆的HindIII和Eco47III限制性酶切位点加下划线。该前导序列的起始ATG在位置9开始。
尽管在图5c中描绘的这些人类IgG₁重链表达载体已经足以实现本发明、并且足以与逆转录病毒IgL链表达载体相组合进行逆转录细胞展示，将体细胞超突变靶向V_H编码区的功能性要求存在该免疫球蛋白轻链或重链基因座的某些顺式调控增强子元件。当已知该κ轻链基因座的的κ内含子和3’κ增强子元件能够将体细胞超突变靶向到位于一种活性启动子的下游的V区时，已经按照以下方式额外地修饰这些基本的逆转录病毒人类Ig重链表达载体pLHCXm1-VHCg1m和pLHCXm1-VHCg1s(图5c)以便含有κ内含子和3’κ增强子元件。鼠κ内含子增强子(κiE)的序列位于一个大约2.3kb长的基因间区域中，该基因间区域位于Jκ5元件和恒定κ编码区之间，该鼠κ内含子增强子的序列可以由NCBI-Genbank输入V00777得到。这种核心κiE在该基因间区域中仅含有约0.5kb，并且它的序列可以由NCBI Genbank输入X00268得到。从 Jκ5到Cκ的全部2.3kb片段(包含该κiE区)含有一个内部的BglII位点，排除了使用该限制性内切酶用于将一种PCR扩增的基因组片段克隆到pLHCX-m1-VHCγ1-s和pLHCX-m1-VHCγ1-m载体中。然而，在该区域中没有内部的BamHI限制性内切酶片段，因此允许将一种侧翼为BamHI位点的基因组PCR片段克隆到BglII线性化载体pLHCX-mod1-VHCγ1s和pLHCX-m1-VHCγ1m中(图5c)。已经构建了以下载体，这些载体含有两个在Jκ5与Cκ之间、全长大约2.3kb的基因间区域(这是使用正向和反向引物Seq-ID5和Seq-ID6、通过从小鼠基因组DNA中对该基因组片段进行PCR扩增来进行的)，两者都含有额外的BamHI限制性酶切位点(加下划线)用于克隆到pLHCX-m1-VHCγ1和pLHCX-m1-VHCγ1m的独特的BglII限制性酶切位点，对应地得到质粒pLHCX-m1-VHCγ1s-κiE和pLHCX-m1-VHCγ1m-κiE(图5d)。
            
除了插入含有来自小鼠κ轻链基因座的基因组片段、完整的约2.3kbκiE之外，还已经将含有核心κiE的一种更短的约0.8kb基因组PCR片段(V00777的位置3634-4394，Seq-ID7)克隆到pLHCX-m1-VHCγ1-s和pLHCX-m1-VHCγ1-m的独特的BglII位点中(未显示)。在Seq-ID8和Seq-ID9中描绘了用于该基因组DNA片段的PCR扩增的正向和反向PCR引物。
Seq-ID7：
5’GAAAAATGTTTAACTCAGCTACTATAATCCCATAATTTTGAAAACTATTTATTAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTATTTAAGGACCCTTTAAAACTCTTGAAACTACTTTAGAGTCATTAAGTTATTTAACCACTTTTAATTACTTTAAAATGATGTCAATTCCCTTTTAACTATTAATTTATTTTAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCTATTGTTTTTCTTGGTAAAGAACTCTCAGTTTTCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCCATCTGGCAGTTGCTTAAGATCAGAAGTGAAGTCTG CCAGTTCCTCCAAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGGTTACAAACCATTAGACCAGGGTCTGATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACAGACCCTGGCTTAAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCATACAGAGGCTAATATCAGAGTATTCTTGGAAGAGACAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCTCTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTGTCAGATAAACTGGTCTGAATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGGAAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGG-3’
            
还将含有基因组PCR片段的大约0.8kb片段的核心κiE作为一种BamHI酶解的PCR片段均克隆到载体pLHCX-m1-VHCγ1-s以及pLHCX-m1-VHCγ1-m的独特的BglII限制性酶切位点中(没有在此显示)。
所贮藏的鼠3’κ增强子元件的序列能够以NCBI-Genbank参考号X15878寻回，并且该序列包含在一种808bp基因序列中，该基因序列位于该小鼠基因组中恒定的κ编码区的大约8.7kb下游。
鼠3’κ增强子不含有一个内部的CiaI位点，并且因此分别使用正向和反向PCR引物Seq-ID10和Seq-ID11从小鼠基因组DNA进行PCR扩增，该增强子含有额外的ClaI限制性酶切位点用于克隆到逆转录病毒载体pLHCX-m1-VHCγ1s-3’κE和pLHCX-m1-VHCγ1m-3’κE的独特的ClaI位点中(图5d)。
            
这产生了编码二者中任何一种Ig重链的最终的Igγ₁H链表达载体pLHCX-m1-VHCγ1s-3’κE-κiE和pLHCX-m1-VHCγ1m-3’κE-κiE(图5e)，这些 Ig重链在IgL链的共表达时对应地导致分泌型人类IgG₁抗体的产生或导致膜结合型人类IgG₁抗体。
这两种载体均额外地在Igγ₁H链表达盒的上游和下游含有κiE以及3’κE顺式调控元件，将体细胞高度突变提供给这些经表达的Igγ₁H链的V_H区。
b)克隆针对人类Igκ轻链的逆转录病毒表达载体
作为构建允许针对逆转录病毒的整合来进行抗生素筛选的、逆转录病毒的人类免疫球蛋白轻链表达载体的一个起点，已经使用了可商购的逆转录病毒载体pLPCX(BD-Clontech，Mountain View，CA)(图6a)。该载体含有提供嘌罗霉素抗性的一种抗生素选择标志物，该标志物由该逆转录病毒主链的5’LTR启动子驱动的。尽管在设计上与pLHCX主链类似(参见实例1a)，pLPCX含有两个Eco47III位点以及具有多个限制性酶切位点的一个MCS，但是在CMV启动子的上游缺少方便的独特的BglII位点(图6a)。
为了从pLPCX载体主链去除Eco47III限制性内切酶、并且同时为了在CMV启动子的上游引入一种独特的BglII限制性内切酶，进行以下预备克隆步骤：第一步，通过定点诱变将在pLHCX包装信号中的Eco47III位点去除，这是使用一种商业性Quikchange^TM试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将Eco47III识别序列AGCGCT的第三个C核苷酸替换为A、使用提供令人希望的突变的特异性的引物对、根据制造商的说明书来进行的(图6a)。已证实在该ψ(Psi)包装信号中这种单碱基对的取代不影响这些已突变的载体的逆转录病毒转导效率(数据未显示)。这种经突变的载体被命名为pLPCX-m1(图6a)。为了获得完全没有Eco47III位点、并且额外包括位于CMV启动子上游的一个独特的BglII位点的一个pLPCX载体主链，将来自pLPCX-m1的一个AscI-NcoI片段(其中已经由克列诺酶将NcoI酶解的DNA末端填满)克隆到一个AscI-BlpI酶解的pLHCX主链中，其中BlpI酶解的DNA末端已经由克列诺酶填满(图6b)，由此产生一种被命名为pLPCX-m2的载体，其中基本上只有pLHCX的潮霉素B基因已经被pLPCX的嘌罗霉素抗性标志物替换(图6b)。
为了构建IgκL链表达载体，使用正向引物和反向引物Seq-ID12和Seq-ID13 (对应地含有HindIII和ClaI限制性酶切位点)将恒定的κ轻链编码区从人类外周血淋巴细胞cDNA中进行PCR克隆，用于定向克隆于pLPCX-m2中(图6b)如在部分a.)中所说明，正向引物Seq-ID12额外含有一个Eco47III位点，允许将V_L编码区框内融合到这种恒定的κ轻链编码区中，仅导致在人类恒定的κ轻链的第一个位置上一个保守的苏氨酸到丝氨酸的氨基酸取代。该反向引物含有一个额外的内部NotI位点从而有助于以后的克隆操作，像例如恒定的κ编码区的交换。
            
将5’端侧翼为HindIII/Eco47III位点、并且在3’端侧翼为NotI/ClaI位点的这种恒定的κ轻链编码区插入到pLPCX-m2中产生质粒pLPCX-m2-Cκ。
为了构建一种完整的人类IgκL重链表达载体，将来自一种之前鉴定的全人类抗体、对NIP-卵白蛋白特异的一种人类Vκ编码区作为一种HindIII-Eco47III片段插入到构建体pLPCX-m2-Cκ中。(图6c)在Seq-ID14中提供了含有前导序列以及5’-HindIII和3’Eco47III克隆位点的NIP-卵白蛋白特异性人类抗体的Vκ编码区。应当注意到，两种额外的C核苷酸已经加到该起始-ATG的上游用于改进的翻译(一种Kozak-共有序列的近似)：
Seq-ID14：5’-
      AAGCTTCCATGGATATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTcAACAGAGTTACAGTACCCCCACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAGCGCT-3’
在Seq-ID14中将用于克隆的HindIII和Eco47III限制性酶切位点加下划线。该前导序列的起始ATG在位置9起始。将这种HindIII-Eco47III片段插入到HindIII-Eco47III线性化的pLPCX-m2-Cκ中得到表达构建体pLPCX-m2-VκCκ(图6c)。
尽管这种逆转录病毒κ轻链表达载体已经足以实现本发明、并且足以通过与逆转录病毒Ig重链表达载体共表达进行逆转录细胞展示，遵循着与用于Ig重链表达构建体相同的克隆策略已经克隆了还含有κiE和3’κE元件的额外载体。因此，将小鼠的κiE插入到CMV启动子上游的pLPCX-m2-Vκ-Cκ中的独特的BglII位点中，作为一种大约2.3kb基因组的、用引物Seq-ID5和Seq-ID6对扩增的BamHI酶解的PCR片段(参见以上所述)，或者作为一种大约0.8kb基因组的、用引物对Seq-ID8和Seq-ID9扩增的BamHI酶解的PCR片段(参见以上所述)。在此仅描绘了将这种含有大约2.3kb基因组的小鼠κiE的片段克隆到pLPCX-m2-VκCκ中，产生质粒pLPCX-m2-VκCκ-κiE(图6d)。
最后，并且与在以上实例1a中所说明的构建含有κiE和3’κE的IgH链逆转录病毒表达载体相类似，将鼠3’κE作为一种用引物对Seq-ID10和Seq-ID11扩增的、ClaI酶解的基因组PCR片段插入到该κ轻链编码区下游的独特的ClaI限制性位点上，以便产生逆转录病毒表达载体pLPCX-m2-Vκ-Cκ-κiE-3’κE(图6d)。
类似于含有κiE和3’κE元件的IgH链表达载体，这种载体现在含有将体细胞超突变提供给克隆到该构建体中的任何一个Vκ编码区所要求的所有顺式调控元件(见以下)。
实例2
产生一种过量表达活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的细胞系
已经证明经活化的B细胞特异性蛋白活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)是一种独特的反式激活性因子，该因子是要求的并且足以向任何脊椎动物细胞系提供一种体细胞超突变表型。在表达AID的细胞中，可以将体细胞超突变特异性 地靶向转录活化的基因座，条件是它们被安排在顺式调控增强子元件的正确环境中，特别是该免疫球蛋白κ轻链基因座的κiE和3’κE元件的正确环境中，。为了获得稳定表达AID的细胞系，首先按照以下方法构建一种编码鼠AID的逆转录病毒表达构建体。
使用高保真Pfx聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)从全部小鼠的脾cDNA中对鼠AID cDNA进行PCR扩增，这是根据制造商的说明书、使用正向和反向PCR引物Seq-ID15和Seq-ID16(包含用于将该PCR扩增的片段连接到适合的载体中的额外的XhoI克隆位点)来进行的。此外，该正向引物在XhoI位点下游以及鼠AID ORF的起始ATG密码子的上游含有额外的两种C核苷酸(斜体字突出显示)，以便近似于一种Kozak翻译初始序列并且由此确保适当地翻译所克隆的cDNA。
            
将所得到的620bp的RT-PCR产物用XhoI酶解，并且连接到用XhoI酶解的、并且用碱性磷酸酶处理的pLPCX(来自BD-Clontech(Mountain View，CA))上。通过诊断型限制性内切酶的酶解来确定含有以正确方向插入的连接产物。通过DNA测序证实具有正确的限制性内切酶模式、含有在正确方向上的鼠AIDcDNA插入片段的一种克隆，并且将其命名为pLPCX-mAID(图7)。
所克隆的鼠AID cDNA的序列确切地对应于已公布的鼠AID cDNA ORF(在NCBI-Genbank输入AF132979提供)。
下一步，将10μg的PvuI线性化的pLPCX-mAID构建体在环境温度下、通过以300V、960μF进行电穿孔转染到再次悬浮于800μ普通RPMI培养基中的5x 10⁶个FA-12Abelson转化的前B细胞中。将转染的细胞再次悬浮于20ml含有FCS的生长培养基中，并且以200μl/孔铺板于10个96孔板中。转染后48小时，通过向该培养基中加入2μg/ml嘌罗霉素抗生素将稳定转染的细胞选择出。
转染后10至14天后，几十个嘌罗霉素抗性集落是可检测到的，并且将选出的克隆转移到含有2μg/ml嘌罗霉素的新鲜的培养基中。将这些嘌罗霉素抗体克隆进一步扩展，并且如制造商所推荐、使用一种商业性抗小鼠AID抗体、通过ECL蛋白印迹法对选出的多个集落测试鼠AID蛋白的表达(见图9a)。
正如所预期的，一个特异性AID蛋白带在大约80％的所分析的FA-12-AID转染细胞克隆中是可检测到的，并且显示表观分子量为25kD。从这个结果得出结论：获得了组成型过量表达该鼠AID蛋白的几种细胞系。
实例3
证明在含有顺式调控κiE和3’κE元件的逆转录病毒人类免疫球蛋白表达构建体中靶向一种该报告基因的体细胞超突变
下一步，证明了在逆转录病毒表达构建体中的人类抗体可变区(正如在本发明中所披露)是用于AID介导的体细胞超突变的靶标。为此，产生了一种报告基因构建体，其中一种人类IgH链的V-区ORF被替换为一种突变的EGFP ORF，其中已经将一种终止密码子引入到一种RGYW序列基序的背景中，该基序已知是用于体细胞超突变的一个热点(Bachl&Olsson，1999)。
将该终止突变引入到EGFP ORF的密码子107处，将一种酪氨酸密码子变成一种TAG终止密码子。此外，对密码子108进行修饰，由此在所突变的EGFP序列中产生一种新颖的诊断型SpeI限制性位点，这样使得当密码子107中的终止突变发生回复突变时，SpeI位点会被破坏，由此促进了回复突变体的鉴定和表征。引入到EGFP ORF的序列修饰描绘于图10a中，全部的经突变的EGFP ORF在图10b中提供。
按照以下方式构建了用于证明体细胞超突变的报告基因构建体：
从作为一种模板的质粒pIRES-EGFP(BD-Clontech，Mountain View，CA)，使用高保真Pfx-聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)、以及正向引物Seq-ID17和Seq-ID18(各自均含有额外的HindIII和Eco47III限制性酶切位点，允许用一个EGFP ORF替代pLHCXm1-VHCγ-s-κiE-3’κE中的V_H-区)将该EGFP ORF进行 PCR扩增。该正向引物在该ATG起始密码子的上游含有额外的两种C核苷酸(以斜体字突出显示)，它近似于一种Kozak翻译起始共有序列并且确保在这种正确的ATG起始密码子处适当地起始翻译。
            
将737bp的Pfx扩增的EGFP PCR片段直接克隆到pCR4-Topo载体中，这种pCR4-Topo载体是一种Zero-Blunt PCR克隆试剂盒(InVitrogen，Carlsbad，CA)的一部分，产生pCR4-Topo-EGFP载体(图11)。下一步，将pCR4-Topo-EGFP的一种证实序列的克隆在EGFP ORF的密码子107和108处进行突变，正如图10中所描绘，这是根据制造商的说明书使用一种Quikchange^TM试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)、使用提供这些令人希望的突变的特异性引物对来进行的，由此产生质粒pCR4-Topo-EGFPmut。
使用限制性内切酶HindIII和Eco47III、通过双限制性内切酶酶解、从该质粒回收pCR4-Topo-EGFPmut的序列经证实的突变的EGFP ORF。将酶解的片段连接到HindIII和Eco47III双消化质粒pLHCXm1-VHCγ-s-κiE-3’κE(图5e)中，并且连接到不含有增强子元件的HindIII和Eco47III双酶解质粒pLHCXm1-VHCγ-s(图5c)中。由此，在两种载体中这些V_H编码区被替换为经突变的EGFP ORF，它们被框内融合到这些Cγ₁区上，得到报告质粒pLHCXm1-E(mut)-Cγ-s-κiE-3’κE、以及对照报告质粒pLHCXm1-E(mut)-Cγ-s(图11)。
将两种质粒转导到抗嘌罗霉素FA-12AID转染子克隆3(表达AID)和作为对照物的5(无AID表达)中。转导后24小时开始在2mg/ml潮霉素B筛选下培养转导的细胞，并且在培养6、8和10天后分析这些细胞分析绿色自身荧光细胞的出现。只有在该实验中(其中在具有κiE和3’κE的背景中(即，使用质粒pLHCXm1-E(mut)-Cγ-s-κiE-3’κE)、并且在FA-12AID转染子中表达一种突变的EGFP报告构建体，其中AID表达可以通过蛋白质印迹法检出的(即，FA-12 AID转染子克隆3))，当一种稳定态频率为大约0.2％(图9b)的绿色细胞可以有FACS检测出时在培养6、8和10天之后才可以检测出绿色自动发荧光细胞。在这些对照实验中(无AID表达，和/或在这些构建体中不存在增强子元件，数据未显示)没有一项实验在该实验的10天持续期间内能够检测到绿色细胞。
在已经长成足够的细胞之后，从这种0.2％的EGFP阳性群中将192个单细胞分选到两个96孔板的各个孔中，并且通过FACS对来自这些单分选克隆的100个克隆分析绿色荧光。在所分析的100个克隆中，95个克隆展示出一种同质(homogenous)的荧光模式，在强度方面与在这些单分选的细胞中检测到的荧光相类似，例如在大约10²对数荧光(FA-12细胞的对照细胞的自动荧光仍然在10¹对数荧光水平以下，通过阈值线指出)。4个克隆展示出一种不同的荧光模式，其中对于EGFP表达而言大约半数的细胞是阴性、并且半数的细胞是阳性。所分析的100个克隆中只有一个在实践上没有展示出EGFP荧光，尽管该克隆也是稍微高于背景的自动荧光水平。具有异质的并且阴性的EGFP模式的这5个克隆可能是由于将病毒整合体的EGFP表达(部分地)位置沉默逆转录，或这些结果可能是由于单细胞分选的假象。尽管如此，在大多数克隆(95％)中，EGFP表达是可清楚地检出的。使用克隆引物Seq-ID17和Seq-ID18、通过PCR来分析这些克隆中的24个克隆，以便从这些稳定转导的细胞再扩增这种EGFP基因。
与来自含有经突变的EGFP ORF的报告载体的一种PCR产物相反，来自表达EGFP克隆的24个PCR产物中没有一种可以用SpeI限制性内切酶进行酶解，这提示在经突变的EGFP ORF的密码子107中TAG终止突变的回复突变(数据未显示)。
通过DNA测序已经分析了这些PCR产物中的10个，证实了所有这10个克隆含有引入到该EGFP ORF中的RGYW基序中G核苷酸的一个G-＞C突变，正如之前在文献(Bachl&Olsson，1999)中所述。
这证明：依赖于顺式调控基因元件(像κiE和3’κE元件)的存在、并且依赖于AID表达，可以将升高水平的体细胞突变以及由此的诱变靶向到一种活性 启动子下游的DNA区，并且因此在所披露的逆转录病毒表达构建体的背景中靶向到人类抗体链的V_H编码区。
就在这些κiE和3’κE构建体中评估AID依赖的体细胞突变的水平而言，所估计的突变率是在大约3x10^-5次突变/bp/代的范围内。该值仍然较低，因为在体内已经报道的体细胞超突变率可以达到高达10^-4次或甚至10^-3次/bp/代的比例。尽管如此，所检测的突变率仍然显著地高于在脊椎动物细胞中报道的背景突变率(该突变率估计是在10^-8次突变/bp/代的范围内)。因此，得出结论：高体细胞突变率以一种增强子和AID依赖的方式特异性地靶向所披露的逆转录病毒构建体中一种活化启动子的下游区域，从而允许在基于通过AID表达介导的体细胞超突变的体内诱变条件下使用逆转录细胞展示。
实例4
通过使用能够进行V(D)J重组逆转录病毒表达载体来证明人类抗体编码区的原位产生
a)在IgH链表达之前对要求V(D)J重组的一种逆转录病毒人类重链(IgH)表达载体进行克隆。
作为来自在实例1中所说明的cDNA表达载体的逆转录病毒表达重链(H)和轻链(L)的一种替代性方法，已经构建了一种不同的逆转录病毒IgH链载体类别，其中通过将V、D和J片段分成“准胚系”构型来对这种可变的编码区进行编码，该构型仍然需要在表达之前通过V(D)J重组过程进行装配。V(D)J重组介导了位点特异的但稍微不精确的V、D和J基因片段的装配，这样当原位转导进入V(D)J重组活性细胞(像例如，前B细胞)时可以从一种单一的表达构建体中产生多样的V编码区。
为此，已经逐个地从衍生自去除B细胞的人类外周血单核细胞(PBMC)的基因组DNA将胚系V_H3.30、D_H1.26和J_H3基因片段进行PCR克隆。选定用于胚系V、D和J基因片段的扩增的PCR引物，这样使得将包括保守的重组信号序列(RSSs)、以及额外的干扰性DNA序列的侧翼DNA序列包含在内，允 许适当地装配V、D和J基因片段。所有PCR扩增子是使用校正热稳定的DNA聚合酶Pfx(Invitrogen，Carlsbad，CA)而产生的，并且最初被亚克隆到一种pSC-BPCR克隆载体中(Stratagene，La Jolla，CA)，在这两种情况中均是根据制造商的说明书进行的。通过DNA测序证实了亚克隆到pSC-B中的PCR片段，并且只有一些片段才可以仅用于进一步克隆，条件是该DNA序列已经是序列证实的。
为了对一个胚系的人类VH3.30片段进行PCR扩增，使用了DNA引物Seq-ID19和Seq-ID20，它们含有BamHI和NheI限制性酶切位点(如所指示)，允许进一步亚克隆这种PCR克隆的DNA片段。
            
通过这种方法，获得了具有侧翼DNA的、含有胚系VH3.30基因片段的623bp长度的一种PCR扩增子(Seq-ID21)，见图11a。
Seq-ID21：
5’atttGGATCCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGATTCATGGAGAAATAGAGAGACTGAGTGTGAGTGAACATGAGTGAGAAAAACTGGATTTGTGTGGCATTTTCTGATAACGGTGTCCTTCTGTTTGCAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACAGTGAGGGGAAGTCATTGTGCGCCCAGACACAAACCTCCCTGCAGGAACGCTGGGGGGAAATCAGCGGCAGGGGGCGCTCAGGAGCCACTGATCAGAGTCAGCCCTGGAGGCAGGTGCAGATGGAGGCTGTTTCCTGTCAGGAGCTAGCggg3’
下一步，使用引物对Seq-ID22和Seq-ID23(对应地含有限制性内切酶NheI 和XhoI位点)实现了含有人类DH1.26片段、具有侧翼基因组DNA的一种人类基因组DNA片段的PCR扩增(图11a)。
            
通过这种方法，获得了含有胚系DH1.26基因片段、具有侧翼DNA的336bp长度的一种PCR扩增子(Seq-ID24)。
Seq-ID24：
5’ggaGCTAGCGGGCTGCCAGTCCTCACCCCACACCTAAGGTGAGCCACAGCCGCCAGAGCCTCCACAGGAGACCCCACCCAGCAGCCCAGCCCCTACCCAGGAGGCCCCAGAGCTCAGGGCGCCTGGGTGGATTCTGAACAGCCCCGAGTCACGGTGGGTATAGTGGGAGCTACTACCACTGTGAGAAAAGCTATGTCCAAAACTGTCTCCCGGCCACTGCTGGAGGCCCAGCCAGAGAAGGGACCAGCCGCCCGAACATACGACCTTCCCAGACCTCATGACCCCCAGCACTTGGAGCTCCACAGTGTCCCCATTGGATGGTGAGGACTCGAGccc33’
最后，使用引物对Seq-ID25和Seq-ID26(对应地含有限制性内切酶SalI和XbaI/HindIII位点)实现了含有人类JH3片段、具有侧翼基因组DNA的一种人类基因组DNA片段的PCR扩增，正如所指示(图11a)。
            
通过这种方法，获得了含有胚系JH3基因片段、具有侧翼DNA的239bp长度的一种PCR扩增子(Seq-ID27)。
Seq-ID27：
5’ggaGTCGACCCCTGCCTGGGTCTCAGCCCGGGGGTCTGTGTGGCTGGGG ACAGGGACGCCGGCTGCCTCTGCTCTGTGCTTGGGCCATGTGACCCATTCGAGTGTCCTGCACGGGCACAGGTTTGTGTCTGGGCAGGAACAGGGACTGTGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTAAGATGGCTAAGCTTatatTCTAGAtata3’
已经将这三个DNA片段Seq-ID21、Seq-ID24和Seq-ID27顺序地克隆到一种穿梭载体中，该穿梭载体含有独特的BamHI、NheI、XhoI和XbaI限制性酶切位点，这样使得含有基因片段VH3.30、DH1.26和JH3的盒可以经由适合的限制性内切酶位点、通过这些DNA片段的顺序连接进行装配。将Seq-ID21作为一种BamHI-NheI片段连接到BamHI-NheI线性化穿梭载体中，然后将NheI-XhoI酶解的片段Seq-ID24连接到NheI-XhoI线性化穿梭载体中，该穿梭载体已经含有Seq-ID21，并且最后，将SalI-XbaI酶解的片段Seq-ID27连接到XhoI-XbaI线性化的、已经含有克隆的Seq-ID21和Seq-ID24的穿梭载体中，从而在一种穿梭载体中产生一种人造的VH3.30-DH1.26-JH3盒(图11a)。
然后，将含有该人工装配的VH3.30、DH1.26以及JH3基因片段的整个“准胚系”盒克隆到逆转录病毒载体MigR1(Pear et al.1998)中，该载体MigR1已经含有已经克隆到MigR1载体的独特的BglII和HpaI位点中的人类μH链(Seq-ID28，见以下)编码区(构建体MigR1-muH，图11b)。在MigR1-muH中将VH编码区与恒定的μH链编码区分开的一种独特的XhoI位点(在Seq-ID28的中间部分以黑体印刷突出显示)可以用于将VH3.30-DH1.26-JH3盒框内连接到恒定的μH链编码区上，而不影响在过渡形式JH到这种恒定的编码区的氨基酸序列。
Seq-ID28：
5’AGATCTACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCGATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAATGGGTCTCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGA CTCTGTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTCTCGTACCTTAGCACCGCGTCCTCCCTTGACTATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCCGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGATCAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCCCCCATCCTTTGCCAGCATCTTCCTCACCAAGTCCACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGACAGCGTGACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCACACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACTTTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCTGCGAGGATGACTGGAATTCCGGGGAGAGGTTCACGTGCACCGTGACCCACACAGACCTGCCCTCGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTCTACTTGCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGGTGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCCCCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAATGGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCATGAGGCCCTGCCCAACAGGGTCACCGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGAGGGGGAGGTGAGCGCCGACGAGGAGGGCTTTGAGAACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTT CCTCCTGAGCCTCTTCTACAGTACCACCGTCACCTTGTTCAAGGTGAAATGAGCGGCCGCTTTACGCGTTAAC3’
在该插入片段的5’和3’末端的BglII-HpaI限制性酶切位点也对应地用黑体印刷突出显示并且加下划线，并且指示转化为MigR1载体主链(Pear et al.1998)。
为了替代在MigR1逆转录病毒主链中含有的Seq-ID28中的V-编码区(该逆转录病毒主链具有VH3.30-DH1.26-JH3“准胚系”盒)，这种大约1.1kb的VH3.30-DH1.26-JH3片段需要使用一种含有BglII正向引物以及一种含有XhoI反向引物(对应地为Seq-ID29和Seq-ID30)通过PCR进行再次扩增(图11a)。
            
将得到的大约1.1kb的PCR片段用BglII和XhoI进行酶解，并且被连接到含有BglII-XhoI线性化的μH链的MigR1载体中，由此得到能够进行V-D-J重组的逆转录病毒表达载体pVDJ-muH-MigR1(图11b)。
b)在转导到前B细胞中时证明在产生多样序列的逆转录病毒V-D-J载体中发生的真正的V(D)J重组。
作为一种概念性证据，为了证明适合的V(D)J重组可以发生在含有处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段的逆转录病毒载体中，将载体pVDJ-muH-MigR1连同一种逆转录病毒IgL链表达载体共转导到A-MuLV-转化的前B细胞系230-238中，如实例1b中所说明。只有若一种V(D)J重组事件发生在pVDJ-muH-MigR1构建体上从而导致这些V、D和J基因片段的框内重排时，才可以在这些双转导的细胞的细胞表面上表达一种全长的人类IgM抗体。通过IRES偶联的EGFP标志物基因的共表达，可以监测pVDJ-muH-MigR1载体的转导效率。正如在图12(a)中可以看到，用至少pVDJ-muH-MigR1构建体(转导效率是44.7％)转导的非常少的0.04％的细胞群在细胞表面上展示可检出的 IgM表达，正如通过用一种抗κ轻链抗体的FACS染色所测量。值得注意的是，实际上在不用pVDJ-muH-MigR1构建体转导的细胞群中没有检测出表达IgM的细胞(图12(a)中下右四分之一图)，这证明了这种染色的特异性。
可以在图12(a)的上右四分之一图中检出的这些稀少的表达IgM的细胞已经使用一台FACS-Aria高速细胞分选仪(BD，Franklin Lakes，NJ)、通过制备型细胞分选得到分选，并且已经通过组织培养扩展8天，以便将这些细胞扩增用于这些逆转录病毒整合体的表征。用于EGFP表达(指示整合的pVDJ-muH-MigR1构建体)以及扩展8天之后表面IgM的FACS图显示出可能的极少的克隆扩展的细胞，这些细胞在细胞表面上展示出IgM并且含有pVDJ-muH-MigR1构建体(正如通过绿色荧光所测量，图12(b))。已经分选了图12(b)的FACS图的上右区中能够区分的细胞群，并且已经从汇集的细胞群中制备了基因组DNA。
使用与VH上游和JH区下游的pVDJ-muH-MigR1构建体相结合的引物、通过诊断型PCR来分析基因组DNA。正如所预期，这些诊断型PCR产生了两个具有几乎相同强度的分离的条带(指示非重排的V、D和J基因片段(大约1.2kb片段))、以及一种更小的大约0.5kb片段(指示V(D)J重组的基因片段)(数据未显示)。对较大的PCR条带进行测序证实：这种PCR扩增子表示仍然处于“准胚系”构型的未重排的V-D-J盒。在IgM阳性细胞中这些未重排的构建体仍然是可检出的，条件是这些细胞用超过一种构建体进行转导，其中不是所有的这些构建体可以接近用于V(D)J重组。当对这种PCR产物进行测序时，这种较小的PCR扩增子不产生一种独特的序列、并且需要将其亚克隆到pSC-BPCR克隆载体中用于单独的PCR片段的PCR序列分析。
在所分析的6种质粒中，2种含有完全相同的真正的V(D)J重组序列，它们显示出由V(D)J重组进行位点定向连接的V、D和J基因片段的所有特征性特点，包括在编码区的核苷酸缺失以及由前体淋巴细胞特异性酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的非模板序列(N-区)的加入(图12(b))。
由克隆225的序列所表示的这两种回收的序列(图12b)已经是对于含有 逆转录病毒表达载体的V、D和J基因片段能够在前B淋巴细胞中经受V(D)J重组的坚实证据，因为对于显示出一种真正的V(D)J重组事件的所有信号的这些序列怎样可以通过其他方式而产生还没有其他解释，即使在这一点上的效率似乎是低的。得出结论：当在前体淋巴细胞的逆转录病毒转导的背景中V(D)J重组的效率增加时，可以从有限量的含有处于“准胚系”构型的V、D和J基因片段的逆转录病毒载体中产生多样的抗体序列集合。
实例5
鉴定并且表征用于逆转录细胞展示的适当的选择鼠B细胞系
a)在B细胞系中内源性抗体的表达可能潜在地阻碍了它们在逆转录细胞展示中作为选择细胞(selector cell)的使用，因为内源性小鼠免疫球蛋白链与重组的完全抗体链的配对也许会负面地影响它们的细胞表面展示，或可能导致具有不可定义的结合特异性的混合型人-鼠免疫球蛋白的表达。因此，使用与FITC相偶联的抗鼠IgM重链抗体(Southem Biotech)，对在文献中所说明的一组Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)转化的鼠前B细胞系组检查内源性IgM重链(μH)的细胞内表达。这些细胞包括谱系40E1、230-238、204-1-8(Alt et al.，1981)、18-81、18-81亚克隆8-11(Rosenberg&Baltimore 1978)、来自RAG-2缺陷小鼠的63-12(在此被称为FA-12)细胞(Sinkai et al.，1992)、以及来自三个替代轻链敲除的小鼠的1624-5、1624-6(Shimizu et al.，2002)。遵循制造商的说明书、使用Fix/Perm-试剂盒(Caltech)将这些细胞进行透化处理。如在图14中所描绘，细胞系FA-12、40E1，以及18-81亚克隆8-11、1624-5以及1624-6，显示对于细胞内IgM染色的最小信号或没有信号，将它们称作用于逆转录细胞展示的适合的选择细胞。
b)因为逆转录细胞展示是基于逆转录病毒载体介导的基因转移，使用含有一种绿色荧光蛋白(GFP)标志物基因(图13)的亲嗜性MLV衍生的载体颗粒进一步对这组A-MuLV转化的前B细胞系检查了它们对逆转录病毒转导的敏感性。使用一种载体制备物、以0.5的MOI转导了1x 10⁵个细胞，该制剂已经 包装着报道基因GFP、包括通过有限稀释之前滴定18-81亚克隆8-11前B细胞的转移载体LEGFP-N1(Clontech)。如以下所说明产生了载体颗粒。通过旋转感染进行转导，实质上使用离心、在1.5ml-Eppendorf管中以3.300rpm并且30℃下持续3小时。转导后两天，通过确定表达GFP的细胞的频率(通过FACS分析)来分析基因转移。未处理的、天然靶细胞充当阴性对照物。如在图13中所展示，只有初始的18-81细胞显示出非常低的允许MLV载体转导(＜10％)。所有其他细胞系显示出小于或等于40％的基因转移效率。值得注意的是，在本实验中使用FA-12、40E1以及1624-5细胞基因转移效率是最高的，并且达到大于50％。
合起来，FA12、40E1以及1624-5细胞被发现为最适合用于逆转录细胞展示，考虑到两个指标：a)低内源性鼠免疫球蛋白表达或没有该表达，以及b)对逆转录病毒转导的敏感性。然而，因为所希望的是表达由重组的重链和轻链组成的免疫球蛋白，B细胞是优选的，这些细胞也缺乏替代轻链组分(可以从λ5，或VpreB1，或VpreB2基因表达)，因为那些可以竞争在野生型前B细胞中与重组的轻链相关联的重链的。因此，预期由替代轻链三元敲除小鼠获得的1624-5细胞是用于进一步的逆转录细胞展示技术的最适合的细胞。然而应当理解，任何其他细胞系(包括在此分析的那些额外的细胞系，这些细胞系满足没有/低内源性免疫球蛋白表达、以及逆转录病毒转导能力的指标)可以用于实现在此披露的方法。
实例6
产生克隆地并且稳定地表达的完全人类抗体文库的选择细胞
为了产生已经包装着转移载体(编码了完全人类抗体链及其文库)的载体颗粒、以及随后将它们用于鼠B细胞系的转导，通过以下方法进行感染实验。转染前16至24小时，将人胚肾293T-HEK细胞在10ml的Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM)以2x10⁶个进行铺板，每个10cm组织培养皿中添加10％胎牛血清(FCS)以及L-谷氨酰胺。制备了5μg的对应的转移载体 IgL(245)-LIB-IRES-YFP和IgH(650)-LIB-IRES-GFP(编码了重链或轻链的文库，这些重链或轻链通过一种IRES与GFP或YFP表达相连接，图15)、3μg的pVPack-GP(一种具有MLV的gag以及pol基因的表达构建体)以及2.5μg的pVPack-Eco(一种包括单嗜性MLV的env基因表达构建体，均来自STRATAGENE)的混合物，并且用30μl的在1ml无血清的DMEM中Fugene(Roche)进行孵育，并且在室温下静置15至30分钟。然后，将这种Fugene/DNA混合物轻柔地加入到接种于10cm培养皿的293T-HEK细胞中。将编码重链和轻链的转移载体染到分开的瞬间包装细胞中。
转染后48小时，从瞬间包装细胞收集含有载体颗粒的上清液，并且将其在3，000rpm下离心以去除污染的细胞。将1.5x 10⁶个1624-5鼠B细胞悬浮在1ml的培养基中，该培养基添加了不同数量的载体颗粒(1∶1；1∶5，1∶20；1∶50；1∶100；1∶200稀释)，这些载体颗粒已经包装着抗体的重链或轻链的编码区。通过在1.5ml-Eppendorf管中以3.300rpm以及30℃下离心3小时来进行转导。将未使用的上清液贮存在-80℃下用于随后时间点的使用。为了确保单拷贝的转移载体已经整合到该宿主细胞基因组中，使用FACS富集了在感染之后4天显示基因转移效率低于10％(通过GFP或YFP的表达所检测)的细胞(图16)。将这些细胞扩展6天，并且使其经受一个第二转导操作，该操作采用之前冷冻的载体颗粒，这些载体颗粒已经包装着如以上说明以1∶5稀释的抗体的轻链编码区。在此，使用转导轻链-IRES-YFP文库的载体颗粒来感染选择用于重链表达的GFP阳性细胞，并且反之亦然(图15&16)。感染之后4天，使用FACS来富集表达GFP和YFP的成功转导的细胞。在第二次转导之后，这些细胞中有大约20％显示GFP和YFP表达。为了确保每个细胞只有单一载体的整合发生，富集了这些群落中的大约三分之一，仅仅显示了在第二轮中所转导的报道基因的低表达或中等表达(大约8％，见图16)。
实例7
通过逆转录细胞展示来检测并且富集表达抗原反应性人类抗体的细胞
a)作为概念性证据实验的逆转录细胞展示的一种准备，首先确定了对于在选择细胞上逆转录病毒表达的IL-15结合抗体的最佳染色和检测条件。将共表达一种人类IgH和IgL链文库的1624-5A-MuLV转化的前B细胞以2∶1的比例与1624-5A-MuLV转化的前B细胞相混合，这些细胞表达了逆转录病毒表达载体，这些表达载体在该细胞表面上编码了一种人类抗IL-15抗体。将这些混合的细胞样品用不同浓度的重组人类IL-15(0.1至2.5μg/ml)，以及不同浓度的多克隆的、生物素酰化的抗人类IL-15抗体(1.0以及3.0μg/ml)进行孵育(正如所指出)，该抗体最终用为抗生蛋白链菌素藻红蛋白(strep-PE)显示。为了将展示抗体的细胞与表达非免疫球蛋白的细胞相区别，用一种抗人类IgκL-APC抗体对多个样品进行复染。如在图17的两个上右侧FACS图片中可见，使用了0.1和0.5μg/ml的重组IL-15作为一种第一试剂、以及3.0μg/ml的生物素酰化的抗人类-IL-15抗体作为一种第二染色试剂的组合最有效地检测出IL-15反应细胞(20.1％和20.4％)。
b)下一步，进行一项概念性证据实验，其中将一种对人类IL-15特异的参比抗体刺入到表达一种多样的人类抗体文库的细胞库中，在刺入时这些插入的抗原反应性细胞已经通过FACS进行了分析。在准备本实验时，将逆转录病毒性地表达于1624-5细胞中的抗体文库(参见实例6)对表面Ig表达以及IL-15结合(NC)进行染色，同时使用了一种表达对人类IL-15抗原特异的参比抗体的1624-5细胞系(PC)。对这些NC以及PC细胞系的FACS分析示于图18，并且证明了在这些PC细胞的表面上所展示的抗IL-15参比抗体的特异性IL-15染色。为了分析这种表达抗IL-15Ab的参比细胞系是否仍可以通过FACS进行定量检测(条件是将这些PC细胞插入到表达一个随机的人类抗体集合的NC细胞系中)，使用以上确定的最佳IL-15染色条件、通过FACS来对该NC文库中不同稀释的PC细胞分析特异性IL-15结合。阴性对照细胞的FACS分析显示只有一个群落显示IL-15结合活性。相比之下，证明了超过60％的阳性对照群落与IL-15相结合。当以10％、12.5％、25％、37.5％和50％的比例将以上两个群落向混合时，观察到混合到该抗体文库细胞库中的阳性对照细胞的百分数与显 示结合到IL-15上的细胞的部分之间的相关性。因此，得出结论：IL-15反应细胞在与表达其他非特异性抗体的细胞的混合物中可以通过FACS染色进行定量地检测。
c)下一步，进行了一项概念性证据实验，其中通过逆转录细胞展示富集了稀少的IL-15反应细胞。为此，通过逆转录病毒转导一种IL-15IgH链(与GFP相偶联)，并且共转导一种复杂集合(复杂度大约7x 10⁴)的人类IgκL链(与YFP相偶联)，产生了一种在1624-5前B细胞中表达的高度多样的人类抗体集合。因此，通过对一种来自人类抗IL-15特异性抗体的单IgH链改组一个多样的人类IgκL链集合而产生了一种逆转录细胞展示抗体文库。使用如之前所确定的最佳条件针对IL-15反应性来对这些细胞染色。通过三轮连续的高速FACS细胞分选、之后跟随细胞培养扩展将IL-15反应细胞富集。三轮逆转录细胞展示富集之后，可以得到一个细胞群，该细胞群表达人类抗体并且基本上对来自一个初始细胞群的抗原IL-15定量地染色的细胞群，在这种初始细胞群中几乎不能检测出IL-15反应细胞。(图19)这个实验证明：反复多轮的逆转录细胞展示富集可以有效地使于使IL-15结合细胞富集。
d)证实从一种3x IL-15富集的细胞库建立的单独的细胞克隆的IL-15结合特异性(参见之前的实例)。然后，在这个经历了三次IL-15特异性逆转录细胞展示富集的细胞库中，已经通过单细胞分选建立了25个单独的细胞克隆。使用之前最佳的染色条件、通过IL-15染色已经对这些25个细胞克隆表征了IL-15特异性(参见实例7a)。作为这种IL-15染色的特异性的一种对照物，还将所有的克隆与所有的染色试剂(除IL-15抗原之外)进行孵育。这25个单细胞克隆中大多数展示了一种高度特异的IL-15染色模式，当IL-15抗原从该染色反应去除后该模式消失。具有4种选定的单独的细胞克隆的代表性IL-15特异性染色示于图19中。这些克隆的染色是从一种3x IL-15富集抗原的细胞群建立的全部25个细胞克隆的代表(以字母顺序A至Y命名)，所有这些克隆对IL-15抗原结合检测为阳性。在图19中提供了针对这些染色的特异性的阴性对照和阳性对照，正如所指示。
实例8
链改组或指导进化的方法：通过高速细胞分选、对编码了来自抗原选择细胞的区域的可变区进行克隆并且证实抗原特异性来检测并且反复富集表达抗原特异性人类抗体的细胞。
如以上所说明(实例6)，产生一种细胞文库，该文库表达了复杂度大约为1.2x 10⁵的人类IgκL链与定向对抗靶抗原人类IL-1β的参比抗体SK48-E26的重链(Young et al.，WO 95/07997 A1)相组合的文库。含有这些链的逆转录病毒载体骨架更详细地描绘于图4c和11中(还参见实例4)。为此，用编码了SK48-E26IgH链、含有颗粒的转移载体对3x 10⁶个1624-5A-MuLV转化的1624-5前B细胞进行转导，其中MOI小于0.1。转导一天之后，使用来自BD的FACSAria、通过标准的高速细胞分选将GFP阳性细胞富集。将分选出的细胞在加湿的培养箱中通过组织培养进行扩展，持续五天。扩展之后，如以上所说明(实例5)通过标准的旋转感染、用已经包装着IgκL链文库(MOI为1.5)的颗粒对该细胞群进行转导，并且允许这些细胞通过组织培养从转导恢复两天。两天的恢复和扩展期之后，使用来自BD的FACSAria使用制备型细胞分选来富集5x 10⁵个共表达GFP和YFP的、并且因此含有至少一个重链和一个轻链的构建体的细胞。将现在富集的用于IgH和IgL链构建体共表达的细胞群通过组织培养再扩展四天。这次最终扩展之后，用2μg/ml、体积为100μl的重组人类IL-1β(R&DSystems)在冰上对表达IgH/IgL链文库的2x 10⁶个细胞的等分部分染色30分钟，之后跟随使用添加1％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的两个洗涤步骤。在用定向对抗IL-1β、并且与生物素相偶联的多克隆抗体孵育之后，将细胞再洗涤两次，并且随后用抗生蛋白链菌素-APC染色用于检测结合抗原的细胞、以及它们随后的富集，这是使用流式细胞仪来进行的。通过FACS进行第一轮细胞分选之后，将这些细胞扩展五天，并且进行另一轮的抗IL-1β染色以及染色呈阳性的细胞的富集，正如以上所说明。将这种选择重复三次(图21)。如以上所说明，针对IL-1β结合来对在三轮逆转录细胞展示富集之后得到的 细胞群进行再次染色，但这次的反应性细胞没有富集为如之前所述的大群落，而是使用来自BD的FACSAria、借助于单细胞分选将单独的细胞克隆分选到96孔板中。在七天的培养和扩展之后，使用所说明的科学试验方案、并且此外使用所有二级试剂(除抗原IL-1β)作为一种阴性对照物，再次对单独的细胞克隆分析IL-1β抗原特异性。正如所预期并且使用流式细胞仪所证实的，一些克隆显示与该靶抗原特异性结合，如在该抗原的存在下(而不在其缺失时)由一个特异性的FACS信号所揭示(排除了这些克隆与这些第二种检测试剂中的任何一种相结合的背景结合)。然而，一些克隆显示出一种染色信号，不论以下抗原存在与否，该抗原指示了这些克隆与这些用于检测IL-1β反应性的二级试剂中的任何一种进行非特异性地结合。总之，24个细胞克隆的基因组DNA被分离，并且充当一种模板用于使用寡核苷酸Seq-ID31和Seq-ID32的、标准的基因组PCR，这些寡核苷酸对应地与在该逆转录病毒轻链文库中编码的人类轻链的可变区的上游和下游进行特异性地结合。
Seq-ID31：5′-CCTTGAACCTCCTCGTTCGACCC-3′
Seq-ID32：5′-AGGCACAACAGAGGCAGTTCCAG-3′
从每个已分析的细胞克隆中获得了预期大小的PCR扩增子，并且将这些PCR扩增子直接进行DNA测序分析。所分析的这24个克隆中有12个显示具有一个完全相同的、但却新颖的IgκL链(被命名为LCB24)，以及正如所预期还含有SK48-E26的IgH链，如分开所确定。
如所预期，表达LCB24IgL链与SK48-E26IgH链的组合的所有12个克隆都展示出特异性的IL-1β信号，这是使用流式细胞仪进行的，如以上所提及。
一种含有所扩增的新颖的LCB24IgκL链的选出的PCR扩增子被限制性内切酶HindIII和Eco47III酶解，侧翼为可变编码区(图4c)，并且将该片段克隆到具有适合的限制性酶切位点的一种逆转录病毒IgκL链表达载体中，允许将LCB24V_L编码区与恒定的人类κ轻链编码区进行框内融合。因此，所得到的载体编码了一种新颖的、完全的人类IgκL链。
将针对LCB24IgκL链的再次克隆的、并且序列证实的逆转录病毒表达载体与IL-1β参比抗体SK48-E26的SK48E26IgH链一起转导到1624-5细胞中。在通过组织培养扩展两天之后，使用来自BD的FACSAria、通过高速细胞分选将GFP+/YFP+细胞富集。如以所说明，首先对得到的、表达Ig的细胞测试了它们结合IL-1β的能力。正如所预期，由LCB2连同SK48-E26的重链的展示所介导的它们的反应性得到了证实(图22)。为了排除这种新颖的抗体总体上是与其他抗原或蛋白交叉反应的，对表达LCB24IgL/SK48-E26IgH组合的细胞测定了IL-15反应性，如之前所说明。如在图23中所描绘，对于这种新颖的IgLLCB24/HC SK48-E26抗体不能检测出对IL-15的反应性，这指示了这种新颖抗体的靶抗原特异性。另外的对照物包括一种细胞系，该细胞系表达了一种抗IL-15特异性参比抗体(作为阳性对照物)、以及初始的SK48-E26IL-1β抗体。尽管这种表达抗IL-15抗体的细胞正如所预期显示出对IL-15的特异性染色，对于SK48-E26IL-1β抗体或对于这些细胞没有检测出反应性(图23)。
总之，在一种筛选实验中鉴定了一种新颖的轻链介导的抗原特异性反应性，该实验采用了针对一种IL-1β特异性参考抗体SK48-E26的重链进行改组的一个轻链文库。
实例9
对改组的IgH和IgL链文库进行逆转录细胞展示筛选。通过高速细胞分选、对编码了来自抗原选择细胞的区域的可变区进行筛选并且证实抗原特异性来检测并且反复富集表达抗原特异性人类抗体的细胞。
如以上所说明(实例6)，产生种个细胞文库，该文库使用大约为0.1的MOI、表达了一种重链文库，这些重链具有大约6.5x 10⁵(与GFP相偶联)的复杂度。含有这些链的逆转录病毒载体骨架更详细地描绘于图4c以及11中(还参见实例4)。为此，使用以上提及的、编码了含有颗粒的转移载体的IgH链文库对3x 10⁶个1624-5A-MuLV转化的1624-5前B细胞进行转导，其中MOI小于0.1。转导后2天，使用来自BD的FACSAria、通过标准的高速细胞分选将 GFP阳性细胞富集。在对GFP+细胞进行分选之后，通过组织培养将这些细胞再扩展两天。扩展之后，使用已经包装着一个轻链文库的颗粒对GFP+细胞群进行转导，该轻链文库由245个完全序列组成，这些序列的特征是MOI大于1的轻链，如以上所说明。转导之后两天，通过高速细胞分选将GFP+/YFP+双转导的细胞富集，并且通过组织培养将该细胞群(现在在这些细胞的大多数中含有IgH和IgL这两种链文库)再扩展三天。在这之后，用一种抗原混合物(a cocktail of antigens)(包括以上说明的inter alia SAV(抗生蛋白链菌素)-APC-Cy7(参见实例8))对2.5x 10⁵个细胞的等分部分进行染色，并且进行富集用于使用流式细胞仪来检测该靶抗原的反应性。平行地，使用抗IgLκ特异性抗体将表达抗体IgH/IgL文库的细胞群进行染色。发现在这些细胞中有大约75％的细胞在该细胞表面上展示人类抗体(数据未显示)。使用来自BD的FACSAria、通过高速细胞分选已经分选出抗原反应的细胞，并且通过组织培养将富集的细胞扩展七天。如以上所说明，将同样的染色以及细胞富集操作重复两次以上。在三轮逆转录细胞展示选择之后，对得到的细胞群进行再次染色以便评估靶抗原SAV-APC-Cy7的结合、并且使用流式细胞仪进行分析。如在图24中所描绘，所获得的大群落显示出与SAV-APC-Cy7相结合，这指示了成功地选择出具有针对SAV-APC-Cy7的抗原特异性的抗体。为了评估对抗靶抗原SAV-APC-Cy7的反应性的特异性，表达这三次富集的文库的细胞还使用抗原SAV-APC以及SAV-PerCP-Cy5.5进行染色(图25)。与未经转导的细胞以及充当阴性对照物的、表达未经选择的文库的细胞相类似，这些抗原没有被这三次SAV-APC-Cy7富集的细胞结合。然而，后者的细胞再次显示出对SAV-APC-Cy7的强反应性，这指示这些选择的细胞群的抗原特异性是定向对抗SAV-APC-Cy7串联染料的Cy7荧光色素的。
这3次富集的细胞群的基因组DNA被分离，并且充当一种模板用于使用寡核苷酸Seq-ID31(见以上)以及Seq-ID33的、标准的基因组PCR，这些寡核苷酸与在这些逆转录病毒文库中编码的人类轻链和重链的编码区的上游和下游特异性地结合。
Seq-ID33：5′-CGGTTCGGGGAAGTAGTCCTT GAC-3′)
获得了预期大小的重链和轻链的PCR扩增子，并且将它们分开地亚克隆到一种克隆载体pSC-B(Stratagene)的、标准的PCR片段中，正如制造商所推荐。将具有这些已克隆的重链和轻链区的pSC-B质粒从10个细菌克隆中分离出，这10个细菌克隆每个均来自IgH PCR片段的亚克隆以及IgL PCR片段的亚克隆，它们都经受了DNA测序分析。DNA测序显示两种不同的IgH链序列(被命名为HC49、HC58)，以及两种不同的IgL链序列(被命名为LC4和LC10)。
从通过HindIII以及Eco47III酶解得到的序列证实的克隆分离出含有V_H以及V_L编码区的DNA片段，因为这些限制性酶切位点在HC49、HC58、LC4以及LC10的对应的V_H以及V_L区的可变区(见图4c)的侧翼。将分离的HC49、HC58、LC4以及LC10的V_H以及V_L区克隆到一种逆转录病毒受体载体中，该逆转录病毒受体载体对应地具有一种人类Igκ1H链的恒定区(表达与GFP相偶联的IRES)以及一种人类IgκL链(表达与YFP相偶联的IRES)，如以上所说明。因此，产生了逆转录病毒表达载体构建体，该构建体编码了新颖的HC49以及HC58IgH链、LC4以及LC10IgL链的全长人类IgH和IgL链。当这些载体共转导到1624-5前B细胞中并且扩展8天时，如之前所述使用流式细胞仪将GFP+/YFP+细胞富集。如所说明，首先对得到的细胞测试它们结合SAV-APC-Cy7的能力。如在图26中所描绘，表达抗体HC49/LC4以及HC/LC10的细胞的反应性没有显示出对抗SAV-APC-Cy7的显著的结合活性。相反，容易检测到由抗体HC58/LC4以及HC58/LC10介导的反应性。这为通过基于多样的IgH链和IgL链集合的逆转录细胞展示成功地鉴定新颖的抗原特异性抗体、而不需要来自一种已知抗原特异性的参比抗体的一种已知IgH或IgL链提供了一种概念性证据。
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