一种溶磷菌及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618449 A (43)申请公布日 2012.08.01 C N 1 0 2 6 1 8 4 4 9 A *CN102618449A* (21)申请号 201210095164.8 (22)申请日 2012.04.01 CGMCC No.5857 2012.03.07 C12N 1/14(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (71)申请人云南省微生物发酵工程研究中心有 限公司 地址 650217 云南省昆明市经济技术开发区 昌宏路9号 (72)发明人杨发祥 尚海丽 张琪 (74)专利代理机构昆明正原专。

2、利代理有限责任 公司 53100 代理人金耀生 (54) 发明名称 一种溶磷菌及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明是一种溶磷菌及其制备方法 和应用。该溶磷菌分类命名为臭曲霉 Aspergillusfoetidus，其保藏登记号为 CGMCCNo.5857。本发明的溶磷菌用于生产微生物 肥料，并用于烟叶的栽培，通过溶磷、解钾等功能 微生物的直接作用，释放土壤中的不易被吸收的 养分，改良了土壤品质，促进土壤中有益微生物的 繁殖，提高了土壤中有益微生物的数量，调节土壤 中的营养平衡，从而提高了烟株对矿质营养的平 衡吸收，提高烟叶质量和肥料利用率，并减少了环 境污染。 (83)生物保藏信息 (5。

3、1)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1页 2 1.一种溶磷菌，其特征在于溶磷菌分类命名为臭曲霉Aspergillus foetidus，其保藏 登记号为CGMCC No.5857。 2.权利要求1所述的溶磷菌的制备方法，其特征在于按以下步骤进行： 1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接种 后进行振荡培养或搅拌培养4-5d，测定菌种浓度达到10 10 以上；培养基为葡萄糖5-15g、硫 酸铵0.2。

4、-0.8g、磷酸钙6-12g、氯化钠0.1-0.5g、氯化钾0.1-0.5g、硫酸镁01-0.5g、硫酸 亚铁0.01-0.05g、硫酸锰0.01-0.05g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5； 2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，冷却后加入培养基，再进行实消，即对 培养基灭菌，培养基与上述种子培养基相同，采用蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度 121-125左右，灭菌20min-30min，无菌空气保压，自然冷却至25； 3）发酵罐接种：将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压 0.03-0.05Mpa； 4）发酵过程控制：保持温度25，发酵罐内压强0.0。

5、5Mpa，通过温度计及压力表1-2h检 测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、 含量及pH值； 5）发酵后放料：发酵后期观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料时保持罐内 压力0.03-0.06Mpa，放料时进行搅拌，以使料液均匀，放料后溶磷菌产品放置于阴凉干燥处 保存或于0-4条件下保存。 3.权利要求1所述的溶磷菌的应用，其特征在于溶磷菌发酵液可直接作为农用微生物 菌剂肥料。 权 利 要 求 书CN 102618449 A 1/7页 3 一种溶磷菌及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种溶磷菌及其制备方法。

6、和应用。 背景技术 0002 现代农业的发展伴随着化肥的大量使用，在增产增收的同时却也导致了土壤板 结，有机质含量下降，土壤中的微生物失衡，土壤酸化，重金属含量增加，同时肥料流失还会 造成水体污染。目前未见一种可用于农用微生物菌剂系列肥料溶磷菌的文献报导和应用， 农用微生物菌剂系列肥料不仅可以有效改善土壤品质，同时也可以增强作物的抗性，增加 作物对肥料的利用率，减少环境污染，调节土壤中的微生物趋于平衡。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种溶磷菌及其制备方法和应用，可用于新型多功能具有溶 磷能力的环保生物肥料的生产。 0004 本发明的溶磷菌分类命名为臭曲霉Aspergillus foe。

7、tidus，其保藏登记号为 CGMCC No.5857。 0005 该菌株鉴定为： 1、形态特征：在PDA培养基上无色，有隔膜，分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞垂直 伸出，无隔膜，粗糙，顶端膨大呈球形。 0006 2、序列信息：经序列比对，信息结果与数据库中Aspergillus菌种的复合率较高； 聚类分析，发现该菌株与Aspergillus niger的聚类相距较远，明显分为两组， 聚类结果与 Aspergillus tubingensis和Aspergillus foetidus等菌种的聚类结果较为相近，可判定 该菌株与Aspergillus foetidus等菌种的亲缘关系较近。 000。

8、7 本发明的溶磷菌的制备方法如下： 1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接种 后进行振荡培养或搅拌培养4-5d，测定菌种浓度达到10 10 以上；培养基为葡萄糖5-15g、硫 酸铵0.2-0.8g、磷酸钙6-12g、氯化钠0.1-0.5g、氯化钾0.1-0.5g、硫酸镁01-0.5g、硫酸 亚铁0.01-0.05g、硫酸锰0.01-0.05g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5； 2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，冷却后加入培养基，再进行实消，即对 培养基灭菌。培养基与上述种子培养基相同，采用蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度 1。

9、21-125左右，灭菌20min-30min，无菌空气保压，自然冷却至25； 3）发酵罐接种：将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压 0.03-0.05Mpa； 4）发酵过程控制：保持温度25，发酵罐内压强0.05Mpa，通过温度计及压力表1-2h检 测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、 含量及pH值； 5）发酵后放料：发酵后期观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料时保持罐内 说 明 书CN 102618449 A 2/7页 4 压力0.03-0.06Mpa，放料时进行搅拌，以使料液均匀，放料后溶磷菌产品放置于阴凉干燥处 保存或于0。

10、-4条件下保存。 0008 本发明的溶磷菌具有较强的溶磷能力，由以下试验证明： 试验室测定菌种溶磷能力 试验目的：通过对三株溶磷真菌溶磷效果的测定，确定其溶磷能力的强弱。 0009 试验原理：采用重量法，依照GB/T8537-1999方法，用水和EDTA溶液提取水溶磷和 有效磷，提取液中正磷酸根离子在酸性介质中与喹钼柠酮溶液生成黄色磷钼酸喹啉沉淀， 用磷钼酸喹啉重量法测定磷的含量。培养结束时用钼蓝法进行测定对比。 0010 试验步骤及方法 1、样品处理 a、设本功能菌为1号样，另购买两组具有解磷功能的菌种设为2号样及3号样，设置一 组不加菌种的空白处理为对照ck，将各处理中的菌种在PDA平板上。

11、划线培养，活化3次； b、将活化好的菌种取一环接种于100ml的PDA液体培养基，27，200r/min,摇床培养 4天； c、取3ml菌种培养液，离心取上清液2.5ml(1%的接种量)加入含磷的250mlCa 3 (PO 4 ) 2 液体培养基，27，200 r/min,摇床培养7天； d、在第三天、第五天、第七天取样测定。 0011 2、重量法测定水溶磷及有效磷 （1）测定方法 a.坩埚恒重试验前准备：将坩埚清洗干净，用热水抽滤三到五次，放入180 2的烘箱中烘干，2小时后取出放置在干燥器中冷却，冷却半小时后第一次称重，然后 继续烘干半小时，冷却半小时后第二次称重，两次重量之差小于0.00。

12、03的可以备用，大于 0.0003的继续重复上述的烘干、冷却、称重过程，直至质量差小于0.0003，坩埚质量记为m 1 。 0012 b.取30ml样品移入小烧杯中，用水清洗取样管35次，洗涤液并入样品液中。 0013 c.称量装有样品的烧杯，质量记为m 样 。 0014 d.将样品通过滤纸滤到250ml容量瓶中，容量瓶中提前加入10ml浓度为50%的 HNO3，清洗烧杯3-5次，洗涤液并入样品液中过滤，再加水定容至刻度。（此步骤用于提取水 溶磷） e.将滤纸连同过滤物移入另一250ml容量瓶中，加入加热到60以上的浓度为37.5g/ L的EDTA热溶液150ml，充分震荡使滤纸破碎，在温度为。

13、602摇床上震荡1小时。（此 步骤用于提取枸溶磷） f.在400ml烧杯中加入10ml浓度为50%的HNO3，将容量瓶中测水溶磷的溶液用移液 管移取10ml加入此烧杯中，此烧杯中的水溶液用于测定水溶磷。 0015 g. 在400ml烧杯中加入10ml浓度为50%的HNO3，将容量瓶中测水溶磷的溶液和 测枸溶磷的溶液用移液管各移取10ml加入此烧杯中，此烧杯中的水溶液用于测定有效磷。 0016 h.向2个烧杯中各加入100ml水，搅拌并盖上一个表面皿进行加热，煮沸后加入 40ml喹钼柠酮磷沉淀剂继续加热，待沉淀出现分层后取下冷却至室温。 0017 i.将沉淀加入坩埚抽滤，充分清洗烧杯使沉淀无损失。

14、，滤干后放入1802烘 箱中烘45分钟。 说 明 书CN 102618449 A 3/7页 5 0018 j.烘干后取出，在干燥器中室温冷却30分钟，称重，水溶磷记为质量m 2 ，有效磷记 为质量m 3 。 0019 （2）试验结果计算 水溶磷含量（X 1 ）、有效磷含量（X 2 ）及水溶磷占有效磷含量的百分比率（X 3 ）以五氧化二 磷（P 2 O 5 ）的质量百分数表示，按下列公式计算： X 1= X 2= X 3 = m 水 ：测定水溶磷所得磷钼酸喹啉沉淀的质量m 2 -m 1 m 有 ：测定有效磷所得磷钼酸喹啉沉淀的质量m 3 -m 1 m 样 ：用于测定水溶磷和有效磷的样品的质量 0。

15、.03207：磷钼酸喹啉质量换算为五氧化二磷质量的系数 （3）试验结果 钼蓝法测定有效磷含量 （1）测定方法 a.将上述已培养七天的培养液摇匀后取4ml4000rpm/min离心20分钟。 0020 b.取上清液2.5ml至25ml的容量瓶中，加水1015ml，加1滴2，4-二硝基酚指 示剂，用4N NaOH调节pH值至溶液赶赴呈微黄色，用2N H2SO4与调节至微黄色，加2.5ml钼 锑试抗显色剂，用水定容到标度，摇匀。30min后分光光度计上用0.5cm光径比色皿，700nm 波长比色测定显色液的吸收值。 0021 c.将吸收光值在标准曲线上查出对应的有效磷含量。 0022 d.有效磷标准。

16、曲线的绘制：吸取5ppmP磷标准溶液0，1，2，3，4，5，6ml分别放入 50ml容量瓶中，加水1525ml，加1滴2，4-二硝基酚指示剂，用4N NaOH调节PH值至溶 说 明 书CN 102618449 A 4/7页 6 液赶赴呈微黄色，用2N H2SO4与调节至黄色退去，加5ml钼锑试抗显色剂，用水定容到标 度，摇匀。30min后分光光度计上用0.5cm光径比色皿，700nm波长比色测定显色液的吸收 值。用0ppm磷标准系列显色液做参比，吸收值调值到零，由稀到浓测标准系列显色液的吸 收值。 0023 （2）测量数据绘图如图1所示。 0024 （3）钼蓝法测定有效磷含量数据 菌株号吸光值。

17、（稀释十倍）有效磷含量（ppm） 1号样0.1534 54.20 2号样0.1489 52.61 3号样0.1142 40.28 CK 0.0476 16.81 试验结果分析： 用重量法进行测定，可以明显看出1号菌的溶磷能力最强，3号菌次之，4号菌的溶磷能 力最差。通过用钼蓝法对第七天的样品进行检测，可以看出与重量法测得的数据结果一致， 1号菌的溶磷能力最强，3号菌次之，4号菌的溶磷能力最差。由于样品为液体，在用重量法 进行检测的过程中可能不够精确，但基本达到了比较菌种之间溶磷能力大小的效果。 0025 本发明的溶磷菌用于生产微生物肥料，并用于烟叶的栽培，通过溶磷、解钾等功能 微生物的直接作用。

18、，释放土壤中的不易被吸收的养分，改良了土壤品质，促进土壤中有益微 生物的繁殖，提高了土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，从而提高了烟株对 矿质营养的平衡吸收，提高烟叶质量和肥料利用率，并减少了环境污染。 附图说明 0026 图1是本发明的溶磷菌菌落形态图。 0027 图2是本发明的溶磷菌分生孢子梗形态图。 0028 图3是本发明的溶磷菌分生孢子形态图。 0029 图4是本发明的溶磷菌有效磷含量变化图。 0030 图5是本发明的溶磷菌与另两组菌的水溶磷含量比较图。 0031 图6是本发明的溶磷菌与另两组菌的有效磷含量比较图。 0032 图7是本发明的溶磷菌与另两组菌的水溶磷占有效磷的百。

19、分比比较图。 0033 本发明的溶磷菌于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 具体实施方式 0034 本发明的溶磷菌通过以下方法制备获得： 1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接 种后进行振荡培养或搅拌培养4-5d，测定菌种浓度达到10 10 以上；培养基为葡萄糖5-15g、 硫酸铵0.2 g （或0.8g）、磷酸钙6 g（或12g）、氯化钠0.1 g（或0.5g）、氯化钾0.1 g （或 0.5g）、硫酸镁01 g（或0.5g）、硫酸亚铁0.01 g（或0.05g）、硫酸锰0.01 。

20、g （或0.05g）、 蒸馏水1000ml，pH7.0（或7.5）； 2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，冷却后加入培养基，再进行实消，即对 说 明 书CN 102618449 A 5/7页 7 培养基灭菌。培养基与上述种子培养基相同，采用蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度 121-125左右，灭菌20min-30min，无菌空气保压，自然冷却至25； 3）发酵罐接种：将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压 0.03-0.05Mpa； 4）发酵过程控制：保持温度25，发酵罐内压强0.05Mpa，通过温度计及压力表1-2h检 测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入。

21、量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、 含量及pH值； 5）发酵后放料：发酵后期观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料时保持罐内 压力0.03-0.06Mpa，放料时进行搅拌，以使料液均匀，放料后溶磷菌产品放置于阴凉干燥处 保存或于0-4条件下保存。 0035 发酵后得到的发酵液可直接作为农用微生物溶磷菌剂肥料。 0036 试验情况：溶磷菌剂对烤烟生产的影响 针对植烟土壤有机质、微生物区系失衡的问题，从施肥手段补充土壤有机养分，对提高 土壤综合肥力，促进土壤中有益微生物的繁殖，提高烟株对矿质营养的平衡吸收，提高烟叶 质量和肥料利用率。本次使用的肥料，经好氧充分发酵后生产的具有溶磷、解。

22、钾等功能的微 生物肥料产品。通过调查其对烤烟经济性状、农艺性状等品质的影响，以期改良土壤品质， 提高土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，并通过溶磷、解钾等功能微生物的 直接作用，释放土壤中的不易被吸收的养分，以提高烟株的营养吸收。 0037 1 材料与方法 1.1、试验材料：云南省微生物发酵工程研究中心有限公司生产的试验一号（溶磷菌剂） 农用微生物菌剂，具有溶磷的功效，有效活菌数大于0.2亿/g。 0038 1.2、试验时间：2011年5月16日 2011年10月22日。 0039 1.3、试验地点：宁洱县勐先乡先胜村。 0040 1.4、前作：冬闲地，小春未种植。 0041 1.5。

23、、供试品种：云烟87。 0042 1.6、试验土壤：红土，生土回填。 0043 1.7、试验设计： 以施用试验一号（溶磷菌剂）农用微生物菌剂的烟草作为示范，采用当地常规施肥的烟 草作为对照。 0044 1.8、施肥量与施肥方法： 移栽后7天内施菌剂80ml/株，其他的措施同当地，统一栽培管理措施。 0045 1.9、生育期调查： 调查不同处理的烟苗移栽期、团棵期、旺长期、现蕾期、打顶期及最后一次采烤的时间 1.10、农艺性状调查： 于团棵期、旺长期、现蕾期、采烤前一天选取长势基本一致的5株烟测量株高、叶长、叶 宽。烟株从第一片底脚叶由下至上顺序编号，只测叶长大于5 cm的叶片。 0046 1.。

24、11、产质量调查： 根据烟株成熟情况，充分成熟采烤，调查不同处理的产量、产值、均价及中上等烟比例， 比较分析各处理的效果。 说 明 书CN 102618449 A 6/7页 8 0047 2 结果与讨论 2.1 农用微生物菌剂对烟草生育期的影响 表一 生育期调查表 处理移栽期团棵期旺长期现蕾期打顶期最后一次采烤时间 试验一号4月18日5月10日5月21日6月18日6月18日8月7日 常规对照4月18日5月14日5月23日6月21日6月20日8月10日 据以上数据显示，试验一号（溶磷菌剂）、试验二号（解钾菌剂）的生育期要略短于常规 对照。 0048 2.2 农用微生物菌剂对烟草农艺性状的影响 表。

25、二 农艺性状调查表 据以上数据显示，试验田烤烟生育期符合优质烟生长规律，大田长势良好，烟株根系发 达、健壮、抗逆性强。施用菌剂的烟株在株高、茎围、叶面积等方面优于常规施肥。 0049 2.3 农用微生物菌剂对烟草经济性状的影响 表三 经济性状统计表 处理亩产量亩产值均价上等烟中上等烟 试验一号126.9 2921.24 23.02 65.33 94.95 常规对照120.8 2293.99 18.99 45.12 72.79 从以上数据可以看出，施用试验一号（溶磷菌剂）农用微生物菌剂的烟草比常规烟草的 亩产量提高5.05%，亩产值提高27.34%，均价提高22.17%，上等烟比例提高44.79。

26、%。 0050 3 总结 3.1 综合以上数据认为，施用农用微生物菌剂的烟株不论在农艺性状方面，还是在经 济性状方面都具有一定的优势。 0051 3.2 因农用微生物菌剂含有大量有益菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具 说 明 书CN 102618449 A 7/7页 9 有的溶磷功能，对改善土壤品质，增强作物对肥料的吸收率等有很大的积极影响。 0052 3.3 施用农用微生物菌剂，对土壤的改良及作物的生长都具有非常大的积极作 用。 说 明 书CN 102618449 A 1/2页 10 序 列 表 SEQUENCE LISTING 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一种溶磷菌及其制备方。

27、法 / 2 PatentIn version 3.3 1 548 DNA 臭曲霉（Aspergillus foetidus ITS1） 1 gcacctccca tccgtgtcta ttataccctg ttgcttcggc gggcccgccg cttgtcggcc 60 gccggggggg cgcctttgcc ccccgggccc gtgcccgccg gagaccccaa cacgaacact 120 gtctgaaagc gtgcagtctg agttgattga atgcaatcag ttaaaacttt caacaatgga 180 tctcttggtt ccggcatcaa。

28、 tgaaaaacgc agcgaaatgc gataactaat gtgaattgca 240 gaattcagtg aatcatcgag tctttgaacg cacattgcgc cccctggtat tccggggggc 300 atgcctgtcc gaacgtcatt gctgccctca agcccggctt gtgtgttggg tcgccgtccc 360 cctctccggg gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccgatc ctcgagcgta 420 tggggctttg tcacatgctc tgtacgattg gtcggcgc。

29、ct gccgacgttt tccaaccatt 480 ttttccaggt tgacctcgaa tcaggtaggg atacccgctg aacttaagaa tatcaataag 540 序 列 表CN 102618449 A 10 2/2页 11 cggaggaa 548 2 552 DNA 臭曲霉（Aspergillus foetidus ITS4） 2 gtcgaggtca cctggaaaaa tggttggaaa acgtcggcag gcgccggcca atcctacaga 60 gcatgtgaca aagccccata cgctcgagga tcggacgcgg t。

30、gccgccgct gcctttcggg 120 cccgtccccc cggagagggg gacggcgacc caacacacaa gccgggcttg agggcagcaa 180 tgacgctcgg acaggcatgc cccccggaat accagggggc gcaatgtgcg ttcaaagact 240 cgatgattca ctgaattctg caattcacat tagttatcgc atttcgctgc gttcttcatc 300 gatgccggaa ccaagagatc cattgttgaa agttttaact gattgcattc aatcaactca。

31、 360 gactgcacgc tttcagacag tgttcgtgtt ggggtctccg gcgggcacgg gcccgggggg 420 caaaggcgcc cccccggcgg ccgacaagcg gcgggcccgc cgaagcaaca gggtataata 480 gacacggatg ggaggttggg cccaaaggac ccgcactcgg taatgatcct tccgcaggtt 540 cacctacgga ag 552 序 列 表CN 102618449 A 11 1/3页 12 图1 图2 图3 说 明 书 附 图CN 102618449 A 12 2/3页 13 图4 图5 说 明 书 附 图CN 102618449 A 13 3/3页 14 图6 图7 说 明 书 附 图CN 102618449 A 14 。