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1、(10)申请公布号 CN 102876600 A (43)申请公布日 2013.01.16 C N 1 0 2 8 7 6 6 0 0 A *CN102876600A* (21)申请号 201210337053.3 (22)申请日 2012.09.13 CGMCC No.6243 2012.06.20 C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C02F 1/52(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (71)申请人哈尔滨工业大学宜兴环保研究院 地址 214205 江苏省无锡市宜兴市环科园绿 园路501。
2、号环保科技大厦12层 (72)发明人马放 邢洁 杨基先 李昂 庞长泷 吴丹 魏薇 (74)专利代理机构宜兴市天宇知识产权事务所 (普通合伙) 32208 代理人李妙英 (54) 发明名称 一株高效生物絮凝剂产生菌及其筛选方法以 及在处理磺胺甲恶唑中的应用 (57) 摘要 一株高效生物絮凝剂产生菌，它涉及城市给 水、污水处理过程中痕量污染物的去除，解决了 生物絮凝剂产量低、人工调控性差及处理底物 单一的问题，筛选方法是取哈尔滨城市污水处 理厂活性污泥驯化富集生物菌群，摇瓶稀释培 养、平板划线、分离和纯化生物菌种，通过多次 重复三区划线，得到纯种生物絮凝剂产生菌株 KlebsiellaSp.，该菌。
3、株对城市生活污水中的痕量 污染物去除率达到67.82%，本发明提高了城市污 水中痕量污染物的去除率、降低了生产能耗。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 1/1页 2 1.一株高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于为克雷伯氏菌MFX（Klebsiella sp.），于 2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号 CGMCC NO. 6243。 2.根据权利要求1所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于具体。
4、筛选步骤如下： （1）取15 mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培 养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速为150 r/min的摇床中培养1848 h，获得富集菌 液； （2）取15mL富集菌液加入100mL YP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条 件34次，获得驯化菌液； （3）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 ，分别取100L 驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30的培养箱中，培养 1848 h，获得单菌落； （4）利用之字划线、三区划线。
5、继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础 培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落； （5）将纯菌落加入100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速为150 r/min的摇床中培养18 h，获得种子液； （6）取10 mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速 为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率； 其中YP液体基础培养基的组成是：5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵母膏，溶 于1000 mL蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有1518g 琼。
6、 脂；絮凝剂液体培养基的组成是：10 g葡萄糖，5 g K 2 HPO 4 ，2 g KH 2 PO 4 ，0.2 g Mg(SO 4 )7H 2 O， 0.1 g NaCl，0.5 g尿素，0.5 g酵母膏，pH 7.27.5。 3.根据权利要求2所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于筛选方法步骤（2）中获 得的驯化菌液OD 660 为1.0，培养基均在112下灭菌30 min后使用。 4.根据权利要求1、2、3之一所述的高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于菌株发酵生产 的生物絮凝剂对药品和个人护理品中抗生素类药物磺胺甲恶唑有良好的去除能力，应用在 城市给水及污水处理中。 权 利 要 求 书CN。
7、 102876600 A 1/4页 3 一株高效生物絮凝剂产生菌及其筛选方法以及在处理磺胺 甲恶唑中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一株高效生物絮凝剂产生菌，属于生物工程、环境工程技术领域，是 采用微生物纯培养技术从自然环境中筛选出的高效高产量生物絮凝剂产生菌Klebsiella sp.，同时提供这种高效生物絮凝剂产生菌的筛选方法和其在处理磺胺甲恶唑中的应用。 背景技术 0002 药品和个人护理品（Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs）作 为水生环境的新兴污染物已经成为现今很多环境研究的中心。药物治疗和个人卫生的需 要导致PPC。
8、Ps源源不断地释放到环境中。虽然知道这些新兴的污染物的存在已经几十年 了，然而仅在最近的1015年内，才研究出检测PPCPs在环境中的痕量浓度的分析方法。尽 管PPCPs是痕量物质，但是PPCPs呈现的化学持久性和抗微生物性的协同作用，以及PPCPs 给水生生物和人类带来的无法完全定义的不利影响，都引起了人们的广泛关注。抗生素类 药物磺胺甲恶唑属于典型的PPCPs，其在污水处理厂中去除比例很低，被频繁检出。国内外 都对水环境中该类药品的处理和检测做了广泛研究，常用的处理方法主要有高级化学氧化 法、吸附法、膜处理技术等。其中利用生物絮凝剂吸附法处理水体中的PPCPs尚未被报道， 利用该方法去除水。
9、坏境中的磺胺甲恶唑较其他方法有着高效、环保、无二次污染的优势。因 此，从自然界筛选出高效生物絮凝剂产生菌，并将其制成生物菌制剂，应用于此类污染的治 理将有着实际的应用价值。 发明内容 0003 本发明的目的是从自然界筛选出高效高产量生物絮凝剂产生菌株Klebsiella sp.，并将其制成生物菌制剂，为生物絮凝剂的应用提供高效的菌剂，强化去除磺胺甲恶唑 的效能。 0004 一株高效生物絮凝剂产生菌，其特征在于为克雷伯氏菌MFX（Klebsiella sp.）， 于2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号 CGMCC NO. 6243。 0005 菌株。
10、克雷伯氏菌MFX（Klebsiella sp.）是从哈尔滨市太平污水处理厂二沉池活性 污泥中分离得到，生物絮凝剂产生菌的分离筛选过程均在30 条件下进行。首先取15mL 活性污泥和若干玻璃珠至已灭菌好的YP液体培养基中，摇瓶培养1832 h。灭菌条件为112 ，高压蒸汽灭菌30分钟。第一个培养周期结束后，将获得的富集菌液按10%的接种量加 入到新鲜的YP液体培养基中继续摇瓶培养1832 h，重复上述操作34次。将此混合菌液 涂布在YP固体培养基上，反复进行平板划线，固体、液体交替培养，得到纯菌落，转接至絮 凝剂液体培养基筛选出一株高效高产量的生物絮凝剂产生菌株Klebsiella sp.。 0。
11、006 具体筛选步骤如下： （1）取15 mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培 说 明 书CN 102876600 A 2/4页 4 养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速为150 r/min的摇床中培养1848 h，获得富集菌 液； （2）取15mL富集菌液加入100mL YP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条 件34次，获得驯化菌液； （3）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 ，分别取100L 驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30的培养箱。
12、中，培养 1848 h，获得单菌落； （4）利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础 培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落； （5）将纯菌落加入100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速为150 r/min的摇床中培养18 h，获得种子液； （6）取10 mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速 为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率。 0007 其中YP液体基础培养基的组成是：5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵 母膏，溶于1000 mL。
13、蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有 1518g 琼脂；絮凝剂液体培养基的组成是：10 g葡萄糖，5 g K 2 HPO 4 ，2 g KH 2 PO 4 ，0.2 g Mg(SO 4 )7H 2 O，0.1 g NaCl，0.5 g尿素，0.5 g酵母膏，pH 7.27.5。 0008 本发明筛选方法的步骤（2）中获得的驯化菌液OD 660 为1.0，培养基均在112下灭 菌30 min后使用。 0009 菌株Klebsiella sp.发酵生产的生物絮凝剂对药品和个人护理品中抗生素类药 物磺胺甲恶唑有良好的去除能力，应用在城市给水及污水处理中。 0010 本发明采。
14、用微生物纯培养技术从自然环境中筛选出生物絮凝剂产生菌 Klebsiella sp.，实现了生物絮凝剂的制备，为生物絮凝剂的产业化提供了高效产絮菌种， 提高了絮凝剂的产量及絮凝效能，解决了生物絮凝剂产量低、人工调控性差及处理底物单 一的问题，这种Klebsiella sp.，是高效高产量的发酵生物絮凝剂，在处理磺胺甲恶唑中应 用，可有效去除磺胺甲恶唑，降低了生产能耗，对城市污水厂中痕量污染物有良好的去除能 力，达到出水水质要求。 附图说明 0011 图1是本发明菌株对污染物去除率的影响因素（pH值）。 0012 图2是本发明菌株对污染物去除率的影响因素（絮凝剂投加量）。 0013 图3是本发明菌。
15、株对污染物去除率的影响因素（助凝剂投加量）。 0014 图4是本发明菌株对污染物去除率的影响因素（温度）。 0015 图5是本发明菌株处理磺胺甲恶唑污水的吸附平衡时间。 具体实施方式 0016 实施例1，一株高效生物絮凝剂产生菌，为克雷伯氏菌MFX（Klebsiella sp.），于 2012年06月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号 CGMCC NO. 6243。 说 明 书CN 102876600 A 3/4页 5 0017 其筛选方法为： （1）取15 mL哈尔滨市太平污水处理厂中的新鲜活性污泥加入100 mL YP液体基础培 养基三角瓶中，置于温度为3。
16、0 ，转速为150 r/min的摇床中培养1848 h，获得富集菌 液； （2）取15mL富集菌液加入100mL YP液体基础培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条 件34次，获得驯化菌液； （3）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 、10 -6 ，分别取100L 驯化菌液加入YP固体基础培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为30的培养箱中，培养 1848 h，获得单菌落； （4）利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，YP液体基础培养基、YP固体基础 培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落； （5）将纯菌落加。
17、入100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速为150 r/min的摇床中培养18 h，获得种子液； （6）取10 mL种子液置于100 mL絮凝剂液体培养基三角瓶中，置于温度为30 ，转速 为150 r/min的摇床中培养24 h，获得发酵液，测其絮凝率及产率，絮凝率为94.26%，此时 的絮凝剂产量（干重）为4.5 g/L。 0018 （7） 向制备好的发酵液中加入发酵液2倍体积95%的无水乙醇（无水乙醇要在4 预冷），搅拌后溶液中出现白色絮体，将白色絮体过滤收集。在过滤后的溶液中，再加入一 倍体积95%的无水乙醇，再次提取白色絮体物质。在收集到的絮体中加入少量蒸馏水，使之。
18、 溶解均匀，于室温放置20 h，之后放入超低温冰箱冷冻24 h，再放入冻干机中冻成干粉。 0019 其中YP液体基础培养基的组成是：5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麦芽膏、3 g酵 母膏，溶于1000 mL蒸馏水中；YP固体基础培养基是在YP液体基础培养基组份中另加有 1518g 琼脂；絮凝剂液体培养基的组成是：10 g葡萄糖，5 g K 2 HPO 4 ，2 g KH 2 PO 4 ，0.2 g Mg(SO 4 )7H 2 O，0.1 g NaCl，0.5 g尿素，0.5 g酵母膏，pH 7.27.5。 0020 实施例2，将实施例1中菌种发酵产生的生物絮凝剂干粉溶于蒸馏水，配制成浓度 。
19、为2g/L水溶液，投入1 mg/L磺胺甲恶唑污水中。方法絮凝剂投加量分别为1mL、3mL、5mL、 7mL、9mL；助凝剂CaCl2溶液投加量为0 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL；pH值调至4、5、6、 7、8；温度分别设定为5，15 ，25 ，35 ，45 ，55 ，摇床转数为140 r/min，反应 0 h、0.25 h、0.5 h、0.75h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，结果如图1-图5所示，最佳 去除条件：pH值为5，絮凝剂投加量为5 mL，助凝剂投加量为0.5 mL，絮凝时间为1 h，温度 为35 。此条件下去除磺胺甲恶唑溶液效果。
20、良好，去除率可达67.82 %。 0021 处理含有磺胺甲恶唑实际生活污水，根据单因素试验初步确定的絮凝条件最佳 值，设计L 9 （4 3 ）正交试验，优化生物絮凝剂去除磺胺甲恶唑的反应条件。结果如表1所示。 pH值5，絮凝剂的投加量为8 mL，助凝剂的投加量为0.2 mL，絮凝时间1 h。通过比较极值 得出各因素对去除率的影响度为RARBRCRD。即pH值的影响度最高，其次为絮凝剂投加 量、助凝剂体积量和絮凝时间。经验证在此条件下生物絮凝剂对生活污水中磺胺甲恶唑的 去除率达到53.27 %。 0022 生物絮凝剂产生菌发酵生产的生物絮凝剂对生活污水中磺胺甲恶唑的去除效果 的正交试验结果和直观分析见表一。 说 明 书CN 102876600 A 4/4页 6 0023 表一 正交试验结果和直观分析表 说 明 书CN 102876600 A 1/3页 7 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102876600 A 2/3页 8 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102876600 A 3/3页 9 图5 说 明 书 附 图CN 102876600 A 。